Спосіб одержання аубазидану

Способ получения аубазидана путем культивирования аспорогенных дрожжей Aureobasidium Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в технологии микробных полисахаридов Известен способ получения аубазидана культивированием аспорогенных дрожжей Aureobasidium puilulans путем аэробной ферментации продуцента на питательной среде, содержащей источник углерода и необходимые для роста клеток микроорганизма минеральные компоненты Для выращивания культуры Aureobasidium pullulans используют синтетическую питательную среду следующего состава, г/л натрий азотнокислый - 3,0, калий фосфорнокислый двузамещенный -1,0, магний сернокислый - 0,5, калий хлористый 0,5, железо сернокислое - 0 01, сахароза - 30, вода обессоленная - до 1 л Перед стерилизацией среды устанавливают рН в пределах 6,4-6,8 с помощью 2 н НС! или 2 н NaOH После стерилизации и охлаждения среду засевают культурой и ведут процесс выращивания при непрерывном перемешивании и аэрации в течение 50-55 часов при температуре 25 ±1°С Выращенный посевной материал имеет рН 3,95,6, содержит не менее 15 млн/мл клеток продуцента и используется для засева ферментационной среды в ферментере Приготовленную ферментационную среду перед стерилизацией доводят до рН=6,4-6,8 соляной кислотой или раствором едкого натра Процесс ферментации проводят при температуре 24±1°С и непрерывном перемешивании и аэрации в течение 72-90 часов Через двое суток pullulans, включающий приготовление посевной и ферментационной сред, доведение их до требуемого значения рН, стерилизацию, выращивание посевного материала, засев ферментационной среды посевным материалом и ферментацию, отличающийся тем, что при приготовлении посевной и ферментационной сред для доведения требуемого значения рН используют молочную кислоту, процесс выращивания посевного материала ведут при рН 4,8-5,0 в течение 30-36 часов, а ферментацию ведут при рН 4,0-4,2 и температуре 28-30°С в течение первых 24 часов с последующим снижением температуры ферментации до 22-24° С ферментации рН культуральной жидкости снижается за счет образования органических кислот до 3,8-4,2 и остается на этом уровне до конца ферментации Выход нативного аубазидана составляет 7,0-12 г/л Причиной, препятствующей дальнейшему повышению продуктивности процесса по выходу аубазидана, является неоптимальная область рН, при которой ведутся размножение посевного материала и ферментация, что снижает удельную скорость роста культуры и экономический коэффициент использования углеводов из-за их потерь на образование побочных продуктов (органических кислот и др ), увеличивает длительность процесса выращивания посевной культуры и ферментации, а также повышает опасность инфицирования культуральной жидкости на стадиях выращивания посевного материала и ферментации Задачей изобретения является усовершенствование известного способа получения аубазидана, в котором путем изменения условий приготовления посевной и ферментационной сред, а также параметров проведения процесса выращивания посевного материала и ферментации, получают технический результат, заключающийся в увеличении биосинтетической активности культуры Aureobasidium pullulans, а также в повышении производительности оборудования за счет сокращения длительности процесса Потребительские свойства объекта изобретения, связанные с техническим результатом, - по О о ф 10607 вышение выхода и качества целевого продукта и снижение его себестоимости Достигается технический результат тем, что в известном способе получения аубазидана путем культивирования аспорогенных дрожжей Aureobasidium puilulans, включающем приготовление посевной и ферментационной сред и доведение их до требуемого значения рН, стерилизацию, выращивание посевного материала, засев ферментационной среды посевным материалом и ферментацию, при приготовлении посевной и ферментационной сред для доведения требуемого значения рН используют молочную кислоту, процесс выращивания посевного материала ведут при рН 4,8-5,0 в течение 30-36 часов, а ферментацию ведут при рН 4,0-4,2 и температуре 28-30°С в течение первых 24 часов с последующим снижением температуры ферментации до 22-24°С После инверсии сахарозы в глюкозу и фруктозу последняя сбраживается по типу гетероферментативного молочнокислого брожения с образованием молочной и других кислот, а глюкоза полимеризуется в полисахарид Образовавшиеся в процессе ферментации органические кислоты являются побочными продуктами и снижают коэффициент конверсии сахарозы в целевой продукт Их образование при ферментации является защитной функцией микроорганизмов в условиях неблагоприятных значений рН в ферментационной среде Таким образом, выбор оптимального значения рН ферментационной среды является фактором повышения продуктивности микробного синтеза полисахарида Снижение рН среды от 6,46,8 до 4,0-4,2 дает увеличение выхода аубазидана от 10 до 18 г/л, или на 80% Коэффициент конверсии при этом увеличивается с 21 до 38% При доведении рН среды до требуемого значения необходимо применять молочную кислоту, которая является вторичным метаболитом, используется культурой A pulluians, и поэтому имеет преимущество перед минеральной соляной кислотой Физиологическое состояние