Вірус грипу собачих, композиція, що містить вірус грипу собачих, та спосіб застосування зазначеного вірусу

1. Виділений вірус грипу собачих підтипу H3N8, депонований у Американській колекції типових культур, патентний депозит № РТА-7694. 2. Виділений вірус грипу собачих за п. 1, який є ослабленим. 3. Виділений вірус грипу собачих за п. 1, який є інактивованим. 4. Композиція, яка містить виділений вірус грипу собачих за п. 1, 2 або З у кількості, достатній для спричинення імунної реакції, а також біологічно прийнятний носій. 5. Композиція за п. 4, яка відрізняється тим, що 3 кількість згаданого вірусу становить від 10 бляш6 котвірних одиниць до 10 бляшкотвірних одиниць на одну композицію. UA (21) a200806411 (22) 17.10.2006 (24) 12.12.2011 (86) PCT/US2006/060025, 17.10.2006 (31) 60/727,808 (32) 18.10.2005 (33) US (31) 11/539,123 (32) 05.10.2006 (33) US (46) 12.12.2011, Бюл.№ 23, 2011 р. (72) ЮН КЬОУН-ДЖІН, US, КУПЕР ВІКІ, US (73) АЙОВА СТЕЙТ ЮНІВЕРСІТІ РІСЬОЧ ФАУНДЕЙШЕН, ІНК., US (56) CRAWFORD P C ET AL: "Transmission of Equine influenza virus to dogs" SCIENCE, AMERICAN ASSOCIATION FOR THE ADVANCEMENT OF SCIENCE,, US, vol. 310, no. 5747, 21 October 2005 (2005-10-21), pages 482-485. DATABASE EMBL [Online] 28 September 2005 (2005-09-28), CRAWFORD, P.C. ET AL.: "Influenza A virus (A/canine/Texas/1/2004(H3N8))" Database accession no. DQ124159. DATABASE EMBL [Online] 12 April 2005 (2005-0412), QUINLIVAN, M ET AL.: "Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the N protein" XP002440725 Database accession no. Q5BUA9. DATABASE EMBL [Online] 12 April 2005 (2005-0412), QUINLIVAN, M ET AL.: "Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the N protein" XP002442858 Database accession no. Q5BUA7. DATABASE EMBL [Online] 12 April 2005 (2005-0412), QUINLIVAN, M ET AL.: "Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the N protein" XP002442859 Database accession no. Q5BUB2. DATABASE EMBL [Online] QUINLIVAN, M ET AL.: "Attenuation of equine influenza viruses through truncations of the N protein" XP002442860 Database accession no. Q5BUB3. LINDSTROM S ET AL: "Phylogenetic analyses of the matrix and non-structural genes of equine influenza virusesr" ARCHIVES OF VIROLOGY, NEW YORK, vol. 143, no. 8, 1998, pages 1585-1598. 2 (19) 1 3 96743 4 6. Композиція за п. 4 або 5, яка відрізняється тим, що вона являє собою композицію з контрольованим вивільненням. 7. Виділений або очищений НА, який і) має амінокислотну послідовність SEQ ID NО: 4 або іі) походить від вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99 % ідентичною до послідовності SEQ ID NО: 4, за умови, що ця амінокислотна послідовність є ідентичною до послідовності SEQ ID NО: 4 за амінокислотами в положеннях 94 та 233. 8. Композиція, яка містить виділений або очищений НА за п. 7 у кількості, достатній для спричинення імунної реакції у тварини, та біологічно прийнятний носій. 9. Спосіб спричинення імунної реакції проти вірусу грипу собачих у тварини, який включає введення тварині композиції за п. 8. 10. Виділена або очищена нуклеїнова кислота, яка кодує НА за п. 7, факультативно як складова частина вектора. 11. Виділена або очищена нуклеїнова кислота за п. 10, яка має нуклеотидну послідовність SEQ ID NО: 3. 12. Композиція, яка містить виділену або очищену нуклеїнову кислоту за п. 10 або п. 11, яка експресує НА у кількості, достатній для спричинення імунної реакції у тварини, та біологічно прийнятний носій. 13. Спосіб спричинення імунної реакції проти вірусу грипу собачих у тварини, який включає введення тварині композиції за п. 12. Перехресне посилання на споріднені заявки [0001] Ця заявка на патент претендує на пріоритет за тимчасовою заявкою на патент США №60/727,808, яка була подана 18 жовтня 2005 р., та за заявкою на патент США № 11/539,123, яка була подана 5 жовтня 2006 р., вміст яких включено до цього опису у повному обсязі шляхом посилання. Галузь, до якої належить винахід [0002] Цей винахід стосується галузі вірусології, молекулярної біології та імунології. Зокрема, цей винахід стосується вірусу грипу собачих, а також споріднених композицій та способів застосування для індукування імунної реакції у тварин. Передумови створення винаходу [0003] Вірус грипу є РНК-вмісним вірусом, який належить до родини Orthomyxoviridae. Вірусна РНК складається з восьми незалежних фрагментів, які легко рекомбінуються між вірусами грипу з утворенням нових підтипів. [0004] Нуклеопротеїн (NP), який являє собою головну складову нуклеокапсиду, кодується у п'ятому фрагменті. NP та матричний білок застосовуються для класифікації вірусу грипу на типи А, В та С. Оскільки NP є внутрішнім білком, він не підлягає селекційному тиску з боку імунної системи хазяїна. Він зв'язує РНК, є частиною транскриптазного комплексу і залучений до ядерноцитоплазматичного перенесення вірусної РНК (вРНК). [0005] Нейрамінідаза (NM), яка розриває кетонний зв'язок, який сполучає кінцеву сіалову кислоту і наступний залишок цукру, завдяки чому забезпечується виділення вірусного потомства з інфікованих клітин, кодується шостим фрагментом. Ідентифіковано дев'ять підтипів (N1-N9) цього ферменту. Усі підтипи мають дві структурні ділянки - ніжку і головку. Усі білки N8 мають 470 амінокислот, перші вісім з яких є висококонсервативними. Наступна ділянка є збагаченою гідрофобними амінокислотами і вважається трансмембранним доменом. Наступні амінокислоти у кількості 51 утворюють ділянку ніжки, а ділянка головки починається на Cys91. Остання згадана ділянка містить каталітичний сайт ферменту. Залишки цисте їну на ділянці головки і ніжки є висококонсервативними. Згаданий фермент має 6-8 ймовірних сайтів N-глікозилування. [0006] Гемаглютинін (НА), який являє собою мембранний глікопротеїн, який несе відповідальність за адсорбування вірусу до клітини-хазяїна, є головним антигеном, на який спрямовуються нейтралізуючі антитіла. Його антигенна змінність є головною причиною епідемій грипу. Він кодується четвертим фрагментом. Ідентифіковано шістнадцять різних підтипів гемаглютиніну (Н1-Н16). НА має сигнальний пептид із 16 амінокислот і два поліпептиди (НА1 та НА2), з'єднані дисульфідними містками. НА1 має амінокінець, у той час як НА2 має карбоксильний кінець. Гідрофобна ділянка на НА2 прикріплює НА до вірусної мембрани. Залишки цистеїну є висококонсервативними. Існує шість ймовірних сайтів глікозилування, які надають можливість вірусу маскувати свої ділянки детермінанти (Скехел (Skehel) та інші, PNAS USA 81:1779 (1984)). [0007] Інші білки включають матричні (М або М1 та М2), неструктурні (NS або NS1 та NS2), РА, РВ1 та РВ2. Білок М1 є головною складовою віріону, що зв'язується з плазматичною мембраною інфікованих клітин за допомогою двох гідрофобних ділянок на N-кінці білка, у той час як М2 являє собою іонний канал і, таким чином, є складовою частиною мембранного білка. Білок NS1 знаходиться у ядрі і впливає на транспортування, сплайсинг і трансляцію клітинної РНК. Білок NS2 знаходиться у ядрі та цитоплазмі і має невідому функцію. Білок РА є транскриптазою і може мати протеазну активність, у той час як білок РВ1 приймає участь у подовженні транскрипту, а білок РВ2 приймає участь у зв'язуванні кепу транскрипту. [0008] У глобальному масштабі, грип являє собою найбільш економічно значуще захворювання дихальних органів у людей, свиней, коней і птахів (Райт (Wright) та інші, Orthomyxoviruses. У: Fields Virology. Кнайп (Knipe) та інші, (редактори). Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001, стор. 1533-1579). Вірус грипу відомий своїми постійними генетичними та антигенними змінами, що перешкоджає ефективній боротьбі із цим вірусом 5 (Райт (Wright) та інші (2001), дивись вище; Вебстер (Webster) та інші, Microbiol. Rev., 56:152-179 (1992)). Особливою проблемою при запобіганні епідемій і пандемій є виникнення нового підтипу вірусу унаслідок генетичного пересортування та міжвидової передачі (Райт (Wright) та інші (2001), дивись вище). [0009] Впродовж останнього часу спалахи грипу мали місце у видів, наприклад, родини собачих і котячих, які історично вірус грипу не переносять (Ківчарен (Keawcharoen) та інші, Emerg. Infect. Dis. 10:2189-2191 (2004); Кроуфорд (Crawford) та інші, Science 310:398-485 (21 жовтня 2005 p.; викладено в Інтернеті 29 вересня 2005 p.); Дубові (Dubovi) та інші, Isolation of equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. У: th Proceedings of the 4 Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Greensboro, NC, жовтень 2005 p. стор. 158; Юн (Yoon) та інші, Emerg. Infect. Dis. 11(12):1974-1976 (грудень 2005 p.)). Таким чином, діапазон хазяїв вірусу грипу розширюється. [0010] Спалахи хвороби дихальних органів у бігових хортів, яка була спричинена вірусом грипу, мали місце у штаті Флорида у 2004 р., у східних та західних районах