Фіксоване дозування антитіл до her

1. Спосіб лікування раку, що включає уведення однієї або більше доз антитіла до HER2 хворій людині у кількості, ефективній для лікування раку, в якому антитіло до HER2 зв'язується з доменом II зовнішньоклітинного домену HER2. 2. Спосіб за п. 1, в якому антитіло зв'язується зі сполученням між доменом І, II та IIІ зовнішньоклітинного домену HER2. 3. Спосіб за п. 1 або п. 2, в якому HER2 антитіло пригнічує гетеродимеризацію HER2 з EGFR aбo HER3. 4. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому HER2 антитіло складається з послідовностей різних легких та різних важких амінокислот у SEQ ID N: 3 та 4, відповідно. 5. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому антитіло до HER2 є пертузумабом. 6. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому фіксована доза знаходиться в діапазоні від приблизно 20 мг до приблизно 2000 мг антитіла до HER2. 7. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому фіксована доза вибирається з групи, що складається з приблизно 420 мг, приблизно 525 мг, приблизно 840 мг та приблизно 1050 мг HER2 антитіла. 8. Спосіб за п. 7, в якому фіксована доза складає приблизно 420 мг антитіла до HER2. 9. Спосіб за п. 7, в якому фіксована доза складає приблизно 1050 мг антитіла до HER2. 10. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому фіксовану дозу антитіла до HER2 уводять хворому приблизно кожного тижня, приблизно кожні 2 тижні, приблизно кожні 3 тижні або приблизно кожні 4 тижні. UA (21) a200709470 (22) 15.06.2005 (24) 25.06.2011 (86) PCT/US2005/021287, 15.06.2005 (31) 60/645,697 (32) 21.01.2005 (33) US (46) 25.06.2011, Бюл.№ 12, 2011 р. (72) АЛЛІСОН ДЕВІД Е., US, БРЮНО РЕНЕ, FR, ЛУ ЦЗЯНЬ-ФЕН, CN/US, НГ ЧІ М., US (73) ДЖЕНЕНТЕК, ІНК., US (56) WO0100238 A1, 04.01.2001. MALIK M. A. ET AL: "Dose-response studies of recombinant humanized monoclonal antibody 2C4 in tumor xenograft models." PROCEEDINGS OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH ANNUAL MEETING, vol. 44, July 2003 (2003-07), page 150, XP001246708 & 94TH ANNUAL MEETING OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH; WASHINGTON, DC, USA; JULY 11-14, 2003. BASELGA J ET AL: "PHASE II STUDY OF WEEKLY INTRAVENOUS RECOMBINANT HUMANIZED ANTI-P185HER2 MONOCLONAL ANTIBODY IN PATIENTS WITH HER2/NEU-OVEREXPRESSING METASTATIC BREAST CANCER" JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, GRUNE AND STRATTON, NEW YORK, NY, US, vol. 14, no. 3, March 1996 (1996-03), pages 737-744. BASELGA J: "Phase I and II clinical trials of trastuzumab" ANNALS OF ONCOLOGY 2001 NETHERLANDS, vol. 12, no. SUPPL. 1, 2001, pages S49-S55. AGUS D B ET AL: "PHASE I CLINICAL STUDY OF PERTUZUMAB, A NOVEL HER DIMERIZATION INHIBITOR, IN PATIENTS WITH ADVANCED CANCER" JOURNAL OF CLINICAL ONCOLOGY, GRUNE AND STRATTON, NEW YORK, NY, US, vol. 23, no. 11, 10 April 2005 (2005-04-10), pages 25342543. NG C ET AL: "Rationale for fixed dosing of pertuzumab by population pharmacokinetic (POP PK) modeling" CLINICAL PHARMACOLOGY & THERAPEUTICS, MOSBY-YEAR BOOK, ST LOUIS, MO, US, vol. 77, no. 2, 5 February 2005 (2005-0205), page P33. 2 (19) 1 3 94899 4 11. Спосіб за п. 10, в якому фіксована доза антитіла до HER2 уводиться хворому приблизно кожні 3 тижні. 12. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому антитіло до HER2 є ізольованим антитілом. 13. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому антитіло до HER2 є інтактним антитілом. 14. Спосіб за будь-яким з пунктів від 1 до 12, в якому антитіло до HER2 є фрагментом антитіла, до якого входить ділянка, що зв'язує антиген. 15. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому антитіло до HER2 є адаптованим до людини або IgGl антитілом людини. 16. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, в якому рак проявляє HER експресію, апмліфікацію або активацію. 17. Спосіб за будь-яким з пп. 1-16, в якому рак є раком яєчників, перитонеальним раком або раком фаллопієвої труби. 18. Спосіб за будь-яким з пп. 1-16, в якому рак є метастатичним раком молочної залози (МВС). 19. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-16, в якому рак є недрібноклітинною карциномою легень (NSCLC). 20. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-16, в якому рак є раком простати. 21. Спосіб за будь-яким з пунктів 1-16, в якому рак є раком кишечнику. 22. Спосіб за будь-яким з попередніх пунктів, що включає уведення хворому другого терапевтичного агента. 23. Спосіб за п. 22, в якому другий терапевтичний агент вибирають з групи, що складається з хіміотерапевтичного засобу, іншого HER антитіла, антитіла, спрямованого проти антигену, асоційованого з іншою пухлиною, антигормональної сполуки, кардіопротектора, сайтокіна, препарату, спрямованого на EGFR, антиангіогенного засобу, інгібітору тирозинкінази, інгібітору СОХ, нестероїдного протизапального препарату, інгібітору фарнезилтрансферази, антитіла, що зв'язує онкоембріональний білок СА 125, вакцини HER2, іншої, спрямованої на HER терапії, Raf або ras інгібітору, доксорубікону HCL ліпосомної ін'єкції, топотекану, таксану, інгібітору дуальної тирозинкінази, TLK286, EMD-7200, препарату проти нудоти, препарату, що запобігає або лікує шкірне висипання, або стандартної акнетерапії, препарату, що знижує температуру тіла, та фактора кровотворного росту. 24. Спосіб за п. 23, в якому другий терапевтичний засіб є хіміотерапевтичним засобом. 25. Спосіб за п. 24, в якому хіміотерапевтичний засіб є антиметаболітним хіміотерапевтичним засобом. 26. Спосіб за п. 25, в якому антиметаболітний хіміотерапевтичний засіб є гемцитабіном. 27. Спосіб за п. 23, в якому другий терапевтичний засіб є трастузумабом, ерлотінібом HCL або бевацизумабом. 28. Спосіб лікування раку у хворої людині, що передбачає уведення принаймні одної фіксованої дози пертузумабу хворому, причому фіксована доза вибирається з групи, що складається з приблизно 420 мг, приблизно 525 мг, приблизно 849 мг га приблизно 1050 мг пертузумабу. 29. Спосіб за п. 28, в якому фіксована доза пертузумабу уводиться хворому приблизно кожні 3 тижні. 30. Спосіб за п. 28 або за п. 29, в якому рак вибирають з групи, що складається з раку яєчника, перитонеального раку, раку фаллопієвої труби, метастатичного раку молочної залози (МВС), недрібноклітинної карциноми легень (NSCLC), раку простати та раку кишечнику. 31. Виріб, що складається з ампули, що містить фіксовану дозу HER2 антитіла, в якому фіксована доза вибирається з групи, що складається з приблизно 420 мг, приблизно 525 мг, приблизно 840 мг та приблизно 1050 мг HER2 антитіла, в якому HER2 антитіло є пертузумаб. 32. Виріб за п. 31, що також містить листівкувкладиш, що інструктує користувача стосовно уведення фіксованої дози хворому на рак. 33. Виріб за п. 32, в якому рак вибирається з групи, що складається з раку яєчника, перитонеального раку, раку фаллопієвої труби, метастатичного раку молочної залози (МВС), недрібноклітинної карциноми легень (NSCLC), раку простати, раку кишечнику. 34. Виріб за п. 32 або п. 33, в якому листівкавкладиш також інструктує користувача стосовно уведення фіксованої дози хворому на рак, у якого рак проявляє HER експресію, апмліфікацію або активацію. 35. Виріб за будь-яким з пунктів від 31 до 34, до складу якого входять дві ампули, у якому перша ампула містить фіксовану дозу приблизно 849 мг пертузумабу, а друга ампула містить фіксовану дозу приблизно 420 мг пертузумабу. 36. Виріб за будь-яким з пунктів від 31 до 34, до складу якого входять дві ампули, в якому перша ампула містить фіксовану дозу приблизно 1050 мг пертузумабу, а друга ампула містить фіксовану дозу приблизно 525 мг пертузумабу. Це є непопередня заявка, подана відповідно до 37 CFR 1.53(b), що заявляє про переваги відповідно до 35 USC § 119(е) попередньої заявки 60/645,697, що була подана 21 січня 2005 p., зміст якої включено до цього документу шляхом посилання. Даний винахід стосується фіксованого дозування антитіл до HER, таких як Пертузумаб. HER-рецептори та антитіла до них Родина HER рецептору тирозинкінази є важливим медіатором росту, диференціювання та довголіття клітин. Ця родина рецептору складається з чотирьох окремих членів, включаючи ре 5 цептори до епідермального фактору росту (EGFR, neu ErbB1, або HER1)), HER2 (ЕrbВ2 або р185 ), HER3 (ЕrbВ3) та HER4 (ЕrbВ4 або tyro2). EGFR, що кодується геном erbB1 є причиною злоякісних новоутворень у людини. Зокрема, зростання експресії EGFR спостерігається при раці грудей, сечового міхура, легень, голови, шиї та шлунка так само, як при гліобластомах. Зростання експресії EGFR-рецепторів часто асоціюється зі зростанням продукції EGFR-ліганд, що трансформують фактор росту альфа (TGF-α) через активацію рецепторів деяких пухлинних клітин шляхом аутокринної стимуляції. Baselga and Mendelsohn, Pharmac. Ther. 64:127-154 (1994). Моноклональні антитіла, що спрямовані проти EGFR або їх ліганд, TGF-α та EGF, були оцінені як терапевтичні агенти при лікуванні таких злоякісних новоутворень. Дивись, наприклад, вказані вище Baselga and Mendelsohn, Masui et al. Cancer Research 44:10021007 (1984); and Wu et al. J. Clin. Invest. 95:18971905 (1995). neu Другий член родини HER-рецепторів p185 був спершу ідентифікований як продукт трансформації гену через нейробластому у щурів після хіміотерапії. Активована форма neu протоонкогену виникає через точкову мутацію (заміна валіну на глутаматну кислоту) в трансмембранній області кодованого протеїну. Ампліфікація людського гомологу neu спостерігається при пухлинах грудей та яєчників та корелює з поганим прогнозом (Slamon et al., Science, 235:177-182 (1987); Slamon et al., Science, 244:707-712 (1989); та US Pat No. 4,968,603). На даний час немає даних щодо таких точкових мутацій, як при neu протоонкогені для пухлин у людей. Надекспресія HER2 (часто, але не постійно через ампліфікації гену) також спостерігається при інших карциномах, включаючи карциному шлунку, ендометрію, слинних залоз, легень, нирок, товстого кишечника, щитоподібної залози, підшлункової залози, сечового міхура. Дивись серед іншого, King et al., Science, 229:91 A (1985); Yokota et al., Lancet: 1:765-767 (1986); Fukushige et al., Моl Cell Вiol, 6:955-958 (1986); Guerine et al., Oncogene Res., 3:21-31 (1988); Cohen et al., Oncogene, 4:81-88 (1989); Yonemura et al., Cancer Res., 51:1034 (1991); Borst et al., Gynecol Oncol, 38:364 (1990); Weiner et al., Cancer Res., 50:421-425 (1990); Kern et al., Cancer Res., 50:5184 (1990); Park et al., Cancer Res., 49:6605 (1989); Zhau et al., Моl Carcinog., 3:254-257 (1990); Aasland et al. Br. J. Cancer 57:358-363 (1988); Williams et al., Pathobiology 59:46-52 (1991); та McCann et al., Cancer, 65:88-92 (1990). Надекспресія HER2 може спостерігатися при раці простати (Gu et al., Cancer Lett. 99:185-9 (1996); Ross et al., Hum. Pathol 28:827-33 (1997); Ross et al., Cancer 79:2162-70 (1997); та Sadasivan et al., J. Urol 150:126-31 (1993)). Були описані антитіла, що спрямовані проти neu щурячого р185 та людського HER2 білкових продуктів. Drebin та колеги створили антитіла проneu ти щурячого neu генного продукту р185 . Дивись, наприклад, доповідь Derebin et al., Cell 41:695706(1985); Myers et al., Meth. Enzym. 198:277290(1991); та WO94/22478. Drebin et al. Oncogene 94899 6 2:273-277 (1988), відповідно до якої суміші реактиneu ву антитіл з двома окремими ділянками р185 дає синергічний протипухлинний ефект на neuтрансформованих NIH-3T3 клітинах, імплантованих до "голої" миші. Дивись також U.S. Patent 5,824,311, виданий 20 жовтня 1998 р. Hudziak et al., Моl Cell. Biol. 9(3): 1165-1172 (1989) описують покоління ряду антитіл до HER2, які були охарактеризовані за допомогою клітин пухлини грудей лінії SK-BR-3. Проліферація клітин, споріднених до SK-BR-3 клітин, внаслідок впливу антитіл була визначена за допомогою фарбування кристалвіолетом моношарів після 72 годин. Використовуючи цей дослід, максимальне пригнічення було отримане з так званим антитілом 4D5, яке інгібує клітинну проліферацію на 56%. Інші антитіла ряду знизили клітинну проліферацію в цьому досліді в меншій мірі. Антитіло 4D5 також підвищує чутливість HER2-надекспресованого ряду клітин пухлини грудей до цитотоксичних ефектів TNF-α. Дивись також U.S. Patent No. 5,677,171, виданий 14 жовтня 1997 p. Антитіла до HER2, що розглядаються в Hudziak et al. Пізніше характеризуються в Fendly et al. Cancer Research 50:15501558 (1990); Kotts et al. In Vitro 26(3):59A (1990); Sarap et al. Growth Regulation 1:72-82 (1991); Shepard et al. J. Clin. Immunol. 11(3):117-127 (1991); Kumar et al. Моl. Cell. Biol. 11(2):979-986 (1991); Lewis et al. Cancer Immunol. Immunother. 37:255-263 (1993); Pietras et al. Oncogene 9:18291838 (1994); Vitetta et al. Cancer Research 54:53015309 (1994); Sliwkowski et al. J. Biol. Chem. 269(20): 14661-14665 (1994); Scott et al. J. Biol. Chem. 266:14300-5 (1991); D'souza et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 91:7202-7206 (1994); Lewis et al. Cancer Research 56:1457-1465 (1996); та Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394(1997). Рекомбінантна людська версія мишачого антитіла до HER2 4D5 (huMAb4D5-8, rhuMAb HER2, 7 Трастузумаб або ГЕРЦЕПТИН ; U.S. Patent No. 5,821,337) клінічно активна у пацієнтів з НЕR2надекспресованими метастатичними раками грудей, які попередньо отримували масовану протиракову терапію (Baselga et al., J. Clin. Oncol. 14:131-144 (1996)). Трастузумаб отримав дозвіл від Адміністрації з контролю за продуктами харчування та ліками 25 вересня 1998р. для лікування пацієнтів з метастатичним раком грудей, чиї пухлини надекспресують HER2-протеїн. Інші антитіла до HER2 з різноманітними якостями були описані в Tagliabue et al. Int. J. Cancer 47:933-937 (1991); McKenzie et al. Oncogene 4:543548 (1989); Maier et al. Cancer Res. 51:5361-5369 (1991); Bacus et al. Molecular Carcinogenesis 3:350362 (1990); Stancovski et al. PNAS (USA) 88:86918695 (1991); Bacus et al. Cancer Research 52:25802589 (1992); Xu et al. Int. J. Cancer 53:401-408 (1993); WO94/00136; Kasprzyk et al. Cancer Research 52:2771-2776 (1992); Hancock et al. Cancer Res. 51:4575-4580 (1991); Shawver et al. Cancer Res. 54:1367-1373 (1994); Arteaga et al. Cancer Res. 54:3758-3765 (1994);Harwerth et al. J. Biol. Chem. 267:15160-15167 (1992); U.S. Patent No. 5,783,186 та Klappereia/. Oncogene 14:20992109(1997). 7 Гомологічний скринінг дав результат в ідентифікації двох інших членів родини HER-рецепторів; НЕR3 (US Pat. Nos. 5,183,884 та 5,480,968, а також Kraus et al., PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989)) та HER4 (ЕР Pat Appln No 599,274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993); та Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993)). Обидва ці рецептори показують зростання експресії принаймні деяких рядів клітин раку грудей. HER-рецептори зазвичай знаходять в клітинах в різних комбінаціях та вважається, що гетеродимеризація збільшує різноманітність клітинної відповіді до багатоманітності HER-ліганд (Earp et al. Breast Cancer Research and Treatment 35: 115-132 (1995)). EGFR пов'язаний з шістьма різними лігандами: епідермальним фактором росту (EGF), трансформуючим фактором росту альфа (TGF-α), амфірегуліном, гепаринзв'язуючим епідермальним фактором росту (HB-EGF), бетацелюліном та епірегуліном (Groenen et al. Growth Factors 11:235257 (1994)). Родина протеїнів херегулінів - результат альтернативного сплайсінгу одинарного гену лігандами HER3 та HER4. Родина херегулінів включає в себе альфа-, бета- та гамма-херегуліни (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); U.S. Patent No. 5,641,869; та Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394 (1997)); фактори neu диференціації (NDFs), гліальні фактори росту (GGFs); ацетилхоліновий рецептор, що індукує активність (ARIA); та фактор розгалуження чутливого і моторного нейронів (SMDF). Дивись Groenen et al. Growth Factors 11:235-257 (1994); Lemke, G. Molec. & Cell. Neurosci. 7:247-262 (1996) та Lee et al. Pharm. Rev. 47:51-85 (1995). Нещодавно були ідентифіковані три додаткові HER-ліганди; неурегулін-2 (NRG-2), який згідно доповідей, зв'язує будь-який HER3 або HER4 (Chang et al. Nature 387:509-512 (1997); та Carraway et al. Nature 387:512-516 (1997)); неурегулін-3, який зв'язує HER4 (Zhang et al. PNAS (USA) 94(18):9562-7 (1997)); та неурегулін-4, який зв'язує HER4 (Harari et al. Oncogene 18:268189(1999)) HB-EGF, бетацелюлін та епірегулін також зв'язують HER4. Хоча EGF та TGFα не зв'язують HER2, EGF стимулює EGFR та HER2 до формування гетеродимеру, який активує EGFR та призводить до трансфосфориляції HER2 у гетеродимер. Димеризація та/або трансфосфориляція з'являються для активації HER2 тирозинкінази. Дивись Еагр et al., вище. Так само, коли HER3 коекспресує з HER2, формується активний сигнальний комплекс та антитіла, спрямовані проти HER2, які можуть зруйнувати цей комплекс (Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994)). До того ж, спорідненість HER3 до херегуліну (HRG) зростає при коекспресії з HER2. Дивись також Levi et al., Journal of Neuroscience 15: 1329-1340 (1995); Morrissey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1431-1435 (1995) та Lewis et al., Cancer Res., 56:1457-1465 (1996) щодо HER2-HER3 білкового комплексу. HER4, подібно до HER3, формує активний сигнальний комплекс з HER2 (Carraway та Cantley, Cell 78:5-8 (1994)). Патентні публікації щодо антитіл до HER включають: US 5,677,171, US 5,720,937, US 5,720,954, US 5,725,856, US 5,770,195, US 94899 8 5,772,997, US 6,165,464, US 6,387,371, US 6,399,063, US2002/019221 1A1, US 6,015,567, US 6,333,169, US 4,968,603, US 5,821,337, US 6,054,297, US 6,407,213, US 6,719,971, US 6,800,738, US2004/0236078A1, US 5,648,237, US 6,267,958, US 6,685,940, US 6,821,515, WO98/17797, US 6,127,526, US 6,333,398, US 6,797,814, US 6,339,142, US 6,417,335, US 6,489,447, WO 99/31140, US 2003/0147884A1, US 2003/0170234A1, US 2005/0002928A1, US 6,573,043, US 2003/0152987A1, WO 99/48527, US 2002/0141993A1, WO 01/00245, US 2003/0086924, US 2004/0013667A1, WO 00/69460, WO 01/00238, WO 01/15730, US 6,627,196B1, US 6,632,979B1, WO 01/00244, US 2002/0090662A1, WO 01/89566, US 2002/0064785, US 2003/0134344, WO 04/24866, US 2004/0082047, US 2003/0175845A1, WO 03/087131, US 2003/0228663, WO 2004/008099A2, US 2004/0106161, WO 2004/048525,US 2004/0258685A1,US 5,985,553, US 5,747,261, US 4,935,341, US 5,401,638, US 5,604,107, WO 87/07646, WO 89/10412, WO 91/05264, EP 412,116 B1, EP 494,135 B1, US 5,824,311, EP 444,181 B1, EP 1,006,194 A2, US 2002/0155527A1, WO 91/02062, US 5,571,894, US 5,939,531, EP 502,812 B1, WO 93/03741, EP 554,441 B1, EP 656,367 A1, US 5,288,477, US 5,514,554, US 5,587,458, WO 93/12220, WO 93/16185, US 5,877,305, WO 93/21319, WO 93/21232, US 5,856,089, WO 94/22478, US 5,910,486, US 6,028,059, WO 96/07321, US 5,804,396, US 5,846,749, EP 711,565, WO 96/16673, US 5,783,404, US 5,977,322, US 6,512,097, WO 97/00271, US 6,270,765, US 6,395,272, US 5,837,243, WO 96/40789, US 5,783,186, US 6,458,356, WO 97/20858, WO 97/38731, US 6,214,388, US 5,925,519, WO 98/02463, US 5,922,845, WO 98/18489, WO 98/33914, US 5,994,071, WO 98/45479, US 6,358,682 B1, US 2003/0059790, WO 99/55367, WO 01/20033, US 2002/0076695 A1, WO 00/78347, WO 01/09187, WO 01/21192, WO 01/32155, WO 01/53354, WO 01/56604, WO 01/76630, WO02/05791, WO 02/11677, US 6,582,919, US2002/0192652A1, US 2003/0211530A1, WO 02/44413, US 2002/0142328, US 6,602,670 B2, WO 02/45653, WO 02/055106, US 2003/0152572, US 2003/0165840, WO 02/087619, WO 03/006509, WO03/012072, WO 03/028638, US 2003/0068318, WO 03/041736, EP 1,357,132, US 2003/0202973, US 2004/0138160, US 5,705,157, US 6,123,939, EP 616,812 B1, US 2003/0103973, US 2003/0108545, US 6,403,630 B1, WO 00/61145, WO 00/61185, US 6,333,348 B1, WO 01/05425, WO 01/64246, US 2003/0022918, US 2002/0051785 A1, US 6,767,541, WO 01/76586, US 2003/0144252, WO 01/87336, US 2002/0031515 A1, WO 01/87334, WO 02/05791, WO 02/09754, US 2003/0157097, US 2002/0076408, WO 02/055106, WO 02/070008, WO 02/089842 та WO 03/86467. Діагностика Пацієнти, до яких застосовувалося антитіло до HER2 трастузумаб, були відібрані для лікування на основі НЕК2-надекспресії/ампліфікації. Дивись, наприклад, WO99/31140 (Paton et al.), US2003/0170234A1 (Hellmann, S.), та 9 US2003/0147884 (Paton et al.,) та WO O1/89566, US 2002/0064785, та US 2003/0134344 (Mass et al.). Дивись також US 2003/0152987, Cohen et al., щодо використання імуногістохімічної (ІНС) та флуоресцентної гібридізації in situ (FISH) для визначення НЕR2-надекспресії та ампліфікації. WO 2004/053497 (Bacus et al.) стосується визначення або передрікання відповіді на терапію 7 ГЕРЦЕПТИН . US2004/013297A1 (Bacus et al.) стосується визначення або передрікання відповіді на терапію АВХ0303 EGFR-антитілами. WO2004/000094 (Bacus et al.) - щодо визначення відповіді до GW572016, маленької молекули, EGFR-HER2-інгібітора тирозинкінази. WO2004/063709, Amler et al., стосується біомаркерів та способів визначення чутливості до інгібітора EGFR, еротініба НСI. US 2004/0209290, Cobleigh et al., - щодо маркерів генної експресії для визначення прогнозу раку грудей. Пацієнти, що лікуються Пертузумабом можуть бути відібрані для терапії на основі HER-активації або димеризації. Патентні публікації щодо Пертузумабу та відбору пацієнтів для лікування ним включають: WO 01/00245 (Adams et al.); US 2003/0086924 (Sliwkowski, Μ.); US 2004/0013667A1 (Sliwkowski, Μ.), WO 2004/008099A2 та і US 2004/0106161 (Bossenmaier et al.). Cronin et al., Am. J. Path. 164(1): 35-42 (2004) описують вимірювання генної експресії архівних парафінованих тканин. Ma et al. Cancer Cell 5:607616 (2004) описує профілювання гену в олігонуклеотидній послідовності, за допомогою ізольованої РНК з секцій пухлинної тканини, які бралися з архівних первинних біопсій. Дозування протипухлинних ліків та антитіл до HER Статті, що описують дозування протипухлинних препаратів, включають: Egorin, Μ. J Clin Oncol 2003; 21:182-3 (2003); Baker et al. J Natl Cancer Inst 94:1883-8 (2002); Felici et al. Eur J Cancer 38:167784 (2002); Loos et al. Clin. Cancer Res. 6:2685-9 (2000); de Jongh et al. J. Clin Oncol. 