Лікування хронічної запальної демієлінізуючої поліневропатії із застосуванням b-інтерферону

1. Застосування препарату IFN-β для одержання лікарського засобу для лікування хронічної демієлінізуючої невропатії, де вказаний лікарський засіб вводиться суб'єкту, який раніше не був стійким до інших видів лікування хронічної демієлінізуючої невропатії, де препарат IFN-β вводять у комбінованому лікуванні, вибраному з групи, яка складається з введення IVIg, введення імунодепресанту, введення протизапального лікарського засобу і плазмаферезу. 2. Застосування за п. 1, де другим лікуванням є введення IVIg. 3. Застосування за п. 1, де другим лікуванням є введення імунодепресанту. 4. Застосування за п. 3, де імунодепресант вибраний з групи, яка складається зі стероїду, азотіоприну, циклоспорину, циклофосфаміду та мікофеноляту. 5. Застосування за п. 1, де другим лікуванням є введення протизапального лікарського засобу. 6. Застосування за п. 3, де другим лікуванням є плазмаферез. 7. Застосування препарату IFN-β для отримання лікарського засобу для лікування хронічної демієлінізуючої невропатії, де препарат IFN-β вводять у 2 UA 1 (19) ДЕРЖАВНИЙ ДЕПАРТАМЕНТ ІНТЕЛЕКТУАЛЬНОЇ ВЛАСНОСТІ 3 86749 4 23. Застосування за будь-яким з пп. 1-22, в якому 34. Застосування за п. 33, в якому стабілізуючий IFN-β глікозильований. агент є аргініном. 24. Застосування за будь-яким з пп. 1-22, в якому 35. Застосування за будь-якими з пп. 1-34, в якому IFN-β не глікозильований. лікарський засіб має значення рН у межах від бли25. Застосування за п. 20 в якому IFN-β є IFN-β-la. зько 4,0 до 7,2. 26. Застосування за п. 20, в якому IFN-β є IFN-β-lb. 36. Застосування за будь-яким з пп. 1-35, яке 27. Застосування за будь-яким з пп. 1-26, в якому включає введення ссавцю декількох доз препарату препарат IFN-β містить IFN-β, злитий з константIFN-β. ним доменом молекули імуноглобуліну. 37. Застосування за будь-яким з пп. 1-36, в якому 28. Застосування за п. 27, в якому молекула імунопрепарат IFN-β вводять один раз на тиждень у глобуліну є молекулою людського імуноглобуліну. дозі близько 6 ММО. 29. Застосування за п. 28, у якому молекула імуно38. Застосування за будь-яким з пп. 1-36, в якому глобуліну є важким ланцюгом IgGl. препарат IFN-β вводять двічі на тиждень у дозі 30. Застосування за п. 29, в якому IFN-β містить близько 6 ММО. SEQ ID NO:14. 39. Застосування за будь-яким з пп. 1-36, в якому 31. Застосування за будь-яким з пп. 1-30, в якому препарат IFN-β вводять один раз на тиждень у препарат IFN-β містить пегильований IFN-β. дозі близько 12 ММО. 32. Застосування за будь-яким з пп. 1-31, в якому 40. Застосування за будь-яким з пп. 1-36, в якому препарат IFN-β містить стабілізуючий агент. препарат IFN-β вводять двічі на тиждень у дозі 33. Застосування за п. 32, в якому стабілізуючий близько 12 ММО. агент є кислою амінокислотою. 41. Застосування за будь-яким з пп. 1-40, в якому лікарський засіб вводять людині. Хронічна запальна демієлінізуюча поліневропатія (CIDP) є неврологічним захворюванням, що характеризується повільно прогресуючою слабкістю і порушенням чутливості в ногах і руках. Причиною виникнення даного захворювання є руйнування мієлінової оболонки периферичних нервів. Опухання нервових корінців також є відмітною ознакою даного захворювання. Хоча вказане захворювання може виникати в будь-якому віці і в представників обох статей, CIDP частіше виявляється у молодих людей, причому у чоловіків частіше, ніж у жінок. Характерними симптомами є поколювання або оніміння (починаючи з пальців ніг і рук), слабкість рук і ніг, ниючі болі в м'язах, втрата глибоких сухожильних рефлексів (арефлексія), втома і атипові відчуття. CIDP взаємопов'язана з деякими іншими захворюваннями. Наприклад, встановлено, що запальна демієлінізуюча невропатія, наприклад CIDP, діагностована у третини серопозитивних суб'єктів, інфікованих вірусом імунодефіциту людини (ВІЛ), що направляються до лікаря з приводу периферичних нервових захворювань. Крім того, встановлено, що CIDP зустрічається у суб'єктів, які страждають вовчаком, парапротеїнемією, лімфомою або діабетом. За відсутності лікування CIDP приводить до втрати працездатності, що вимагає проведення фізіотерапії і трудотерапії, застосування ортопедичних апаратів і тривалого лікування. Для призначення правильного лікування треба, щоб кваліфікований лікар спостерігав хворого у позалікарняних умовах. Сучасні методи лікування CIDP включають введення кортикостероїдів, таких як преднізон, який може бути призначений окремо або в поєднанні з імунодепресантами. Імунодепресанти можуть бути також призначені без стероїду. Плазмаферез (заміна плазми) і внутрішньовенне введення імуноглобуліну (IVIg) також є досить ефективними методами, що засто совуються в цей час. IVIg можна використати навіть як основне лікування. Крім того, фізіотерапія може збільшити м'язову силу, функціональність і рухливість кінцівок і мінімізувати розвиток контрактур. CIDP по-різному розвивається у різних людей. У деяких людей після одного приступу CIDP може піти спонтанне видужання, в той час як в інших може бути багато приступів з частковим відновленням між рецидивами. Дане захворювання є набутою невропатією, що піддається лікуванню, тому лікування рекомендується починати якомога раніше, щоб запобігти втраті нервових клітин. Однак у деяких суб'єктів зберігається деяке залишкове оніміння або слабкість кінцівок. Таким чином, сучасні методи лікування CIDP є шкідливими (наприклад, стероїди або імунодепресанти), або незручними (наприклад, плазмаферез) методами, що дорого коштують (наприклад, IVIg і плазмаферез). Тому вельми бажані ефективні терапевтичні методи лікування хронічних демієлінізуючих невропатій, наприклад CIDP, які будуть менш токсичними, більш дешевими і більш зручними в порівнянні з сучасними методами. Один варіант здійснення винаходу відноситься до способів лікування хронічної демієлінізуючої рухової невропатії у ссавця. Вказаний спосіб може включати введення ссавцеві терапевтично ефективної кількості препарату IFN-b. Препарат IFN-b можна вводити парентерально, не вдаючись до підшкірних ін'єкцій, наприклад внутрішньом'язово. У переважному варіанті здійснення винаходу невропатія є хронічною