штату Айова у квітні 2005 р. та у Техасі у 2005 р. Хвороба характеризувалась швидкою появою гарячки та кашлю, прискореного дихання та геморагічних виділень із носа. Захворюваність як у звичайних, так і у бігових хортів у штаті Айова становила майже 100%, хоча смертність була меншою за 5%. Великий відсоток уражених собак видужав, але багато тварин загинули унаслідок геморагічної пневмонії. Терапевтичне введення антибіотиків широкого спектру дії полегшило тяжкість перебігу захворювання, але подолати його не змогло. [0011] Приймаючи до уваги вищенаведене, метою цього винаходу є надання вірусу грипу, який інфікує родину собачих. Інша мета цього винаходу полягає у наданні матеріалів і методів індукування імунної реакції проти вірусу грипу у родини собачих. Ці та інші цілі та переваги, а також додаткові відмітні ознаки винаходу, стануть очевидними з докладного опису, який наводиться. Короткий виклад суті винаходу [0012] Цей винахід пропонує виділений вірус грипу собачих підтипу H3N8, що містить НА, який має ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 або амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4, за умови, що амінокислоти у положеннях 94 та 233 є ідентичними до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4. Зокрема, цей винахід пропонує виділений вірус грипу собачих підтипу H3N8, депонований у Американській колекції типових культур (Manassas, штат Вірджинія) 29 червня 2006 р. як патентний депозит №РТА-7694. Відповідно, цей винахід пропонує також композицію, яка містить атенуйований вірус, а також композицію, яка містить інактивований вірус. [0013] Цей винахід пропонує також виділені або очищені білки. За одним із варіантів здійснення, цей винахід пропонує виділений або очищений НА, який і) має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 або іі) походить із вірусу грипу і має амінокисло 96743 6 тну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4 за положеннями амінокислот 94 та 233, або фрагмент (і) або (іі), причому згаданий фрагмент містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 94 або 233 ПОСЛІДОВНОСТІ № 4. [0014] За іншим варіантом здійснення, цей винахід пропонує виділену або очищену NM, яка і) містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2 або іі) походить із вірусу грипу і містить амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2 за положеннями амінокислот 68 та 134, або фрагмент (і) або (іі), причому згаданий фрагмент містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 68 або 134 ПОСЛІДОВНОСТІ № 2. [0015] За ще одним варіантом здійснення, цей винахід пропонує виділений або очищений NP, який і) має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6 або іі) походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 6, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 6 за положенням амінокислоти 402, або фрагмент (і) або (іі), причому згаданий фрагмент містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 402 ПОСЛІДОВНОСТІ № 6. [0016] За ще одним варіантом здійснення, цей винахід пропонує виділений або очищений М1, який і) має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 8 або іі) походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 8, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 8 за положенням амінокислоти 111, або фрагмент (і) або (іі), причому згаданий фрагмент містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 111 ПОСЛІДОВНОСТІ № 8. [0017] Пропонується також виділений або очищений NS1, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10. [0018] Додатково пропонується виділений або очищений білок РА, який і) має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 12 або іі) походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 98% (або 99%) ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 12, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 12 за положеннями амінокислот 233, 256, 327 та 561, або фрагмент (і) або (іі), причому згаданий фрагмент містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 233, 256, 327 та 561 ПОСЛІДОВНОСТІ № 12. 7 [0019] Додатково ще пропонується виділений або очищений РВ1, який і) має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 14 або іі) походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 14, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 14 за положеннями амінокислот 200 та 213, або фрагмент (і) або (іі), причому згаданий фрагмент містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 200 або 213 ПОСЛІДОВНОСТІ № 14. [0020] Додатково ще пропонується виділений або очищений РВ2, який і) має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 16 або іі) походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 16, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 16 за положеннями амінокислот 107, 221, 292 та 661, або фрагмент (і) або (іі), причому згаданий фрагмент містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 107, 221, 292 або 661 ПОСЛІДОВНОСТІ № 16. [0021] Приймаючи до уваги вищенаведене, цей винахід додатково пропонує композицію, яка містить білок, опис якого наведено вище, наприклад, НА або NM, чи його фрагмент у кількості, достатній для індукування імунної реакції у тварини, та біологічно прийнятний носій. [0022] Приймаючи також до уваги вищенаведене, цей винахід пропонує спосіб індукування імунної реакції проти вірусу грипу собачих у тварини. Цей спосіб включає введення тварині композиції, яка містить білок або його фрагмент. [0023] Пропонується також виділена або очищена нуклеїнова кислота, яка кодує білок, опис якого наведено вище, або його фрагмент, факультативно як частина вектора, а також композиція, яка містить виділену або очищену нуклеїнову кислоту, яка експресує білок, наприклад, НА або NM, чи його фрагмент у кількості, достатній для індукування імунної реакції у тварини та біологічно прийнятний носій. [0024] Відповідно, цей винахід пропонує також інший спосіб індукування імунної реакції проти вірусу грипу собачих у тварини. Згаданий спосіб включає введення тварині композиції, яка містить нуклеїнову кислоту. Короткий опис фігур [0025] Фіг. 1 - часткова нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1; дивись також номер депонування GenBank DQ146420) послідовності кодувального домену (CDS) гена NM вірусу грипу собачих підтипу H3N8. Відповідно до загальноприйнятого звичаю, послідовність представлена зліва направо і зверху вниз. [0026] Фіг. 2 - амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2; дивись також номер депонування GenBank DQ146420), який кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 1. Відповідно до загальноприйнятого звичаю, послідовність представлена у однолітерному форматі зліва направо і зверху до низу. 96743 8 [0027] Фіг. 3 - повна нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3; дивись також номер депонування GenBank DQ146419) CDS гена НА вірусу грипу собачих підтипу H3N8. [0028] Фіг. 4 - амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4; дивись також номер депонування GenBank DQ146419), який кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 3. [0029] Фіг. 5 - повна нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5) CDS гена NP вірусу грипу собачих підтипу H3N8. [0030] Фіг. 6 - розшифрована амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6), яка кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 5. [0031] Фіг. 7 - повна нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7) CDS гена білка М1 вірусу грипу собачих підтипу H3N8. [0032] Фіг. 8 - розшифрована амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 8), яка кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 7. [0033] Фіг. 9 - повна нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 9) CDS гена білка NS1 вірусу грипу собачих підтипу H3N8. [0034] Фіг. 10 - розшифрована амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10), яка кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 9. [0035] Фіг. 11 - повна нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 11) CDS гена білка РА вірусу грипу собачих підтипу H3N8. [0036] Фіг. 12 - розшифрована амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 12), яка кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 11. [0037] Фіг. 13 - повна нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 13) CDS гена білка РВ1 вірусу грипу собачих підтипу H3N8. [0038] Фіг. 14 - розшифрована амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 14), яка кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 13. [0039] Фіг. 15 - повна нуклеотидна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 15) CDS гена білка РВ2 вірусу грипу собачих підтипу H3N8. [0040] Фіг. 16 - розшифрована амінокислотна послідовність (ПОСЛІДОВНІСТЬ № 16), яка кодується