микроорганизмов характеризуется адекватной реакцией на действие среды (Баснакьян И А Культивирование микроорганизмов с заданными свойствами - Москва "Медицина", 1992 - 187 с ) Культура в возрасте 30-36 часов имеет наиболее высокую активность для данной питательной среды и экономический коэффициент потребления субстрата имеет максимальное значение при одновременном сокращении длительности ферментации на 24 часа Ступенчатое снижение температуры в процессе ферментации позволяет в оптимальных условиях провести двухфазный процесс синтеза аубазидана, где в первой фазе при температуре 28-30°С обеспечивается интенсивное размножение культуры, а во второй фазе при температуре 22-24°С рост культуры замедляется и наступает активное образование полисахарида В заявляемом техническом решении предложено несколько неизвестных в микробиологии приемов - использование при биосинтезе микробных полисахаридов в качестве титруемого агента для доведения рН среды молочной кислоты и ведение биосинтеза полисахарида при рН 4,0-4,2, - посевной материал при передаче его на ферментацию должен быть в стадии логарифмического роста, что для культуры A pulluians, достигается на 30-36 часу выращивания, - оптимизация двухфазного микробиологического процесса по температуре, где первая фаза - размножение культуры - ведется при 28-30°С, а вторая - синтез полисахарида - при температуре 22-24°С Совокупное влияние указанных приемов позволяет получить технический результат и возникающие при этом потребительские свойства объекта изобретения Предлагаемый способ осуществляют следующим образом Готовят питательную среду, подкисляют молочной кислотой до рН 4,8-5,0, стерилизуют, засевают культурой A pulluians и выращивают в течение 30-36 часов Ферментационную среду подкисляют молочной кислотой до рН 4,0-4,2, стерилизуют и засевают выращенным посевным материалом в количестве 7,0-7,5% об Ферментацию ведут при постоянном перемешивании и аэрировании при температуре в первых 24 часа 28-ЗОХ, а в последующие часы при температуре 22-24°С Пример 1 Готовят посевную среду Чашка - Докса на дистиллированной воде с содержанием сахарозы 30 г/л, подкисляют молочной кислотой до рН 4,9, стерилизуют, засевают из пробирки культурой А pullulan 19 и выращивают на качалке в течение 33 часов, после чего используют для засева ферментационной среды Ферментационную среду Чашка - Докса готовят на дистиллированной воде с содержанием сахарозы 50 г/л, подкисляют молочной кислотой до рН 4,1, стерилизуют и засевают культурой в возрасте 33 часов в количестве 7,5% об Ферментацию проводят при температуре 29°С в течение 24 часов, а затем температуру снижают до 23°С Общая продолжительность ферментации 72 часа Определяют выход нативного аубазидана, биомассы и чистого полисахарида По полученным данным рассчитывают экономический коэффициент потребления углеводов Примеры 2, 3 и 4 были проведены по той же методике с изменением параметров активной кислотности среды и возраста посевного материала Результаты сведены в табл 1 10607 Таблица 1 Характеристики процесса Титруемый агент Исходное рН среды 4?І " Молочная кислота Молочная Кислота ~Т2 Молочная кислота Продолжительность ферментации, ч 72 І2 Показатели культуральной жидкости в конце ферментации выход нативного аубазидана, г/л АСВ выход биомассы, г/л, выход чистого аубазидана, г/л АСВ, относительная вязкость, степень конверсии, % Данные табл 1 свидетельствуют о том, что наилучшие результаты по выходу аубазидана и по экономическому коэффициенту использования углеводов достигаются при значении рН среды 4,1, которое устанавливается молочной кислотой Отклонение активной кислотности от оптимального значения как в меньшую (рН 5,0), так и в большую (рН 3,5) сторону приводит к ухудшению показателей по выходу аубазидана и его качеству Характеристика процесса Возраст жидкого посевного материала, ч Количество вносимого инокулюма, % Температура культивирования, °С до24 часов в последующие часы Исходное рН среды Титруемый агент Продолжительность ферментации, ч Показатели культуральной жидкости в конце ферментации выход нативного аубазидана, г/л выход биомассы, г/л АСВ выход чистого аубазидана, г/л АСВ относительная вязкость степень конверсии, % Как видно из данных табл 2, предлагаемый способ получения аубазидана позволяет повысить выход целевого продукта от 10,5 до 19,4 г/л, или на 84% по отношению к известному способу При этом относительная вязкость культуральной 3,5 13,9 5,6 18,0 (вязкости) Это свидетельствует о существенном влиянии активной кислотности, возраста посевного материала и температуры культивирования Aureobasid.um pullulans для решения поставленН И ° ДаДннЧью подтверждающие достижение технического результата и преимущества заявляемого способа в сравнении со способом-прототипом, приведены в табл 2 Таблица 2 По известному способу j48 По предлагаемому способу 33 24 2± _6I4-6JL8_ 2 Н соляная кислота 96 4,1 40% молочная кислота 72 жидкости увеличивается от 3,6 до 8,0, что свидетельствует о преобладании в ней высокомолекулярного полисахарида, т е о качестве целевого продукта 10607 ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Киів-133, бульв Лесі Українки, 26 (044)295-81-42, 295-61-97 0368 %Х 3 9 2 М 68 ^ ЛГо -ого,180