запальною демієлінізуючою невропатією (CIDP). Препарат IFN-b може містити людський IFN-b. Наприклад, препарат IFN-b може містити білок, який щонайменше приблизно на 95% ідентичний непроцесованому зрілому людському IFN-b, що має SEQ ID NO:4. Препарат IFN-b може також містити непроцесований зрілий людський IFN-b, що 5 86749 6 кування CIDP включають введення препарату IFNмає SEQ ID NO:4. Препарат IFN-b може також місb в кількості, ефективній для значного зменшення тити непроцесований зрілий людський IFN-b, що дози або частоти проведення основного лікування має SEQ ID NO:4, злитий з гетерологічним поліпеCIDP, причому препарат IFN-b вводять парентептидом, наприклад, з константним доменом молеральним способом, відмінним від підшкірного ввекули людського імуноглобуліну. Молекула імунодення, для досягнення ефективного ослаблення глобуліну може являти собою важкий ланцюг IgG1. симптомів CIDP. Відповідно до іншого способу Препарат IFN-b може містити SEQ ID NO:14. Прелікування CIDP потребуючий суб'єкт проходить парат IFN-b може також містити пегильований IFNосновний курс лікування CIDP, вибраний з групи, b. що складається з введення стероїду, введення Препарат IFN-b або утримуюча його композипротизапального засобу, введення IVIg і провеція може включати стабілізуючий агент, такий як дення плазмаферезу, при цьому крім основного білок або амінокислота. Наприклад, стабілізуючим лікування CIDP суб'єкту вводять препарат IFN-b агентом може бути аргінін. Препарат IFN-b або один раз на тиждень в кількості, ефективній для утримуюча його композиція може мати значення значного зменшення дози або частоти проведення рН в межах від близько 4,0 до 7,2. основного лікування CIDP, для досягнення ефекПрепарат IFN-b можна вводити один, два або тивного ослаблення симптомів CIDP. Суб'єкту, що три рази на тиждень. У деяких варіантах здійсненмає CIDP, може бути також призначене основне ня винаходу препарат IFN-b вводять в кількості лікування CIDP, вибране з групи, що складається з приблизно 6 або 12 мільйонів міжнародних одивведення стероїду, введення протизапального ниць (ММО). Препарат IFN-b можна вводити внутзасобу і проведення плазмаферезу, при цьому рішньом'язово або підшкірно. У переважному варікрім основного лікування CIDP суб'єкту вводять анті здійснення винаходу суб'єкт є ссавцем, препарат IFN-b в кількості, ефективній для значнопереважно людиною. го зменшення дози або частоти проведення осноДаний винахід відноситься також до способів вного лікування CIDP, для досягнення ефективнолікування невропатії, наприклад CIDP, що включає го ослаблення симптомів CIDP. введення суб'єкту, страждаючому невропатією, На Фігурах 1А-С показані нуклеотидна посліфармацевтично ефективної кількості препарату довність (SEQ ID NO:11) і амінокислотна послідовIFN-b і подальше введення суб'єкту імунодепресаність (SEQ ID NO:12) злитого білка, що містить нту або проведення плазмаферезу. Вказаний спосигнальну послідовність VCAM, злиту зі зрілим сіб може включати введення суб'єкту імунодепренепроцесованим людським IFN-b (SEQ ID NO:3 і санту, вибраного з групи, що складається з 4), в якому гліцин в положенні амінокислоти 162 стероїду, азотіоприну, циклоспорину, циклофосSEQ ID NO:4 замінений цистеїном, злитим з шарфаміду і мікофеноляту. нірними, СН2- і СН3-доменами Fc-фрагмента IgG1 В об'єм даного винаходу входять також спосолюдини (ZL5107). би лікування невропатії, наприклад CIDP, що На Фігурах 2А-С показані нуклеотидна послівключають введення хворому невропатією фардовність (SEQ ID NO:13) і амінокислотна послідовмацевтично ефективної кількості препарату IFN-b ність (SEQ ID NO:14) злитого білка, що містить в поєднанні з додатковим лікуванням невропатії, сигнальну послідовність VCAM, злиту зі зрілим причому препарат IFN-b вводять парентеральним непроцесованим людським IFN-b (SEQ ID NO:3 і способом, відмінним від підшкірного введення. 4), в якому гліцин в положенні амінокислоти 162 Препарат IFN-b можна вводити внутрішньом'язоSEQ ID NO:4 замінений цистеїном, злитим з лінкево. Препарат IFN-b можна вводити один раз на ром G4S, який в свою чергу злитий з шарнірними, тиждень, наприклад, близько 6 ММО препарату СН2- і СН3-доменами Fc-фрагмента IgG1 людини IFN-b один раз на тиждень. Коли невропатія являє (ZL6206). собою CIDP, додаткове лікування може бути вибДаний винахід відноситься до способів лікуране з групи, що включає введення стероїду, ввевання хронічних демієлінізуючих невропатій, надення IVIg, введення протизапального засобу і приклад CIDP, що включає введення фармацевтипроведення плазмаферезу. чно ефективної кількості препарату IFN-b. Інший варіант здійснення винаходу відносить1. Визначення термінів ся до способів лікування невропатії, наприклад Для більш чіткого і точного викладення предCIDP, що включає введення хворому невропатією мета винаходу, описаного в формулі винаходу, фармацевтично ефективної кількості препарату нижче приведені визначення деяких термінів, виIFN-b в поєднанні з додатковим лікуванням неврокористаних в описі винаходу і прикладеній формупатії, причому препарат IFN-b вводять один раз на лі винаходу. тиждень. Якщо невропатія являє собою CIDP, доУ значенні, використаному в описі винаходу і даткове лікування CIDP може бути вибране з груприкладеній формулі винаходу, терміни в формі пи, що включає введення стероїду, введення IVIg, однини мають узагальнююче значення за винятвведення протизапального засобу і проведення ком тих випадків, коли з контексту винаходу вихоплазмаферезу. дить зворотне. Інший варіант здійснення винаходу відноситьТермін «хронічна запальна демієлінізуюча пося до способів лікування CIDP у суб'єкта, що проліневропатія» має взаємозамінне значення з терходить основний курс лікування CIDP, вибраний з міном «CIDP». Нижченаведені захворювання є групи, що складається з введення стероїду, ввеідентичними або вважаються по суті ідентичними дення протизапального засобу, введення IVIg і CIDP і тому входять у визначення терміну «CIDP», проведення плазмаферезу, які крім основного ліщо використовується в даному описі винаходу: 7 86749 8 «хронічна рецидивна поліневропатія», «хронічна (INCAT) за допомогою підсумовування балів чутідіопатична демієлінізуюча поліневропатія», «хроливості (ISS) [Merkies et al. (2000) Neurology нічна запальна демієлінізуюча полірадикулонев54:943]. Антигени лейкоцитів людини Dw3, DRw3, ропатія» і «хронічна набута демієлінізуюча полінеA1 і В8 частіше зустрічаються у хворих на CIDP, вропатія» («CADP»). CIDP є хронічним ніж у здорових людей [Zvartau-Hind et al. (2002) прогресуючим захворюванням з поступовим розChronic Inflammatory Demyelinating витком або рецидивами [див., наприклад, Dyck et Polyradiculoneuropathy, адреса в Інтернеті al, (1993) in Dyck, P.J., Thomas, РІК., Griffin, J.W., www.emedicine.com/neuro]. Low, P.A., Poduslo, J.F., (Eds.), Peripheral Термін «IFN-b-1a» означає глікозильовану моNeuropathy, 3rd ed. Saunders, Philadelphia, pp. 1498лекулу IFN-b, що містить амінокислотну послідов1517]. Патологічні ознаки CIDP включають сегменності людського IFN-b дикого типу. тну демієлінізацію і ремієлінізацію і наявність моТермін «IFN-b-1b» означає неглікозильовану нонуклеарних клітинних інфільтратів в ендоневрії молекулу IFN-b, що містить амінокислотну послі[Duck et al., див. вище]. CIDP іноді визначають як довність IFN-b дикого типу, де цистеїн в положенні периферичний різновид розсіяного склерозу (MS) 17 замінений серином і відсутній метіонін в поло[Toyka and Hartung (1996) Curr. Opin. Neurol. 9, женні 1 («ініціюючий метіонін»). 240-250]. Дане захворювання іноді визначають Термін «варіант IFN-b» означає білок IFN-b дитакож як хронічну форму синдрому Гійєна-Барре. кого типу, що містить одну або декілька модифікаКритеріями для діагностики CIDP є клінічні, електцій, наприклад, делецій, додавань, заміни амінорофізіологічні дослідження і аналіз цереброспінакислот, посттрансляційну модифікацію або льної рідини (CSF), описані, наприклад, в [звіті включає один або декілька штучних амінокислотспеціального підкомітету Американської академії них залишків або зв'язків між ними. Частини IFN-b неврології, AIDS taks force (1991) Neurology входять у визначення терміну «варіант IFN-b». 41:617]. Діагностичні дослідження включають голТермін «біологічно активний варіант IFN-b» ознаковколювання в дев'яти точках; проходження 10 чає варіант IFN-b, який володіє щонайменше деметрів; шкалу Ранкіна або її модифіковану форму і якою активністю при лікування невропатії, наприпідсумовування балів по шкалі MRC або її модифіклад CIDP. Варіант IFN-b може бути природним кованій формі [Mathiowetz et al., (1985) IFN-b, що включає, наприклад вставку, делецію Occupational Therapy J. of Res. 5: 24; Thompson et або заміну однієї або декількох амінокислот в поal., (1996) J. Neurol. 243: 280; Collen et al., (1990) рівнянні з IFN-b дикого типу, тобто природним муInt. Disability Studies 12: 6; van Swieten et al. (1988) тантом або поліморфним варіантом, або штучним Stroke 19: 604 and Kleyweg et al., (1991) Muscle IFN-b. Nerve 14: 1103]. Неврологічні оцінки можуть також Термін «міжнародні одиниці» або (МО) у завключати шкалу неврологічної втрати працездатності (NDS); шкалу втрати працездатності (0, постосуванні до IFN-b означає одиниці вимірювання, вністю здоровий; 1, незначні симптоми; 2, може прийняті Всесвітньою організацією охорони здороходити без допомоги, але не може бігати; 3, може в'я (WHO) як міжнародний стандарт для вимірюпройти 5 метрів з допомогою; 4, прикований до вання інтерферону. інвалідного крісла/ліжка); тест рухової здатності Термін «виділений» (що має взаємозамінне Хамерсміта (НМАТ) [Dyck P.J., In «Peripheral значення з терміном «по суті чистий») у застосуNeuropathy» (1993), supra, pages 686-697; Scott et ванні до поліпептидів означає поліпептид, який за al. (1982) Muscle Nerve 5:291] і дослідження провісвоїм походженням або внаслідок маніпуляцій: (1) дності нервів. Визначення м'язової сили може присутній в клітині-хазяїні як продукт експресії часвключати оцінку рухових функцій, наприклад вимітини експресуючого вектора; (іі) пов'язаний з білрювання максимального довільного ізометричного ком або іншою хімічною частиною молекули, що не скорочення м'яза (MVIC), відоме в даній галузі, і є частиною молекули, з якою він зв'язаний в привимірювання м'язової сили. Інші дослідження роді; або (ііі) не зустрічається в природі, напривтрати працездатності включають індекс здатності клад, білок, який хімічно модифікований шляхом переміщатися; вимірювання функціональної незаприєднання або додання щонайменше однієї гідлежності; шкалу неврологічної втрати працездатрофобної частини, внаслідок чого білок набуває ності Гая (GNDS); підсумовування балів по шкалі форми, що не зустрічається в природі. Термін Медичної науково-дослідної ради; підсумовування «виділений» далі означає білок, який: (і) синтезобалів по шкалі чутливості і функціональну шкалу ваний хімічним способом; або (іі) експресований в Хьюза [Hauser et al. (1983) Ν. Engl. J. Med. 308:173; клітині-хазяїні і очищений від пов'язаних і забрудHall et al. (1993) J. Head Trauma Rehabilitation 8:60; нюючих білків. Даний термін звичайно служить для Sharrack et al. (1996) J. Neurol. 243:332 and Merkies позначення поліпептиду, який був відділений від et al. (2002) Neurology 59:84]. Електрофізіологічні інших білків і нуклеїнових кислот, разом з якими критерії діагностики CIDP були запропоновані спевін зустрічається в природних умовах. Крім того, ціальним комітетом Американської академії невказаний поліпептид переважно відділений від врології (AAN) в 1991р. і недавно були переглянуті таких речовин, як антитіла або гелеві матриці (по[Nicolas et al. (2002) Muscle Nerve 25:26]. Іншим ліакриламід), що використовуються для його очидослідженням, що використовується для діагносщення. Термін «виділений» (що використовується тики імуноопосередкованої сенсорно-рухової полівзаємозамінно з терміном «по суті чистий») у заневропатії, наприклад, CIDP і синдрому Гійєнастосуванні до нуклеїнових кислот означає полінукБарре (GBS), є психометрична оцінка причини леотид РНК або ДНК, частину геномного полінуквиникнення і лікування запальної невропатії леотиду, кДНК або синтетичний полінуклеотид, 9 86749 10 ябсий за своїм походженням або внаслідок маніТермін «процентна тотожність» або «процентпуляції: (і) не зв'язаний з всім полінуклеотидом, з на схожість» означає схожість послідовностей яким він зв'язаний