ПОСЛІДОВНІСТЮ № 15. Докладний опис винаходу [0041] Основу цього винаходу становить відкриття штаму вірусу грипу у собачих. Цей штам було виділено від бігових хортів у східних та західних районах штату Айова. Згаданий штам було класифіковано як підтип H3N8 і позначено: А/собачий/штат Айова/13628/2005 (A/canine/Iowa/13628/2005). Відповідно, цей винахід пропонує вірус, що містить НА, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 або амінокислотну послідовність, яка є більше ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4, за умови, що амінокислоти у положеннях 94 та 233 є ідентичними до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4. Вірус може додатково містити NM, яка містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2 або амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2, за умови, що амінокислоти у положеннях 68 та 134 є ідентичними до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2. Вірус, який містить вищезгаданий НА, самостійно або у додатковій комбінації з вищезгаданою NM, 9 може додатково містити щонайменше одне з переліченого нижче: NP, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6 або амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 6, за умови, що амінокислота 402 є ідентичною амінокислотній ПОСЛІДОВНОСТІ № 6; М1, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 8 або амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 8, за умови, що амінокислота 111 є ідентичною амінокислоті ПОСЛІДОВНОСТІ № 8; NS1, що має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10; білок РА, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 12 або амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 98% (або 99%) ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 12, за умови, що амінокислоти 233, 256, 327 та 561 є ідентичними до ПОСЛІДОВНОСТІ № 12; РВ1, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 14 або амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 14, за умови, що амінокислоти 200 та 213 є ідентичними до ПОСЛІДОВНОСТІ № 14; та/або РВ2, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 16 або амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 16, за умови, що амінокислоти 107, 221, 292 та 661 є ідентичними до ПОСЛІДОВНОСТІ № 16. Зокрема, цей винахід пропонує виділений вірус грипу собачих підтипу H3N8, депонований у Американській колекції типових культур, 10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, США 29 червня 2006 p. як патентний депозит № РТА-7694. [0042] Вірус грипу може бути преципітований шляхом піддання згаданого вірусу у водному середовищі одній або декільком стадіям переведення до нерозчинної форми, обумовленої присутністю до 5% (мас.) поліетиленгліколю (PEG), який має молекулярну масу у межах 3000-20000 або іншого лінійного волокнистого незарядженого полімеру у кількості, еквівалентній розчинній здатності PEG, відокремлення нерозчинної фракції від фракції, яка не переводиться до нерозчинної форми і виділення вірусу з однієї із фракцій (дивись, наприклад, патент США № 3,989,818). За варіантом, якому віддається перевага, температура не перевищує 35°С, pH знаходиться у межах 6-9 і іонна сила водного середовища знаходиться нижче точки висолювання вірусу. Концентрація вірусу у водному середовищі перед переведенням до нерозчинної форми відповідає титру гемаглютинації щонайменше 1 до 32. Одержують агреговані вірусні частинки, які, як вважають, забезпечують кращий антигенний ефект унаслідок повільного виділення вірусних частинок після вакцинації. Якщо, однак, були одержані неагреговані або меншою мірою агреговані частинки, вони можуть бути дисоційовані будь-яким прийнятним способом, наприклад, шляхом обробки ультразвуком. [0043] Вірус може бути ослаблений шляхом пасажування у клітинній системі доти, доки вірус не втратить своєї здатності до викликання захворювання, водночас із повним збереженням свого імуногенного характеру. Наприклад, вірус може серійно пасажуватись у культурі клітин, які походять від виду собачих або іншого відповідного ви 96743 10 ду при температурі приблизно 37°С. При здійсненні кожного пасажу, вірус збирають з однієї культури і інокулюють ним середовище, яке містить свіжу культуру клітин відповідно до методів, відомих у цій галузі. Наприклад, вірус може збиратись із рідин культури клітин тканини та/або клітин. Факультативно, під час збирання, культура клітин може піддаватись обробці ультразвуком для стимулювання виділення вірусу. Дивись, наприклад, патенти США № 5,698,433 та № 6,455,298. [0044] У разі потреби, штам вірусу грипу може пасажуватись щонайменше один раз у алантоїсній порожнині яєць з ембріонами, які розвиваються, наприклад, курячих яєць, у присутності сироватки, з одержанням стійкого до сироватки вірусу (дивись, наприклад, патент США № 3,953,592; Кілбурн (Kilbourne) та інші, J. Exp. Med., 111:387 (1960); Кілбурн (Kilbourne), Science, 1960:74-75 (квітень 1968 p.); і Лавер (Laver) та інші, Virology, 30:493-501 (1966)). Високоефективну вакцину проти грипу з низькою пірогенністю і низькою ендотоксичністю можна одержати шляхом послідовної обробки концентрованої алантоїсної рідини, яка містить ослаблений вірус, бутилацетатом та етилацетатом, із подальшим одноразовим випарюванням (дивись, наприклад, патент США № 4,000,257). Такий вірус може вводитись інтраназальним шляхом як вакцина. [0045] Після інокуляції хазяїна, вірус певною мірою розмножується, завдяки чому потрібен лише невеликий початковий інокулят. Вірус повинен бути нешкідливим і інфікування сприйнятливих осіб, які зазнають впливу заразної речовини, повинно бути зведене до мінімального рівня. [0046] За альтернативним варіантом, вірус може бути інактивований шляхом усунення реплікації і ліквідування вірулентності. Цього можна досягти хімічними або фізичними засобами. Хімічну інактивацію можна здійснити шляхом обробки вірусу ферментом, формальдегідом, пропіолактоном або його похідним, етиленіміном або його похідним, органічним розчинником (наприклад, галогенізованим вуглеводнем) та/або детергентом (наприклад, твін, тритон X®, дезоксихолат натрію, сульфобетаїн або солі цетилтриметиламонію). У разі необхідності, хімічно активовані композиції можуть бути нейтралізовані. Наприклад, якщо для дезактивування композиції застосовують формальдегід, композицію можна нейтралізувати тіосульфатом. У разі необхідності, pH у подальшому можна повернути до рівня приблизно 7. За альтернативним варіантом вірус може екстрагуватись сумішшю складного ефіру та етанолу, водна та органічна фази можуть відокремлюватись і залишковий простий ефір може видалятись із вірусної суспензії під зниженим тиском (дивись, наприклад, патент США № 4,431,633). Фізична інактивація може успішно здійснюватись шляхом піддання вірусу впливу випромінення високого енергетичного рівня, наприклад, ультрафіолетового випромінення, -випромінення або рентгенівських променів. Інактивовані форми потребують відносно великої кількості інокуляту і, таким чином, відповідно, великої кількості антигенного матеріа 11 лу, який повинен бути виготовлений, перевірений і розподілений. [0047] Приймаючи до уваги вищенаведене, цей винахід пропонує також композицію, яка містить атенуйований або інактивований вірус. Вірус повинен бути присутнім у кількості, достатній для спричинення імунної реакції і, бажано, повинен забезпечувати захист у разі контрольного зараження. Як правило, до композиції додають ад'ювант, наприклад, твін, спан (Span®), повний ад'ювант Фрейнда, сапонін, Corynebacterium parvum (Coparvax®), фосфат алюмінію, гідроксид алюмінію або їх суміш, зокрема, якщо композиція містить інактивований вірус. Для стабілізації композиції можуть додаватись гідролізати білка та/або амінокислоти (дивись, наприклад, патент США № 4,537,769). За альтернативним варіантом, композиція може виготовлятись у формі емульсії типу "масло у воді" із застосуванням таких масел, як, наприклад, Маrсоl та/або Arlacel. [0048] Можна одержати також штами рекомбінантного вірусу грипу, наприклад, із комбінації "надослабленого" (тобто кількість пасажів для атенуювання є значно більшою, аніж кількість, яка є необхідною за нормальних умов для ліквідування патогенності) вихідного штаму грипу А, наприклад, А2, з вірулентним штамом вірусу грипу за наведеним описом (дивись, наприклад, патент США № 3,991,179; дивись також патенти США № 4,009,258; № 4,278,662; № 4,318,903; № 4,338,296 та № 4,693,893). Рекомбінантний штам, за варіантом, якому віддається перевага, має характеристики росту надослабленого штаму у поєднанні з антигенними властивостями, наприклад, білки НА та NM, вірулентного штаму. Опис вибору штамів вірусу грипу для одержання вакцин наведено у патенті США № 5,162,112. Рекомбінантним штамам може надаватись форма композицій для індукції імунної