19:3733-9 (2001); Mathijssen et al. J. Clin Oncol. 20:81-7 (2002) та de Jong et al. Clin Cancer Res 10:4068-71 (2004). Зазвичай доза доступних для придбання людських моноклональних антитіл IgG (Трастузумаб та Бевацізумаб, Genentech Inc., South San Francisco, та Гемтузумабу Озогоміцин, Wyeth Pharmaceuticals, Philadelphia), та цитотоксичних дрібномолекулярних ліків в онкології визначається у розрахунку на одиницю ваги пацієнта (мг/кг) або одиницю площі поверхні його тіла (ППТ). Цетуксімаб (ERBITUX®) - це антитіло, що зв'язує EGF рецептор та є випробуваним для лікування колоректального раку. При колоректальному 2 раці Цетуксімаб призначається у дозі 400 мг/м внутрішньовенно крапельно протягом двох годин у вигляді ударної дози. Після цього підтримуюча 2 доза 250 мг/м вводиться протягом 1 години один раз на тиждень. Дивись інструкцію до Цетуксімабу. Трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН®) призначається пацієнтам з метастатичним раком грудей: 4мг/кг ударна доза, з наступними - 2мг/кг на тиждень. Дивись інструкцію до Трастузумабу. 94899 10 Дивись також WO 99/31140; US 2003/0147884A1; US 2003/0170234A1; US 2005/0002928A1; WO 00/69460; WO 01/15730 та US 6,627,196B1 щодо дозування Трастузумабу. Пертузумаб (також відомий як рекомбінантні людські моноклональні антитіла 2С4; OMNITARG™, Genentech,Inc, South San Francisco) є першим в новому класі агентів, відомих як інгібітори HER-димеризації (HDI), він інгібує можливість HER2 формувати активні димери з іншими HERрецепторами (такими як EGFR/HER1, HER3 і HER4) та не залежить від рівня експресії HER2. Дивись, наприклад, Наrаrі and Yarden Oncogene 19:6102-14 (2000); Yarden and Sliwkowski. Nat Rev Моl Cell Biol 2:127-37 (2001); Sliwkowski Nat Struct Biol 10:158-9 (2003); Cho et al. Nature 421:756-60 (2003) та Malik et al. Pro Am Soc Cancer Res 44:176-7 (2003). Блокування Пертузумабом формування HER2HER3-гетеро димерів в пухлинних клітинах було продемонстроване в пригніченні критичної сигналізації клітин, що проявляється у зменшенні пухлинної проліферації та часу її виживання (Agus et al. Cancer Cell 2:127-37 (2002)). Пертузумаб пройшов випробування як окремий агент в Іа фазі клінічного випробування у пацієнтів з поширеним раком та II фазу у пацієнтів з раком яєчників, раком грудей, легень та простати. У І фазі дослідження пацієнтам з невиліковними, місцевопоширеними, повторними або метастатичними солідними пухлинами, що прогресували протягом або після стандартної терапії вводили Пертузумаб внутрішньовенно кожні 3 тижні. В цілому Пертузумаб переноситься пацієнтами добре. Регресія пухлини, яку можна було прийняти за достовірну, була досягнута у 3 з 20 пацієнтів. У двох пацієнтів була підтверджена часткова відповідь. Стабілізація хвороби, що тривала понад 2,5 місяці спостерігалась у 6 з 21 пацієнтів (Agus et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22:192 (2003)). У дозі 2.0-15 мг/кг, фармакокінетика Пертузумабу була лінійною з середнім кліренсом 2,69-3,74 мл/добу/кг та середнім кінцевим напіввиведенням протягом 15,3 27,6 днів. Антитіла до Пертузумабу не були виявлені (Allison et al. Pro Am Soc Clin Oncol 22:197 (2003)). У І фазі дослідження Пертузумаб дозувався у розрахунку на одиницю ваги тіла (мг/кг). II фаза була розпочата, використовуючи фіксовану дозу. Цей винахід забезпечує першу критичну оцінку впливу і ефективності фіксованого дозування гуманізованого моноклонального антитіла IgGl щодо фармакокінетики та цільової концентрації ліків. Первинними цілями аналізу антитіла до HER Пертузумабу були: 1) оцінити популяційну фармакокінетику та прогностичні випадкові перемінні для антитіла до HER Пертузумаб у пацієнтів, хворих на рак, та 2) вивчити варіабельність стаціонарних найнижчих концентрацій у сироватці після фіксованого, на одиницю ваги тіла або на одиницю площі поверхні тіла (ППТ) способів дозування. Відповідно, з одного боку, винахід передбачає спосіб лікування хворих на рак, що включає призначення однієї або більше фіксованих доз антитіла 11 до HER людині-пацієнту у кількості, що є ефективною для лікування раку. З іншого боку, винахід передбачає спосіб лікування пацієнтів, хворих на рак, що включає призначення принаймні однієї фіксованої дози Пертузумабу людині-пацієнту, де фіксована доза обирається в групі, що складається з приблизно 420мг, приблизно 525мг, приблизно 840мг та приблизно 1050мг Пертузумабу. Винахід також стосується виробу, який включає ампулу з фіксованою дозою антитіла до HER, при чому фіксована доза обирається з групи, що складається з приблизно 420мг, приблизно 525мг, приблизно 840мг та приблизно 1050мг антитіла до HER. Фігура 1 показує схематичну структуру HER2протеїну та амінокислотну послідовність для Доменів Ι-ΓΥ (SEQ ID Nos. 19-22, відповідно) його екстрацелюлярного домену. Фігури 2А та 2В зображують вирівнювання амінокислотних послідовностей легких варіабельних (VL) (Фіг. 2A) та важких варіабельних (VH) (Фіг. 2B) доменів мишачих моноклональних антитіл 2С4 (SEQ ID №№ 1 та 2, відповідно); VL та VH доменів людської 2С4 версії 574 (SEQ ID №№ 3 та 4, відповідно), та людські VL та VH узагальнюючі структури (hum κ1, легка каппа підгрупа І; humlll, важка підгрупа III) (SEQ ID №№ 5 та 6, відповідно). Зірочкою позначено різницю між людською 2С4 версією 574 та мишачим моноклональним антитілом 2С4 або між гуманізованою 2С4 версією 574 і гуманізованою структурою. Області, що визначають комплементарність (CDRs) вказані у квадратних дужках. Фігури 3А та 3В показують амінокислотну послідовність легкого та важкого ланцюгів Пертузумабу (SEQ ID №№ 13 та 14, відповідно). CDRs виділені жирним шрифтом. Підраховані молекулярні маси легкого та важкого ланцюгів становлять 23,526.22 Da та 49,216.56 Da (цистеїн у відновленій формі). Вуглеводна частина приєднана до важкого ланцюга Asn 299 . Фігура 4 схематично зображує приєднання 2С4 в сайті гетеродимерного з'єднання HER2, таким чином попереджуючи гетеродимеризацію з активованими EGFR або НЕR3. Фігура 5 зображує зв’язок HER2/HER3 з сигнальними шляхами МАРК та Akt. На Фігурі 6 порівнюються різні активності Трастузумабу та Пертузумабу. Фігури 7А та 7В показують амінокислотну послідовність легкого ланцюга Трастузумабу (Фіг. 7А; SEQ ID No. 15) та тяжкого ланцюга (Фіг. 7В; SEQ ID No. 16), відповідно. Фігури 8А та 8В зображують варіант послідовності легкого ланцюга Пертузумабу (Фіг 8A; SEQ ID No. 17) та варіант послідовності важкого ланцюга Пертузумабу (Фіг 8В; SEQ ID No. 18) відповідно. Фігури 9А та 9В відображують профілі окремого об'єкту ФК даних, що відповідають одно- (Фіг 9А) або двох- (Фіг 9В) компартментальним моделям. Відкриті кола вказують концентрацію, що спостерігається. Суцільна та пунктирна лінії вказують на прогнозовану популяційну та прогнозовану індивідуальну концентрації відповідно. 94899 12 Фігури 10А та 10В представляють схеми моделей діагностики. Фігура 10А зображує криву прогнозованих концентрацій Пертузумабу. Суцільна лінія - лінія з'єднання. Фігура 10В зображує криву зважених залишків прогнозованих концентрацій Пертузумабу. Пунктирна лінія є LOESSвирівнюванням даних. Фігури 11А та 1 1В зображують довільний ефект (η) для кліренсу (CL) за вагою (WT) та об'ємом в центральному компартаменті (Vc) за площею поверхні тіла (ППТ) для базової моделі (Фіг 11 А) та кінцевої моделі (Фіг 11В). Фігури 12A-F показують моделі оцінювання кінцевої популяційної фармакокінетики Пертузумабу, використовуючи наступну модель перевірки. Наступне прогнозоване розподілення та оцінка, th для статистичного аналізу: Фіг. 12А -2.5 ; Фіг. 12В th th th th - 5 ; Фіг. 12С - 50 , Фіг. 12D - 90 , Фіг. 12Е - 95 , th Фіг. 12F - 97.5 . Вертикальна лінія на кожній гістограмі представляє статистичну оцінку. Фігура 13 ілюструє прогнозовану стаціонарну найнижчу концентрацію Пертузумабу (84-й день) після фіксованого, на одиницю ваги (WT) тіла або на одиницю площі поверхні тіла способів дозування для 1000 модельованих об'єктів з покращеними, в порівнянні з оригінальною фармакокінетикою (ФК), даними відповідно до кінцевої моделі. Фігури НА та 14В показують прогнозовану стаціонарну найнижчу концентрацію Пертузумабу (84й день) після фіксованого, на одиницю ваги (WT) тіла або на одиницю площі поверхні тіла (ППТ) th дозування для популяцій пацієнтів з ≤ 10 (50.4 кг) th (Фіг. 14А) або ≥ 90 (88.5 кг) (Фіг. 14В) WT величиною. Визначення "Фіксована" або "однорідна" доза терапевтичного агенту означає дозу, що призначається людині-пацієнту, незважаючи на його вагу (WT) або площу поверхні тіла (ППТ). Через це фіксована 2 або однорідна доза вказується не в мг/кг або мг/м , а в абсолютній кількості терапевтичного агенту. "Ударна" доза, зазвичай, включає початкову дозу терапевтичного агента, яка призначається пацієнту, та наступну одну або більше підтримуючі дози. Взагалі, призначається одна ударна доза, але при цьому розглядається можливість багаторазового призначення ударної дози. Зазвичай величина призначеної ударної дози (доз) перевищує величину підтримуючої дози (доз) та/або ударна доза призначається більш часто, ніж підтримуюча для більш швидкого досягнення бажаної стаціонарної концентрації терапевтичного агенту. "Підтримуюча доза" означає в цьому документі призначення однієї або більше доз терапевтичного агента пацієнту протягом всього терміну лікування. Зазвичай підтримуючі дози призначаються у певні терапевтичні інтервали, наприклад, приблизно кожний тиждень, кожні два, три або чотири тижні. "HER-рецептор" - білковий рецептор тирозинкінази, що належать до родини HER-рецепторів і включають EGFR-, HER2-, HER3- та HER4рецептори. HER-рецептор загалом включає екстрацелюлярний домен, який може зв'язатися з HER-лігандою та/або димеризувати з молекулою іншого HER-рецептору; ліпофільним трансмемб 13 ранним доменом; збереженим інтрацелюлярним тирозинкіназним доменом та кінцевим сигнальним карбоксильним доменом, приховуючи кілька тирозинових залишків, які можуть бути фосфорильовані. HER-рецептор може бути нативною послідовністю HER-рецептора або варіантом амінокислотної послідовності. Переважно HER-рецептор - нативна послідовність людського HER-рецептору. Терміни "ErbBl" та "HER1", "рецептори до епідермального фактору росту" та "EGFR" є взаємозамінними і означають EGFR, як описано, наприклад, у Carpenter et al. Ann. Rev. Biochem. 56:881914 (1987), включаючи мутантні форми, які зустрічаються у природі (e.g., делеція мутантного EGFR як у Humphrey et al. PNAS (USA) 87:4207-4211 (1990)). erbB1 передбачає генне кодування продукції EGFR-білка. Вирази "ErbB2" та "HER2" використовується взаємозамінно та означають людський HER2npoTem, описаний, наприклад, у Semba et al., PNAS (USA) 82:6497-6501 (1985) та Yamamoto et al. Nature 319:230-234 (1986) (Номер доступу у Банку генів Х03363). Термін "erbBl" передбачає генне кодування людського ЕrbВ2 та "neu" передneu бачає генне кодування щурячого p185 . Переважно HER2 - це нативна послідовність людського HER2. Екстрацелюлярний домен HER2 включає в себе чотири домени: "Domain I" (амінокислотні залишки приблизно з 1-195; SEQ ID NO:19), "Domain ll" (амінокислотні залишки приблизно з 196-319; SEQ ID NO:20), "Domain III" (амінокислотні залишки приблизно з 320-488: SEQ ID NO:21), та "Domain IV" (амінокислотні залишки приблизно з 489-630; SEQ ID NO:22) (залишки нумеруються без сигнального пептиду). Дивись Garrett et al. Моl. Cell. 11: 495-505 (2003), Cho et al. Nature 421: 756760 (2003), Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004) та Plowman et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 90:1746-1750 (1993), а також Фіг. 1. "ЕrbВ3" та "HER3" означають поліпептидні рецептори, як описано, наприклад, у US Pat. №№ 5,183,884 та 5,480,968, а також у Kraus et al. PNAS (USA) 86:9193-9197 (1989). Терміни "ErbB4" та "HER4" означають поліпептидні рецептори, як описано, наприклад, у ЕР Pat Appln No 599,274; Plowman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:1746-1750 (1993) та Plowman et al., Nature, 366:473-475 (1993), включаючи ізоформи, наприклад, як розкрито у WO 99/19488, опублікованому 22 квітня 1999р. Під "HER-лігандою" розуміється поліпептид, що зв'язується та/або активує HER-рецептор. HER-ліганда, що розглядається тут, - це нативна послідовність людської HER-ліганди, а саме епідермальний фактор росту (EGF) (Savage et al., J. Biol. Chem. 247:7612-7621 (1972)); трансформуючий фактор росту альфа (TGF-α) (Marquardt et al., Science 223:1079-1082 (1984)); амфірегулін, також відомий як шванома або кератиноцитаутокриновий фактор росту (Shoyab et al. Science 243:1074-1076 (1989); Kimura et al. Nature 348:257260 (1990); and Cook et al. Моl. Cell. Biol. 11:25472557 (1991)); бетацелюлін (Shing et al., Science 259:1604-1607 (1993); та Sasada et al. Biochem. 94899 14 Biophys. Res. Commun. 190:1173 (1993)); гепаринзв'язуючий фактор росту (HB-EGF) (Higashiyama et al., Science 251:936-939 (1991)); епірегулін (Toyoda et al., J. Biol. Chem. 270:7495-7500 (1995); та Komurasaki et al. Oncogene 15:2841-2848 (1997)); херегулін (див. нижче); неурегулін-2 (NRG-2) (Carraway et al., Nature 387:512-516 (1997)); неурегулін-3 (NRG-3) (Zhang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:9562-9567 (1997)); неурегулін-4 (NRG-4) (Harari et al. Oncogene 18:2681-89 (1999)); та кріпто (CR-1) (Kaman et al. J. Biol Chem. 272(6):3330-3335 (1997)). HER-ліганди, які зв'язують EGFR, включають EGF, TGF-α, амфірегулін, бетацелюлін, HBEGF та епірегулін. HER-ліганди, які зв'язують HER3, включають херегуліни. HER-ліганди, що здатні зв'язувати HER4, включають бетацелюлін, епірегулін, HB-EGF, NRG-2, NRG-3, NRG-4 та херегулін. Коли використовується термін "херегулін" (HRG), мається на увазі поліпептид, продукція якого кодується геном, як це описано у U.S. Patent No. 5,641,869 або Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993). Зразки херегулінів включають херегулін-α, херегулін-β1, херегулін-β2 та херегулін-β3 (Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); and U.S. Patent No. 5,641,869); neu фактор диференціювання (NDF) (Peles et al. Cell 69: 205-216 (1992)); рецептор, що індукує активність ацетилхоліну (ARIA) (Falls et al. Cell 72:801-815 (1993)); гліальний фактор росту (GGFs) (Marchionni et al., Nature, 362:312-318 (1993)); фактор розгалуження чутливого і моторного нейронів (SMDF) (Но et al. J. Biol. Chem. 270:14523-14532 (1995)); -херегулін (Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394(1997)). "HER-димер" - це нековалентно асоційований димер, що включає в себе принаймні два HERрецептори. Такі комплекси можуть формуватися, коли клітина, що експресує два або більше HERрецептори, піддається впливу HER-ліганд та може виділятися методом імунопреципетації і аналізуватися за допомогою SDS-PAGE, як це описано, наприклад, у Sliwkowski et al., J. Biol. Chem., 269(20): 14661-14665 (1994). Приклади таких HERдимерів включають EGFR-HER2, HER2-HER3 та HER3-HER4 гетеродимери. Крім того, HER-димер може включати в себе два або більше HER2рецептори, комбіновані з різними HERрецепторами, такими як HER3, HER4 або EGFR. Інші протеши, такі як субодиниця цитокінового рецептору (наприклад, gpl30) можуть асоціюватися з димером. "HER-інгібітор" - це агент, який впливає на активацію або функціонування HER. Приклади HERінгібіторів включають антитіла до HER (наприклад, EGFR, HER2, HER3 або HER4 антитіла); ліки спрямовані на EGFR; дрібномолекулярні HERантагоністи; HER-інгібітори тирозинкінази; HER2 та EGFR подвійні інгібітори тирозинкінази, такі як лапатініб/GW572016; антисенсові молекули (див., наприклад, WO 2004/87207); та/або агенти, які зв'язують або впливають на функцію наступних сигнальних молекул, таких як МАРК або Akt (див. Фіг. 5). Переважно, HER-інгібітор - це антитіло або дрібна молекула, яка зв'язується з HERрецептором. 15 "Антитіло до HER" - це антитіло, яке зв'язується з HER-рецептором. Іноді антитіло до HER підтримує активацію або функціонування HERрецептора. Антитіло до HER переважно зв'язується з HER2-рецептором. Антитіло до HER2, про яке йдеться в цьому документі, - це Пертузумаб. Інший приклад антитіла до HER2 - Трастузумаб. Приклади EGFR-антитіл включають Цетуксімаб та АВХ0303. "Активація HER" означає активацію або фосфориляцію будь-якого з HER-рецепторів. Взагалі, активація HER проявляється у сигнальній трансдукції (наприклад, що спричиняється інтрацелюлярним кіназним доменом HER-рецептора, що сприяє фосфорилюванню тирозинових залишків у HERрецепторі або субстратному поліпептиді). Активація HER може спричинятися зв'язуванням HERліганди з HER-димером, що включає в себе потрібний HER-рецептор. Зв'язування HER-ліганди з HER-димером може активувати кіназний домен одного або більше HER-рецепторів у димері і таким чином проявитися у фосфорилюванні тирозинових залишків в одному або більше HERрецепторах та/або фосфорилюванні тирозинових залишків у додатковому субстратному поліпептиді (поліпептидах), такому як Akt або МАРК інтрацелюлярна кіназа. Див., наприклад, Фіг. 5. "Фосфорилюванням" називається приєднання однієї або більше фосфатних груп до білка, такого як HER-рецептор або його субстрату. Антитілом, яке "інгібує димеризацію HER", називається антитіло, яке інгібує або впливає на формування HER-димеру. Переважно таке антитіло зв'язується з HER2 в його гетеродимерному сайті. Антитіло, що найкраще інгібує димеризацію - це Пертузумаб або МАb 2С4. Зв'язування 2С4 з гетеродимерним сайтом з'єднання HER2 проілюстроване на Фіг. 4. Інші приклади антитіл, що інгібують димеризацію HER, включають в себе антитіла, які зв'язуються з EGFR і таким чином інгібують його димеризацію з одним або кількома іншими HERрецепторами (наприклад, моноклональні антитіла EGFR 806, МАb 806, які зв'язуються з активованим або вивільненим EGFR; див. Johns et al., J. Вiol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)); антитіла, які зв'язуються з HER3 і таким чином інгібують димеризацію з одним або кількомаг HER-рецепторами, та антитіла, які зв'язуються з HER4 і таким чином інгібують його димеризацію з одним або кількомаг HER-рецепторами. Антитіло, яке "інгібує димеризацію ефективніше за Трастузумаб", це антитіло, яке знижує або усуває HER-димери більш ефективно (наприклад, принаймні в два рази ефективніше), ніж Трастузумаб. Переважно таке антитіло інгібує димеризацію HER2 принаймні так само ефективно як антитіло, відібране з групи, що складається з мишачого моноклонального антитіла 2С4, Fab-фрагменту мишачого моноклонального антитіла 2С4, Пертузумабу і Fab-фрагменту Пертузумабу. Інгібування димеризації HER може оцінюватися за допомогою прямого вивчення HER-димерів або за оцінкою активації HER, або наступної сигналізації, що виникає внаслідок HER-димеризації, та/або за оцінкою зв'язувальних сайтів HER2-антитіло тощо. 94899 16 Досліди для скринінгу антитіл зі здатністю інгібувати димеризацію HER більш ефективно, ніж Трастузумаб, описані в Agus et al. Cancer Cell 2:121-131 (2002) та WO 01/00245 (Adams et al.). Лише як приклад, можна дослідити інгібіцію димеризації HER, оцінивши, наприклад, інгібіцію формування HERдимеру (див., наприклад, Фіг. 1A-B of Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002) та WO 01/00245); зменшення активації HER-ліганд клітин, які експресують HER-димери (наприклад, WO 01/00245 та Фіг. 2A-B of Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)); блокування HER-лігандами зв'язування з клітинами, які експресують HER-димери (наприклад, WO01/00245, та Фіг. 2E of Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)); пригнічення росту пухлинних клітин (наприклад, MCF7, MDA-MD-134, ZR-751, MD-МВ-175, T-47D клітин), які експресують HERдимери у присутності (або відсутності) HER-ліганд (наприклад, WO 01/00245 та Figs. 3A-D of Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)); інгібують наступне сигналізування (наприклад, пригнічення HRGзалежної АКТ-фосфориляції або інгібування HRGабо TGFct- залежної МАРК фосфориляції) (див., наприклад, WO 01/00245, та Фіг. 2C-D of Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002)). Також антитільне пригнічення HER-димеризації можна оцінити, вивчаючи, наприклад, з'єднувальний сайт HER2антитіла, через оцінювання такої структури або моделі, як кристалоїдна структура зв'язку між антитілом і HER2 (Див., наприклад, Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)). "Гетеродимерний з'єднувальний сайт" на HER2 означає ділянку в екстрацелюлярному домені HER2, що поєднується або роз'єднується з екстрацелюлярним доменом EGFR, HER3 або HER4, формуючи тим самим димер. Ця ділянка знаходиться у Домені II у HER2. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004). HER2-антитіла можуть "інгібувати HRGзалежну АКТ фосфориляцію" та/або пригнічувати "HRG- або TGFα-залежну МАРК фосфориляцію" більш ефективно (наприклад, принаймні у два рази ефективніше), ніж Трастузумаб (див., наприклад, Agus et al. Cancer Cell 2: 127-137 (2002) та WO01/00245). Антитіло до HER2 може "не пригнічувати ектодоменне ділення HER2" (Molina et al. Cancer Res. 61:4744-4749(2001)). Антитіло до HER2, що "з'єднується з гетеродимерним з'єднувальним сайтом" на HER2, приєднується до залишків у домені II (та іноді також приєднується до залишків в інших екстрацелюлярних доменах HER2, таких як домени І та III), і може заважати, принаймні в певній мірі, формуванню HER2-EGFR, HER2-HER3, або HER2-HER4 гетеродимерів. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004) характеризує кристалічну структуру HER2Пертузумабу, що зберігається з RCSB Protein Data Bank (ID Code IS78), ілюструє зразкове антитіло, яке з'єднується з гетеродимерним з'єднувальним сайтом на HER2. Антитіло, що "приєднується до домену ll" HER2, приєднується до залишків у домені II та іноді залишків в іншому домені (доменах) HER2, таких як домени І та III. Переважно, антитіло, яке 17 приєднується до домену II, приєднується до з'єднання між доменами І, II та III HER2. Поліпептид з "нативною послідовністю" - це поліпептид, який має таку саму амінокислотну послідовність, як і природний поліпептид (наприклад, HER-рецептор або HER-ліганда). Такі поліпептиди з нативною послідовністю можуть бути взяті з природи або можуть бути синтезовані чи вироблені шляхом рекомбінації. Тому поліпептид з нативною послідовністю може мати амінокислотну послідовність природного людського поліпептиду, мишачого поліпептиду або поліпептиду будь-якого виду ссавців. Термін "антитіло" тут використовується у найширшому значенні та враховує інтактні моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, поліспецифічні антитіла (наприклад, біспецифічні антитіла), сформовані з принаймні з двох інтактних антитіл та антитільних фрагментів поки вони проявляють бажану біологічну активність. Термін "моноклональні антитіла" використовується для позначення популяції гомогенних антитіл, тобто індивідуальних антитіл, що включають ідентичну популяцію та/або зв'язують той самий епітоп(и), окрім можливих варіантів, які можуть виникати під час продукції моноклонального антитіла, але такі варіанти в цілому зустрічаються у невеликій кількості. Таке моноклональне антитіло, зазвичай, включає антитіло з поліпептидною послідовністю, яка зв'язує ціль, при цьому цільзв'язуюча поліпептидна послідовність отримується через процес, що включає відбір однієї цільзв'язуючої послідовності з множини поліпептидних послідовностей. Наприклад, процес відбору може бути відбором унікального клону з множини клонів, такої як пул гібридних клонів, фагових клонів або клонів з рекомбінантною ДНК. Під цим розуміється, що відібрана ціль-зв'язуюча послідовність, може бути додатково змінена, наприклад, для того, щоб покращити спорідненість до цілі, для гуманізації ціль-зв'язуючої послідовності, для покращення її продукції в культурі клітин, зменшення імуногенності in vivo, для створення поліспецифічних антитіл тощо, при цьому антитіло, що включає в себе змінену ціль-зв'язуючу послідовність, також є моноклональним антитілом цього винаходу. На відміну від препаратів поліклональних антитіл, які включають різні антитіла, спрямовані проти різних детермінант (епітопів), кожне моноклональне антитіло з препарату моноклональних антитіл, спрямоване проти окремої детермінанти на антигені. Крім їхньої специфічності, препарати моноклональних антитіл мають перевагу перед іншими імуноглобулінами у їхній типоспецифічності. Ознака "моноклональний" вказує на те, що антитіло було отримане з гомогенної популяції антитіл, і не повинна тлумачитися як така, що вимагає виготовлення антитіла якимось специфічним способом. Наприклад, моноклональні антитіла, що можуть використовуватися відповідно до даного винаходу, можуть бути вироблені за допомогою різноманітних технологій, включаючи, наприклад, метод гібридоми (наприклад, Kohler et al., Nature, 256:495 (1975); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd 94899 18 ed. 1988); Hammerling et al., в: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)), рекомбінантні ДНК методики (див., наприклад, U.S. Patent No. 4,816,567), технології візуалізації бактеріфагу (див., наприклад, Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991); Marks et al., J. Моl Biol, 222:581-597 (1991); Sidhu et al., J. Моl. Biol 338(2):299-310 (2004); Lee et al., J.Mol.Biol.340(5)A013-1093 (2004); Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004) та Lee et al. J. Immunol Methods 284(1-2): 119-132 (2004), та технології продукування людських і подібних до людських антитіл у тварин, що мають частини або цілі локуси або гени, що кодують послідовність людських імуноглобулінів (див., наприклад, WO 1998/24893; WO 1996/34096; WO 1996/33735; WO 1991/10741; Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); U.S. Patent Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,591,669 (всі GenPharm); U.S. Patent No. 5,545,807; WO 1997/17852; U.S. Patent Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425 та 5,661,016; Marks et al., Bio/Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature, 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature, 368: 812-813 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology, 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826 (1996), та Lonberg і Huszar, Intern. Rev. Immunol, 13: 65-93 (1995). Моноклональні антитіла, про які йдеться тут, включають "химерні" антитіла, у яких частина важких та/або легких ланцюгів ідентична чи гомологічна відповідній послідовності в антитілах, що походять від певного виду чи належать до певного класу або субкласу антитіл, в той час як решта ланцюга (ланцюгів) ідентична чи гомологічна відповідним послідовностям в антитілах, що походять від іншого виду чи належать до певного класу або субкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, якщо вони виявляють бажану біологічну активність (U.S. Patent No. 4,816,567 та Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984)). Зазначені химерні антитіла, включають "приматизовані" антитіла з варіабельними антигензв'язуючими послідовностями домена, що походять від нелюдини-примата (наприклад, давні мавпи, людиноподібні мавпи, тощо) та послідовності з постійними ділянками людини. "Фрагменти антитіла" включають частину інтактного антитіла, що переважно має на собі ділянку для зв'язування антигену. Прикладами фрагментів 2 антитіла є Fab, Fab', F(ab') та Fv фрагменти; димерні фрагменти антитіл; лінійні антитіла; одинарно-ланцюгові антитільні молекули та поліспецифічні антитіла, сформовані з фрагменту(-ів) антитіл. "Інтактне антитіло" включає дві антигензв'зуючі ділянки та Fc-ділянку. Частіше за все, інтактне антитіло має одну або більше ефекторні функції. В залежності від амінокислотної послідовності постійного домену їх важких ланцюгів, інтактні антитіла можуть бути віднесені до різних "класів". Існує п'ять основних класів інтактних антитіл: IgA, IgD, IgE, IgG та IgM. Кілька з них можуть бути роз 19 ділені на "субкласи" (ізотопи), наприклад, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA та IgA2. Важко-ланцюгові постійні домени, які відповідають різним класам антитіл, називаються α, , ε та μ, відповідно. Субодиничні структури та тривимірні конфігурації різних класів імуноглобулінів добре відомі. "Ефекторні функції" антитіла означають біологічні функції, що властиві Fc-ділянці (нативна послідовність Fc-ділянки або амінокислотний варіант послідовності Fc-ділянки) антитіла. Прикладами ефекторних функцій антитіл є Clq-зв'язування; цитотоксичність, що залежить від комплементу; зв'язування Fc-рецептора; антитіло-залежну клітинно-опосередковану цитотоксичність (ADCC); фагоцитоз; регулювання рецепторів на поверхні клітин (наприклад, В-клітинний рецептор; BCR) тощо. "Антитіло-залежна клітинно-опосередкована цитотоксичність" та "ADCC" означають клітинноопосередковану реакцію, у якій неспецифічні цитотоксичні клітини, які експресують Fc-рецептори (FcRs) (наприклад, Натуральні Кіллери (NK), нейтрофіли та макрофаги), розпізнають зв'язане з клітиною-мішенню антитіло і призводять до лізісу клітини-мішені. Первинні клітини-посередники ADCC, NK-клітини, експресують тільки FcyRIII, тоді як моноцити експресують FcyRI, FcyRII та FcyRIII. FcR-експресія на гематопоетичних клітинах підсумована у Таблиці 3 на стор. 464 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991). Для того, щоб оцінити ADCC-активність необхідної молекули, може бути проведене ADCC-дослідження in vitro, як це описано у US Patent No. 5,500,362 або 5,821,337. Придатні для такого дослідження ефекторні клітини включають мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) та натуральні кіллери (NK). Замість цього або додатково, ADCCактивність необхідної молекули може оцінюватися in vivo, наприклад, на тваринних моделях, як це описано у Clynes et al. PNAS (USA) 95:652-656 (1998). "Людські ефекторні клітини" - це лейкоцити, які експресують один або більше FcRs та виконують ефекторні функції. Переважно клітини експресують принаймні FcyRIII та виконують ADCCефекторну функцію. Прикладами людських лейкоцитів-медіаторів ADCC є мононуклеарні клітини периферичної крові (РВМС) та натуральні кіллери (NK), моноцити, цитотоксичні Т-клітини та нейтро1 філи; клітинам РВМС та NK віддається перевага. Ефекторні клітини можуть бути ізольованими від нативного джерела, наприклад, від крові або клітин РВМС як тут описано. Термін "Fc-рецептор" або "FcR" використовується для опису рецептора, який зв'язується з Fcділянкою антитіла. Перевагу надають FcR з нативною людською послідовністю FcR. Крім того, FcR, якому надають перевагу, зв'язує IgG (гаммарецептор) і включає в себе рецептори FcyRI-, FcyRII- та РсуМП-підкласів, включаючи алельні варіанти та альтернативно сплайсовані форми цих рецепторів. РсуМІ-рецептори включають в себе FcyRIIA ("активуючий рецептор") та FcyRIIB ("інгібуючий рецептор"), які мають подібні амінокислотні послідовності, що мають принципову різницю у 94899 20 цитоплазматичних доменах). Активуючий рецептор має імунорецептор, в ι цитоплазматичному домені що базується на тирозиновій активації (ІТІМ) (дивись огляд М. in Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)). FcRs розглянуто в Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); та de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995). Інші FcRs, включаючи ті, що будуть ідентифіковані у майбутньому, охоплюються терміном "FcR". Цей термін також включає неонатальний рецептор FcRn, який відповідає за перенос материнських IgGs до плоду (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) та Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)) і регулює гомеостаз імуноглобулінів. "Комплемент-залежна цитотоксичність" або "CDC" передбачає здатність молекули до лізісу мішені у присутності комплементу. Шлях активації комплементу ι ініціюється зв'язуванням першого компоненту системи комплементу (Clq) з молекулою (наприклад, антитілом) у комплексі з відповідним антитілом. Для оцінки активації комплементу може проводитися CDC-дослідження, наприклад, як описано у Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods 202:163 (1996). "Нативні антитіла" - це зазвичай гетеротетрамеричні глікопротеїни вагою приблизно 150,000 Da, які складаються з двох ідентичних легких (L) та двох ідентичних важких (Н) ланцюгів. Кожний легкий ланцюг з'єднується з важким ковалентним дісульфідним зв'язком, а кількість дісульфідних містків варіює у важких ланцюгах різних ізотопів імуноглобулінів. Кожний важкий і легкий ланцюг має рівновіддалені внутрішньоланцюгові дісульфідні містки. Кожний важкий ланцюг має на одному кінці варіабельний домен (VH), за яким слідують константні домени. Кожний легкий ланцюг має варіабельний домен на одному кінці (VL) та константні домени на іншому кінці. Константний домен легкого ланцюга зорієнтовані на перший константний домен важкого ланцюга, і варіабельний домен легкого ланцюга зорієнтований на варіабельний домен важкого ланцюга. Вважається, що відповідні амінокислотні залишки формують зв'язок між варібельними доменами легкого і важкого ланцюгів. Термін "варіабельний" означає факт, що певні частини варіабельних доменів між антитілами суттєво відрізняються послідовністю та використовуються у зв'язуванні та специфікації кожного визначеного антитіла до його визначеного антигену. Однак варіабельність представлена нерівномірно серед варіабельних доменів антитіл. Вона сконцентрована у трьох сегментах, що називаються гіперваріабельними ділянками і знаходяться у варіабельних доменах легких і важких ланцюгів. Найбільш збережені частини називаються каркасними ділянками (FRs). Варіабельні домени нативних важкого і легкого ланцюгів включають до себе чотири FRs, що в основному приймають β-шарову конфігурацію, пов'язану трьома гіперваріабельними ділянками, які формують петльові зв'язки і, в деяких випадках, формують частину β-шарової структури. Гіперваріабельні ділянки в кожному ланцюгу тримаються поряд за допомогою FRs та з гіперваріабельними ділянками іншого ланцюга, 21 беруть участь у формуванні антиген-зв'язуючого сайту антитіл (див. Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Константні домени не беруть прямої участі у зв'язуванні антитіла з антигеном, але проявляють різні ефекторні функції, такі як участь антитіл у антитіл-залежній клітинній цитотоксичності (ADCC). Термін "гіперваріабельна ділянка" у цьому документі означає амінокислотні залишки антитіла, які відповідають за зв'язування антигену. Гіперваріабельна ділянка загалом має в своєму складі амінокислотні залишки "ділянки, що визначає комплементарність" або "CDR", (наприклад, залишки 24-34 (L1), 50-56 (L2) та 89-97 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга, та 31-35 (Н1), 50-65 (Н2) і 95-102 (Н3) у варіабельному домені важкого ланцюга; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)), та/або ці залишки з "гіперваріабельної петлі" (наприклад, залишки 26-32 (L1), 50-52 (L2) та 91-96 (L3) у варіабельному домені легкого ланцюга та 26-32 (Н1), 53-55 (Н2) і 96-101 (Н3) у варіабельному домені важкого ланцюга; Chothia and Lesk J. Моl. Вiol. 196:901-917 (1987)). "Каркасна ділянка" або "FR''-залишки - це залишки варіабельного домену крім залишків гіперваріабельної ділянки, як зазначено в цьому документі. Переробка папаїну антитілами призводить до продукування двох ідентичних антиген-зв'язуючих фрагментів, що називаються 'Таb"-фрагментами, кожний з одинарним антиген-зв'язуючим сайтом та залишковим "Fc''-фрагментом, чия назва вказує на його здатність кристалізуватися. При лікуванні пепсином вироблється F(ab')2-фрагмент, який має два антиген-зв'язуючих сайта і здатний утворювати зв'зки з антигеном. "Fv" - це найменший фрагмент антитіла, який має повний антиген-розпізнавальний і антигензв'язуючий сайт. Ця ділянка складається з димеру одного важкого ланцюга і варіабельного домену одного легкого ланцюга у міцній нековалентній асоціації. У такій конфігурації три гіперваріабельні ділянки кожного варіабельного домену взаємодіють для визначення антиген-зв'язуючого сайту на поверхні VH-VL-димeру. Разом шість гіперваріабельних ділянок надають антитілу антиген-зв'язуючої специфічності. Незважаючи на це, навіть один варіабельний домен (або половина Fv включає тільки три гіперваріабельні ділянки, специфічні для антигену) має здатність розпізнавати і зв'язувати антиген, хоча і з меншою спорідненістю ніж цілий зв'язуючий сайт. Fab-фрагмент також має в своєму складі константний домен легкого ланцюга та перший константний домен (СН1) важкого ланцюга. РаЬ=фрагменти відрізняються від Fab-фрагментів додаванням кількох залишків на вугле-кінці домену важкого ланцюга СН1, включаючи один або більше цистеїнів з антитільної петльової ділянки. Fab'SH це назва для Fab,' в якому цистеїновий залишок (залишки) константного домену переносить принаймні одну тіолову групу. Р(аb')2-антитільні 94899 22 фрагменти спочатку продукувалися як пари Fab'фрагментів, які мають петлі цистеїну між собою. Також відомі інші хімічні сполучення антитільних фрагментів. "Легкі ланцюги" антитіл будь-якого виду хребетних на основі амінокислотних послідовностей їх константних доменів можуть бути розподілені на два зовсім різні типи, які називаються каппа () та лямбда (). "Одноланцюгові Fv" або "scFv" антитільні фрагменти включають в себе VH та VL домени антитіл, де ці домени присутні у одинарному поліпептидному ланцюгу. Переважно Fv-поліпептид має в своєму складі лінкер між VH та VL доменами, які дають scFv можливість формувати бажану структуру для зв'язування антигену. Для додаткової інформації щодо scFv дивись Pliickthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994). НЕR2-антитільні scFv-фрагменти описані у WO 93/16185; U.S. Patent No. 5,571,894 та U.S. Patent No. 5,587,458. Термін "димерні фрагменти антитіл" означає маленькі фрагменти антитіл з двома антигензв'язуючими сайтами, чиї фрагменти мають у своєму складі варіабельний важкий домен (VH), з'єднаний з варіабельним легким доменом (Vl) тим же поліпептидним ланцюгом (VH - VL). Використовуючи лінкер, що є закоротким для того, щоб дозволити зв'язування між двома доменами на тому ж ланцюгу, домени змушені утворювати пари з комплементарними доменами іншого ланцюга та створювати два антиген-зв'язуючі сайти. Димерні фрагменти антитіл більш повно описані, наприклад, у ЕР 404,097; WO 93/11161; та Hollinger et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993). "Гуманізовані" форми нелюдських антитіл (наприклад, гризунів) - це химерні антитіла, що мають у своєму складі мінімальну послідовність, похідну від нелюдського імуноглобуліну. У більшості випадків гуманізовані антитіла - це людські імуноглобуліни (реципієнтні антитіла), в яких залишки гіперваріабельної ділянки реципієнта заміщаються залишками нелюдської гіперваріабельної ділянки (донорські антитіла), наприклад, мишачими, щурячими, кролячими або взятими у приматів, що мають бажану специфічність, аффінність та функціональну здатність. В деяких прикладах залишки каркасної ділянки (FR) людських імуноглобулінів заміщаються відповідними нелюдськими залишками. Крім того, гуманізовані антитіла можуть мати у своєму складі залишки, які не знаходять ані у антитілах реципієнта, ані у антитілах донора. Такі модифікації робляться для того, щоб покращити функціонування антитіл. Взагалі, гуманізовані антитіла мають у своєму складі майже всі з принаймні одного, а типово - з двох варіабельних доменів, в яких всі або майже всі з гіперваріабельних петель відповідають таким з нелюдського імуноглобуліну і всі, або майже всі, FRs такі ж, як у людській імуноглобуліновій послідовності. Гуманізовані антитіла додатково також мають у своєму складі принаймні частину константної ділянки (Fc) імуноглобуліну, зазвичай такий самий як у людському 23 імуноглобуліні. Детальніше дивись Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); тa Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992). Гуманізовані HER2-антитіла включають huMAb4D5-l, huMAb4D5-2, huMAb4D5-3, huMAb4D5-4, huMAb4D5-5, huMAb4D5-6, huMAb4D5-7 та huMAb4D5-8 або Трастузумаб (ГЕРЦЕПТИН7), як описано у Table 3 of U.S. Patent 5,821,337, що включається до цього документу як посилання; гуманізовані 520С9 (WO 93/21319) та гуманізовані 2С4 антитіла, як описано в цьому документі. Терміни "Трастузумаб", "ГЕРЦЕПТИН7" та "huMAb4D5-8" в даному контексті означають антитіло, що включає в себе амінокислотні послідовності легкого та важкого ланцюгів, SEQ ID NOS. 15 та 16, відповідно. Терміни "Пертузумаб" та "OMNITARGJ" в даному контексті означають антитіло, що включає в себе амінокислотні послідовності легкого та важкого ланцюгів, SEQ ID NOS. 13 та 14, відповідно. Різниця між функціями Трастузумабу та Пертузумабу проілюстрована на Фіг. 6. "Неізольоване антитіло" - це антитіло, що не кон'юговане з гетерологічною молекулою, такою як цитотоксична частинка або радіоактивна мітка. "Ізольоване антитіло" - це те антитіло, яке було ідентифіковане та виділене з компоненту його природного середовища. Домішки з його оточуючого середовища - це матеріали, які можуть впливати на діагностичні або терапевтичні ефекти антитіла і можуть включати в ензими, гормони та інші білкові чи небілкові розчинні речовини. У бажаних варіантах здійснення винаходу, антитіло очищається (1) більш ніж на 95% за вагою антитіла, використовуючи метод Lowry, а краще більш ніж на 99% за вагою, (2) до необхідного ступеню, для того щоб отримати принаймні 15 залишків Nкінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовності при використанні чашкового секвенатора, або (3) до гомогенності за допомогою SDS-PAGE при редукованих і не редукованих умовах, використовуючи кумасі блакитний, або краще - серебріння. Ізольовані антитіла включають в себе антитіла in situ у рекомбінантних клітинах доки принаймні один компонент природного середовища антитіла не буде присутнім. Зазвичай ізольовані антитіла готуються принаймні одним способом очистки. "Аффінно зріле" антитіло - це антитіло з однією або більше альтернацією на одній або більше гіперваріабельній ділянці, які призводять до покращення афінності (спорідненості) антитіла до антигену, у порівнянні з вихідним антитілом, яке не має подібних альтернацій. Аффінно зрілі антитіла, яким надається перевага, мають наномолекулярну або навіть пікомолярну аффінність до антигенумішені. Аффінно зрілі антитіла виробляються за певною методикою. Marks et al. Bio/Technology 10:779-783 (1992) описують афінну зрілість через перестановку VH та VL-доменів. Випадковий мутогенез CDR та/або каркасних залишків описані: Barbas et al. Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schist et al. Gene 169:147-155 (1995); Yelton et al.. J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson et 94899 24 a.l, J. Immunol. 