в природі (наприклад, знаходвох поліпептидів, молекул або двох нуклеїнових диться в клітині-хазяїні у вигляді експресуючого кислот. Якщо в певному положенні двох послідоввектора або його частини); (іі) пов'язаний з нуклеїностей, що порівнюються, знаходиться одна і та ж новою кислотою або іншою хімічною частиною основа або мономерна амінокислотна субодиниця, молекули, яка не є частиною молекули, з якою він відповідні молекули вважаються ідентичними в зв'язаний в природі; або (ііі) не зустрічається в даному положенні. Процентна ідентичність двох природі. Термін «виділений» далі означає полінукпослідовностей визначається числом співпадаюлеотидну послідовність, яка: (і) ампліфікована in чих або ідентичних положень в двох послідовносvitro, наприклад, внаслідок виконання полімеразтях, діленим на число положень, що порівнюютьної реакції синтезу ланцюга (PCR); (іі) синтезована ся, x 100. Наприклад, якщо 6 з 10 положень в двох хімічним способом; (ііі) продукована методами послідовностях співпадають або є ідентичними, рекомбінантних ДНК шляхом клонування; або (iv) тоді дві послідовності характеризуються 60% гоочищена шляхом розщеплення і розділення в гелі. мологією. Як приклад можна порівняти послідовТермін «багатоосередкова рухова невропатія» ності ДНК CTGACT і CAGGTT, які є гомологічними або «MMN» означає хронічну імуноопосередкована 50% (співпадають 3 з 6 положень). Порівняння ну демієлінізуючу невропатію, яка характеризуєтьзвичайно виконують при вирівнюванні двох посліся поступовим розвитком асиметричної м'язової довностей для досягнення максимальної ідентичслабості і аміотрофії, локалізованої в ділянках ності. Таке вирівнювання можна зробити, наприанатомічного розподілу периферичних нервів клад методом Карліна і Альтскула, який більш [Pestronk et al. (1988) Aim. Neurol. 24:73 and детально описаний нижче. Застосовно до нуклеїKornberg et al. (1995) Ann. Neurol. (suppl. 1) S43]. нової кислоти терміни «процентна гомологія» і Електрофізіологічною ознакою багатоосередкової «процентна ідентичність» мають взаємозамінні рухової невропатії є постійне блокування провідзначення, а застосовно до поліпептиду термін ності нервів. У клінічному відношенні дане захво«процентна гомологія» означає міру схожості, при рювання описане як асиметричний чисторуховий якій амінокислоти, що являють собою консервативаріант CIDP з багатоосередковим блокуванням вні заміни інших амінокислот, вважаються ідентичпровідності рухових нервів. У процесі розвитку ними вказаним іншим амінокислотам. Термін «конбагатоосередкової рухової невропатії характер сервативна заміна» залишку в еталонній даного захворювання може поступово трансфорпослідовності являє собою заміну амінокислотою, муватися з виникненням по суті симетричної каряка фізично і функціонально подібна відповідному тини, яка в клінічному відношенні нагадує рухову еталонному залишку, наприклад, має аналогічний форму CIDP. Дослідження патології дозволили розмір, форму, електричний заряд, хімічні властиоб'єднати ці два захворювання [Krendel et al. вості, включаючи здатність утворювати ковалентні (1996) Ann. Neurol. 40:948 і Oh et al. (1995) або водневі зв'язки, або подібні характеристики. Neurology 45:1828]. Більшість хворих на багатоОсобливо переважними консервативними замінаосередкову рухову невропатію характеризуються ми є такі заміни, які задовольняють критерію, що високим титром антитіл проти гангліозиду GM1 визначається для «прийнятої точкової мутації» в [Pestronk et al., див. вище і Kornberg et al., див. [публікації Dayhoff et al., 5: Atlas of Protein вище]. Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, chapter 22:354Нуклеїнова кислота «функціонально пов'яза352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington], на» з іншою нуклеїновою кислотою, коли вона знаПроцентну гомологію або ідентичність двох аміноходиться в функціональному взаємозв'язку з покислотних послідовностей або двох послідовносслідовністю іншої нуклеїнової кислоти. Наприклад, тей нуклеїнових кислот можна визначити за допоДНК для передпослідовності або секреторної лімогою алгоритму вирівнювання Карліна і дерної послідовності (наприклад, сигнальної поАльтскула [Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 87:2264 слідовності або сигнального пептиду) функціона(1990)], модифікованого в публікації Карліна і Альльно пов'язана з ДНК, що кодує поліпептид, якщо тскула [Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90:5873 (1993)]. дана ДНК експресована у вигляді білкаВказаний алгоритм вводять в програми NBLAST попередника, що бере участь в секреції поліпепабо XBLAST, описані в [публікації Altschul et al., J. тиду; промотор або енхансер функціонально поMol. Biol. 215:403 (1990)]. Пошук методом BLAST в'язаний з кодуючою послідовністю, якщо він виконують за допомогою програми NBLAST, оцінка впливає на транскрипцію даної послідовності; і = 100, довжина слова = 12, для виявлення нуклеосайт зв'язування рибосоми функціонально пов'ятидних послідовностей, гомологічних нуклеїновій заний з кодуючою послідовністю, якщо його полокислоті згідно з даним винаходом. Пошук білка ження полегшує трансляцію. Термін «функціонаметодом BLAST виконують за допомогою програльно зв'язаний» звичайно означає, що зв'язані ми XBLAST, оцінка = 50, довжина слова = 3, для послідовності ДНК є суміжними і, наприклад, у виявлення амінокислотних послідовностей, гомовипадку секреторної лідерної послідовності, є сулогічних еталонному поліпептиду. Для порівняння міжними і знаходяться в рамці зчитування. Зв'язувирівняних послідовностей з розривами ланцюга вання може бути досягнуте в результаті лігування, використовують метод BLAST з пропусками відпонаприклад, на зручних сайтах рестрикції. Якщо відно до опису, приведеного в [публікації Altschul такі сайти відсутні, можна використати синтетичні et al., Nucleic Acids Res., 25:3389 (1997)]. При виолігонуклеотидні адаптери або лінкери відповідно користанні методів BLAST і BLAST з пропусками до відомої практики. застосовують параметри за умовчанням відповід 11 86749 12 маних шляхом гібридизації в умовах низької сувоних програм (XBLAST і NBLAST). Див. в Інтернеті http://www/ncbi.nhn.nih.gov. рості з геном IFN-b іншого виду. Якість