реакції. [0049] Цукроза, моногідрохлорид аргініну, моногідрат мононатрію глуматінової кислоти і гідролізат желатину можуть застосовуватись для стабілізування композиції вірусу грипу для зберігання у холодильнику. Дивись, наприклад, заявку на патент США № 2006/0110406. [0050] Приймаючи до уваги вищенаведене, цей винахід пропонує також виділений або очищений НА. НА має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 або походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 4 за положеннями амінокислот 94 та 233. Пропонується також фрагмент НА, який містить щонайменше дев'ять (наприклад, 9, 12, 15, 18, 21 або 24) суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 94 або 233 ПОСЛІДОВНОСТІ № 4. [0051] Пропонується також виділена або очищена NM. NM містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 2 або походить із вірусу грипу і містить амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентич 96743 12 ною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2 за положеннями амінокислот 68 та 134. Пропонується також фрагмент NM, який містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 68 або 134 ПОСЛІДОВНОСТІ № 2. [0052] Додатково пропонується виділений або очищений NP. NP має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 6 або походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 6, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 6 за положенням амінокислоти 402. Пропонується також фрагмент NP, який містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 402 ПОСЛІДОВНОСТІ № 6. [0053] Додатково пропонується виділений або очищений M1. M1 має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 8 або походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 8, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 8 за положенням амінокислоти 111. Пропонується також фрагмент М1, який містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 111 ПОСЛІДОВНОСТІ № 8. [0054] Додатково пропонується виділений або очищений NS1, який має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 10. [0055] Пропонується також виділений або очищений білок PA. PA має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 12 або походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 98% (або 99%) ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 12, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 12 за положеннями амінокислот 233, 256, 327 та 561. Пропонується також фрагмент РА, який містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 233, 256, 327 та 561 ПОСЛІДОВНОСТІ № 12. [0056] Пропонується виділений або очищений РВ1. РВ1 має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 14 або походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 14, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 14 за положеннями амінокислот 200 та 213. Пропонується також фрагмент РВ1, який містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 200 або 213 ПОСЛІДОВНОСТІ № 14. [0057] Пропонується також виділений або очищений РВ2. РВ2 має амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 16 або походить із вірусу грипу і має амінокислотну послідовність, яка є більш ніж на 99% ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 16, за умови, що амінокислотна послідовність є ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 16 за положеннями 13 амінокислот 107, 221, 292 та 661. Пропонується також фрагмент РВ2, який містить щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, щонайменше одна з яких є ідентичною до амінокислоти у положенні 107, 221, 292 або 661 ПОСЛІДОВНОСТІ № 16. [0058] Вищезгадані білки та їхні фрагменти можуть бути очищені (у поєднанні з хімічною або фізичною фрагментацією для одержання фрагментів) або синтезовані за способами, добре відомими у цій галузі. Дивись, наприклад, синтез білків у твердій фазі у Мейнхофер (Meienhofer), Hormonal Proteins and Peptides, 2:46, Academic Press, NY (1973) і синтез білків у рідкій фазі у Шредер (Schroder) та інші, The Peptides, том 1, Academic Press, NY (1965). Для здійснення таких методів за інструкціями виробників можуть застосовуватись автоматизовані системи. Терапевтичні кількості можуть бути одержані рекомбінантним способом і очищені. [0059] За альтернативним варіантом, білки, зокрема, НА та NM, можуть бути виділені шляхом вибіркового розчинення, із залишенням, водночас, залишкових субвірусних частинок, які складаються з інтактної ліпідної/білкової мембрани, яка вміщує усі інші другорядні вірусні складові. Різниця у розмірі/густині розчинених білків і залишкових субвірусних частинок забезпечує можливість відокремлення на основі різниць фізичних властивостей шляхом центрифугування і фракціонування у градієнті щільності, осадження, хроматографування на молекулярних ситах або осадження на ультрацентрифузі. Вибіркове розчинення НА та NM може бути здійснене шляхом обробки вірусу катіоногенним детергентом (дивись, наприклад, патент США № 4,140,762; патент '762). Рідина, що містить вірус, який одержали з культури клітин, у повному об'ємі може бути оброблена ферментом, який розщеплює ДНК, з подальшим доданням катіоногенного детергенту і виділенням поверхневих антигенних білків (дивись, наприклад, патент США № 5,948,410). Згадану рідину можна піддавати декільком стадіям ультрацентрифугування або вірус може фрагментуватись у присутності амфіфільного неіоногенного детергенту з подальшим фільтруванням для видалення небажаних речовин (дивись, наприклад, патент США №6,048,537). За альтернативним варіантом, для одержання вірусного білка можна застосовувати ультрафільтрацію через напівпроникну мембрану і хімічне розщеплення (дивись, наприклад, патент США № 4,327,182). Опис інших методів наведено у патентах США № 4,064,232 та № 4,057,626. За варіантом, якому віддається перевага, вірус перед обробкою розмножують, як описано, наприклад, у патенті '762 (стовпчик 2, рядки 10 і наступні). [0060] Для ідентифікування антигенної детермінанти вірусного білка, що індукує імунну реакцію, може бути проведене картування, тобто "картування антигенної детермінанти". Таке картування включає фрагментування білка на пептиди, які перекриваються (наприклад, пептиди, які містять 9, 12, 15, 18, 21 або 24 амінокислоти). Білок може бути фрагментований за допомогою протеолітичного ферменту. Після цього окремі пептиди перевіряють на їх здатність до зв'язування антитіла, 96743 14 поява якого була викликана нативним білком, або до індукування активації Т-клітин або В-клітин. За альтернативним варіантом, можуть бути вибрані гідрофільні ділянки білка, оскільки гідрофільні залишки часто знаходяться на поверхні білка, і, завдяки цьому, доступні для антитіла. Може здійснюватись також рентгеноструктурний аналіз комплексу антиген-антитіло. За амінокислотною послідовністю білка можуть бути ідентифіковані потенційні мотиви зв'язування фрагмента HLA (головний комплекс гістосумісності людини), які являють собою пептидні послідовності, які, як відомо, ймовірно зв'язуються з молекулами МНС (головний комплекс гістосумісності). За варіантом, якому віддається перевага, вибраною антигенною детермінантою є детермінанта, послідовність якої зовсім не має нічого спільного або має незначний рівень ідентичності з послідовностями, велика кількість яких виявляється у тварини, якій буде введена композиція, яка містить або експресує фрагмент білка. [0061] Пропонується також виділена або очищена нуклеїнова кислота, яка кодує білок або його фрагмент, опис яких наведено вище, факультативно як складова частина вектора. Нуклеїнова кислота, яка кодує НА, може містити нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3 або її фрагмент, що кодує щонайменше дев'ять (9, 12, 15, 18, 21 або 24) суміжних амінокислот. У разі необхідності, можна одержати тривалентну вакцину на основі НА, де один із гемаглютинінів містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 4 (дивись, наприклад, патенти США № 5,762,939 та № 6,245,532; щодо тривалентної вакцини, дивись, наприклад, патент США № 6,740,325). Нуклеїнова кислота, яка кодує NM, може мати нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1 або її фрагмент, що кодує щонайменше дев'ять суміжних амінокислот (дивись, наприклад, патент США № 6,605,457 та заявку на патент США № 2003/0129197), у той час як нуклеїнова кислота, яка кодує NP, може мати нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 5 або її фрагмент, що кодує щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, нуклеїнова кислота, яка кодує білок М1, може мати нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 7 або її фрагмент, що кодує щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, нуклеїнова кислота, яка кодує білок NS1, може мати нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 9, нуклеїнова кислота, яка