154(7):3310-9 (1995) та Hawkins et ah, J. Моl Biol. 226:889-896(1992). Термін "антитіло основного виду" означає структуру антитіла в композиції, у складі якої кількісно превалює молекула антитіла в композиції. За одним з варіантів здійснення винаходу, антитілом основного виду є антитіло до HER, таке як антитіло, що зв'язуються з Доменом II в HER2, антитіло, що інгібує HER-димеризацію більш ефективно, ніж Трастузумаб та/або антитіло, яке зв'язується з гетеродимерним зв'язуючим сайтом HER2. За бажаним варіантом здійснення винаходу антитіло основного виду включає варіабельні легку та важку амінокислотні послідовності у SEQ ID Nos. 3 та 4 і, найкраще, включає легку та важку амінокислотні послідовності у SEQ ID Nos. 13 та 14 (Пертузумаб). "Варіант амінокислотної послідовності" антитіла - це антитіло з амінокислотною послідовністю, яка відрізняється від антитіл основного виду. Зазвичай варіанти амінокислотної послідовності мають принаймні близько 70% схожості з антитілом основного виду, та, краще, принаймні близько 80%, і ще краще - принаймні близько 90% схожості з антитілом основного виду. Варіанти амінокислотної послідовності мають заміни, делеції та/або додавання на певних позиціях в або поряд з амінокислотною послідовністю антитіла основного виду. Прикладами варіантів амінокислотної послідовності є ацидитичний варіант (наприклад, варіант дезамінованих антитіл), базовий варіант, антитіло з подовженим амінним кінцем (наприклад, VHS-) на одному або двох його легких ланцюгах, антитіло з С-кінцевим залишком лізину на одному або двох важких ланцюгах тощо, та включає комбінації варіацій амінокислотних послідовностей важкого та/або легкого ланцюгів. Варіант антитіла, що розглядається тут - це антитіло, що включає лідерне подовження на аміно-кінці на його одному або двох легких ланцюгах, а як варіант, воно включає іншу амінокислотну послідовність та/або глікозиловані відмінності з антитілами основного виду. "Варіант за глікозилуванням" антитіла - це антитіло з прикріпленим одним або кількома вуглеводними фрагментами, які відрізняються від одного або кількох вуглеводних фрагментів, прикріплених до антитіл основного виду. Приклади варіантів за глікозилуванням включають антитіло з олігосахаридною структурою G1 або G2, відмінною від олігосахаридної структури G0, що приєднана до його Fc-ділянки, антитіло з одним або двома вуглеводними фрагментами, приєднаними до його одного або двох легких ланцюгів, антитіло без вуглеводних фрагментів, приєднаних до одного або двох важких ланцюгів антитіла тощо, та комбінації глікозилованих альтернацій. Якщо антитіло має Fc-ділянку, олігосахаридна структура, як це показано на Фіг. 9, може приєднуватися до одного або двох важких ланцюгів антитіла, наприклад, в залишку 299 (298, Еu нумерації залишків). Для Пертузумабу, GO була основною олігосахаридною структурою серед інших олігосахаридних структур, таких як GO-F, G-1, Маn5, 25 Маn6, G1-1, G1(1-6), G1(1-3) та G2, що були знайдені у меншій кількості у композиції Пертузумабу. Якщо не сказано інше, "G1-олігосахаридна структура" включає G-1, G1-1, G 1(1-6) та G1(0-3) структури. Термін "лідерне подовження на аміно-кінці" означає один або кілька амінокислотних залишків лідерної послідовності аміно-кінця, що присутні на аміно-кінці одного чи кількох важких або легких ланцюгів антитіла. Типове лідерне подовження на аміно-кінці включає або складається з трьох амінокислотних залишків, VHS, що знаходяться на одному або обох легких ланцюгах варіанта антитіла. "Дезамідоване" антитіло - це антитіло, один або більше аспарагінових залишки якого були дерівітазовані, наприклад, до аспарагінової кислоти, сукциніміду або ізо-аспаргунової кислоти. Терміни "рак" та "раковий" описують фізіологічний стан у ссавців, що, зазвичай характеризується нерегульованим ростом клітин. Приклади раку включають (але не обмежуються цим): карциному, лімфому, бластому, (включаючи медулобластому та ретинобластому), саркому (включаючи ліпосаркому та сіновіальноклітинну саркому, нейроендокринні пухлини (включаючи карциноїдні пухлини, гастриному та острівцевоклітинний рак), мезотеліому, шваному (включаючи акустичну невриному), менінгіому, аденокарциному, меланому та лейкоз або лімфоїдні пухлини. Більш конкретні приклади таких раків включають лускатноклітинний рак (наприклад, епітеліальний лускатноклітинний рак), легеневий рак, включаючи дрібноклітинний рак легень (SCLC), не дрібноклітинний рак легень (NSCLC), аденокарциному легень та лускатноклітинну карциному легень, рак очеревини, гепатоцелюлярний рак, рак шлунку, включаючи гастроінтестінальний рак, рак підшлункової залози, гліому, церві кальний рак, рак яєчників, рак печінки, рак сечового міхура, гепатому, рак грудей (включаючи метастатичний рак грудей), рак товстого кишечника, рак прямої кишки, колоректальний рак, ендометріальну або маткову карциному, карциному слинних залоз, рак нирок, рак простати, рак вульви, рак щитоподібної залози, карциному печінки, анальну карцинома, карциному пеніса, рак яєчка, рак стравоходу, пухлини міліарного тракту, та раки голови і шиї. "Пацієнт" в цьому документі означає людинупацієнта. Пацієнт може бути "пацієнтом, хворим на рак", тобто таким, у якого проявляються або є ризик прояву одного з симптомів раку, чи інший пацієнт, якому може бути корисне лікування HERантитілами. "Біологічний зразок" означає зразок клітин або тканини, що походить з біологічного джерела. "Зразок пацієнта" означає зразок, взятий у пацієнта, наприклад, пацієнта, хворого на рак. "Зразок пухлини" - зразок, отриманий з пухлини пацієнта і містить її клітини. Приклади зразків пухлини включають (але не обмежуються): біопсію пухлини, циркулюючі пухлинні клітини, циркулюючі білки плазми, асцитичну рідину, первинні культури клітин, або ряди клітин, отримані з пухлин, або ті, що виявляють пухлинні властивості та законсер 94899 26 вовані пухлинні зразки такі, як зафіксовані формаліном, парафіном, або заморожені зразки пухлин. "Фіксований" зразок пухлини - це зразок, що його гістологічно приготовано з використанням фіксатору. "Фіксований формаліном" зразок пухлини - це зразок, що його приготовано з використанням формальдегіду як фіксатора. "Залитий" зразок пухлини - це зразок, що його оточено твердим, зазвичай середньої твердості, матеріалом, таким як парафін, віск, целоїдин або смола. Заливка робить можливим нарізання тонких препаратів для мікроскопічного дослідження або генерації мікромасивів (TMAs). "Залитий парафіном" зразок пухлин - це зразок, оточений очищеною сумішшю твердих гідрокарбонатів, похідних нафти. Термін "заморожений" зразок пухлини означає в цьому документі зразок, який є чи було заморожено. Раковий або біологічний зразок, який "демонструє HER-експресію, ампліфікацію або активацію" - це такий зразок, який при діагностичному тесті експресує (включаючи надекспресію) HERрецептор, має ампліфікований HER-ген, та/або поіншому демонструє активацію або фосфориляцію HER-рецептора. Така активація може бути визначена прямо (наприклад, шляхом вимірювання HER-фосфориляції) або опосередковано (наприклад, шляхом аналізу генної експресії або визначення HER-гетеродимерів, як описано в цьому документі). Рак з "надекспресією або ампліфікацією HERрецептора" - це той, що має значно вищі рівні білка або гена HER-рецептора у порівнянні з нераковою клітиною того ж типу тканин. Така надекспресія може бути спричинена генною ампліфікацією або зростанням транскрипції чи трансляції. Надекспресія або ампліфікація HER-рецептора у діагностичних або прогностичних пробах можуть бути спричинені оцінкою зростаючих рівнів HER-білка, що знаходиться на поверхні клітини (наприклад, при імуногістохімічному аналізі; ІНС). Альтернативно або додатково можна використовувати вимірювання рівнів HER-кодуючої нуклеїнової кислоти в клітині, наприклад, шляхом флюоресценції in situ гібридізації (FISH; дивись WO98/45479 опублікований у жовтні 1998р), саузерн-блоттінгу, або полімеразної ланцюгової реакції (PCR), такої як кількісна PCR в реальному часі (qRT-PCR). Можна також вивчати надекспресію або ампліфікацію HER-рецептора вимірюючи антиген, що "злущується" (наприклад, HER-екстрацелюлярний домен) у біологічній рідині, такій як сироватка (дивись, наприклад, U.S. Patent No. 4,933,294, виданий 12 червня 1990р.; WO 91/05264, опублікований 18 квітня 1991р.; U.S. Patent 5,401,638, виданий 28 березня 1995р. та Sias et al. J. Immunol. Methods 132: 73-80 (1990)). Крім перерахованих вище дослідів, існують in vivo-досліди для досвідченого спеціаліста. Наприклад, можна піддавати клітини пацієнта впливу антитіл, мічених, наприклад, радіоактивним ізотопом, при цьому можна оцінити зв'язування антитіл з клітинами пацієнта, наприклад, використовуючи зовнішнє сканування радіо 27 активності або аналізуючи біопсію, взяту у пацієнта, підданого впливу антитіл. І навпаки, рак, який "не надекспресує або не ампліфує HER-рецептори", - це той, що не має вищі за норму рівні білка або гену HER-рецептора у порівнянні з нераковою клітиною того ж типу тканин. Антитіла, що інгібують HER-димеризацію, такі як Пертузумаб, можуть використовуватися у лікуванні раку, який не надекспресує або не ампліфікує HER2-рецептори. Термін "агент, що інгібує ріст" означає у цьому документі суміш або композицію, яка інгібує ріст клітини, особливо HER-експресуючої ракової клітини in vitro та in vivo. Таким чином, ростінгібуючим агентом може бути той, що значно зменшує процент HER-експресуючих клітин у S-фазі. Прикладами ріст-інгібуючих агентів можуть бути агенти, що блокують циклічну прогресію клітин (не в S-фазі), такі як агенти, що індукують затримку G1- та М-фаз. Класичні блокатори М-фази включають Вінкас (Вінкрістін та Вінбластін), Таксанес та топо II інгібітори, такі як Доксорубіцин, Епірубіцин, Даунорубіцин, Етопозід, та Блеоміцин. Ці агенти затримують G1, а також затримують S-фазу, наприклад агенти, що алкілують ДНК, такі як Тамоксіфен, Преднізон, Дакарбазін, Мехлоратамін, Ципластін, Метотрексат, 5-фторурацил та Ара-С. Детальнішу інформацію можна знайти у The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn та Israel, eds., Chapter 1, що названа "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drags" Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), особливо cтop. 13. Прикладами антитіл, що "інгібують ріст" є ті, що зв'язуються з HER2 та інгібують ріст ракових клітин, що надекспресують HER2. Бажані антитіла до HER2, що інгібують ріст, інгібують ріст SK-BR-3 клітин пухлини грудей в культурі клітин більш ніж на 20%, та краще, більше ніж на 50% (наприклад, з приблизно 50% до приблизно 100%) при концентрації антитіл приблизно 0.5 - 30 μг/мл, де пригнічення росту визначається через шість днів після впливу антитіл на SK-BR-3 клітини (дивись U.S. Patent No. 5,677,171, виданий 14 жовтня 1997р). Досліди з пригніченням SK-BR-3-клітин описані детальніше в зазначеному патенті та нижче. Найбажанішим антитілом, що інгібує ріст, є гуманізований варіант мишачого моноклонального антитіла 4D5, наприклад, Трастузумаб. Антитіло, що "індукує апоптоз" - це антитіло, що індукує запрограмовану смерть клітини, що визначається зв'язуванням аннексіну V, фрагментацією ДНК, стисканням клітини, дилатацією ендоплазматичного ретикулуму, фрагментацією клітини та/або формуванням мембранних пухирців (які називаються апоптичними тільцями). Зазвичай така клітина надекспресує НЕК2-рецептор. Переважно це пухлинна клітина, наприклад, грудна яєчникова, шлункова, ендометріальна, слинної залози, легенева, ниркова, кишечникова, тиреоїдна, панкреатична, міхурова клітина. In vitro, клітина може бути K-BR-3, BT474, Calu 3 cell, MDA-MB453, MDA-MB-361 або SKOV3 клітиною. Існують різні методи для оцінки того, що відбувається з клітиною у зв'язку з апоптозом. Наприклад, тран 94899 28 локація фосфатиділ серину (PS) може вимірюватися зв'язуванням аннексіну, фрагментація ДНК може бути оцінена по ступневості ДНК та нуклеарно/хроматиновій конденсації, разом з тим ДНКфрагментація може бути оцінена по зростанню в будь-якій гіподиплоїдній клітині. Переважно, антитіло, що індукує апоптоз, - це те, що викликає приблизно 2-50 скручувань, а краще, приблизно 5-50 скручувань та найкраще - приблизно 10-50 скручувань, індукція зв'язування аннексіну близька до нелакованої клітини в досліді зі зв'язуванням аннексіну, використовуючи ВТ474 клітини (дивись нижче). Приклади HER2-антитіл, що індукують апоптоз - це 7С2 тa 7F3. "Епітоп 2С4" - це ділянка в екстрацелюлярному домені HER2, до якої приєднується антитіло 2С4. Для виявлення антитіл, що приєднуються до епітопу 2С4, може проводитися звичайний дослід з перехресним блокінгом, так як це описано у Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Переважно антитіло блокує приєднання 2С4 до HER2 на приблизно 50% або більше. Як альтернатива може проводитися картування епітопів для визначення, чи приєднується антитіло до епітопу 2С4 HER2. Епітоп 2С4 включає в себе залишки Домену II в екстрацелюлярному домені HER2. 2С4 та Пертузумаб приєднуються до екстрацелюлярного домену HER2 у з'єднанні доменів І, II та III. Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004). "Епітоп 4D5" - це ділянка в екстрацелюлярному домені HER2, до якої приєднуються антитіло 4D5 (АТСС CRL 10463) та Трастузумаб. Цей епітоп близький до трансмембранного домену HER2 та до Домену IV HER2. Для виявлення антитіл, що приєднуються до епітопу 4D5, може проводитися звичайний дослід з перехресним блокінгом, так як це описано у Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Як альтернатива може проводитися картування епітопів для визначення чи приєднується антитіло до епітопу 4D5 HER2 (наприклад, будьякий з епітопів в ділянці від приблизно 529 залишку до приблизно 625 залишку, що включають HER2 ECD, залишки нумеруються, враховуючи сигнальні пептиди). "Епітоп 7C2/7F3" - це ділянка на N-кінці в Домені І екстрацелюлярного домену HER2, до якої приєднуються 7С2- та/або 7F3-антитіла (кожне, осаджене за допомогою АТСС, дивись нижче) . Для скинінгу антитіл, що приєднуються до епітопу 7C2/7F3, може проводитися звичайний дослід з перехресним блокінгом, так як це описано у Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988). Як альтернатива, може проводитися картування епітопів для визначення чи приєднується антитіло до епітопу 7C2/7F3 HER2 (наприклад, будь-який з епітопів в ділянці від приблизно 22 залишку до приблизно 53 залишку, що включають HER2 ECD, залишки нумеруються, враховуючи сигнальні пептиди). "Лікування" означає як терапевтичне лікування, так і профілактичні або превентивні заходи. До осіб, що потребують лікування, відносяться як ті, 29 що вже мають хворобу, так і ті, у кого хвороба попереджається. Таким чином, пацієнт, якого лікують, може бути вже зі встановленим діагнозом або може бути схильним чи чутливим до хвороби. Термін "ефективна кількість" означає кількість ліків, достатню для лікування раку у пацієнта. Ефективна кількість ліків може зменшувати кількість ракових клітин; зменшувати розміри пухлини; інгібувати (тобто уповільнити до певної міри, а в найкращому разі - зупинити) інфільтрацію периферичних органів раковими клітинами; інгібувати (тобто уповільнити до певної міри, а в найкращому разі - зупинити) пухлинні метастази; інгібувати певною мірою ріст пухлини; та/або полегшити певною мірою один або більше симптомів, що викликаються раком. Певною мірою ліки можуть попередити ріст та/або вбити існуючі ракові клітини, вони можуть бути цитостатичними та/або цитотоксичними. Ефективна кількість може подовжити виживання без прогресії (наприклад, як вказано у Response Evaluation Criteria for Solid Tumors, RECIST та СА-125 зміни), викликати об'єктивну відповідь (включаючи часткову відповідь, PR, або повну відповідь, CR), спричинити зростання загального часу виживання, та/або полегшити один або більше симптомів раку (наприклад, як досліджено FOSI). "Загальний час виживання" означає підтримання життя пацієнта протягом певного періоду, такого як 1 рік, 5 років тощо, наприклад, з часу встановлення діагнозу або лікування. "Виживання без прогресії" означає підтримання життя пацієнта без погіршення раку. "Об'єктивна відповідь" означає відповідь, яку можна виміряти, включаючи повну відповідь (CR) або часткову відповідь (PR). "Повна відповідь" або "повна ремісія" передбачає зникнення всіх ознак раку у відповідь на лікування. Це не завжди означає виліковування раку. "Часткова відповідь" передбачає зменшення розміру однієї або більше пухлин або уражень чи поширення раку у тілі у відповідь на лікування. Термін "цитотоксичний агент" використовується у цьому документі для позначення субстанції, що інгібує або попереджує функціонування клітин та/або спричиняє деструкцію клітин. Термін пе211 редбачає радіоактивні ізотопи (наприклад, At , 131 125 90 186 188 153 212 32 І ,1 , Y , Re , Re , Sm , Ві , Ρ та радіоактивні ізотопи Lu), хіміотерапевтичні агенти та токсини, такі як дрібномолекулярні токсини або ферментативно-активні молекули бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи їх фрагменти/або варіанти. "Хіміотерапевтичний агент" - це хімічне з'єднання, корисне при лікуванні раку. Приклади хіміотерапевтичних агентів включають алкілуючі агенти, такі як Тіотепа та ЦИТОКСАН7, Циклофосфамід; алкіловані сульфонали, такі як Бусульфан, Імпросульфан та Піпосульфан; азірідіни, такі як Бензодопа, Карбокон Метуредопа та Уредопа; етіленіміни та метиламіламіни, включаючи Альтерамін, Третіленемеламін, Третіленефосфорамід, Третіленетіофосфорамід та Триметіллоломеламін; TLK 286 (ТЕЛЦИТАЙ); ацтогеніни 94899 30 (особливо Буллатацин та Буллатацинон); дельта9-тетрагідроканнабілол (Дронабілол, МАРІНOЛ7); бета-лапахон; лапахол; колхіцини; бетулініциннову кислоту; камптотецин (включаючи синтетичний аналог топотекан (ПКАМТIH7), СРТ-11 (ірінотекан, КАМПТОСАР7), ацетілкамптотецин, скополектин та 9-амінокампротецин); бріостатин; каллістатин; СС-1065 (включаючи синтетичні аналоги Адозелезіну, Карзелезіну та Бізелезіну); подофіллтоксін; подофіллініцинова кислота; теніпозид; кріптофіцин (особливо кріптофіцин 1 та кріптофіцин 8); доластатин; дуокарміцин (включаючи синтетичні аналоги, KW-2189 та СВ1-ТМ1); елеутеробін; панкратістатин; саркодіктиїн; спонгістатин; азотистий іприт такий як Хлорамбуцил, Хлорнафазін, Холофосфамід, Естрамустин, Іфосфамід, Мехлоретамін, Мехлоретамін оксида гідрохлорид, Мелфалан, Новембіхін, Фенестрин, Преднімустин, Трофосфамід, урациловий іприт; нітросураси, такі як Кармустин, Хлозотоцин, Фотемустин, Ломустин, Німустин та Ранімнустин; бісфосфонати, такі як Клодронат; антибіотики, такі як енедиїнові антибіотики (наприклад, Каліхеаміцин, особливо Каліхеаміцин гаммал та Каліхеаміцин омегалл (дивись, наприклад, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl, 33: 183-186 (1994)) та 5 антрацикліни, такі як Аннаміцин, AD 32, Алкарубіцин, Даунорубіцин, Дексарокзан, DX52-1, Епірубіцин, GPX-100, Ідарубіцин, KRN5500, Меногарил, Динеміцин, включаючи Динеміцин А, Еспераміцин, Неокарзіностатин Хромофор та споріднені Хромопротеїн енедеїнові антибіотики хромофори, аклациноміцини, Актиноміцин, Аутраміцин, Азасерін, Блеміцин, Кактіноміцин, Карабіцин, Карміноміцин, Карзінофілін, Хромоміцин, Дактіноміцин, Деторубіцин, 6-діазо-5-оксо-L-норлеуцин, АДРІАМАЦИН7, Доксорубіцин (включаючи морфоліно-доксорубіцин, цианоморфоліно-доксорубіцин, 2-пірроліно-доксорубіцин,ліпосомальний доксорубіцин та деіксідоксорубіцин), езорубіцин, марселломіцин; мітоміцини, такі як мітоміцин С, мікофенолева кислота, ногаламіцин, олівоміцин, пепломіцин, потфіроміцин, пуроміцин, квеламіцин, родорубіцин, стрептонігрин, стрептозоцин, туберцидін, убенімекс, зіностатин, та зорубіцин; аналоги фолієвої кислоти, такі як деноптерин, птероптерин, та триметрексат; аналоги пуринів, такі як флударабін, 6-меркаптопурине, тіаміпирин та тіогуанін; аналоги піримідинів, такі як анцитабін, азацитидін, 6-азауридін, кармо фур, цитарабін, дідеоксіуридин, доксіфлурідин, еноцитабін, та флоксуридін, оксіфлуридін, еноцитабін, та флоксуридін; андрогени, такі як калустерон, дромостанолона пропіонат, епістанол, мепітіостан та тестолактон; анти адреналінові, такі як аміноглутетімід, мітотан та трілостан; додаток фолієвої кислоти, такий як фолінева кислота (лейковариін); ацеглатоне; анти-фолатові антинеопластичні агенти, такі як ALIMTA7, LY231514; дігідрофолатові інгібітори редуктази, такі як метотрексат; антиметаболіти, такі як 5-фторурацил (5-FU) та його проліки, такі як UFT, S-1 та капецитабін, та інгібітори тиміділатсинтетази, та інгібітори гліцинамід рибонуклеотид формілтрансферази, такі як ралтітрект (ТОМУRМ ДЕКС , TDX); інгібітори дигідропіримідиндегідрогенази, такі як енілурацил; альдофосфамідгліко 31 зид; амінолевулінова кислота; амсакрин; бестрабуцил; бісантрен; едатраксат; дефофамін; демеколцин; діазіквон; елфорнітин; елліптініума ацетат; епотилон; етоглюцид; галліуму нітрат; гідроксіуреа; лентінан; лонідаінІн; мейтансіноїди, такі як мейтансін та ансамітоцин; мітогуазон; мітоксантрон; мопіндамол; нітраерин; пентостатин; фенамет; пірарубіцин; лозоксантрон; 2-етилхідразид; прокарбазин; PSK.7 полісахаридний комплекс (JHS Natural Products, Eugene, OR); разоксан; різоксин; сізоферан; спірогерманіум; тенуазонієва кислота; триазіквон; 2,2',2"-трихлоротриетиламін; трихотецени (особливо Т-2 токсин верракурин А, рорідин А та ангідин); уретан; віндезин (ELDISINE7, FILDESIN7); дакарбазін; манномустин; мітобронітол; мітолактол; піпоброман; гацитозін; арабінозид ("Аrа-С"); циклофосфамід; тіотепа; таксоїдита таксани, наприклад, TAXOL7 паклітаксел (Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), ABRAXANE™ безкремофорові, альбумінові наночастинки формування паклітакселю (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), та TAXOTERE7 доцетаксель (Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France); хлоранбуцил; гемцитабін (GEMZAR7); 6-тіогуанін; меркаптопурин; платина; аналоги платини або аналоги, що базуються на платині, такі якцисплатин, оксаліплатин та карбоплатин; вінбластин (VELBAN7); етопозид (VP-16); ізофамід; мітоксантрон; вінкристин (ONCOVIN7); алкалоїд барвінку; вінорелбін (NAVELBINE7); новантрон; едатрексат; дауноміцин; аміноптерин; кселода; ібандронат; інгібітор топоізомерази RFS 2000; діфлюорометилорнітин (DMFO); кретиноїди, такі як ретиноїва кислота; фармацевтично здобуваємі солі, кислоти або похідні будь чого з перерахованого вище або їхні комбінації, такі як CHOP, абревіатура для комбінованої терапії циклофосфамідом, доксорубіцином, вінкристином та преднізолоном, та FOLFOX, абревіатура курсу лікування оксаліплатином (ELOXATIN™), комбінованим з 5FU та лейковарином. Також це визначення включає антигормональні агенти, що впливають на регуляцію або інгібіцію дії гормонів на пухлини, такі як анти-естрогени та селективні естрогенові рецептори-модулятори (SERMs), включаючи, наприклад, тамоксіфен (включаючи N0LVADEX7 тамоксіфен), ралоксіфен, дролоксіфен, 4-гідроксітамоксіфен, тріоксіфен, кеоксіфен, LY117018, онапрістон, та FARESTON7 тореміфен; інгібітори аромотаз, які інгібують фермент аромат азу, який регулює продукцію естрогенів в наднирниках, такі як, наприклад, 4(5)імідазол, аміноглутетімід, MEGASE7 мегестролу ацетат, AROMASIN7 екземестан, форместан, фадрозол, RIVISOR7 ворозол, FEMARA7 летрозол, та ARIMIDEX7 анатрозол; та анти андрогени, такі як флутамід, нілутамід, бікалутамід, леупроділ, та госерелін; та троксітабін (аналог 1,3-діоксоланнуклеозид-цитозину); антизмістовні олігонуклетиди, особливо ті, що інгібують експресію генів в сигнальних шляхах, що знаходяться у абберантних клітинах проліферації, такі як, наприклад, РKС-альфа, Raf, H-Ras, та епідермальний фактор росту (EGF-R); вакцини, такі як генні терапевтичні вакцини, наприклад, ALLOVECTIN7 вакцина, 94899 32 LEUVECTIN7 вакцина та VAXID7 вакцина; PROLEUKIN7 rIL-2; LURTOTECAN7 інгібітор топоізомерази 1, ABARELIX7 rmRH; та отримані фармацевтично солі, кислоти або їх похідні. "Антиметаболічний хіміотерапевтичний агент" - це агент, який структурно схожий з метаболітом, але не може бути використаний організмом для продуктивних цілей. Багато антиметаболічних хіміотерапевтичних агентів мають вплив на продукцію нуклеїнових кислот, РНК та ДНК. Приклади антиметаболічних хіміотерапевтичних агентів включають гемцитабін (GEMZAR7), 5-фторурацил (5-FU), капецитабін (XELODAJ), 6-меркаптопурин, метотрексат, 6-тіогуанін, пеметрексед, ралтітрексед, арабіносилцитозин ARA-C цитарабін (CYTOSAR-U7), дакарбазін (DTIC-DOME7), азоцитозін, деоксіцитозін, пирідміден, флударабін (FLUDARA7), кладрабін, 2-деоксі-О-глюкоза, etc. Найбажаніший антиметаболічний хіміотерапевтичний агент - це Гемцитабін. "Гемцитабін" або "2'-деоксі-2', 2'діфлюороцитидін моногідрохлорид (b-ізомер)" - це нуклеозидний аналог, який проявляє протипухлинну дію. Емпірична формула Гемцитабіну НСI - це C9H11F2N3O4 А НСI. Гемцитабін НСI продається Eli Lilly під торговою маркою GEMZAR7. "Хіміот"ерапевтичний агент, що базується на платині" означає органічну суміш, яка має в своєму складі платину у якості складової частини молекули. Приклади хіміотерапевтичного агенту, що базується на платині, включають карбоплатин, цисплатин та оксаліплатин. "Хіміотерапія, що базується на платині" - передбачає терапію одним або більше хіміотерапевтичним агентом, що базується на платині, або у комбінації з одним або більше хіміотерапевтичним агентом. "Платино-резистентний" рак - рак, що прогресує під час отримання хіміотерапії, що базується на використанні платини (тобто пацієнт є "платино-рефрактерним"), або у пацієнта спостерігається прогресування хвороби терміном до 12 місяців (наприклад, до 6 місяців) після закінчення курсу хіміотерапії, що базується на використанні платини. "Антиангіогенний агент" означає речовину, що блокує або певною мірою впливає на розвиток кровоносних судин. Антиангіогенний фактор може, наприклад, бути дрібною молекулою або антитілом, яке приєднується до фактору росту або рецептору фактора росту, які беруть участь у стимуляції ангіогенезу. Бажаний антиангіогенний фактор - це антитіло, яке приєднується до ендотеліального фактору росту судин (VEGF), наприклад, Бевацизумаб (AVASTIN7). Термін "цитокін" - це загальна назва білків, вироблених однією популяцією клітин, які впливають на інші клітини як клітинні медіатори. Прикладами таких цитокінів є лімфокіни, монокіни та звичайні поліпептидні гормони. Серед цитокінів є гормони росту, такі як людський гормон росту, N-метіоніл гормон росту людини та бичачий гормон росту; паратириоїдний гормон; тироксин; інсулін; проінсулін; релаксин; прорелаксін; глікопротеїнові гормони, такі як фолікулостимулюючий гормон FSH), 33 тириоїдстимулюючий гормон (TSH), та лютеїнизуючий гормон (LH); печінковий фактор росту; фактор росту фібробластів; пролактин; плацентарний лактоген; фактор неурозу пухлин-α та -β; мюллерово-інгібуюча речовина; мишачий гонодотропінасоційований пептид; інгібін; активін; ендотеліальний фактор росту судин; інтегрін; тромбопоетин (ТРО); фактор росту нервів, такий як NGF-β; фактор росту тромбоцитів; трансформуючі фактори росту (TGFs), такі як TGF-α та TGF-β; інсуліноподібний фактор росту-І та -II; еритропоетин (ЕРО); остеоіндуктивні фактори; інтерферони, такі як інтерферон-α, -β, та -; колоніє стимулюючі фактори (CSFs), такі як макрофаг-CSF (M-CSF); гранулоцит-макрофаг-CSF (GM-CSF) та гранулоцит-CSF (G-CSF); інтерлейкіни (ILs), такі як IL-1, IL-Іа, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL12; фактори некрозу пухлин, такі як TNF-α або TNF-β та інші поліпептидні фактори, включаючи LIF та набір ліганд (KL). В даному тексті, термін цитокін включає білки з природних джерел або з рекомбінантних культур клітин та біологічно активні еквіваленти нативної послідовності цитокінів. Термін "EGFR-спрямованi ліки" означає терапевтичний агент, що приєднується до EGFR та значно інгібує активацію EGFR. Приклади таких агентів включають антитіла та дрібні молекули, що приєднуються до EGFR. Приклади антитіл, що приєднуються до EGFR, включають МАb 579 (АТСС CRL НВ 8506), МАb 455 (АТСС CRL HB8507), МАb 225 (АТСС CRL 8508), МАb 528 (АТСС CRL 8509) (дивись US Patent No. 4,943, 533, Mendelsohn et al.) та їхні варіанти, такі як химеризований 225 (С225 або Цетуксімаб; ERBUTIX7) та переформований людський 225 (Н225) (див. WO 96/40210, Imclone Systems Inc.); антитіла, що зв'язують тип II мутантних EGFR (US Patent No. 5,212,290); гуманізовані та химерні антитіла, що зв'язують EGFR як описано у US Patent No. 5,891,996; та людські антитіла, що зв'язують EGFR, такі як ABX-EGF (дивись WO 98/50433, Abgenix); EMD 55900 (Stragliotto et al. Eur. J. Cancer 32A:636-640 (1996)); та mAb 806 або гуманізований mAb 806 (Johns et al., J. Вiol. Chem. 279(29):30375-30384 (2004)). Анти-EGFR антитіла можуть бути кон'юговані з цитотоксичним агентом, таким чином, генеруючи імунокон'югат (дивись, наприклад, ЕР659,439А2, Merck Patent GmbH). Приклади дрібних молекул, які приєднуються до EGFR, включають ZD1839 або Гефітініб (IRESSAJ; Astra Zeneca); CP-358774 або Ерлотініб HCL (TARCEVAJ; Genentech/OSI); та AG1478, AG1571 (SU 5271; Sugen). "Інгібітор тирозинкінази" - молекула, яка інгібує тирозинкіназну активність тирозинкіназ, таких як HER-рецептор. Прикладами таких інгібіторів є EGFR-спрямовані ліки, зазначені у попередньому абзаці; дрібномолекулярний HER2тирозинкіназний інгібітор, такий як ТАКІ65, що поставляється Takeda; подвійні HER-інгібітори, такі як ЕКВ-569 (що поставляються Wyeth), які переважно зв'язують EGFR, але інгібують і HER2, і EGFRнадекспресуючи клітини; GW572016 (що поставляється Glaxo); оральний HER2 та EGFR тирозинкіназний інгібітор; РKІ-166 (що поставляється 94899 34 Novartis); пан-HER інгібітори, такі як канертініб (СІ1033; Pharmacia); Raf-1 інгібітори, такі як антизмістовний агент ISIS-5132, що поставляється ISIS Pharmaceuticals, який інгібує Raf-1 сигналізацію; не HER-спрямовані ТK-інгібітори, такі як Іматініба мезілат (GleevacJ), що поставляється Glaxo; МАРК інгібітор екстрацелюлярної регульованої кінази І СІ-1040 (що поставляється Pharmacia); квіназоліни, такі як PD 153035,4-(3-хлоранілін) квіназолін; піримідини; піримідопіримідини; пірролопіримідини, такі як CGP 59326, CGP 60261 та CGP 62706; пірозолопіримідини, 4-(феніламін)-7Н-пірроло[2,3d] піримідини; куркумін (діферулоїл метан, 4,5-біс (4-флуоранілін)фталімід); тирфостін, що включає частинки нітрофену; PD-0183805 (Warner-Lamber); антизмістовні молекули (наприклад, ті, що приєднуються до нуклеїнової кислоти, що кодує HER); квіноксаліни (US Patent No. 5,804,396); трифостін (US Patent No. 5,804,396); ZD6474 (Astra Zeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); пан-HER інгібітори, такі як СІ-1033 (Pfizer); Аффінітак (ISIS 3521; Isis/Lilly); Іматініба мезілат (Gleevac; Novartis); PKI 166 (Novartis); GW2016 (Glaxo SmithKline); CI-1033 (Pfizer); EKB-569 (Wyeth); Семаксініб (Sugen); ZD6474 (AstraZeneca); PTK-787 (Novartis/Schering AG); INC-lCl 1 (Imclone); або як описано в будь-якій з наступних патентних публікацій: US Patent No. 5,804,396; WO 99/09016 (American Cyanimid); WO 98/43960 (American Cyanamid); WO 97/38983 (Warner Lambert); WO 99/06378 (Warner Lambert); WO 99/06396 (Warner Lambert); WO 96/30347 (Pfizer, hie); WO 96/33978 (Zeneca); WO 96/3397 (Zeneca); and WO 96/33980 (Zeneca). "Аутоімунна хвороба" - в цьому документі означає хворобу або розлад, що походить з та спрямований проти власних тканин людини, або є його результатом чи проявом або обумовлюється ним. Приклади аутоімунних хвороб або розлідів включають, (але не обмежуються ними) артрит (ревматоїдний артрит такий як гострий артрит, хронічний ревматоїдний артрит, подагричний артрит, гостра подагра, гострий подагричний артрит, хронічний запальний артрит, дегенеративний артрит, інфекційний артрит, хвороба Дайма, проліферативний артрит, псоріатичний артрит, хребцевий артрит та ювенільний ревматоїдний артрит, остеоартрит, гострий прогресуючий артрит, деформуючий артрит, первино хронічний поліартрит, реактивний артрит та анкілозуючий спонділіт), запальні гіперпроліферативні захворювання шкіри, псоріаз, такий як бляшковий псоріаз, кришковий псоріаз, пустулярний псоріаз та псоріаз нігтів, атопія, включаючи атопічні хвороби такі як сінна лихоманка та синдром Джоба, дерматити включаючи контактний дерматит, хронічний контактний дерматит, алергічний дерматит, алергічний контактний дерматит, герпетіформний дерматит та атопічний, дерматит, пов'язаний з Х-хромосомою гіпер-IgM синдром, кропивниці, такі як хронічна алергічна кропивниця та хронічна ідіопатична кропивниця, включаючи хронічну аутоімунну кропивницю, поліміозіт/дерматоміозіт, ювенільний дерматоміозіт, токсичний епідермальний некроліз, склеродермія (включаючи системну склеродермію), склероз такий як системний склероз, множинний склероз 35 (MS) такий як спінально-оптичний MS, первинний прогресивний MS (PPMS), та рецидивуючий ремітуючий MS (RRMS), прогресуючий системний склероз, атеросклероз, артеріосклероз, дисемінований склероз та атаксичний склероз, запальна хвороба кишок (IBD) (наприклад, хвороба Крона, аутоімунно опосередковані гастроінтестинальні хвороби, коліт, такий як виразковий коліт,мікроскопічний коліт, колагенозний коліт, поліпозний коліт, некротичний ентероколіт та трансмуральний коліт та аутоімунна запальна хвороба кишок), гангренозна піодермія, вузлова еритема, первинний склерозуючий холангіт, епісклеритз), респіраторний дистрес-синдром, включаючи дорослий або гострий респіраторний дистрес-синдром, (ARDS), менінгіт, запалення всіх частин судинної оболонки ока, ірит, хороїдит, аутоімунний гематологічний розлад, ревматоїдний спонділіт, раптова втрата слуху, IgE-опосередковані хвороби, такі як анафілаксія та алергічний і атопічний рініт, енцефаліт, такий як енцефаліт Расмусена та лімбічний та/або стовбуровий енцефаліт, увеїт, такий як передній увеїт, гострий передній увеїт, грануломатозний увеїт, негрануломатозний увеїт, erior uveitis, granulomatous uveitis, nongranulomatous uveitis, факоантигенний увеїт, задній увеїт або аутоімунний увеїт, гломерулонефрит (GN) з або без нефротичного синдрому такий як хронічний або гострий гломерулонефрит, такий як первинний GN, імунноопосередкований GN, мембранозний GN (мембранозна нефропатія), ідіопатичний мембранозний GN або ідіопатична мембранозна нефропатія, мембрано- або мембранозний проліферативний GN (MPGN), включаючи Тип І та Тип II, та швидкопрогресуючий GN, алергічні стани та відповіді, алергічна реакція, екзема, включаючи алергічну або атопічну екзему, астма, така як бронхіальна астма, та аутоімунна астма, стани, що викликають інфільтрацію Т-клітинами, та хронічні запальні відповіді, імунні реакції проти чужорідних антигенів таких як фетальні А-В-0 групи крові протягом вагітності, хронічна запальна хвороба легень, аутоімунний міокардит, недостатність адгезії лейкоцитів, системний червоний вовчак (SLE) або системний люпусний еритематоз такий як шкірний SLE, подгострий шкірний люпусний еритематоз, неонатальний люпусний синдром (NLE), дисемінований люпусний еритематоз, люпус (включаючи нефрит, церебрит, дитячий, не нирковий, екстра нирковий, дискоїдний, алопеція), ювенільний початок діабету (Тип 1), включаючи дитячий інсулінзалежний діабет (EDDM), початок діабету у дорослому віці (Тип 2), аутоімунний діабет, ідіоматичний нецукровий діабет, імунні відповіді, асоційовані з негайною та відстроченою гіперчутливістю, що виникає під впливом цитокінів та Т-лімфоцитів, туберкульоз, саркоїдоз, грануломатоз, включаючи лімфатоїдний грануломатоз, грануломатоз Вагнера, агранулоцитоз, васкуліти, включаючи васкуліт (включаючи васкуліт великих судин (включаючи ревматичну поліміалгію та гігантоклітинний артеріїт (Такаясу)), васкуліт судин середнього калібру (включаючи хворобу Кавасакі та вузловий/ вузловий періартеріальний поліартріїт, мікроскопічний поліартріїт, CNS-васкуліт, некротичний, шкірний 94899 36 або гіперчутливий васкуліт, системний некротизуючий васкуліт та ANCA-асоційований васкуліт, такий як васкуліт або синдром Чурга-Штрауса (CSS)), тем'яний артеріїт, апластична анемія, аутоімунна апластична анемія, Кумбс-позитивна анемія, анемія Даймонда-Блекфана, гемолітична анемія або імунна гемолітична анемія, включаючи аутоімунну гемолітичну анемію (АША), перніціозну анемію (anemia perniciosa), Аддисонову хворобу, анемію з малою кількістю еритроцитів або аплазію (PRCA), дефіцит VIII фактору, гемофілія А, аутоімунна нейтропенія, панцитопенія, лейкопенія, хвороби, що викликають лейкоцитарний діапедез, CNS-запальні розлади, синдром множинного ураження органів, такий як внаслідок септицемії, травми або кровотечі, хвороби, медіатором яких є антиген-антитільний комплекс, хвороба антигломерулярної базальної мембрани, антифосфоліпідний антитільний синдром, алергічний неврит, хвороба Бекета, синдром Кастелмана, синдром Гудпастчера, синдром Рейно, синдром Шенгрена, синдром Стівена-Джонсона, пемфігоїд, такий як бульозний пемфігоїд та шкірний пемфігоїд, пемфігоїд (включаючи пемфігоїд вульгарний, пемфігоїд листоподібний, пемфігоїд слизових мембран та еритрематозний пемфігоїд), аутоімунні поліендокринопатії, хвороба або синдром Рейтера, імунокомплексний нефрит, антитільноопосередкований нефрит, оптичний нейромієліт, полінейропатії, хронічна нейропатія, така як IgM-полінейропатія, або IgM-опосередкована нейропатія, тромбоцитопенія (така як, наприклад, розвивається у пацієнтів з інфарктом міокарду), включаючи тромбоцитопенічну пурпуру (ТТР), посттрансфузіонну пурпуру (РТР), гепарин-індуковану тромбоцитопенію та аутоімунну або імунноопосередковану тромбоцитопенію, таку як ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура (ІТР), включаючи хронічну або гостру ІТР, аутоімунна хвороба яєчок та яєчників, включаючи аутоімунний орхіт та оофорит, первинний гіпотиреоїдизм, гіпопаратиреоїдизм, аутоімунні ендокринні захворювання, включаючи тиреоїдит, такий як аутоімунний тиреоїдит, хворобу Хашимото, хронічний тиреоїдит (тиреоїдит Хашимото), або підгострий тиреоїдит, аутоімунне тиреоїдне захворювання, ідіоматичний гіпотиреїдизм, хвороба Грейвса, полігландулярні синдроми такі як аутоімунні полігландулярні синдроми (або синдроми полігландулярних ендокринопатій), паранеопластичні синдроми, включаючи неврологічні паранеопластичні синдроми такі як міастенічний синдром Ламберта-Ітона або синдром Ітона-Ламберта, синдром застиглої людини, енцефаломієліт, такий як алергічний енцефаломієліт або енцефаломієлітіс аллерджіка та експериментальний алергічний енцефаломієліт (ЕАЕ), міастенія гравіс така як тимома-асоційована міастенія гравіс, мозочкові дегенерація, нейроміотонія, опсоклонус або опсоклонічний міоклонічний синдром (OMS), та сенсорна нейропатія, мультифокальна моторна нейропатія, синдром Шихана, аутоімунний гепатит, хронічний гепатит, люпоїдний гепатит, гігантоклітинний гепатит, хронічний активний гепатит або аутоімунний хронічний активний гепатит, лімфоїдний інтерстиціальний пневмоніт (LIP), облітирую 37 чий бронхіоліт (не трансплантантний) vs NSIP, синдром Гієна-Барре, хвороба Бергера (IgA нефропатія), ідіопатична IgA нефропатія, лінійний IgA дерматоз, первинний міліарний цироз, пневмоцироз, синдром аутоімунної ентеропатії, синдром сонячного сплетіння, целіакія, целіакічні афти (глютенова ентеропатія), рефрактерні афти, ідіопатичні афти, кріоглобулінемія, аміотрофічний латеральний склероз (ALS; хвороба Лу-Геріга), хвороба коронарних артерій, аутоімунна хворобу вух така як аутоімунна хвороба внутрішнього вуха (AIED), аутоімунна втрата слуху, опсоклонічний міоклонічний синдром (OMS), полі хондрит такий як рефрактерний або поворотний полі хондрит, альвеолярний протеїном легень, амілоїдоз, склерит, нераковий лімфоцитом, первинний лімфоцитом, який включає моноклональний В-клітинний лімфоцитоз (e.g., доброякісна моноклональна гаммапатія та моноклональна гаммопатія невизначеного значення, MGUS), периферична нейропатія, паранеопластичний синдром, каналопатії такі як епілепсія, мігрень, аритмія, м'язові розлади, глухота, сліпота, періодичний параліч, та каналопатії ЦНС, аутизм, запальна міопатія, фокальний сегментарний гломерулосклероз (FSGS), ендокринна офтальмопатія, увеоретиніт, хоріоретиніт, аутоімунні гепатологічні розлади, фіброміалгія, множинні ендокринні розлади, синдром Шмідта, адреналіт, атрофія шлунку, пресенільна деменція, демієлінізуючі захворювання такі як аутоімунні демієлінізуючі захворювання та хронічна запальна демієлінізуюча полінейропатія, діабетична нефропатія, синдром Дресслера, вогнищева алопеція, CREST-синдром (кальциноз, феномен Рейно, порушення моторики стравоходу, склеродактилія та телангіектазії), чоловіче та жіноче аутоімунне безпліддя, змішана хвороба сполучної тканини, хвороба Шага, ревматична лихоманка, повторний аборт, легені фермера, полі формна еритема, посткардіотомічний синдром, синдром Кушинга, легеня птахівника, алергічний грануломатозний ангіїт, доброякісний лімфоцитарний ангіїт, синдром Альпорта, альвеоліт, такий як алергічний альвеоліт та фіброзуючий альвеоліт, інтерстиціальна хвороба легень, трансфузійна реакція, лепра, малярія, лейшманіаз, кіпаносоміаз, шистоматоз, аскарідоз, аспергільоз, синдром Самптера, синдром Каплана, лихоманка Денге, ендокардит, ендоміокардіальний фіброз, дифузний інтерстиціальний фіброз легень, фіброз легень, ідіопатичний фіброз легень, муковісцидоз, ендофтальм, еритема elevatum et diutinum, фетальний еритробластомоз еозинофільний фасциїт, синдром Шульмана, синдром Ферті, філяріаз, цикліт, такий як хронічний цикліт, гетерохронічний цикліт, іридоцикліт (гострий або хронічний), цикліт Фуша, пурпура Шенляйн-Геноха, вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), екховірусна інфекція, кардіоміопатія, хвороба Альцгеймера, парвовірусна інфекція, вірусна краснуха, поствакцинальні синдроми, природжена краснуха, вірусна інфекція Епштейна-Барра, епідемічний паротит, синдром Еванса, аутоімунний розлад гонад, хорея Сіденгама, постстрептококковий нефрит, облітеруючий тромбоангіїт, тиреотоксикоз, спинні сухоти, хоріоїдит, 94899 38 гігантоклітинна поліміалгія, ендокринна офтальмопатія, хронічний гіперчутливий пневмоніт, сухий кератокон'юнктивіт, епідемічний кератокон'юнктивіт, ідіопатичний некротичний синдром, нефропатія з мінімальними змінами, доброякісне сімейне та ішемічно-реперфузійне порушення, аутоімунне пошкодження сітківки, запалення суглобів, бронхіт, хронічне обструктивне захворювання легень, сілікоз, афти, афтозний стоматит, атеросклеротичні розлади, асперміогенез, аутоімунний гемоліз, хвороба Бека, кріоглобулінемія, контрактура Дюпюитрена, факоанафілактична ендофтальмія, алергічний ентерит, лепротична вузлова еритема, ідіопатичний параліч обличчя, синдром хронічної втоми, ревматична лихоманка, хвороба ХамманаРіча, сенсоневральна втрата слуху, пароксизмальна гемоглобінурія, гіпогонадізм, регіональний ілеїт, лейкопенія, інфекційний мононуклеоз, поперековий мієліт, первинна ідіопатична мікседема, нефроз, симпатична офтальмопатія, грануломатозний орхіт, панкретит, гострий полірадікуліт, гангренозна піодермія, тиреоїдит де Куервена, набута спінальна атрофія, безпліддя, спричинене антисперматозоїдними антитілами, не злоякісна тимома, вітіліго, SCID та хвороби асоційовані з вірусом Епштейн-Барра, синдром набутого імунодефіциту (СНІД), паразитарні хвороби, такі як лейшманіоз, синдром токсичного шоку, харчове отруєння, стани, що викликають інфільтрацію Т-клітинами, недостатність адгезії лейкоцитів, імунні відповіді, асоційовані з негайною та відстроченою гіперчутливістю, медіаторами якої є цитокіни та Тлімфоцити, хвороби, що викликають діапедез лейкоцитів, синдром множинного ураження органів, хвороби, медіатором яких є комплекс антигенантитіло, хвороба антигломерулярної базальної мембрани, алергічний