життя можна виміряти по візуальній Варіанти білків IFN-b дикого типу включають аналоговій шкалі EuroQol і підсумовуванню балів білки, що мають амінокислотну послідовність, яка по анкеті EuroQoL; шкалі визначення стану здорощонайменше на 70%, 80%, 90%, 95%, 98% або в'я з 36 пунктів Medical Outcome Study (SF-36) і 99% ідентична або гомологічна IFN-b дикого типу, візуальній аналоговій шкалі (VAS) [EuroQoL Group наприклад, людський IFN-b, що має SEQ ID NO:2 (1990) Health Policy 16: 199 і Merkies et al. (2002) або 4. Варіанти можуть включати заміни, делеції Neurology 59: 84]. або додавання однієї або декількох амінокислот. Вважається, що препарат IFN-b володіє «теНаприклад, можна використати біологічно активні рапевтичною ефективністю» і кількість препарату фрагменти білків IFN-b дикого типу. У таких фрагIFN-Β є «терапевтично ефективною», якщо ввементах можуть бути видалені, додані або замінені дення такої кількості одного препарату IFN-b в 1, 2, 3, 5, 10 або до 20 амінокислот біля С- або Nкомбінованій терапії достатньо для досягнення кінця білка. Варіанти можуть також включають клінічно значущого ослаблення щонайменше одзаміни, делеції або додавання 1, 2, 3, 5, 10 або до ного симптому захворювання в порівнянні з відсу20 амінокислот. Деякі варіанти можуть включають тністю лікування препаратом IFN-b. У переважнозаміни, делеції або додавання менше 50, 40, 30, му варіанті здійснення винаходу введення 25, 20, 15, 10, 7 або 5 амінокислот. Для замін мотерапевтично ефективної кількості препарату IFNжуть бути використані природні амінокислоти або b суб'єкту, страждаючому CIDP, спричиняє ослабїх аналоги, наприклад, D-стереоізомерні амінокислення щонайменше одного симптому CIDP, наприлоти. клад, м'язових або нервових порушень. В об'єм даного винаходу входять варіанти IFNТермін «IFN-b дикого типу» означає нативний b, кодовані нуклеїновими кислотами, гібридизуюабо рекомбінантний IFN-b, що містить природну чими в суворих умовах з нуклеїновою кислотою, що кодує природний IFN-b, наприклад, виражений амінокислотну послідовність нативного IFN-b. НукSEQ ID NO:1 або 3, або її комплементом. Умови леотидна і амінокислотна послідовність нативного відповідної суворості, які стимулюють гібридизацію людського IFN-b приведені відповідно в SEQ ID ДНК, наприклад, 6,0-кратний об'єм хлориду наNO:1 і 2, які є послідовностями, представленими, трію/цитрату натрію (SSC) при температурі близьнаприклад в банку генів GenBank під номерами ко 45°С з подальшим промиванням 2,0-кратним доступу М28622 (і Е00029) і ААА36040, відповідно. об'ємом SSC при 50°С, відомі фахівцям в даній 2. Препарати IFN-b галузі або з ними можна ознайомитися в [публікаПрепарати IFN-b, які можна використати відціях: Current Protocols in Molecular Biology, John повідно до даного винаходу, включають IFN-b диWiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6; Sambrook et кого типу і його біологічно активні варіанти, наприal., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, клад, природні і штучні варіанти. Нуклеотидні і Cold Spring Harbor Press, N.Y.; S. Agrawal (ed.), амінокислотні послідовності природного людського Methods in Molecular Biology, volume 20 і Tijssen IFN-b дикого типу приведені відповідно в SEQ ID (1993), Laboratory Techniques in biochemistry and NO:1 і 2, які ідентичні послідовностям, представmolecular biology-hybridization with nucleic acid леним в банку генів GenBank під номерами достуprobes, e.g., part I chapter 2 «Overview of principles пу М28622 і ААА36040, відповідно. Вказані IFN-b of hybridization and the strategy of nucleic acid probe описані також в [публікації Seghal (1985) J. assays», Elsevier, New York]. Наприклад, концентInterferon Res. 5:521]. Непроцесований білок людрацію солі на стадії промивання можна вибрати в ський IFN-b складається з 187 амінокислот, і кодудіапазоні від умов низької суворості, відповідних юча послідовність SEQ ID NO:1 відповідає нуклеоприблизно 2,0-кратному об'єму SSC при 50°С, до тидам 76-639. Сигнальна послідовність відповідає умов високої суворості, відповідних приблизно 0,2амінокислотам 1-21. Амінокислотна послідовність кратному об'єму SSC при 50°С. Крім того, темпезрілої форми IFN-b відповідає амінокислотам 22ратуру на стадії промивання можна підвищити в 187 (нуклеотиди 139-639 SEQ ID NO:1). Зрілий інтервалі від умов низької суворості при кімнатній білок IFN-b людини і нуклеотидна послідовність, температурі, близько 22°С, до умов високої сувощо кодує вказаний білок, представлені відповідно рості при температурі близько 65°С. Можна змінюу вигляді SEQ ID NO:4 і 3. вати температуру і концентрацію солі, або темпеIFN-b, продукований в клітинах ссавця, є глікоратура або концентрація солі можуть мати постійні зильованим. Природний IFN-b дикого типу глікозизначення при одночасній зміні іншого параметра. льований по залишку 80 (Asn 80) зрілого поліпепТипові умови гібридизації включають гібридизацію тиду SEQ ID NO:4 або залишку 101 (Asn 101) в 6,0-кратному об'ємі хлориду натрію/цитрату нанезрілого поліпептиду SEQ ID NO:2. трію (SSC) при температурі близько 50°С з подаПрепарати IFN-b також включають IFN-b, відльшим промиванням в 0,2-кратному об'ємі SSC мінні від людського, наприклад, IFN-b хребетних, при кімнатній температурі. Температуру на стадії таких як ссавці, наприклад, приматів крім людини, промивання можна підвищити приблизно до 45°С, великої рогатої худоби, овець, свиней, коней, кі50°С, 55°С, 60°С або 65°С з метою посилення сушок, собак, щурів і мишей, а також птахів або амворості гібридизації. Гібридизацію можна також фібій. З послідовностями IFN-b вказаних видів виконувати в 5-кратному об'ємі SSC, 4-кратному можна ознайомитися в банку генів і/або в публікаоб'ємі SSC, 3-кратному об'ємі SSC, 2-кратному ціях або визначити по нуклеїнових кислотах, отриоб'ємі SSC, 1-кратному об'ємі SSC або 0,2кратному об'ємі SSC. Гібридизацію можна викону 13 86749 14 вати протягом щонайменше 1 години, 2 годин, 5 во може являти собою консервативну заміну. Нагодин, 12 годин або 24 годин. У процесі гібридизаприклад, можна виробляти заміни, які по суті не ції може бути також використаний інший агент, що впливають на тривимірну структуру IFN-b. Трививпливає на суворість