кодує РА, може мати нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 11 або її фрагмент, що кодує щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, нуклеїнова кислота, яка кодує РВ1, може мати нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 13 або її фрагмент, що кодує щонайменше дев'ять суміжних амінокислот, і нуклеїнова кислота, яка кодує РВ2, може мати нуклеотидну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 15 або її фрагмент, що кодує щонайменше дев'ять суміжних амінокислот. Пересічному фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, однак, що унаслідок виродженості генетичного коду існують численні інші нуклеотидні послідовності, які можуть кодувати такі амінокислотні послідовності. [0062] Вищезгадані нуклеїнові кислоти, які можуть бути ДНК або РНК, та їхні фрагменти можуть бути синтезовані (дивись, наприклад, 15 Oligonucleotide Synthesis, Гейт (Gait), редактор, 1984). Такі молекули можуть містити штучні нуклеотиди/основи, які кодують бажану амінокислотну послідовність. Наприклад, основа або цукор можуть бути метильовані. На додаток до цього, каркас нуклеїновокислотної молекули може бути модифікований, наприклад, фосфоротіоатний каркас, метилфосфонатний, метилфосфоротіоатний, фосфородитіоатний та їх комбінації. [0063] За альтернативним варіантом, виділена вРНК може бути піддана обробці ревертазою з одержанням гібриду РНК/ДНК, від якого РНК відщеплюють, а залишкову ДНК обробляють з одержанням двониткової ДНК із кінцем, який являє собою комбінацію двоспіральної і односпіральної ділянок і має форму шпильки для волосся, яку обробляють однонитковоспецифічною нуклеазою з одержанням бімолекулярної двониткової копії вРНК (дивись, наприклад, патент США № 4,357,421). Дивись, наприклад, заявку на патент США № 2006/0166321 щодо застосування тандемних транскрипційних кластерів для одержання вірусу грипу за відсутності вірусу-помічника. [0064] Нуклеїнова кислота факультативно являє собою складову частину вектора на основі ДНК, яка містить щонайменше один промотор. У цьому разі, кожна нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з промотором, який може бути одним і тим самим або іншим. На додаток до промоторів, складовою частиною вектора на основі ДНК можуть бути інші контрольні послідовності, наприклад, сигнал термінації тощо. [0065] Наприклад, нуклеїнова кислота може бути введена до відповідного рекомбінантного експресійного вектора, наприклад, до векторів, адаптованих для бактерій, наприклад, Е. соli та Salmonella typhi, дріжджів, наприклад, Saccharomyces cerevisiae або Pichia pastoris чи нитчастих грибів, наприклад, Aspergillus nidulans. Бактерії,дріжджі або гриби можуть вирощуватись шляхом безперервної культури. У подальшому поліпептиди, які продукуються під час культивування, можуть виділятись і очищатись. За альтернативним варіантом, молекула нуклеїнової кислоти може бути введена до представників родини вірусів віспи (Poxviridae) (наприклад, вектори на основі вірусу віспи птахів), представників родини вірусів герпесу (Herpesviridae) (наприклад, вектори на основі вірусу псевдосказу, вектори на основі вірусу герпесу індиків, вектори на основі вірусу герпесу котячих, вектори на основі вірусу інфекційного ларинготрахеїту та вектори на основі вірусу герпесу великої рогатої худоби), представників родини аденовірусів (Adenoviridae) (наприклад, аденовірус великої рогатої худоби (наприклад, серотип 3), аденовірус людини (наприклад, серотип 4 або 7) та аденовірус собачих (наприклад, серотип 2; CAV2; дивись, наприклад, патент США № 6,090,393) або експресійного вектора на основі вірусу комах, наприклад, рекомбінантного бакуловірусу (наприклад, вірус ядерного поліедрозу Autographa californica (AcNPV)), які, у свою чергу, можуть застосовуватись для інфікування сприйнятливих культур клітин SF9, які одержують від комах Spodotera frugiperda. Інші вектори на основі 96743 16 вірусного геному, які можуть вводитись шляхом екскоріації або ін'єкції, факультативно у формі ліпосомної композиції, містять вірус коров'ячої віспи (дивись, наприклад, патент США № 4,722,848), аденовірус, аденоподібний вірус, аденоасоційований вірус, ретровірус та вірус віспи (дивись, наприклад, Грабі (Gruby), Vet. Parasitol, 29:281-282 (1988); Ю (Uiu), "AIDS Research Reviews", Dekker, Inc., 1991, 1:403-416). Інші вектори містять бацилу Кальметта-Герена (BCG; Стовер (Stover) та інші, Nature, 351:456-460 (1991)), вектори на основі детоксикованого токсину сибірки тощо. Для експресії поліпептиду з відповідної генно-інженерної конструкції можуть застосовуватись клітини ссавців, наприклад, клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО) і навіть клітини рослин. Пересічному фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, що вибір клітини-хазяїна буде впливати на природу посттрансляційного процесингу (наприклад, глікозилування, укладання тощо), що, у свою чергу, може впливати на імуногенність поліпептиду і подальші методи очищення. [0066] Експресія може відбуватись у будь-якій відповідній клітині-хазяїні, трансформованій/трансфікованій експресійним вектором. Прикладами придатних клітин-хазяїв є (але без обмеження) клітини-хазяї, опис яких наведено вище. Таким чином, цей винахід пропонує також клітинухазяїна, трансформовану/трансфіковану експресійним вектором. [0067] Супернатанти систем хазяїн/вектор, які секретують білок або його фрагмент до культуральних середовищ, можуть бути нанесені на очисну матрицю, наприклад, афінну колонку або іонообмінну колонку. Для додаткового очищення рекомбінантного білка або його фрагмента може бути застосована одна або декілька стадій хроматографування з оберненою фазою. [0068] Продукування білка або його фрагмента у вигляді гібридного білка може стабілізувати процес продукування. Це можна здійснити шляхом лігування полінуклеотидних послідовностей, які кодують два або декілька білків (або їхні фрагменти), з відповідним експресійним вектором за допомогою або без пептидного лінкера. Бажано, щоб зчитувальні рамки полінуклеотидних послідовностей знаходились у фазі таким чином, щоб продукувався один гібридний білок, який зберігає біологічну активність кожного білка (або його фрагмента). Пептидний лінкер довжиною від 1 амінокислоти до приблизно 50 амінокислот може застосовуватись для відокремлення білків, які одержують (або їхніх фрагментів), таким чином, щоб забезпечувалось відповідне укладання кожного білка (або його фрагмента) до його нативної вторинної, третинної або четвертинної структур (дивись, наприклад, Маратеа (Maratea) та інші; Gene, 49:39-46 (1985); Мерфі (Murphy) та інші, PNAS USA, 83:8258-8262 (1986); патент США № 4,935,233 і патент США № 4,751,180). Факторами, які приймаються до уваги при виборі пептидного лінкера є здатність до приймання гнучкої подовженої конформації, нездатність до приймання вторинної структури, яка могла б взаємодіяти із функціональними амінокислотами, одним або обома 17 білками і відсутність гідрофобних або заряджених залишків, які могли б реагувати з одним або обома білками. У лінкерах немає потреби, коли кінці білків, призначених для з'єднання, не містять незамінних ділянок, завдяки чому згадані кінці можуть застосовуватись для відокремлення функціональних доменів і запобігання просторового взаємовпливу. Послідовності пептидних лінкерів, яким віддають перевагу, містять залишки Gly, Asn та Ser. Застосовуватись можуть також інші майже нейтральні залишки, наприклад, Thr та Ala. [0069] Для підсилення експресії та/або імуногенності білка або його фрагмента може(-уть) вибиратись інша(-і) додаткова(-і) амінокислотна(-і) послідовність(-ості). Наприклад, білок або його фрагмент може зливатись із важким ланцюгом імуноглобуліну G (IgG) або білком, який зв'язує антигенпрезентуючі клітини (АРС) чи білком, який зв'язує дендритні клітини, наприклад, IL-D, GMGSF, IL-1, TNF, IL-4, CD40L, CTLA4, CD28, або лігандом FTL-3. Можна вдаватись до таких методів, як застосування осушників, наприклад, дициклогексилкарбодііміду (DCCI), або утворення зв'язків між сульфгідрильними групами, епсилонаміногрупами, карбоксильними групами тощо. У разі потреби, до гібридного білка може вводитись сайт розщеплення для забезпечення можливості відокремлення білка (або його фрагмента) від штучної(-их) послідовності(-ей). Прикладами сайтів розщеплення є цільова послідовність для протеолітичного ферменту, або, у разі присутності у білку (або його фрагменті) метіоніну, метіонін, який, у свою чергу, розщеплюється бромідом ціаногену. Такі методи відомі у цій галузі. Білок або його фрагмент можуть бути модифіковані шляхом глікозилування або іншими методами дериватизації (наприклад, ацетилювання або карбоксилювання), також за методами, відомими у цій галузі. [0070] Білок (або його фрагмент) може експресуватись in situ з відповідної експресійної