неврит, аутоімунні поліендокринопатії, оофорит, первинна мікседема, аутоімунний атрофічний гастрит, симпатична офтальмія, ревматичні хвороби, змішані хвороби сполучної тканини, нефротичний синдром, інсуліт, поліендокринний розлад, периферична нейропатія, аутоімунний полігандулярний синдром Тип І, початок у дорослому віці ідіопатичного гіпопаратиреоїдизму (АОIH), повна алопеція, дилятаційна кардіоміопатія, набутий бульозний епідермоліз (ЕВА), гемохроматоз, міокардит, нефротичний синдром, первинний склерозуючий холангіт, гнійний або негнійний синусіт, гострий або хронічний синусіт, етмоїдальний, фронтальний, максілярний або сфеноїдальний синусіти, розлади, пов'язані з еозінофілами, такі як легеневий еозинофільний інфільтрат, еозинофільний-міалгічний синдром, синдром Лефлера, хронічна еозинофільна пневмонія, тропічна еозинофільна пневмонія, бронхопневмонічний аспергільоз, аспергільома або еозинофільні гранульоми, анафілаксія, серонегативний спонділоартрит, аутоімунна поліендокринна хвороба, склерозуючий холангіт, склера, епісклера, хронічний слизово-шкірний кандидоз, синдром Брутона, транзиторна гіпогаммаглобулінемія у дітей, синдром Віскота-Олдрича, атаксіятелеангіектазія, аутоімунні розлади, асоційовані з коллагенозами, ревматизм, неврологічна хвороба, лімфаденіт, ішемічний реперфузійний розлад, 39 зниження відповіді кров'яного тиску, судинна дисфункція, ангіектазійне ураження тканин, кардіоваскулярна ішемія, гіперальгезія, алергічні гіперчутливі розлади, гломерулонефрити, реперфузійний розлад, реперфузійні ураження міокарду або інших тканин, дерматоз з гострозапальними компонентами, гострий гнійний менінгіт або інші запальні захворювання центральної нервової системи, очні або орбітальні запальні захворювання, синдроми, асоційовані з трансфузією гранулоцитів, цитокініндукована токсичність, нарколепсія, гостре серозне запалення, хронічне важкокуповане запалення, пієліт, пневмоцироз, діабетична ретинопатія, діабетичні розлади в судинах великого діаметру, ендартеріальна гіперплазія, пептична виразка, вальвуліт та ендометріоз. "Доброякісний гіперпроліферативний розлад" означає стан пацієнта, що має відношення до клітинної проліферації та визнається ненормальним членами медичної спільноти. Ненормальний стан характеризується рівнем властивостей, який статистично відрізняється від рівня, що спостерігається в організмі, який не страждає подібним розладом. Проліферація клітин передбачає ріст або збільшення клітин шляхом розмноження та включає ділення клітин. Рівень клітинної проліферації може бути виміряний шляхом підрахунку кількості клітин, що з'являються за певний проміжок часу. Прикладами доброякісних гіперпроліферативних розладів є псоріази і поліпи. "Респіраторна хвороба" передбачає ураження дихальної системи та включає бронхіт, астму, включаючи гостру астму та алергічну астму, муковісцидоз, бронхоектази, алергічний або інші риніти або синусіти, дефіцит 1-антитрипсіну, кашель, легеневу емфізему, легеневий фіброз або гіперреактивність дихальних шляхів, хронічну обструктивну хворобу легень та хронічний обструктивний легеневий розлад. "Псоріаз" - це стан, який характеризується обмеженим макулопапульозним висипанням окремих або зливних червоних зі сріблястим покриттям елементів. Псоріатичні ураження найчастіше зустрічаються на ліктях, колінах, волосистій частині голови та тулубі та мікроскопічно характеризується паракератозом та видовженням сітки гребенів. Термін включає різноманітні форми псоріазу, включаючи еритродермічний, пустулярний, середньої гостроти та важковиліковні форми хвороби. "Ендометріоз" означає ектопічні ділянки ендометріальної тканини, які часто формують кісти, що вміщують зміщену кров. Термін "судинна хвороба або розлад" означає різні хвороби або розлади, які впливають на судинну систему, включаючи серцево-судинну систему. Прикладами таких хвороб є атеросклероз, судинна реобструкція, постопераційний судинний стеноз, рестеноз, судинна оклюзія або каротидна обструктивна хвороба, хвороба коронарниих артерій, стенокардія, хвороба дрібних судин, гіперхолестеринемія, гіпертензія та стани, що включають ненормальну проліферацію або функцію клітин епітелію. 94899 40 Термін "стеноз" означає звуження або стріктуру просвіту (наприклад, протоки або каналу) в організмі. Термін "судинний стеноз" означає оклюзію або звуження кровоносних судин. Судинний стеноз часто виникає через жирові відкладення (як у випадку атеросклерозу), або надмірну міграцію та проліферацію гладком'язевих клітин судин та ендотеліальних клітин. Артерії найбільш чутливі до стенозу. Термін "стеноз" включає первинний стеноз та рестеноз. Термін "рестеноз" означає повернення стенозу після лікування первинного стенозу з явним успіхом. Наприклад, "рестеноз" в контексті судинного стенозу передбачає повторний випадок судинного стенозу після його успішного лікування, наприклад, видалення жирових відкладень шляхом ангіопластики (наприклад, чрезшкірна чрезотвірна коронарна ангіопластика), пряма коронарна атеректомія або стентування тощо. Один з факторів виникнення рестенозу - це гіперплазія інтими. Термін "гіперплазія інтими", що використовується взаємозамінно з "неоінтимальна гіпералазія" та "неоінтимальне утворення", передбачає потовщення внутрішнього шару кровоносних судин внаслідок надмірної проліферації та міграції клітин гладкої мускулатури судин та ендотеліальних клітин. Різноманітні зміни, що відбуваються під час рестенозу, часто разом призводять до "ремоделювання судинної стінки". Терміни "балонна ангіопластика" та "чрезшкірна чрезотвірна коронарна ангіопластика" (РТСА) часто використовуються взаємозамінно та означають нехірургічне лікування, що базується на видаленні бляшки з коронарної артерії, використвуючи катетер. Стеноз або рестеноз часто призводять до гіпертензії як результату зростання опору току крові. Термін "гіпертензія" означає ненормально високий артеріальний тиск, тобто вище за нормальний рівень. Термін "поліп" означає масив тканин, що пиступає назовні або вище нормального рівня поверхні і таким чином стає видимим макроскопічно у вигляді гемороїдальної сферичної або неправильної форми структури, що росте на широкій основі або тонкій ніжці. Прикладами є кишковий, ректальний та назальний поліпи. Термін "фіброаденома" означає доброякісне новоутворення, що походить з залозистого епітелію та в якому розрізняють строму з проліферуючих фібропластів та сполучнотканинні елементи. Зазвичай трапляється в тканині грудей. "Астма" - це стан, який проявляється в утрудненні дихання. Бронхіальна астма означає стан легень, при якому наявні численні звуження дихальних шляхів, який може спричинятися спазмом гладкої мускулатури, набряком слизової тканини або мукози в просвіті бронхів та бронхіол. "Бронхіт" означає запалення слизової мембрани бронхів. У цьому документі „ампула" означає контейнер з терапевтичним агентом. Ампула може бути герметично закрита кришкою, яка проколюється шприцом. Зазвичай ампули робляться зі скла. Те 41 рапевтичний агент в ампулі може бути у різних станах, включаючи рідкий, ліофільний, замерзлий тощо. "Листівка-вкладиш" - означає інструкцію, що зазвичай вкладенаються в упаковки з терапевтичними агентами і містять інформацію про показання, способи використання, дозування, призначення, протипоказання та/або попередження щодо використання таких терапевтичних продуктів. ІІ. Продукція антитіл Нижче наводиться опис типової технології продукції HER-антитіл, що використовується у відповідності до даного винаходу. HER-антигеном, що використовується для продукції антитіл, може бути, наприклад, розчинна форма екстрацелюлярного домену HER або його частина, що включає бажаний епітоп. Крім того, для генерації антитіл можуть використовуватися клітини, що експресують HER на своїй клітинній поверхні (наприклад, NIH-3T3 клітини, трансформовані для надекспресії HER2; або лінія клітин карциноми, такі як SK-BR-3 клітини, дивись Stancovski et al. PNAS (USA) 88:8691-8695 (1991)). Інші форми HER-рецепторів, що можуть використовуватися для генерації антитіл, будуть очевидними для спеціалістів. (і) Поліклональні антитіла Поліклональні антитіла переважно вирощуються у тваринах, шляхом числених підшкірних (sc) або інтраперітоніальних (ір) ін'єкцій відповідного антигену та ад'юванту. Корисною може бути кон'югація відповідного антигену з протеїном, який є імуногенним у видів, що імунізуються, наприклад, гемоцианін, сироватковий альбумін, бичачий тиреоглобулін або соєвий трипсіновий інгібітор, з використанням біфункціональних або похідних агентів, наприклад, малімідобензол сульфосукциніламідний ефіру (кон'югація з залишками цистеїну), N-гідроксісукциніламіду (з залишками лізину), 1 глутаральдегіду, янтарного ангідриду, SOCI2, or R 1 N=C=NR, де R та R різні алкільні групи. Тварини імунізуються проти антигену імуногенними кон'югатами або похідними шляхом комбінування, наприклад, 100 μг або 5 μг білку або кон'югати (для кролів або мишей відповідно) з потрійним об'ємом повного ад'юванта Фрейнда та ін'єкцією розчину внутрішньошкірно в кількох місцях. Через місяць тваринам підвищують навантаження підшкірним введенням в кілька місць у обсязі 1/5 - 1/10 початкової кількості пептиду або кон'югати у повному ад'юванті Фрейнда. Через 714 днів тварині пускають кров і досліджують титр антитіл сироватки. Тваринам підвищують навантаження доки титр антитіл не виходить на плато. Тварині, переважно, збільшують навантаження кон'югатою того ж самого антигену, але кон'югованим з іншим білком та/або з іншим перехресним реагентом. Кон'югати, також, можуть бути зроблені в культурі рекомбінантних клітин шляхом злиття білків. Також, агрегацію агентів, таких як галуни доцільно використовувати для підвищення імунної відповіді. (іі) Моноклональні антитіла Існують різноманітні способи продукції моноклональних антитіл. Наприклад, моноклональні антитіла можуть бути вироблені, використовуючи 94899 42 спосіб гібридизації, вперше описаний Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), способами рекомбінації ДНК (U.S. Patent No. 4,816,567). При способі гібридизації миша або інша придатна піддослідна тварина, така як хом'як, імунізується, описаним вище шляхом для виділення лімфоцитів, які продукують або здатні продукувати антитіла, які специфічно зв'язуватимуться з білком, який використовувався для імунізації. Крім того, лімфоцити можуть імунізуватися in vitro. Потім лімфоцити можуть зв'язуватися з мієломними клітинами, використовуючи придатний для цього зв'язувальний агент, такий як поліетиленгліколь, для формування гібридомних клітин (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Клітини гібридоми, приготовані таким чином, висіваються та вирощуються в придатному для цього поживному середовищі, яке, переважно, має в своєму складі одну або більше речовину, що інгібує ріст та виживання введених вихідних мієломних клітин. Наприклад, якщо у вихідних мієломних клітинах недостатньо ферменту гіпоксантингуанінфосфорібозілтрансферази (HGPRT або HPRT), поживне середовище для гібридоми буде мати в своєму складі гіпоксантин, аміноптерин та тимідин (НАТ-середовище), речовини яких будуть попереджувати ріст клітин з недостатністю HGPRT. Бажані мієломні клітини - це ті, що ефективно зв'язуються, підтримують стабільно високий рівень продукції антитіл, підібрані шляхом відбору антитіло-продукуючих клітин та чутливі до таких середовищ як НАТ-середовище. Серед них перевага надається мишачим мієломним лініям, таким як похідні МОРС-21 та МРС-11 мишачі пухлини, що поставляються Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California USA, та SP-2 або X63-Ag8653 клітини, що поставляються American Type Culture Collection, Rockville, Maryland USA. Також були описані для продукування людських моноклональних антитіл лінії клітин людської мієломи та мишачо-людської гетеромієломи (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984); та Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)). Поживні середовища, в яких клітини гібридоми ростуть, досліджуються на предмет продукції моноклональних антитіл, спрямованих проти антигену. Переважно, специфічне зв'язування моноклональних антитіл, які продукуються клітинами гібрид оми визначається імунопреципітацією або дослідженням зв'язування in vitro, таким як радіоімунне дослідження (RIA) або ферментозв'язувальним імуноабсорбентним дослідженням (ELISA). Зв'язувальна спорідненість моноклонального антитіла може, наприклад, визначатися шляхом Scatchard аналізу, описаного у Munson et al., Anal. Biochem., 107:220 (1980). Після ідентифікації гібридомних клітин, як таких, що продукують антитіла бажаної специфічності, спорідненості та/або активності, клони можуть бути субклоновані шляхом обмеженої кількості 43 процедур розведення та вирощуватися стандартними способами (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)). Придатні для цього поживні середовища включають, наприклад, D-MEM або RPMI-1640середовища. Крім того, гібридомні клітини можуть бути вирощені in vivo як асцитичні пухлини у тварин. Моноклональні антитіла, секретовані субклонами, зручно відділяються від поживного середовища, асцитичної рідини або сироватки методами стандартної очистки антитіл, такими як, наприклад, білок A-Sepharose, гідроксілапатитна хроматографія, електрофорез у гелі, діаліз, або аффінна хроматографія. ДНК, що кодує моноклональні антитіла, легко ізолюються та використовується з використанням стандартних процедур (наприклад, використовуючи олігонуклеотидні проби, які сприяють специфічному зв'язуванню з генами, що кодують важкі та легкі ланцюги мишачих антитіл). Клітини гібрид оми слугують найкращим джерелом такої ДНК. Ізольована таким чином ДНК може бути розміщена у векторах експресії, які потім трансфектуються у клітини-реципієнти такі, як клітини Е. соlі, мавпячі COS-клітини, клітини яєчників китайського хом'яка (СНО) або мієломні клітини, які інакше не продукують білки антитіл, для отримання синтезу моноклональних антитіл в рекомбінантних клітинахреципієнтах. Перелік статей щодо рекомбінантної експресії ДНК, що кодують антитіла у бактерій, включають Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993) та Pliickthun, Immunol. Revs., 130:151-188 (1992). Як один з варіантів здійснення винаходу, моноклональні антитіла або фрагменти антитіл можуть бути ізольованими від фагових бібліотек антитіла, генерованих за технологією, описаною у McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) та Marks et al., J. Моl Вiol, 222:581-597 (1991) описують ізоляцію мишачих та людських антитіл відповідно, використовуючи фагові бібліотеки. Наступні публікації описують продукцію людських антитіл з високою спорідненістю (nM рівень) шляхом перетасовування ланцюгів (Marks et al., Bio/Technology, 10:779-783 (1992)), та комбінаторним інфікуванням, та рекомбінацією in vivo як стратегію створення дуже великих фагових бібліотек (Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)). Таким чином, ці технології є конкурентоздатною альтернативою для традиційної технології гібридоми моноклональних антитіл для ізоляції моноклональних антитіл. ДНК може бути модифікована, наприклад, шляхом заміни кодуючої послідовності для константних доменів людських важких і легких ланцюгів в місці гомологічної мишачої послідовності (U.S. Patent No. 4,816,567; та Morrison, et al., Proc. Natl Acad. Set USA, 81:6851 (1984)), або шляхом ковалентного приєднання до імуноглобулінкодуючої послідовності всієї або частини кодуючої послідовності не імуноглобулінового поліпептиду. Зазвичай такі не імуноглобулінові поліпептиди заміщуються константними доменами антитіл або 94899 44 варіабельними доменами одного антигенкомбінуючого сайту антитіла для створення химерного бівалентного антитіла, що має в своєму складі один антиген-комбінуючий сайт, який є специфічним для різних антигенів. (ііі) Гуманізовані антитіла У літературі описані способи гуманізації нелюдських антитіл. Переважно, гуманізовані антитіла мають один або більше амінокислотний залишок, введений в них з нелюдського джерела. Такі нелюдські амінокислотні залишки часто називаються „імпортними" залишками, які зазвичай взяті з „імпортного" варіабельного домену. Гуманізація може бути проведена за методикою Winter та співавторів (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)), шляхом заміни гіперваріабельної ділянки послідовності на відповідну послідовність людського антитіла. Таким чином, такі „гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (U.S. Patent No. 4,816,567), в яких значно менше, ніж інтактний людський варіабельний домен, було замінено відповідною послідовністю, взятою від нелюдського виду. На практиці гуманізовані антитіла - це типово людські антитіла, в яких деяка гіперваріабельна ділянка залишків та, можливо, FR-залишки замінені залишками аналогічних сайтів антитіл гризунів. Вибір людських варіабельних доменів, як легких, так і важких, які використовуються у виробленні гуманізованих антитіл, дуже важливий для зменшення антигенності. Відповідно до так званого методу "найкращої відповідності", послідовність варіабельного домену антитіла гризуна захищується від усієї бібліотеки відомих людських варіабельно-доменних послідовностей. Людська послідовність, яка є найближчою до такої ж у гризунів, приймається за людську матричну ділянку (FR) для гуманізованого антитіла (Sims et al., J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia et al., J. Моl. Biol, 196:901 (1987)). Інший спосіб використовує окрему матричну ділянку, що походить з єдиної послідовності всіх людських антитіл окремої підгрупи легких або важких ланцюгів. Одну і ту ж матрицю можна використовувати для кількох різних гуманізованих антитіл (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta et al., J.Immunol, 151:2623 (1993)). Крім того, важливо щоб гуманізація антитіл проводилася з дотриманням високої спорідненості до антигену та інших сприятливих біологічних властивостей. Для досягнення даної мети, відповідно до обраного способу, гуманізовані антитіла готуються шляхом аналізування вихідних послідовностей та різноманітних концептуальних гуманізованих продуктів, використовуючи тривимірні моделі вихідної та гуманізованої послідовності. Тривимірні моделі імуноглобулінів зазвичай доступні та знайомі для спеціалістів. Існують комп'ютерні програми, які ілюструють та показують можливі тривимірні конформаційні структури обраної послідовності імуноглобуліну. Огляд цих зображень дозволяє аналізувати ймовірну роль залишків у функціонуванні обраної імуноглобулінової послідовності, тобто аналіз залишків, які впливають на 45 здатність обраного імуноглобуліну зв'язуватися з його антигеном. Таким чином, FR-залишки можуть обиратися та комбінуватися між реципієнтними та імпортними послідовностями, так, як це необхідно для характеристик антитіл, таких, як досягання зростання спорідненості до антигену-мішені. Взагалі, залишки гіперваріабельних ділянок суттєво та прямо впливають на зв'язування антигену. WO 01/00245 описує продукцію екземплярів гуманізованих антитіл до HER2, які зв'язують HER2 та блокують активацію ліганд HERрецептора. Гуманізовані антитіла, що розглядаються в цьому документі, блокують EGF, TGF-α та/або HRG-медійовану активацію МАРK так само ефективно, як мишачі моноклональні антитіла 2С4 (або їхні Fab-фрагменти) та/або зв'язують HER2 так само ефективно, як мишині моноклональні антитіла 2С4 (або їхні Fab-фрагменти). Гуманізовані антитіла можуть, наприклад, мати в своєму складі залишки нелюдської гіперваріабельної ділянки, вбудовані у людський варіабельний важкий домен, а також можуть включати в себе матричну ділянку (FR), замінену на позиції, що обрана з групи, яка складається з 69Н, 71Н та 73Н, використовуючи систему нумерації варіабельних доменів, прийняту у Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991). Іноді гуманізоване анитіло має у своєму складі заміни FR у двох або всіх позиціях 69Н, 71Нта 73Н. Типове гуманізоване антитіло, що розглядається тут, має в своєму складі варіабельний важкий домен гіперваріабельної ділянки залишку GFTFTDYTMX, де X є переважно D або S (SEQ ID NO:7); DVNPNSGGSIYNQRFKG (SEQ ID NO:8); та/або NLGPSFYFDY (SEQ ID NO:9), факультативно включає в себе амінокислотні модифікації цих CDR-залишків, наприклад, де модифікації в основному підтримують або покращують аффінність антитіла. Наприклад, варіант антитіла, що розглядається тут, може мати від близько одного до близько сeми або близько п'яти амінокислотних заміщень в зазначених вище варіабельних важких CDR-послідовностях. Такі варіанти антитіл можуть готуватися шляхом аффінного дозрівання, наприклад, як описано нижче. Найбажаніше гуманізоване антитіло має в своєму складі варіабельний важкий домен амінокислотної послідовності у SEQ ID NO:4. Гуманізоване антитіло може мати у своєму складі варіабельний легкий домен гіперваріабельної ділянки залишку KASQDVSIGVA (SEQ ID 1 2 3 і NO:10); SASYXX X X , де X є переважно R або L, 2 3 X є переважно Υ або Е, та X є переважно Τ або S (SEQ ID NO:11); та/або QQYYIYPYT (SEQ ID NO: 12), наприклад, додатково до цих варіабельні важкі домени CDR-залишків у попередньому параграфі. Такі гуманізовані антитіла, як варіант, можуть мати у своєму складі амінокислотні модифікації зазначених вище CDR-залишків, наприклад, де модифікації в основному підтримують або покращують аффінність антитіла. Наприклад, варіант антитіла, який розглядається тут, може мати від близько одного до близько семи або п'яти аміно 94899 46 кислотних заміщень в зазначених вище варіабельних легких CDR послідовностях. Такі варіанти антитіл можуть готуватися шляхом аффінного дозрівання, наприклад, як описано нижче. Найбажаніше гуманізоване антитіло має в своєму складі варіабельний легкий домен амінокислотної послідовності у SEQ ID NO:3. Ця заявка розглядає аффінне дозрівання антитіл, які зв'язують HER2 та блокують активацію ліганд HER-рецептора. Вихідні антитіла можуть бути людськими або гуманізованими, наприклад, можуть мати в своєму складі варіабельну легку та/або важку послідовність SEQ ID Nos. 3 та 4, відповідно (тобто варіант 574). Аффінно зріле антитіло переважно приєднується до HER2peцептора з аффінністю, вищою за мишачий 2С4 або варіант 574 (наприклад, від двох або чотирьох разів до 100 разів або 1000 разів покращеною аффінністю, наприклад, як досліджено при використанні HER2-екстрацелюлярного домену (ECD) ELISA). Типові варіабельні важкі CDR-залишки для заміни включають Н28, НЗО, Н34, Н35, Н64, Н96, Н99, або комбінації двох або більше (наприклад, два, три, чотири, п'ять, шість або сім таких залишків). Приклади варіабельних легких CDR залишків для альтерації включають L28, L50, L53, L56, L91, L92, L93, L94, L96, L97 або комбінації двох або більше (наприклад, два, три, чотири, п'ять, або до десять таких залишків). Передбачаються різноманітні форми гуманізованих антитіл або аффінно зрілих антитіл. Наприклад, гуманізоване антитіло або аффінно зріле антитіло може бути фрагментом антитіла, таким як Fab, який довільно кон'югується з одним або більше цитотоксичним агентом в такому порядку, щоб генерувати імунокон'югату. Крім того, гуманізоване антитіло або аффінно зріле антитіло може бути інтактним антитілом, таким як інтактне IgG1антитіло. Бажане інтактне IgG1-антитіло має в своєму складі легколанцюгову послідовність у SEQ її) N0: 13 та важколанцюгову послідовність у SEQ ID NO: 14. (iv) Людські антитіла Як альтернатива гуманізації можуть генеруватися людські антитіла. Наприклад, зараз можливо відтворювати трансгенних тварин (наприклад, мишей), які здатні, при імунізації, створювати повний репертуар людських антитіл при відсутності ендогенної продукції імуноглобулінів. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція гена важколанцюгової з'єднувальної ділянки антитіла (JH) в химерній та зародковій мутантній миші призводить до повного пригнічення ендогенної продукції антитіл. Пасаж генного масиву людського зародкового імуноглобуліну в такий зародиш миші призводить до продукції людських антитіл у відповідь на введення антигену. Дивись, наприклад, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et ah, Nature, 362:255-258 (1993); Braggermann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); та U.S. Patent Nos. 5,591,669, 5,589,369 та 5,545,807. Як альтернатива, для продукції людських антитіл та антитільних фрагментів in vitro з імуноглобулінового варіабельного (V) домену генного репертуару неімунізованих донорів може 47 використовуватися технологія фагової індикації (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)). Відповідно до цієї технології, гени антитіл V домену клонуються у матриці в гени більших або менших поверхневих білків ниткоподібного бактеріофагу, такого як Μ13 або fd, та проявляються як функціональні антитільні фрагменти на поверхні фагової частинки. Через те, що ниткоподібні частинки мають в своєму складі односпіральну ДНК-копію геному фагу, селекції, що базуються на функціональних властивостях антитіла, також викликають селекцію генів, що кодують виявлення антигенами цих властивостей. Таким чином, фаг мімікрує деякі властивості В-клітини. Фагова індикація може проводитись у кількох форматах, для детальнішої інформації про них дивись, наприклад, Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Деякі джерела сегментів V-гену можуть використовуватися для фагової індикації. Clackson et al., Nature, 352.624628 (1991) виділяють різні масиви антиоксазолонових антитіл з маленької довільної комбінаторної бібліотеки V-генів з селезінки імунізованої миші. Репертуар V-генів від неімунізованих людських донорів може бути сформований та антитіла до різних масивів антигенів (включаючи власні антигени) можуть бути ізольовані переважно за технологією, описаною Marks et al., J. Моl Biol. 222:581597 (1991) або Griffith et al., EMBOJ. 12:725-734 (1993). Дивись також U.S. Patent Nos. 5,565,332 та 5,573,905. Як зазначено вище, людські антитіла також можуть генеруватися активованими in vitro Вклітинами (див. U.S. Patents 5,567,610 та 5,229,275). Людські НЕК2-антитіла описані у U.S. Patent No. 5,772,997, виданому 30 червня 1998р. та WO 97/00271, опублікованому 3 січня 1997р (ν) Фрагменти антитіл Було розроблено різноманітні технології для продукції фрагментів антитіл, які мають в своєму складі одну або більше антиген-зв'язуючі ділянки. Зазвичай ці фрагменти були похідними протеолітичного травлення інтактних антитіл (дивись, наприклад, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) та Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Однак, зараз ці фрагменти можуть продукуватися прямо рекомбінантними клітинами-реципієнтами. Наприклад, фрагменти антитіл можуть ізолюватися від фагових бібліотек антитіл як зазначено вище. Як альтернатива, Fab'-SH фрагменти можуть прямо отримуватися від Е. соlі та хімічно з'єднуватися для формування F(ab')2-фрагментів (Carter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Відповідно до іншого підходу, F(ab')2 фрагменти можуть ізолюватися безпосередньо з культури рекомбінантних клітин-реципієнтів. Інші технології продукування фрагментів антитіл зрозумілі обізнаному практику. За іншими варіантами здійснення винаходу, обирається антитіло, яке є одноланцюговим Fvфрагментом (scFv). Дивись WO 93/16185; U.S. Patent No. 5,571,894 та U.S. Patent No. 5,587,458. Фрагмент антитіла також може бути „лінійним антитілом", наприклад, як описано у U.S. Patent 94899 48 5,641,870. Такі фрагменти лінійних антитіл можуть бути моноспецифічними або біспецифічними. (vi) Біспецифічні антитіла Біспецифічні антитіла - це антитіла, які мають зв'язувальні властивості, принаймні для двох різних епітопів. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть приєднуватися до двох різних епітопів HER2 протеїну. Інші подібні антитіла можуть створювати НЕR2-зв'язувальний сайт зі зв'язувальним сайтом (сайтами) для EGFR, HER3 та/або HER4. Як альтернатива, НЕК2-плече може комбінуватися з плечем, яке приєднується до тригерної молекули на лейкоциті, такої як молекула Т-клітинного рецептора (наприклад, CD2 або CD3), або Fcрецептори до IgG (FcR), такі як FcRl (CD64), FcRII (CD32) та FcRIII (CD 16) для того, щоб сфокусувати механізм захисту клітин на НЕR2експресуючих клітинах. Біспецифічні антитіла також можуть використовуватися для локалізації цитотоксичних агентів до клітин, які експресують HER2. Ці антитіла мають НЕR2-зв'язуюче плече та плече, яке зв'язує цитотоксичний агент (наприклад, сапорин, антиінтерферон-а, алкалоїд барвінку, рицин-А-ланцюг, метотрексат або гаптен з радіоактивним ізотопом). Біспецифічні антитіла можуть готуватися як повнорозмірні антитіла або фрагменти антитіл (наприклад, F(ab')2 біспецифічні антитіла). WO 96/16673 описує біспецифічне HER2/ FcRIII антитіло, а U.S. Patent No. 5,837,234 розкриває біспецифічне HER2/ FcRI антитіло ШМ1 (Osidem). Біспецифічне HER2/Fcα антитіло показане у WO 98/02463. U.S. Patent No. 5,821,337 описує біспецифічне HER2/CD3 антитіло. MDX-210 - це біспецифічне HER2- FcRIII Ab. Відомі способи вироблення біспецифічних антитіл. Традиційна продукція повнорозмірних біспецифічних антитіл базується на ко-експресії двох пар важколегколанцюгових імуноглобулінів, де два ланцюги мають різні специфікації (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Через довільний набір важких і легких ланцюгів імуноглобулінів такі гібридоми (квадроми) продукують потенційну суміш з десяти різних молекул антитіл, з яких тільки одна має правильну біспецифічну структуру. Очищення правильної молекули, яке зазвичай робиться аффінно-хроматографічним способом, достатньо незручне та продуктивність його низька. Схожі процедури описані у WO 93/08829, та у Traunecker et al., EMBOJ., 10:3655-3659(1991). Відповідно до іншого підходу, варіабельні домени антитіл з бажаними зв'язуючими властивостями (антитіло-антиген комбінуючі сайти) приєднуються до послідовностей константного домену імуноглобуліну. Перевага надається приєднанню до константного домену важкого ланцюга імуноглобуліну, що має в своєму складі принаймні частину шарніру, СН2, та СН3 регіони. Перевага надається першій важколанцюговій константній ділянці (СН1), що має в своєму складі сайт, необхідний для приєднання легкого ланцюга, присутнього в принаймні одному з'єднанні. ДНК, що кодує з'єднання важкого ланцюга імуноглобуліну, та, якщо необхідно, легкого ланцюга імуноглобуліну вставляються в окремі вектори експресії та ко 49 трансфектуються в придатний для цього організм реципієнта. Це забезпечує велику гнучкість в регулюванні взаємних пропорцій трьох поліпептидних фрагментів у варіантах здійснення, коли не рівні коефіцієнти трьох поліпептидних ланцюгів, що використовуються в конструкції, що забезпечує оптимальну продуктивність. При цьому існує можливість помістити кодуючі послідовності для двох або всіх трьох ланцюгів поліпептидів в один вектор експресії, коли експресія принаймні двох поліпептидних ланцюгів в рівних пропорціях призводить до високої продуктивності або коли співвідношення не має особливого значення. Відповідно до бажаного варіанту здійснення цього підходу, біспецифічні антитіла складаються з гібридних важких ланцюгів іммуноглобуліну з першим зв'язувальним сайтом на одному плечі та гібридною парою важкий-легкий ланцюг імуноглобуліну (забезпечує другий зв'язувальний сайт) на іншому плечі. Було виявлено, що ця асиметрична структура дає можливість сепарації бажаної біспецифічної суміші від небажаних комбінацій ланцюгів іммуноглобуліну, таких як присутність легкого ланцюгу іммуноглобуліну тільки в одній половині біспецифічної молекули, яка забезпечує можливість сепарації. Цей підхід розкривається у WO 94/04690. Для більш детальної інформації про генерування біспецифічних антитіл дивись, наприклад, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210(1986). Відповідно до іншого підходу, що описано у U.S. Patent No. 5,731,168, інтерфейс між парою антитільних молекул може бути створений для максималізації проценту гетеродимерів, які походять з культури рекомбінантних клітин. Найкращий інтерфейс має в своєму складі принаймні частину СН3-домену константного домену антитіла. В цьому способі одна або більше маленьких амінокислот бічних ланцюгів інтерфейсу молекули першого антитіла заміщена більшим бічним ланцюгом (наприклад, тирозином або триптофаном). Компенсаторні „порожнини" ідентичного або схожого розміру з великим бічним ланцюгом (ланцюгами) створюються на інтерфейсі другої молекули антитіла заміщенням великої амінокислоти бічного ланцюга на меншу (наприклад, аланіном або треоніном). Це забезпечує механізм зростання продукції гетеродимерів більше інших небажаних кінцевих продуктів, таких як гомодимери. Біспецифічні антитіла включають зшиті або "гетерокон'юговані" антитіла. Наприклад, одне з таких антитіл в гетерокон'югаті може бути зв'язане з авідіном, інше з біотіном. Такі антитіла, наприклад, пропонувалися для націлення клітин імунної системи на небажані клітини (U.S. Patent No. 4,676,980), та для лікування ВІЛ-інфекції (WO 91/00360, WO 92/200373 та ЕР 03089). Гетерокон'юговані антитіла можуть бути створені з використанням будь-якого зручного зшивального способу. Придатні для цього зшиваючі агенти добре відомі та описані у U.S. Patent No. 4,676,980, наряду з іншими зшиваючими технологіями. Технології генерації біспецифічних антитіл з антитільних фрагментів також були описані в літературі. Наприклад, біспецифічні антитіла можуть 94899 50 бути створені, використовуючи хімічну зшивку. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) описують процедуру, при якій інтактні антитіла протеолітично розщеплюються для генерації Р(аЬ')2фрагментів. Ці фрагменти зменшуються у присутності дітіол-комплесуючого агенту карбонату арсену для стабілізації кристалів дітіолу та попередження інтермолекулярної дисульфідної формації. Згенеровані Fab'-фрагменти потім конвертуються у похідні тіонітробензоату (TNB). Одна з похідних Fab'-TNB потім реконвертується у Fab'-тіол шляхом редукції з меркаптоетиламіном та змішується з рівномолекулярною кількістю іншої похідної Fab'TNB для формування біспецифічного антитіла. Вироблене біспецифічне антитіло може використовуватися як агент для селективної іммобілізації ферментів. Сучасний розвиток зробив можливим пряме виділення Fab'-SH фрагментів з Е. соlі, які можуть хімічно з'єднуватися для формування біспецифічних антитіл. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217225 (1992) описують продукцію Р(аЬ')2-молекули повністю гуманізованого біспефічного антитіла. Кожен Fab'-фрагмент був окремо секретований з Е. соlі та підданий прямій хімічній з'єднувальній реакції in vitro для формування біспецифічного антитіла. Сформоване таким чином біспецифічне антитіло було здатне до приєднання до клітин з надекспресією НЕR2-рецептору та нормальних людських Т-клітин, так само, як і тригерів літичної активності людських цитотоксичних лімфоцитів проти людської пухлини грудей. Також були описані різноманітні технології вироблення та ізоляції біспецифічних антитільних фрагментів прямо у культурі рекомбінантних клітин. Наприклад, біспецифічні антитіла були продуковані з використанням лейцинової „блискавки". Kostelny et al.J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992). Пептиди лейцинової „блискавки" з Fos та Jun білків були зчеплені з Fab'-частинами двох різних антитіл шляхом генного злиття. Гомодимери антитіл були зменшені у шарнірній області для формування мономерів і подальшого окислення для формування гетеродимерів антитіл. Цей спосіб може також використовуватися для продукції гомодимерів антитіл. Технологія „димерних фрагментів антитіл", описана у Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993), забезпечила альтернативний механізм вироблення фрагментів біспецифічних антитіл. Фрагменти мають у своєму складі варіабельний домен важкого ланцюга (VH), з'єднаний з варіабельним доменом легкого ланцюга (VL) за допомогою зшивача, який є закоротким для того, щоб дозволити кон'югацію між двома доменами одного ланцюга. Відповідно, VH та VL домени одного фрагменту змушені паруватися з комплементарними VL та VH доменами іншого фрагменту, таким чином, формуючи антигензв'язуючі сайта. Також відомо про іншу методику вироблення біспецифічних фрагментів антитіл за допомогою о дно ланцюгових Fv (sFv) димерів. Дивись Graber et al., J. Immunol, 152:5368 (1994). Розглядаються також антитіла з більше ніж двома валентностями. Наприклад, можуть бути 51 створені трьохвалентні антитіла. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991). (vii) Інші модифікації амінокислотної послідовності Береться до уваги модифікація (модифікації) амінокислотної послідовності антитіл, розглянута вище. Наприклад, бажаним може бути покращення зв'зувальної спорідненості та/або інших біологічних функцій антитіл. Варіанти амінокислотної послідовності антитіла створюються шляхом введення відповідних нуклеотидних змін в нуклеїнову кислоту антитіла або шляхом пептидного синтезу. Такі модифікації включають, наприклад, делеції з та/або вставки в, та/або заміни залишків амінокислотними послідовностями антитіла. Будь-яку комбінацію делеції, вставлення та заміни роблять для досягнення фінальної конструкції, за умови, що фінальна конструкція має бажані характеристики. Амінокислотні зміни можуть також змінювати посттрансляційні процеси антитіла, такі як зміна числа або позицій глікозильованих сайтів. Корисний метод ідентифікації певних залишків або ділянок антитіла, які є найкращими місцями для мутагенезу називається „аланін скануючий мутагенез", як це описано у Crniningham and Wells Science, 244:1081-1085 (1989). Залишок або група залишків-мішеней ідентифікуються (наприклад, заряджені залишки, такі як arg, asp, Ms, lys, та glu) та переміщуються нейтральною або негативно зарядженою амінокислотою (найкраще аланіном або поліаланіном) для ураження зв'язку амінокислот з антигеном. Такі амінокислотні локуси, що демонструють функціональну чутливість до замін, потім очищуються шляхом введення подальших або інших варіантів у чи для сайтів заміни. Таким чином, якщо сайт для введення варіанту амінокислотної послідовності предетермінований, характер мутації за своєю суттю не повинен бути предетермінований. Наприклад, для аналізу ефектів мутації даного сайту проводиться ала-сканування або довільний мутагенез в об'єктному кодоні або ділянці, та експресовані варіанти антитіла досліджуються на наявність бажаної активності. Вставки амінокислотних послідовностей включають аміно- та/або карбокси-кінцеві з'єднання, ранговані за довжиною з одного залишку до поліпептиду, що має в своєму складі сто або більше залишків та вставки окремих або множинних амінокилотних залишків всередині послідовності. Прикладами кінцевих вставок є антитіло з Nкінцевим метіоніловим залишком або антитіло, зв'язане з цитотоксочним поліпептидом. Інші вставні варіанти молекули антитіла включають приєднання N- або С-кінцевих антитіл до ферментів (наприклад, до ADEPT) або поліпептид, який збільшує період напіврозпаду антитіла у сироватці. Інший тип варіанту - заміщений амінокислотний варіант. Ці варіанти мають принаймні один амінокислотний залишок в молекулі антитіла заміщений іншим залишком. Сайти, які викликають найбільше зацікавлення у зв'язку з замінним мутагенезом, включають гіперваріабельні ділянки, але також розглядаються FR-альтерації. Консервативні заміни показані у Таблиці 1 під назвою "бажані 94899 52 зміни". Якщо такі заміни призводять до зміні біологічної активності, тоді більш суттєві зміни, що зазначено як "типові зміни" у Таблиці 1 або більш повно описано нижче у поясненні до амінокислотних класів, можуть бути представлені, а відповідні продукти - досліджені. Таблиця 1 Вихідний залишок Ala (A) Arg(R) Asn(N) Asp (D) Cys (С) Gln(Q) Glu (E) Glv (G) His (H) He (I) Leu (L) Lys (K) Met(M) Phe (F) Pro (P) Ser(S) Thr(T) Trp(W) Tyr(Y) Val (V) Типові зміни Бажані зміни Val Lys Gin Glu Ser Asn Asp Ala Arg Phe; Leu Val; Leu; lle Lys; Gln; Asn Gin; His; Asp, Lys; Arg Glu; Asn Ser; Ala Asn; Glu Asp; Gln Ala Asn; Gln; Lys; Arg Leu; Val; Met; Ala; Norleucine Norleucine; Ile; Val; Met; Ala; Phe Arg; Gln; Asn Leu; Phe; Ile Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Ala Thr Val; Ser Tyr; Phe Trp; Phe; Thr; Ser Не; Leu; Met; Phe; Ala; Norleucine He Arg Leu Tyr Ala Thr Ser Tyr Phe Leu Суттєві модифікації у біологічних властивостях антитіла досягаються шляхом селекції змін, які значно відрізняються у їхньому впливі на підтримання (а) структури поліпептидного скелету у місці заміщення, такої як, наприклад, листова або спіральна структура; (b), заряду або гідрофобності молекули у сайті-мішені, або (с) об'єму бічного ланцюга. Амінокислоти можуть групуватися за схожістю властивостей їхніх бічних ланцюгів (у A. L. Lehninger, in Biochemistry, second ed., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)) наступним чином: (1) неполярні: Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M) (2) з незарядженою полярністю: Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (С), Тут (Y), Asn (N), Gln(Q) (3) кислотні: Asp (D), Glu (E) (4) базисні: Lys (K), Arg (R), His(H) Крім того, залишки, які трапляються у природі, можуть бути розподілені на групи на основі спільних властивостей бічних ланцюгів: (1) гідрофобні: Norleucine, Met, Ala, Val, Leu, Ile; (2) нейтральні гідрофільні: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) acidic: Asp, Glu; (4) базисні: His, Lys, Arg; (5) залишки, які впливають на орієнтацію: Gly, Pro; (6) ароматичні: Trp, Туr, Phe. 53 Неконсервативні заміни призведуть до зміни члену одного з цих класів на інший клас. Будь-який цистеїновий залишок, що не відповідає за підтримання потрібної структури антитіла, також може бути замінений, частіше за все серином - для покращення окисної стабільності молекули та попередження абберантного перехресного зшивання. І навпаки, цистеїновий зв'язок (зв'язки) може додаватися до антитіла для покращення його стабільності (зокрема, там де антитіло - це антитільний фрагмент, такий як Fv-фрагмент). Найбажаніший тип замінного варіанту передбачає заміну однієї або більше гіперваріабельних ділянок залишків вихідного антитіла (наприклад, гуманізованого або людського антитіла). Загалом, отриманий варіант(и), обраний для подальшого розвитку, покращує біологічні властивості вихідного антитіла, з якого вони генерувалися. Придатний для цього шлях генерування таких замінних варіантів включає аффінне дозрівання з використанням фагової індикації. Коротше кажучи, кілька сайтів гіперваріабельних ділянок (наприклад, сайти 6-7) піддаються мутації для генерації всіх можливих амінних заміщень в кожному сайті. Варіанти антитіл, генеровані таким чином, індикуються у моновалентному вигляді з частинок ниткоподібного фага як зв'язки з геном ПІ продуктом М13, що укомплектований з кожною частинкою. Фаг-індиковані варіанти потім досліджуються на предмет біологічної активності (наприклад, зв'язувальної спорідненості). З метою ідентифікації гіперваріабельних ділянок сайтів, що є кандидатами для модифікації, може проводитися аланінскануючий мутагенез для ідентифікації гіперваріабельних ділянок залишків, які значно впливають на зв'язування антигену. Як альтернатива або додатково може бути корисно провести аналіз кристалічної структури комплексу антиген-антитіло для ідентифікації контактних точок між антитілом та людським HER2. Такі контактні залишки та суміжні залишки є кандидатами для