гібридизації, наприклад фомірна структура неглікозильованого людського рмамід. Наприклад, сувора гібридизація може бути IFN-b описана, наприклад, в [публікації виконана в присутності 50% формаміду, який підRadhakrishnan et al. (1996) Structure 4: 1453], і тривищує суворість гібридизації при вказаній темпевимірна структура глікозильованого IFN-b описана, ратурі. Стадія промивання може бути виконана в наприклад, в [публікації Karpusas et al. (1997) присутності детергента, наприклад SDS, в такій PNAS 94:11813]. Зокрема IFN-b містить п'ять спікількості, як 0,1% або 0,2% SDS. Після гібридизації ралей: спіраль А, що включає амінокислоти 2-22 може бути виконане промивання, що включає одну SEQ ID NO:4; спіраль В, що включає амінокислоти стадію або щонайменше дві стадії, які можуть про51-71 SEQ ID NO:4; спіраль С, що включає аміноводитися при однаковій або різній солоності і темкислоти 80-107 SEQ ID NO:4; спіраль D, що вклюпературі. Наприклад, після гібридизації можуть чає амінокислоти 118-136 SEQ ID NO:4, і спіраль бути виконані два промивання при 65°С кожне Е, що включає амінокислоти 139-162 SEQ ID NO:4 протягом приблизно 20 хвилин в 2-кратному об'ємі [Karpusas et al., див. вище]. Спіралі А, В, С і Ε SSC, 0,1% SDS, з подальшим виконанням двох утворюють лівосторонній чотириспіральний тяж промивань при 65°С кожна протягом приблизно 20 типу 2. В IFN-b є довга верхня петля АВ, що з'єдхвилин в 0,2-кратному об'ємі SSC, 0,1% SDS. Тинує спіралі А і В, і три більш короткі петлі (що імепові суворі умови гібридизації включають гібридинуються, ВС, CD і DE), що з'єднують інші спіралі зацію протягом ночі при 65°С в розчині, що містить [(Karpusa et al., див. вище]. Раніше виконані дослі50% формаміду, 10-кратний об'єм розчину Денхадження показали, що N-кінцеві, С-кінцеві і глікозирдта (0,2% фіколу, 0,2% полівінілпіролідону, 0,2% льовані ділянки спіралі С молекули IFN-b не знаальбуміну бичачої сироватки) і 200мкг/мл денатуходяться в сайті зв'язування рецептора (див. рованої несучої ДНК, наприклад, фрагментованої заявки W0 00/23472 і USSN 09/832659). Тому муДНК сперми лосося, з подальшим виконанням тації у вказаних ділянках не впливають істотно двох промивань при 65°С кожне протягом приблишкідливого чином на біологічну активність молекузно 20 хвилин в 2-кратному об'ємі SSC, 0,1% SDS, ли IFN. Крім того, раніше було встановлено, що і двох промивань при 65°С протягом приблизно 20 мутації в спіралі С (амінокислоти 81, 82, 85, 86 і 89 хвилин в 0,2-кратному об'ємі SSC, 0,1% SDS. Гібзрілого людського IFN-b) спричиняють утворення ридизація може включати гібридизацію двох нукмолекули, яка володіє більш високою антивіруслеїнових кислот в розчині або нуклеїнової кислотиною активністю в порівнянні з IFN-b дикого типу в розчині з нуклеїновою кислотою, прикріпленою (див. заявки WO 00/23472 і USSN 09/832659). Анадо твердої підкладки, такої як фільтр. У деяких логічним чином було встановлено, що мутанти в випадках, наприклад, коли одна нуклеїнова кислоспіралі А (амінокислоти 2, 4, 5, 8 і 11 зрілого людта знаходиться на твердій підкладці, гібридизації ського IFN-b) і петлі CD (амінокислоти 110, 11, 113, може передувати стадія попередньої гібридизації, 116 і 119) володіють більше високою активністю яку виконують протягом щонайменше 1 години, 3 зв'язування з рецептором і більш високою антивігодин або 10 годин в такому ж розчині і при такій русною і антипроліферативною активністю в поріже температурі, що і в розчині для гібридизації внянні з природним людським IFN-b дикого типу (без зонда). У переважному варіанті здійснення (див. заявки WO 00/23472 і USSN 09/832659). винаходу нуклеїнову кислоту, що кодує варіант Інші переважні модифікації або заміни усуваIFN-b, гібридизують з послідовністю SEQ ID NO: 1 ють сайти для міжмолекулярного перехресного або 3 або її комплементом в умовах помірної сузшиття і неправильного утворення дисульфідних ворості, наприклад, що включають промивання в зв'язків. Наприклад, відомо, що IFN-b має три за2,0-кратному об'ємі SSC при температурі близько лишки cys в положеннях 17, 31 і 141 SEQ ID NO:4 40°С. В особливо переважному варіанті здійснендикого типу. Одним варіантом IFN є IFN, в якому ня винаходу нуклеїнову кислоту, що кодує варіант залишок cys (С) в положенні 17 замінений залишIFN-b, гібридизують з послідовністю SEQ ID NO:1 ком ser (S), як це описано, наприклад, в патенті або 3 або її комплементом в умовах високої сувоСША №4588585. Іншими варіантами IFN-b є варіарості, наприклад, що включають промивання в 0,2нти IFN-b, в яких один або декілька залишків cys кратному об'ємі SSC при температурі близько (С) в положенні 17 замінені залишками ser (S) і 65°С. залишок val (V) в положенні 101 замінений залишТиповими модифікаціями є консервативні моком phe (F), trp (W), tyr (Y) або his (H), переважно дифікації, які впливають мінімальний чином на phe (F), при нумерації у відповідності до IFN-b дивторинну і третинну структуру білка. Типові консекого типу, що має, наприклад, SEQ ID NO:4, анарвативні заміни включають заміни, описані в [публогічно описаному, наприклад, в патенті США лікаціях Dayhoff in the Atlas of Protein Sequence and №6127332. Інші переважні варіанти включають Structure 5 (1978) і Argos in EMBO J., 8, 779-785 поліпептиди, які містять послідовність IFN-b дикого (1989)]. Наприклад, амінокислоти, що відносяться типу, наприклад, SEQ ID NO:4, в якій залишок val до однієї з нижченаведених груп, являють собою (V) в положенні 101 при нумерації у відповідності консервативні заміни: ala, pro, gly, gin, asn, ser, thr; до IFN-b дикого типу замінений залишком phe (F), cys, ser, tyr, thr; val, ile, leu, met, ala, phe; lys, arg, tyr (Y), trp (W), his (H) або phe (F), як це описано в his; і phe, tyr, tip, his. патенті США №6127332. Інші модифікації включають заміну однієї амінокислоти іншою амінокислотою, яка необов'язко 15 86749 16 тину для зв'язування двох суміжних частин посліІнші варіанти IFN-b являють собою молекули довностей за допомогою зворотного пептидного зрілого IFN-b, в яких відсутній ініціюючий метіонін, (зворотного амідного) зв'язку. У вищезгаданому наприклад, метіонін 1 SEQ ID NO:4. У типових вавипадку (а) центральний залишок дикетосполуки ріантах