системи. Будь-яка генно-інженерна конструкція на основі ДНК, яка є ефективною щодо продукування закодованого білка або його фрагмента у бажаному середовищі, може застосовуватись для експресії білка або його фрагмента, як описано вище. [0071] За альтернативним варіантом, молекула нуклеїнової кислоти може вести себе як ефективна експресійна система in situ у разі введення тварині у формі "оголеної ДНК" (дивись, наприклад, Ульмер (Ulmer) та інші, Science, 259:17451749 (1993); і Коен (Cohen), Science, 259:16911692 (1993)). Доставка ДНК може також полегшуватись завдяки застосуванню бупівікену (bupivicaine), полімерів і пептидів; за альтернативним варіантом, можуть застосовуватись катіоногенні ліпідні комплекси, частинки або тиск (дивись, наприклад, патент США № 5,922,687). [0072] Приклади амінокислотних послідовностей, які є щонайменше приблизно на 95% або більше ідентичними до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 або 16, наприклад, щонайменше приблизно на 96%, 97%, 98% або 99% або більше, включають амінокислотні послідовності, які містять одну або декілька замін, інсерцій, додань та/або делецій. Ідентичність послідовності може визнача 96743 18 тись шляхом впорядкованого розміщення поліпептидних послідовностей і застосування публічно доступних комп'ютерних алгоритмів, наприклад, BLASTP (Пірсон (Pearson) та інші, PNAS USA, 85:2444-2448 (1988); Пірсон (Pearson), Methods Enzymol, 183:63-98 (1990); і Альтшуль (Altschul) та інші, Nucl. Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). Програма для BLASTP є доступною на сервері FTP Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) або NCBI, Національна медична бібліотека, будівля 38А, кімната 8N8O5, Bethesda, MD 20894. Після впорядкованого розміщення поліпептидних послідовностей, визначають кількість ідентичних амінокислот на впорядковано розміщених ділянках, кількість ідентичних амінокислот ділять на загальну кількість амінокислот поліпептиду, що становить інтерес, і результат множать на 100 для визначення відсоткової ідентичності послідовності. [0073] У цьому відношенні, пересічному фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, що фрагмент даної амінокислотної послідовності може бути щонайменше приблизно на 95% або більше ідентичним до амінокислотної послідовності, наприклад, на 96%, 97%, 98% або 99%. Таким чином, вважається, що фрагменти входять до складу "амінокислотної послідовності, яка є щонайменше приблизно на 95% або більше (або 96%, 97%, 98% або 99%) ідентичною до ПОСЛІДОВНОСТІ № 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14 або 16". Бажано, щоб такі фрагменти зберігали імуногенність непроцесованого білка. Функціональні фрагменти можуть одержуватись шляхом аналізу нуклеїнової кислоти, яка кодує білок, методом мутацій, з подальшою експресією одержаного білка-мутанта або хімічного/ферментативного розщеплення самого білка. [0074] Модифікації, наприклад, заміни, інсерції, додання та/або делеції можуть вводитись до нуклеїнової кислоти або білка (чи його фрагмента) за методами, відомими у цій галузі (дивись, наприклад, Едельман (Adelman) та інші, DNA, 2:183 (1983) щодо сайтспецифічного мутагенезу із застосуванням олігонуклеотидів). Бажано, щоб модифікація значною мірою не зменшувала імуногенності фрагмента білка; перевагу, скоріше, віддають тому, щоб імуногенність залишалась по суті такою самою або збільшувалась, порівняно з немодифікованим білком. [0075] "Консервативною заміною" є заміна, у разі якої амінокислоту замінюють на іншу амінокислоту, яка має подібні властивості, тобто подібну вторинну структуру та гідропатичну природу. Амінокислотні заміни можуть здійснюватись на основі подібності полярності, заряду, розчинності, гідрофобності, гідрофільності та/або амфіпатичної природи залишків. Наприклад, негативно заряджені амінокислоти, наприклад, аспарагінова кислота і глутамінова кислота, можуть взаємозамінюватись, у той час як позитивно заряджені амінокислоти, наприклад, лізин і аргінін, можуть взаємозамінюватись і амінокислоти з незарядженими полярними головними групами, які мають однакові показники гідрофільності, можуть взаємозамінюватись. У цьому відношенні, лейцин, ізолейцин і валін можуть взаємозамінюватись, гліцин і аланін можуть взаємозамінюватись, аспарагін і глутамін можуть 19 взаємозамінюватись і серин, треонін, фенілаланін і тирозин можуть взаємозамінюватись. Іншими групами амінокислот, які можуть взаємозамінюватись, є: 1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser та thr; 2) cys, ser, tyr та thr; 3) val, ile, leu, met, ala та phe; 4) lys, arg та his; і 5) phe, tyr, tip та his. [0076] Приймаючи до уваги вищенаведене, пропонується також композиція, яка містить виділений або очищений білок/нуклеїнову кислоту або фрагмент будь-якого з вищенаведених та біологічно прийнятний носій. Нуклеїнова кислота або її фрагмент можуть бути складовою частиною вектора. Дивись, наприклад, патент США № 4,029,763, який спрямовано на протигрипозну вакцину, яка містить, як активний інгредієнт, NM, і патент США № 4,140,762, який спрямовано на протигрипозну вакцину, яка містить, як активні інгредієнти, НА та NM. У патенті США №4,826,687 описують додання мураміл-дипептиду до вакцини, яка містить НА та NM. У разі необхідності, до композиції білка/нуклеїнової кислоти або їхнього фрагмента можуть додаватись поліпептиди, які відповідають по суті амінокислотам 148-162, 163-166 та/або 215-239 М1 (дивись, наприклад, патенти США № 5,136,019; № 5,616,327 та № 5,741,493). У композиції може застосовуватись будь-який придатний біологічно прийнятний носій. Наприклад, білок(-ки)/нуклеїнова(-і) кислота(-и)/їхні фрагменти можуть ресуспендуватись у розріджувачі, наприклад, 0,9% розчині хлориду натрію, який факультативно є забуференим, наприклад, фосфатним буфером. Будь-яка сахароза, що залишається після очищення вірусу, може відновлюватись шляхом діалізу. Діаліз або гель-хроматографія можуть застосовуватись для видалення будь-якого залишкового катіоногенного детергенту. За варіантом, якому віддається перевага, білок або його фрагмент є присутнім у кількості, достатній для спричинення імунної реакції (тобто клітинної або гуморальної) у тварини. Носієм, який часто вибирають для фармацевтичних препаратів і антигенів, є полі(dі,1-лактид-ко-гліколід) (PLGA). PLGA являє собою біодеградувальний поліефір, який може застосовуватись для контрольованого виділення антигену (Елдрідж (Eldridge) та інші, Сurr. Topics Micro. Immuno., 146:59-66 (1989); дивись також патент США № 6,090,393). Було показано, що включення антигенів до мікросфер PLGA діаметром 1-10 мкм має значний ад'ювантний ефект у разі перорального введення. [0077] У разі необхідності, може додаватись консервант або інактивуючий агент, наприклад, формальдегід. Традиційна кількість консерванта/інактивуючого агента становить 1 частину на 10000 частин. [0078] У разі необхідності, один або декілька білків (або їхніх імуногенних фрагментів), наприклад, НА, опис якого наведено вище, можуть об'єднуватись з протеосомами. Дивись, наприклад, патент США № 6,743,900 та заявку на патент США № 2004/0156867. [0079] Імуногенність може бути поліпшена шляхом включення традиційних імунологічних ад'ювантів, наприклад, гідроксиду алюмінію (наприклад, приблизно 0,2%) або фосфату алюмінію, 96743 20 алюмінію (дивись, наприклад, патенти США № 6,372,223, № 6,635,246, № 6,861,244 та № 7,052,701 і заявки на патент США № 2004/0096464 та № 2006/0147468), хітозану (дивись, наприклад, патенти США № 6,136,606 та № 6,534,065), галуну, наприклад, у формі гідроксиду алюмінію, фосфату алюмінію або оксиду алюмінію, мінеральних масел (наприклад, Вауоl® та Маrсоl 52®), повного ад'юванту Фрейнда, неповного ад'юванту Фрейнда, мураміл-дипептиду, монофосфорилу ліпіду А і сапонінів, у тому числі компоненту Quil А. Імуногенність може поліпшуватись також шляхом додання цитокіну, наприклад, інтерлейкіну, або шляхом кон'югування білків або їхніх фрагментів. За варіантом, якому віддається перевага, білок або його фрагмент кон'югують із макромолекулярним носієм, наприклад, білком (наприклад, сироватковий альбумін, гемоціанін лімфи равлика, імуноглобулін, троглобулін та овальбумін), полісахаридом (наприклад, сефароза, функціоналізована латексом, агароза, кульки целюлози тощо), фосфоліпідом, полімерними амінокислотами (наприклад, поліглутамінова кислота, полілізин тощо) або співполімерами амінокислот (дивись, наприклад, патенти США № 5,136,019 та № 5,612,037). За альтернативним варіантом, білок або його фрагмент може включатись до протеоліпосомного або ліпідного пухирця. [0080] Композиція, яка може індукувати імунну реакцію, може одержуватись у формі суспензії або може ліофілізуватись. У разі ліофілізації, перевагу віддають доданню одного або декількох стабілізаторів. Придатними