заміни відповідно до технологій ретельно викладених вище. Якщо такі варіанти генеруються, варіантна панель підлягає описаному вище скринінгу та антитіла з кращими властивостями, показаними в одному або більше дослідженні, можуть обиратися для наступного розвитку. Інший тип амінокислотного варіанту антитіла змінює оригінальну глікозильовану структуру антитіла. Під зміною мається на увазі видалення одного або більше вуглеводних фрагментів, знайдених у антитілі та/або додавання одного або більше сайтів глікозиляції, яких немає в антитілі. Глікозиляція антитіл зазвичай буває Nзв'язаною або О-зв'язаною. N-зв'язана передбачає приєднання вуглеводу до бічного ланцюга аспаргінового залишку. Трипептидні послідовністі аспаргін-Х-серин та аспаргін-Х-треонін, де X - це будь-яка амінокислота, крім проліну, є послідовностями, які розпізнаються для ферментного приєднання вуглеводу до аспаргінової частини ланцюга. Таким чином, присутність кожної з цих трипептидних послідовностей створює потенційний сайт глікозиляції. О-зв'язана глікозиляція передбачає приєднання одного з цукрів Nацетилгалактозаміну, галактози або ксилози до 94899 54 гідроксиамінової кислоти, найчастіше серину або треоніну, хоча також може використовуватись 5гідроксипролін або 5-гідроксилізин. Додавання сайтів глікозиляції до антитіла значною мірою досягається зміною амінокислотної послідовності, такої як та, що має у своєму складі одну або більше з описаних вище трипептидних послідовностей (для N-зв'язаних сайтів глікозиляції). Зміни також можуть завдаватися шляхом додавання до або заміни одного або більше серинового або треонінового залишку у послідовності вихідного антитіла (для О-зв'язаних сайтів глікозиляції). Якщо антитіло має у своєму складі Fc-ділянку, прикріплений до нього вуглевод може бути змінений. Наприклад, антитіла зі стабільною вуглеводною структурою та нестачею фукози, прикріпленої до Fc-ділянки антитіла, описані у US Pat Appl No US 2003/0157108 Al, Presta, L. Дивись також US 2004/0093621 A1 (Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd). Антитіла з половиною N-ацетилглюкозаміну (GlcNAc) в прикріпленому до Fc-ділянки антитіла вуглеводі описані у WO 03/011878, Jean-Mairet et al. та US Patent No. 6,602,684, Umana et al. Антитіла з принаймні одним галактозним залишком в прикріпленому до Fc-ділянки антитіла олїгосахариді описані у WO 97/30087, Patel et al. Дивись також WO98/58964 (Raju, S.) та WO 99/22764 (Raju, S.) стосовно антитіл зі зміненим вуглеводом, прикріпленим до їх Fc-ділянки. Може бути доцільним модифікувати антитіло винаходу стосовно ефекторної функції, наприклад, таким чином, щоб посилити антиген-залежну клітинно-медійовану цитотоксичність (ADCC) та/або комплемент-залежну цитотоксичність антитіла (CDC). Це може бути досягнуто введенням однієї або більше амінокислотних замін до Fc-ділянки антитіла. Як альтернатива або додатково, до Fcділянки може бути введений цистеїновий залишок (залишки), дозволяючи таким чином формування дісульфідного зв'язку в цій ділянці. Гомодимерне антитіло, згенероване таким чином, може покращувати здатність до інтерналізації та/або підвищення комплемент-медійованого знищення клітин та антиген-залежно клітинно-медійовану цитотоксичність (ADCC). Дивись Caron et al., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) та Shopes, В. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Гомодимерні антитіла з покращеною антипухлинною активністю також можна готувати, використовуючи гетеробіфункціональні перехресні зшивачі, як описано у Wolff et al. Cancer Research 53:2560-2565 (1993). Як альтернатива, може бути створене антитіло, яке має подвійну Fc-ділянку та покращений таким чином комплементний лізіс та ADCC-можливості. Дивись Stevenson et al. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). WO 00/42072 (Presta, L.) описує антитіла з покращеною ADCC-функцією у присутності людських ефекторних клітин, де антитіла мають у своєму складі амінокислотні заміни у їх Fc-ділянці. Перевага надається антитілу з покращеною ADCC, що має у своєму складі заміни на позиціях 298, 333 та/або 334 Fc-ділянки. Перевага надається зміненій Fc-ділянці людського IgGl, Fc-ділянка якого має 55 у своєму складі заміни на одній, двох або трьох таких позиціях. Антитіла зі зміненим Clq-зв'язуванням та/або комплемент-залежною цитотоксичністю (CDC) описані у WO 99/51642, US Patent No. 6,194,551B1, US Patent No. 6,242,195B1, US Patent No. 6,528,624B1 та US Patent No. 6,538,124 (Idusogie et al.). Антитіла мають у своєму складі амінокислотні заміни на одній або більше амінокислотній позиції 270,322, 326, 327, 329, 313, 333 та/або 334 їх Fcділянки. Для збільшення сироваткового напівперіоду життя антитіла можна включати рецептор реутилізації зв'язувального епітопу в антитіло, (особливо в антитільний фрагмент) як описано, наприклад, у US Patent 5,739,277. Термін "рецептор реутилізації зв'язувального епітопу" використовується тут для позначення епітопу Fc-ділянки молекули IgG (наприклад, IgG1, IgG2, IgG3, або IgG4), які відповідають за збільшення сироваткового напівперіоду життя молекули IgG in vivo. Антитіла з покращеним зв'язуванням з неонатальним Fc-рецептором (FcRn), та збільшеними напівперіодами життя описані у WO 00/42072 (Presta, L.). Такі антитіла мають у своєму складі Fc-ділянку з однією або більше заміною, які покращують зв'язування Fcділянки з FcRn. Наприклад, Fc-ділянка може мати заміни на одній або більше позиціях 238, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 або 434. Перевага надається варіанту антитіла з Fc-ділянкою з покращеним FcRn-зв'язуванням, яке має у своєму складі амінокислотні заміни на одній, двох або трьох позиціях 307, 380 та 434 Fc-ділянки. Також розглядаються створені антитіла з трьома або більше (найкраще з чотирма) функціональними антиген-зв'язувальними сайтами (US Appln No. US 2002/0004587 Al, Miller et al.). Молекули нуклеїнової кислоти, що кодують варіанти амінокислотної послідовності антитіла, готують різноманітними відомими способами. Ці способи включають, але не обмежуються цим, ізоляцію від природного джерела (у випадку варіантів амінокислотної послідовності, які зустрічаються у природі) або приготування шляхом олігонуклеотид-медійованого (або сайт-спрямованого) мутагенезу, ПЛР-мутагенезу, та касетного мутагенезу раніше підготованих варіантів або неваріантної версії антитіла. (viii) Скринінг антитіл з бажаними властивостями Технології генерації антитіл були описані вище. Антитіла можуть обиратися за певними біологічними характеристиками, які є бажаними. Для ідентифікації антитіла, яке блокує ліганду активації HER-рецептора, може визначатися можливість антитіла до блокування HER-ліганди, яка приєднується до клітин, що експресують HERрецептор (наприклад, при кон'югації з іншим HERрецептором, з яким відповідний HER-рецептор формує HER-гетероолігомер). Наприклад, клітини, які природньо експресують або трансфектовані до експресування HER-рецепторів HERгетероолігомеру, можуть бути інкубовані з антитілом, а потім піддані впливу міченої HER-ліганди. 94899 56 Здатність антитіла блокувати приєднання ліганди до HER-рецептора в HER-гетероолігомері може бути оцінена. Наприклад, пригнічення приєднання HRG до МСР7-лінії клітин пухлини грудей HER2антитілами може проводитись, використовуючи моношар MCF7 культур на льоду у 24-чарунковій тарілці, як описано у WO 01/00245. HER2моноклональні антитіла можуть додаватися до кожної чарунки та інкубуватися 30 хвилин. І-мічені rHRGβ1 177-224 (25 pm) можуть потім додаватися та інкубація може подовжуватися на 4-16 годин. Крива доза-відповідь може готуватися та ІС50 об'єм може підраховуватися для антитіла, яке представляє інтерес. За одним з варіантів здійснення винаходу, антитіло, яке блокує ліганду активації HERрецептора буде мати ІС50 для пригнічення приєднання HRG до MCF7-клітин, в цьому дослідженні приблизно 50nМ або менше, а краще 10nМ або менше. Там, де антитіло є антитільним фрагментом, таким як Fab-фрагмент, ІС50 для пригнічення приєднання HRG до МСР7-клітин може, наприклад, бути приблизно 100nМ або менше, а краще 50nМ або менше. Як альтернатива, або додатково, може бути оцінена здатність антитіла до блокування HERліганд-стимульованої тирозинової фосфориляції HER-рецептора, присутнього в HERгетероолігомері. Наприклад, клітини, які ендогенно експресують HER-рецептори або трансфектовані до їх експресування, можуть інкубуватися з антитілом і потім досліджуватись на предмет HERліганд-залежної тирозинової фосфориляційної активності, використовуючи антифосфотирозинові моноклональні антитіла (які довільно кон'юговані з міткою, яку можна розпізнати). Дослідження кіназного рецептора описане у U.S. Patent No. 5,766,863, також доступне для визначення HERрецепторної активації та блокування цієї активації антитілом. В одному з прикладів здійснення винаходу, визначається антитіло, яке пригнічує HRGстимуляцію p180 тирозинової фосфориляції у МСР7-клітинах, як описано у WO 01/00245. Наприклад, МСF7-клітини можуть досліджуватися у 24чарункових тарілках та моноклональні антитіла до HER2 можуть додаватися до кожної чарунки та інкубуватися протягом 30 хвилин при кімнатній температурі; потім rHRGβ1 177-244 можуть додаватися до кожної чарунки до кінцевої концентрації 0.2nМ, та інкубація може подовжуватися до 8 хвилин. Середовище може аспіруватися з кожної чарунки та реакції можуть зупинятися шляхом додавання 100 μl SDS буферного зразку (5% SDS, 25 mMDTT, та 25 mM Tris-HCl, pH 6.8). Кожний зразок (25 μl) може піддаватися електрофорезу у 4-12% гелі (Novex) та потім переноситься за допомогою електрофорезу до полівінілідіндифторидної мембрани. Антифосфотирозиновий (1 μг/мл) імуноблоттінг може розвиватися та інтенсивність предомінантного реактивного тяжу з Мr -180,000 може підраховуватися шляхом відображальної денситометрії. Обране антитіло буде переважно пригнічувати HRG-стимуляцію p180 тирозинової фосфориляції до приблизно 0-35% від контрольного в 57 цьому дослідженні. Крива доза-відповідь для пригнічення HRG-стимуляції ρ 180 тирозинової фосфориляції, яка визначена відображальною денситометрією, може бути намальована та ІС50 для антитіла, що представляє інтерес, може бути підрахована. В одному випадку антитіло, яке блокує ліганду активації HER-рецептора, буде мати ІС50 для пригнічення HRG-стимуляції p180 тирозинової фосфориляції у цьому досліді приблизно 50nМ або менше, а краще 10nМ і менше. Там, де антитіло є фрагментом антитіла, таким як Fab-фрагмент, ІС50 для пригнічення HRG-стимуляції р180 тирозинової фосфориляції в цьому досліді може, наприклад, бути приблизно 100nМ або менше, а краще 50nМ і менше. Також можна оцінити ефективність пригнічення росту антитіла на MDA-MB-175-клітинах, наприклад, як описано у Schaefer et al. Oncogene 15:1385-1394(1997). Відповідно до цієї оцінки, MDA-MB-175-клітини можуть очищатися за допомогою моноклонального антитіла до HER2 (10μг/мл) за 4 дні та фіксуватися за допомогою кристалвіолету. Інкубація з антитілом до HER2 може виявити ефект пригнічення росту на цій лінії клітин, подібний до показаного моноклональним антитілом 2С4. У наступному випадку екзогенний HRG не змінить суттєво цього пригнічення. Перважно антитіло буде здатне пригнічувати проліферацію клітин MDA-MB-175 в більшій мірі, ніж моноклональне антитіло 4D5 (та іноді в більшій мірі, ніж моноклональне антитіло 7F3), у присутності або відсутності екзогенного HRG. В одному випадку антитіло до HER2, яке представляє інтерес, може блокувати херегулінзалежну асоціацію HER2 з HER3 в обох MCF7 та SK-BR-3-клітинах, як визначено у коімунопреціпетантному експерименті, такому як описаний у WO 01/00245 в основному більш ефективно, ніж моноклональне антитіло 4D5, та краще більш ефективно, ніж моноклональне антитіло 7F3. Для ідентифікації антитіл до HER2, які є інгібіторами росту, можна визначати антитіла, які пригнічують ріст ракових клітин, які надекспресують HER2. В одному випадку антитіло вибору, що пригнічує ріст, здатне пригнічувати ріст SK-BR-3клітин в культурі клітин приблизно на 20-100% та краще приблизно на 50-100% при концентрації антитіл приблизно 0,5 - 30 μг/мл. Для ідентифікації таких антитіл може проводитися SK-BR-3-дослід, описаний у U.S. Patent No. 5,677,171. Відповідно до цього досліду, SK-BR-3-клітини, вирощуються у суміші F12 та середовища DMEM у пропорції 1:1 з додаванням 10% фетальної бичачої сироватки, глутаміну та пеніциліну і стрептоміцину. SK-BR-3клітини помішують на 20,000 клітин у 35мм тарілки клітинної культури (2mls/35мм тарілка). 0,5 - 30 μг/мл НЕR2-антитіл може додаватися до тарілки. Після шести днів кількість клітин у порівнянні з неочищеними клітинами рахується з використанням електронного підраховувана клітин COULTERJ. Такі антитіла, які пригнічують ріст SKBR-3-клітин приблизно на 20-100% або приблизно 50-100% можуть бути обрані як антитіла, що пригнічують ріст. Дивись US Pat No. 5,677,171 щодо 94899 58 досліджень антитіл, що пригнічують ріст, таких як 4D5 та 3Е8. Для обрання антитіл, які індукують апоптоз можливе використання аннексин-зв'язуючого досліду з використанням ВТ474-клітин. ВТ474-клітини культуруються та висіваються на тарілках, як це описано у попередньому параграфі. Середовище потім видаляється та переміщується з окремим свіжим середовищем або середовищем, яке має у своєму складі 10 μг/мл моноклональних антитіл. Після трьох днів інкубаційного періоду моношари відмиваються за допомогою PBS та відділяються шляхом трипсинізації. Потім клітини центрифугу2+ ються та ресуспензуються в Са -зв'язувальному буфері та порівну поміщаються у пробірки, як це описано вище, для дослідження знищення клітин. Потім в пробірки додають мічений аннексии (наприклад, аннексии V-FTIC) (1μг/мл). Зразки можуть аналізуватися, використовуючи проточний цитометр FACSCANJ та програмне забезпечення FACSCONVERTJ CellQuest (Becton Dickinson). Такі антитіла, які індукують статистично значимі рівні зв'язування аннексину, подібні до контрольних, обираються як апоптоз-індукуючі антитіла. Крім аннексин-зв'язуючого досліду, можливе проведення досліду з забарвленням ДНК, з використанням ВТ474-клітин. Для виконання цього досліду ВТ474клітини, які були очищені антитілом, яке представляє інтерес, як було описано в попередніх двох пунктах, інкубують з 9μг/мл HOECHST 33342J на 2 год при 37°С, і потім аналізують на проточному цитометрі EPICS ELITEJ (Coulter Corporation) з використанням програмного забезпечення MODFIT LTJ (Verity Software House). Антитіла, які індукують зміни в частці клітин апоптозу, яка більша у 2 рази (краще в 3 рази більша) ніж неочищених клітин (до 100% клітин апоптозу) можуть бути обрані як про-апоптичні антитіла відповідно до цього дослідження. Дивись WO98/17797 щодо досліджень антитіл, які індукують апоптоз, таких як 7С2 та 7F3. Для виділення антитіл, які приєднуються до епітопу на антитілі до HER2, яке представляє інтерес, може проводитися стандартне перехресноблокуюче дослідження, таке як описане у Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988), для досягнення перехресного блокування антитілом зв'язування антитіла, такого як 2С4 або Пертузумаб, до HER2. Як альтернатива, може проводитися картування епітопів відомими способами та/або вивчення структури HER2-антитіла (Franklin et al. Cancer Cell 5:317-328 (2004)) для того, щоб дізнатися, що зв'язує домен (домени) антитіла до HER2. (іх) Композиції Пертузумабу За одним з варіантів реалізації композиції антитіла до HER2, така композиція має у своєму складі суміш основних видів антитіл Пертузумабу та одного або кількох їх варіантів. Варіант основних видів антитіл Пертузумабу, якому тут надається перевага, має у своєму складі варіабельну легку та варіабельну важку амінокислотну послідовність у SEQ ID Nos. 3 та 4, та найкраще включає легкий ланцюг амінокислотної послідов 59 ності, обраної з SEQ ID No. 13 та 17, та важкий ланцюг аміниокислотної послідовності, обраної з SEQ ID No. 14 та 18 (включаючи деаміновані та/або окислені варіанти цих послідовностей). Одна з композицій має у своєму складі суміш основних видів антитіл Пертузумабу та варіант амінокислотної послідовності, який має лідерне подовження на аміно-кінці. Переважно лідерне подовження на аміно-кінці знаходиться на легкому ланцюзі варіанту антитіла (наприклад, на одному або двох легких ланцюгах варіанту антитіла). Основні види антитіла до HER2 або варіанту антитіла можуть бути повнорозмірними антитілами або фрагментами антитіла (наприклад, Fab з F(ab=)2 фрагментів), але краще - обидва повнорозмірні антитіла. Антитільний варіант може мати у своєму складі лідерне подовження на аміно-кінці на одному або більше важкому або легкому ланцюгах. Краще, якщо лідерне подовження на аміно-кінці знаходиться на одному або двох легких ланцюгах антитіла. Лідерне подовження на аміно-кінці переважно має у своєму складі VHS-. Присутність лідерного подовження на аміно-кінці може бути визначена різними аналітичними технологіями, включаючи, але не обмежуючись, аналізом Nкінцевої послідовності, оцінкою заряду гетерогенності (наприклад, катіонобмінна хроматографія або капілярний електрофорез), масспектрометрією тощо. Кількість варіантів антитіл у композиції загалом знаходиться в межах від кількості, яка складає межу для визначення будь-яким дослідженням (переважно аналіз N-кінцевої послідовності), що використовується для визначення варіанту до кількості, яка менша за кількість основних видів антитіла. Загалом, приблизно 20% або менше (наприклад, від близько 1% до близько, 15%, зокрема від 5% до приблизно 15%) молекул антитіл в композиції мають у своєму складі лідерне подовження на аміно-кінці. Такий відсоток найкраще визначається, використовуючи кількісний аналіз N-кінцевої послідовності (найкраще з використанням високої резолюції, катіонобмінної колонии з низькою концентрацією, такої як PROP AC WCX-IOJ катіонобмінна колонна). Навпроти лідерного подовження на аміно-кінці розглядається амінокислотна послідовність альтернацій основного виду антитіл та/або варіанту, включаючи, але не обмежуючись, антитіло, яке має в своєму складі Скінцевий залишок лізину на одному або двох важких ланцюгах, деамінований варіант антитіла тощо. Крім того, основні види антитіла або варіанту можуть мати в своєму складі глікозильовані варіації, невичерпні приклади яких включають антитіло, що містить G1 або G2 олігосахаридні структури, прикріплені до його Fc-ділянки, антитіло, що має в своєму складі вуглеводний фрагмент, прикріплений до легкого ланцюга (наприклад, один або кілька вуглеводних фрагментів, таких як глюкоза або галактоза, прикріплені до одного або двох легких ланцюгів антитіла, наприклад прикріплені до залишків лізину) антитіла, що має в своєму складі один або більше неглікозильовані важкі ланцюги, або антитіла, що має в своєму складі сіаловий 94899 60 олігосахарид, прикріплений до одного або двох важких ланцюгів тощо. Композиція може регенеруватися з генетично створених ліній клітин, наприклад, лінія клітин яєчників китайського хом'ячка (СНО), які експресують антитіла до HER2 або може готуватися шляхом пептидного синтезу. (х) Імунокон'югати Винахід також стосується імунокон'югат, які включають антитіло, кон'юговане з цитотоксичним агентом, таким як хіміотерапевтичний агент, токсин (наприклад, маленька молекула токсину або ферментноактивний токсин бактеріального, грибкового, рослинного або тваринного походження, включаючи фрагменти та/або варіанти) або радіоактивний ізотоп (тобто радіокон'югата). Хіміотерапевтичні агенти, що використовуються для генерації таких імунокон'югат, описано вище. Також розглядаються кон'югати антитіла та однієї або більше маленьких молекул токсина, такого як калхіміцин, мейтанцин (U.S. Patent No. 5,208,020), трихотен та СС1065. В одному з бажаних варіантів здійсненні винаходу, антитіло кон'юговане з однією або кількома молекулами мейтанцину (наприклад, приблизно 110 молекул мейтанцина на одну молекулу антитіла). Мейтанцин може, наприклад, перетворюється на May-SS-Me, який може зменшуватися до MaySH3 та реактивуватися модифікованим антитілом (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992)) для генерації мейтанциноїд-антитільної кон'югати. Інша імунокон'югата, яка представляє інтерес, має в своєму складі антитіло, кон'юговане з однією або більше молекулою калхіміцину. Родина антибіотиків калхіміцину здатна призводити до розривів двоспіральної ДНК у субпікомолярних концентраціях. Структурні аналоги калхіміцину, які також можуть використовуватися, включають, але не l l l l l обмежуються, 1 , α2 , α3 , N-acetyl-1 , PSAG та θ1 (Hinman et al. Cancer Research 53: 3336-3342 (1993) та Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)). Дивись також, US Patent Nos. 5,714,586; 5,712,374; 5,264,586; та 5,773,001. Ферментно активні токсини та їхні фрагменти, які можуть використовуватися, включають ланцюг А дифтерії, незв'язані активні фрагменти дифтеритчного токсину, ланцюг А екзотоксину (з Pseudomonas aeruginosa), ланцюг А рицину, ланцюг А абрину, ланцюг А модецину, альфа-сарцин, білки Aleurites fordii, білки діантину, білки Phytolaca атегісапа (РАРІ, РАРll, та PAP-S), інгібітор момордії харантії, курцин, кротин, інгібітор сапаонарії офіцинальної, гелонін, мітогеллін, рестріктоцин, феноміцин, еноміцин та трікотецен. Дивись, наприклад, WO 93/21232 опублікований 28 жовтня 1993р. Даний винахід розглядає імунокон'югату сформовану між антитілом і сумішшю з нуклеотидною активністю (наприклад, рибонуклеаза або ендонуклеаза ДНК, така як дезоксірибонуклеаза; ДНаза). Різноманітні радіоактивні ізотопи здатні створювати радіокон'юговані антитіла до HER2. 211 131 125 90 188 Приклади включають At , І , І , Y , Re , 188 153 212 32 Re , Sm , Bi , Ρ та радіоактивні ізотопи Lu.