IFN-b відсутній ініціюючий метіонін і заміможна успішно використати для зв'язування струкнена щонайменше одна амінокислота, наприклад, тур двома амідними зв'язками з отриманням псевв положенні 17 зрілої форми, як це описано в падопептидної структури. У вищезгаданому випадку тенті США №4588585. (b) центральний залишок діаміносполуки можна Молекули IFN-b можна також модифікувати аналогічним чином використати для зв'язування шляхом заміни однієї або декількох амінокислот структур двома амідними зв'язками з утворенням однією або декількома похідними амінокислот, псевдопептидної структури. Зворотний напрям природними або існуючими штучними амінокислозв'язування в таких поліпептидах звичайно виматами, в яких природний бічний ланцюг або кінцева гає додаткової інверсії енантіомерної конфігурації група модифікована внаслідок виконання хімічної зворотних амінокислотних залишків для зберереакції. Такі модифікації включать, наприклад, ження просторової орієнтації бічних ланцюгів, яка гамма-карбоксилювання, бета-карбоксилювання, аналогічна орієнтації нормального пептиду. Конфіпегилювання, сульфатування, сульфурування, гурація амінокислот в зворотній частині пептидів фосфорилювання, амідування, етерифікацію, Nпереважно є D-конфігурацією, і конфігурація норацетилювання, карбобензилування, тозилування і мальної частини переважно є L-конфігурацією. інші модифікації, відомі в даній галузі. Протилежні або змішані конфігурації є прийнятниІнші модифікації включають використання аміми для оптимізації активності зв'язування в тих нокислотних аналогів або похідних амінокислот, в випадках, коли це можливо. Модифікації поліпепяких бічний ланцюг подовжений або укорочений з тидів далі описані, наприклад, в патенті США утворенням карбоксильної, аміногрупи або іншої №6399075. реакційноздатної функціональної групиПрепарати IFN-b включають також білки IFN-b попередника для циклізації, а також амінокислоті їх варіанти (наприклад зрілий білок), злиті з одних аналогів, що мають різні бічні ланцюги з відпоним або декількома гетерологічними поліпептидавідними функціональними групами. Наприклад, ми. Гетерологічний поліпептид може бути додасполука згідно з даним винаходом може включати ний, наприклад, для збільшення напівперіоду амінокислотний аналог, такий як, наприклад, ціаіснування білка IFN-b або посилення його продукуноаланін, канаванін, д'єнколова кислота, норлейвання. Типові гетерологічні поліпептиди включацин, 3-фосфосерин, гомосерин, дигідроксифенілають молекули імуноглобуліну (Ig) або їх частини, ланін, 5-гідрокситриптофан, 1-метилгістидин, 3наприклад, константний домен легкого або важкометилгістидин, діамінопімелінова кислота, орнітин го ланцюга молекули Ig. В одному варіанті здійсабо діаміномасляна кислота. Фахівцям в даній нення винаходу білок IFN-b або його варіант злигалузі повинні бути відомі інші природні амінокисвають або яким-небудь іншим чином зв'язують з лотні метаболіти або попередники, що мають привсією або частиною шарнірної і константної діляйнятні бічні ланцюги, які входять в об'єм даного нок легкого ланцюга, важким ланцюгом або обома винаходу. ланцюгами імуноглобуліну. Таким чином, даний Інші варіанти IFN-b включають зворотні або винахід відноситься до молекули, яка включає: (1) ретро пептидні послідовності. «Зворотна» або білкову частину IFN-b (тобто IFN-b або його варі«ретро» пептидна послідовність означає частину ант), (2) другий пептид, наприклад, пептид, що загальної послідовності ковалентно пов'язаних збільшує розчинність або час існування in vivo часамінокислотних залишків (їх аналогів або псевдотини IFN-b, зокрема, член надсімейства імуноглозалишків), в якій нормальне утворення пептидного зв'язку в напрямі від карбоксикінця до амінокінця в булінів, його фрагмент або частину, наприклад, амінокислотному кістяку було змінене таким чичастину або фрагмент IgG, а саме константну діном, що при зчитуванні в звичайному напрямі злілянку важкого ланцюга IgG1 людини, наприклад, ва направо амінокінцева частина пептидного зв'язСН2-, СН3- і шарнірні ділянки. Зокрема, термін ку передує (а не знаходиться позаду) «злитий білок IFN-p/Ig» означає білок, що містить карбоксикінцевої частини. [Див. публікацію біологічно активну частину IFN-b, пов'язану з NGoodman, Μ. and Chorev, M. Accounts of Chem. кінцем ланцюга імуноглобуліну. Підвидом злитого Res. 1979, 12, 423]. Пептиди із зворотною орієнтабілка IFN-b/Ig є «злитий білок IFN-b/Fc», який є цією, розглянуті в даному описі винаходу, включабілком, що містить частину IFN-b, пов'язану щоють (а) пептиди, в яких один або декілька амінокінайменше з частиною константного домену імунонцевих залишків розташовані в зворотній («rev») глобуліну. Переважний Fc-злитий білок містить орієнтації (утворюючи таким чином другий «карбочастину IFN-b, пов'язану з фрагментом антитіла, ксикінець» в лівій частині молекули), і (b) пептиди, що включає С-кінцевий домен важких ланцюгів в яких один або декілька карбоксикінцевих залишімуноглобуліну. ків розташовані в зворотній («rev») орієнтації Злитий білок може містити поліпептид IFN-b (утворюючи другий «амінокінець» в правій частині або його варіант, з N- і С-кінцями якого зв'язані молекули). Пептидний (амідний) зв'язок не може гетерологічні поліпептиди. Гетерологічний поліпебути утворений на поверхні розділу між залишком птид може також знаходитися всередині поліпепз нормальною орієнтацією і залишком із звороттиду IFN-b або його варіанту. ною орієнтацією. Тому деякі зворотні поліпептиди В одному варіанті здійснення винаходу злитий згідно з даним винаходом можна отримати, викобілок має загальну формулу X-Y-Z, де X означає ристовуючи відповідну амінокислотну псевдочас 17 86749 18 гідрохлорид 1-етил-3-(3поліпептид, що має амінокислотну послідовність диметиламінопропіл)карбодііміду (EDC), 4IFN-b, його частини або варіанту; Υ означає несукцинімідилоксикарбоніл-альфа-метил-альфа-(2обов'язкову лінкерну частину і Ζ означає поліпеппіридилтіо)толуол (SMPT; Pierce Chem. Co., № за тид, що містить щонайменше частину поліпептиду, каталогом 21558G). що не є бета-інтерфероном частини X. В інших Переважний злитий білок IFNb/Ig має SEQ ID варіантах здійснення винаходу злитий білок має NO:12, яка містить