стабілізаторами є, наприклад, цукроза, фосфат, глутамат і альбумін (SPGA; Боварнік (Bovarnick), J. Bacteriol, 59:509 (1950)), вуглеводи (наприклад, сорбіт, маніт, крохмаль, декстран і глюкоза), білки (наприклад, альбумін і казеїн) або продукти їх розкладу, білоквмісні агенти (наприклад, сироватка великої рогатої худоби або знежирене молоко) і буфери (наприклад, фосфати лужних металів). [0081] За альтернативним варіантом, композиції може бути надана форма композиції пролонгованої дії. Атенуйований/інактивований вірус або рекомбінантний вектор може включатись до мікрокапсул із полімерами, наприклад, полікарбонатами, поліефірами, поліуретанами, поліортоефірами і поліамідами. Конкретний вибраний полімер залежить від ряду факторів, у тому числі, відтворюваності синтезу полімерів та включення до мікрокапсул, вартості матеріалів і процесу, токсикологічного профілю, вимог до кінетики змінного виділення та фізико-хімічної сумісності полімеру та вірусу/вектора. [0082] Композиції, опис яких наведено, можуть застосовуватись самостійно або у комбінації з іншими активними інгредієнтами/композиціями. Прикладами є композиції, які можуть спричинювати імунну реакцію проти чуми собачих, інфекційного гепатиту собачих (CAV-1 і CAV-2), сказу, парагрипу, коронавірусу собачих, кору, лептоспірозу і бордетели. Було встановлено, що поліфеноли пригнічують грипозну інфекцію у людей (дивись, наприклад, патент США № 5,173,922; патент '922). Відповідно, благотворним може виявитись додан 21 ня поліфенолу, наприклад, галату епігалокатехіну, галату епікатехіну, епігалокатехіну, епікатехіну, вільного теафлавіну, моногалату теафлавіну А, моногалату теафлавіну В та/або дигалату теафлавіну (дивись патент '922). Інгібітори NM розкривають у патенті США № 5,453,533. Застосування цитокінів у ролі імунопотенціаторов і включення до ліпосомних капсул описують у патенті США № 5,919,480. [0083] Кількість нуклеїнової кислоти у композиції може коливатись у широких межах. Наприклад, концентрація може коливатись у межах від менше ніж приблизно 0,1% (мас.) до приблизно 20-50% (мас.) або більше, як правило, щонайменше приблизно 2%. Концентрація білка у композиції також може коливатись у широких межах. Наприклад, концентрація може коливатись у межах від менше ніж приблизно 0,1% (мас.) до приблизно 20-50% (мас.) або більше, як правило, щонайменше приблизно 2%. Об'єм рідини та в'язкість приймають до уваги у разі визначення кінцевої концентрації. [0084] Відповідно, пропонується спосіб індукування імунної реакції проти вірусу грипу собачих у тварини. Сприйнятливість тварини до інфекції може визначатись за допомогою реакції пригнічення бляшкоутворення (патент США № 4,315,073) або реакції гемаглютинації. Згаданий спосіб включає введення тварині вищеописаної композиції, яка містить виділений або очищений білок/нуклеїнову кислоту або їхній фрагмент. У разі, якщо композиція містить нуклеїнову кислоту (або її фрагмент) як складову частину вектора, білок (або його фрагмент), за варіантом, якому віддається перевага, експресують у кількості, достатній для спричинення імунної реакції у тварини. Наприклад, може вводитись одноразова доза від приблизно 9 міжнародних одиниць до приблизно 43 міжнародних одиниць на кг маси тіла тварини. У разі ссавців більшого розміру, одноразова доза може містити від приблизно 600 міжнародних одиниць до приблизно 3000 міжнародних одиниць на кг маси тіла. У разі вакцинних композицій, які одержують шляхом культивування вірусу у алантоїсній порожнині запліднених яєць, збирання вірусу і, у разі необхідності, стабілізування зібраного вірусу за допомогою стабілізатора, наприклад, пептону або цукрози, з подальшим розподілом до скляних флаконів для подальшої ліофілізації, ефективна стандартна доза вакцини може містити щонайме7 нше 10 EID50 (доза 50% інфекційності для яєць) вірусу. У разі останньої згаданої ситуації, ліофілізовану вакцину відновлюють шляхом додання води або іншого фармацевтично прийнятного розріджувача перед введенням, наприклад, у формі спрею в ніс або крапель в ніс. У разі потреби, вакцину можна вводити двома послідовними дозами з тижневим інтервалом. [0085] Композиція може вводитись цуценятам у вигляді одноразової дози у віці 12 тижнів або повторно, розпочинаючи з віку 6 тижнів (наприклад, у тижнів, 9 тижнів та 12 тижнів) чи щотижнево, розпочинаючи з 4-тижневого віку. Ефективна доза і шлях введення визначаються природою композиції, природою експресованого продукту, 96743 22 LD50 і, у разі застосування рекомбінантного вектора, рівнем експресії вектора, а також породою собаки та його віком, статтю, масою і станом. Дози експресованого продукту можуть коливатись від декількох мікрограм до декількох сотень мікрограм, наприклад. 5-500 мкг. Дози вірусу або рекомбінантного вектора, яким віддають перевагу, мо3 жуть коливатись у межах від приблизно 10 6 бляшкотвірних одиниць до приблизно 10 бляшкотвірних одиниць. Доза живого атенуйованого шта3 му може становити щонайменше приблизно 10 TCID50. [0086] Композиції можуть вводитись парентеральним шляхом (тобто шляхом ін'єкції (наприклад, внутрішньошкірної, підшкірної або внутрішньом'язової) або шляхом інфікування, наприклад, інтраназального) чи ентеральним шляхом (тобто шляхом перорального введення). Застосування желеутворювального компоненту та слизової клейкої речовини або біологічного клею для посилення імунної реакції проти імуногенної композиції, введеної внутрішньошкірним шляхом, описують у заявці на патент США № 2005/0255121. У разі потреби, композиція для спричинення імунної реакції може вводитись із питною водою або сиропом за Чу (Сhu) та інші (заявка на патент США № 2006/0171960, яка була опублікована 3 серпня 2006 року). Введенню пероральним шляхом віддається перевага, оскільки цим запобігається тривала і трудомістка внутрішньом'язова ін'єкція, яка, у свою чергу, може створити стресову ситуацію для тварини і дискомфорт. Дискомфорт, у свою чергу, може негативно вплинути на працездатність бігових собак. За альтернативним варіантом, композиція, яка містить рекомбінантний вектор, який експресує щонайменше одну антигенну детермінанту, яка спричинює імунну реакцію, може наноситись безпосередньо на шкіру для локалізованої експресії та спричинення імунної реакції. [0087] Ефективність композиції, яка може спричинювати імунну реакцію, може демонструватись шляхом піддання цуценят дії вірулентного штаму вірусу грипу собачих. У необроблених собак повинні розвинутись клінічні ознаки, характерні для вірусної інфекції грипу собачих, у той час як у оброблених собак вони виникнути не повинні. [0088] Рекомбінантні вектори і продукти, експресовані з них, можуть застосовуватись для продукування антитіл, наприклад, поліклональних антитіл (рАb) і моноклональних антитіл (mAb), за методами, відомими у цій галузі (Харлоу (Harlow), Лейн (Lane), Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988); Харлоу (Harlow), Лейн (Lane), Using Antibodies: A Laboratory Manual (1998), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1998); Шепард (Shepherd), Лін (Dean), Monoclonal Antibodies: A Practical Approach, Oxford University Press, U.S.A. (2000); Xappic (Harris), Адер (Adair), Antibody Therapeutics, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL (1997)). Антитіла, зокрема, mAB, можуть застосовуватись у аналізах зв'язування та діагностичних наборах/тестах для визначення присутності/відсутності антигену вірусу грипу собачих або того, була чи не була стимульована імунна реакція 23 проти згаданого вірусу. Згадані антитіла можуть також застосовуватись для відновлення матеріалу засобами імуноадсорбційної хроматографії. [0089] Антитіла можуть також забезпечувати пасивну імунізацію. Наприклад, тварині можуть вводитись частково очищені імунні сироватки від тварин-хазяїв або з ліній гібридом. Антитіла забезпечують терапевтичний ефект шляхом зв'язування з інфекційним вірусом грипу і його нейтралізування. [0090] Пропонується також композиція, яка містить антиідіотипове антитіло, яке має "внутрішній образ" антигенної детермінанти вищеописаного білка, наприклад, білка, який містить амінокислотну ПОСЛІДОВНІСТЬ № 1 або ПОСЛІДОВНІСТЬ № 3. [0091] Пересічному фахівцю у цій галузі буде зрозуміло, що можна одержати антиідіотипове антитіло, яке несе "внутрішній образ" антигенної детермінанти, такі, наприклад, опис яких наведено. Дивись, наприклад, Херлін (Herlyn) та інші, Science, 232:100-102 (1986). Способи одержання моноклональних і поліклональних антиідіотипових антитіл, які несуть "внутрішній образ" поліпептиду, описують, наприклад, у патенті США № 5,053,224. Стисло, поліклональні антиідіотипові антитіла можна одержати шляхом імунізації тварин моноклональними ідіотиповими антитілами, які були одержані проти поліпептиду і перевірені на реакційну здатність із поліпептидом та перевірені на антисироватках, які реагують з ідіотиповими антитілами проти поліпептиду. Моноклональні антитіла (mAbs) можна одержати також від таких тварин за стандартними методами імморталізації антитілосекретуючих клітин тварини і перевірки культур ідіотиповими антитілами у конкуренції з поліпептидом. Незважаючи на те, що перевагу віддають моноклональним антитілам (mAbs), застосовуватись можуть також поліклональні антитіла (pAbs), які одержують у різних ссавцевих системах. [0092] Пропонується також інший спосіб індукування імунної реакції проти CIV у собачих. Цей спосіб включає введення собачим ефективної кількості композиції, яка містить антиідіотипове антитіло, як описано вище. [0093] Виділені або очищені нуклеїновокислотні молекули або вектори, які їх містять, можуть застосовуватись для одержання ДНК для зондів/праймерів, які можуть застосовуватись для виявлення присутності або відсутності здатної до гібридизації ДНК, або ампліфікації ДНК, наприклад, кДНК. [0094] При проведенні аналізів можуть застосовуватись мічені білки або їхні фрагменти, а також мічені нуклеїнові кислоти або їхні фрагменти. Аналітичні методи включають імунофлуоресцентний аналіз (Сміт (Smith) та інші, Ann. Clin. Віосhem., 18:253-275 (1981)), радіоімуноаналіз (RIA), імуноферментні твердофазні аналізи (ELISA) та імуноаналітичний метод із ферментативним підсиленням (EMIT; дивись Enzyme Immunoassay, Маджіо (Maggio), редактор, CRC Press, Inc., Boca Raton, FL, 1980, стор. 141-150; 234-235 та 242243). Такі методи можуть застосовуватись для 96743 24 виявлення присутності вірусу і діагностування стану інфекції. [0095] Сам вірус може застосовуватись як вектор. Застосування вірусів як векторів знаходиться у межах можливостей цієї галузі. Приклад [0096] Наведений нижче приклад призначений для ілюстрації цього винаходу. Згаданий приклад не призначений для жодного обмеження обсягу цього винаходу. Приклад описує ідентифікацію і часткове визначення характеристик вірусу грипу собачих. [0097] Спалахи хвороби дихальних органів, які характеризуються кашлем, гарячкою, прискореним диханням та геморагічними виділеннями з носа, мали місце у квітні 2005 року серед хортів двох порід, які знаходяться у східних та західних районах штату Айова. Незважаючи на те, що великий відсоток уражених собак видужав, багато тварин загинули унаслідок геморагічної пневмонії. [0098] Легені уражених собак демонстрували широке змінення забарвлення від червоного до червоно-чорного кольору з промацуваною твердістю від помірної до явно вираженої та слабкий фібринозний плеврит. Зрізи легень характеризувались тяжкою геморагічною інтерстиціальноюбронхоінтерстиціальною пневмонією. Очевидною були ацинозні інтерстиціальні зміни з потовщенням альвеолярних перегородок, коагулятами продуктів розпаду у альвеолах і пов'язаним із цим ателектазом. Спостерігалась вогнищево екстенсивна піогрануломатозна бронхоінтерстиціальна пневмонія з розширенням дихальних шляхів переродженими клітинами і продуктами розпаду. Явно вираженим був розсіяний васкуліт і тромби судин. [0099] Мікробіологічна перевірка на традиційні вірусні і бактеріальні агенти не виявила жодних значущих патогенів, за виключенням Streptococcus equi підвид zooepidemicus, який був присутнім у тканинах легень усіх перевірених тварин. Два із чотирьох зразків легень виявились позитивними на вірус грипу за результатами полімеразної ланцюгової реакції з ревертазою у реальному масштабі часу (RT-PCR; Хармон (Harmon) та інші, Development of a PCR-based differential test for H1N1 and H3N2 swine influenza viruses. У: nd Proceedings of the 42 Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. San Diego, CA. Жовтень 1999 року, стор. 44). Імуногістохімічні аналізи із застосуванням моноклонального антитіла (mАb), специфічного відносно NP вірусу грипу (Вінсент (Vincent) та інші, J. Vet. Diagn. Invest., 9:191-195 (1997)) також дали позитивні результати у межах ушкоджень обох легень унаслідок вірусної пневмонії, як і перевірка зразків методом "антигенної пастки" ELISA (Directgen™ Flu А, компанія Becton/Dickinson, Sparks, штат Меріленд). Зразки бронхоальвеолярних змивів двох позитивних легень дали позитивний результат на вірус грипу за даними ПЛР. [00100] Вдались до спроби виділення вірусу, оскільки виявлення вірусу грипу у легенях собачих було неочікуваним спостереженням, тому що існує лише одне повідомлення про інфікування собак вірусом грипу (Дубові (Dubovi) та інші, Isolation of 25 equine influenza virus from racing greyhounds with fatal hemorrhagic pneumonia. У: Proceedings of the th 47 Annual Meeting of American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians. Greensboro, штат Північна Кароліна. Жовтень 2004 року, стор. 158). Вірус, здатний аглютинувати еритроцити півня, виділили на клітинах нирок собачих лінії Madin-Darby (MDCK) із легень і бронхоальвеолярної змивної рідини однієї з двох тварин, у яких вірус грипу виявили за допомогою імуногістохімічного (ІНС) аналізу та ПЛР. За допомогою ПЛР встановили, що ізолят являв собою вірус грипу підтипу НЗ. Вірусний ізолят віднесли до підтипу H3N8 за допомогою аналізів пригнічення НА і пригнічення NM. Вірусний ізолят розпізнали антисироватками, які були одержані проти різних вірусів грипу коней НЗ, у тому числі Miami ((A/Eq/MI/1/63H3N8) 640-1280), AK((A/Eq/AK/29759/91-H3N8) 320-640) та Kentucky ((A/Eq/Kentucky/81-H3N8) 160-320). [00101] При секвенуванні НА та NA генів обох ізолятів виявили 100% та 99,8% ідентичність, відповідно, між двома ізолятами. У філогенетичному плані, НА ген ізолятів був генетично ближчим (96%-98% нуклеотидна гомологія) до НА гена нещодавно виявлених вірусів грипу коней H3N8 (Макен (Macken) та інші, The value of a database in surveillance and vaccine selection. У: Options for the Control of Influenza IV. Остерхауз (Osterhaus) та інші, редактори. Elsevier Science, Amsterdam. 2001, стор. 103-106). NA ген ізолятів також продемонстрував 96%-98% гомологію з NA геном нещодавно виявлених вірусів грипу коней H3N8. Оскільки у хортів двох різних порід, географічно відокремлених у штаті Айова, згадане захворювання з'явилось одночасно без залучення хворих коней, це вказує на те, що ізолят вірусу грипу є адаптованим до собачих штамом, який може тривало зберігатись і поширюватись серед собак. Тяжкості перебігу захворювання сприяв патогенний мікроорганізм S. zooepidemicus, ймовірну причетність якого до хвороби дихальних органів і пов'язаних із септицемією проблем припускають у багатьох різних видів тварин (Вуд (Wood) та інші, J. Clin. Microbiol, 96743 26 43:120-126 (2005); і Джіллеспі (Gillespie) та інші, The General Staphylococcus and Streptococcus. У: Hagan and Bruner's Infectious Diseases of Domestic Animals, 7 видання, Comstock/Cornell University Press. Ithaca, штат Нью-Йорк, 1981, стор. 164-180). [00102] Усі посилання, у тому числі публікації, заявки на патент і патенти, наведені у цьому описі, є включеними до цього описання такою ж самою мірою, якби кожне посилання було у індивідуальному порядку і конкретно призначеним до включення шляхом посилання і було б наведене у цьому описі у повному обсязі. [00103] Застосування однини у контексті опису цього винаходу (зокрема, у контексті наведених нижче пунктів формули винаходу) повинно розглядатись як таке що означає як однину, так і множину, якщо не вказано інше або немає чітко вираженого заперечення у контексті. Вказання діапазонів значень у цьому описі має призначення виключно як скорочений спосіб індивідуального вказання кожного окремого значення, яке знаходиться у межах згаданого діапазону, якщо у цьому описі не вказано інше і кожне окреме значення включається до опису таким чином, якби воно вказувалось у індивідуальному порядку. Усі методи, опис яких наведено, можуть здійснюватись у будь-якому відповідному порядку, якщо у цьому описі не вказано інше або цьому не має чітко вираженого заперечення у контексті. Застосування будь-якого та усіх прикладів або зразкових термінів (наприклад, "такий як"), наведених у цьому описі, є призначеним виключно для кращого пояснення винаходу і не накладає обмеження на обсяг цього винаходу, якщо не вказується інше. Жоден термін у описі не повинен розглядатись як такий, що вказує будьякий незаявлений елемент, як обов'язковий для практичного здійснення цього винаходу. [00104] Наведено опис варіантів здійснення цього винаходу, яким віддають перевагу, у тому числі найкращий відомий винахідникам спосіб здійснення цього винаходу. Слід розуміти, що ілюстративні варіанти здійснення є лише прикладами і не повинні розглядатись як такі, що обмежують обсяг цього винаходу. 27 96743 28 29 96743 30 31 96743 32 33 96743 34 35 96743 36 37 96743 38 39 96743 40 41 96743 42 43 96743 44 45 96743 46 47 96743 48 49 96743 50 51 96743 52 53 96743 54 55 96743 56 57 96743 58 59 96743 60