непроцесовану зрілу форму формулу Ζ-Υ-Χ, де поліпептид, що не є IFN-b, злилюдського IFN-b, тобто SEQ ID NO:4, злиту з Fcтий з N-кінцевою частиною лінкера, злитою з Nділянкою людського IgG1 (ZL5107) (див. заявки W0 кінцевою частиною поліпептиду IFN-b, його части00/23472 і USSN 09/832659) (див. Фіг.1). Відповідни або варіанту. Частина Ζ може бути частиною на нуклеотидна послідовність приведена в SEQ ID поліпептиду, що містить імуноглобуліноподібні NO:11. ДНК, що кодує людський IFN-b, закінчуєтьдомени. Приклади таких поліпептидів включають ся біля триплету нуклеотидів 568-570 (ААС, що GDI, CD2, CD4 і основні антигени гістосумісності, кодує аргінін), і ДНК, що кодує константну ділянку що відносяться до класу І і класу II. Див. патент людського IgG1, починається біля триплету (GAC, США №5565335 (Capon et al) для ознайомлення з що кодує аспарагінову кислоту), що починається з прикладами таких поліпептидів. нуклеотиду 574 SEQ ID NO:11. Частина Ζ може включати, наприклад, декілька залишків гістидину або, переважно, Fc-ділянку Інший переважний злитий білок IFN-b/Ig приімуноглобуліну; термін «Fc» в даному описі винаведений в SEQ ID NO:14 і кодований SEQ ID ходу означає фрагмент антитіла, що містить СNO:13 (див. заявки W0 00/23472 і USSN кінцевий домен важкого ланцюга імуноглобуліну. 09/832659) (див. Фiг.2). Вказаний злитий білок Частина Υ може бути будь-яким лінкером, що включає людський IFN-b, злитий з лінкером G4S, дозволяє частині IFN-b зберігати свою біологічну який в свою чергу пов'язаний з Fc-ділянкою людактивність. Частина Υ може складатися з однієї ського IgG1 (ZL6206). Лінкер G4S (кодований нукамінокислоти або щонайменше з двох амінокислеотидами 571-585 SEQ ID NO:7) включає амінолот. Υ може також включати від близько 2 до бликислотну послідовність GGGGS (SEQ ID NO:9). зько 5 амінокислот; від близько 3 до близько 10 Способи продукування вказаних білків описані в амінокислот або 10 або більше амінокислот. У заявках WO 00/23472 і USSN 09/832659. переважному варіанті здійснення винаходу Υ У переважному варіанті здійснення винаходу включає послідовність GlyGlyGlyGlySer (SEQ ID поліпептид IFN-b злитий біля С-кінця щонайменше NO:6), кодовану, наприклад, нуклеотидною посліз частиною Fc-ділянки імуноглобуліну. IFN-b утводовністю GGCGGTGGTGGCAGC (SEQ ID NO:5). Υ рює амінокінцеву частину, і Fc-ділянка утворює може також включати сайт впізнавання ентерокікарбоксикінцеву частину. У вказаних злитих білках нази, наприклад, AspAspAspAspLys (SEQ ID NO:8), Fc-ділянка переважно обмежена шарнірною ділянкодований, наприклад, послідовністю кою константного домену і СН2- і СН3-доменами. GACGATGATGACAAG (SEQ ID NO:7). В іншому Fc-ділянка у вказаних злитих білках може бути варіанті здійснення винаходу Υ включає послідовтакож обмежена частиною шарнірної ділянки, зданість SerSerGlyAspAspAspAspLys (SEQ ID NO:10), тною утворювати міжмолекулярні дисульфідні кодовану, наприклад, послідовністю зв'язки, і СН2- і СН3-доменами або їх функціонаAGCTCCGGAGACGATGATGACAAG (SEQ ID льними еквівалентами. Вказані константні ділянки NO:9). можуть бути отримані у будь-якого ссавця (переКрім того, частина IFN-b (X) і друга частина Z, важно людини) і виділені з будь-якого відповідного що не є IFN-b (наприклад, Fc-ділянка імуноглобукласу і/або ізотипу, включаючи IgA, IgD, IgM, IgE i ліну), можуть бути також зв'язані внаслідок здійсIgG1, IgG2, IgG3 і IgG4. нення будь-якої хімічної реакції, яка дозволяє зв'яМолекули рекомбінантних нуклеїнових кислот, зати дві молекули разом при збереженні які кодують Ig-злиті білки, можуть бути отримані частинами X і Ζ відповідної активності. Вказане будь-яким методом, відомим в даній галузі хімічне зв'язування може включати багато які хімі[Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning; A чні механізми, такі як ковалентне зв'язування, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, афінне зв'язування, інтеркаляція, координаційне Cold Spring Harbor, N.Y.], або виділені з доступних зв'язування і комплексоутворення. Типові зв'язуючі клонів. Методи отримання генів, що кодують консагенти (тобто лінкери (Υ) в загальній формулі), що тантні ділянки важкого або легкого ланцюга імуновикористовуються для ковалентного зв'язування глобулінів, розглянуті, наприклад, в заявці РСТ, частини IFN-b з частиною Ζ, можуть включати орRobinson, R. et al., публікація WO 87/02671. Послідовність кДНК, що кодує молекулу інтерферону ганічні сполуки, такі як складні тіоефіри, карбодііабо її фрагмент, може бути безпосередньо зв'язаміди, сукцинімідоефіри, діізоціанати, такі як толіна з кДНК, що кодує константні ділянки важкого лен-2, 6-діізоціанат, глутеральдегіди, діазобензоли ланцюга Ig, або за допомогою лінкерної послідові гексаметилендіаміни, такі як біс-(пності. В інших варіантах здійснення винаходу може діазонійбензоїл)етилендіамін, біфункціональні бути створена рекомбінантна векторна система похідні імідоефірів, такі як диметиладипімідат, і для введення послідовностей, що кодують бетабіс-активні сполуки фтору, такі як 1,5-дифтор-2,4інтерферон, в правильну рамку зчитування з синдинітробензол. У вищезгаданий перелік входять тетичною шарнірною ділянкою. Крім того, може різні класи хімічних зв'язуючих агентів, відомих в бути бажано, щоб рекомбінантна векторна систеданій галузі. Багато які вказані агенти можна прима включала у вигляді складової частини нуклеїдбати комерційним шляхом, зокрема, Nнові кислоти, відповідні 3'-фланкуючій ділянці гена сукцинімідил-З-(2-піридилдитіо)пропіонат (SPDP), 19 86749 20 імуноглобуліну, що містить сайти розщепленацетильні групи і тому подібні, або шляхом ствоня/поліаденілювання РНК і нижні послідовності. рення мутантів амінокислотної послідовності. Далі може бути бажано створити сигнальну посліІнші похідні бета-інтерферону/Ig включають довність вгорі від послідовностей, що кодують ковалентні або агреговані кон'югати бетазлитий білок імуноглобуліну, для полегшення секінтерферону або його фрагментів з іншими білкареції злитої молекули з клітини, трансформованої ми або поліпептидами, наприклад, отримані внарекомбінантним вектором. слідок синтезу в рекомбінантній культурі у вигляді Даний винахід відноситься до димерних злидодаткових N- або С-кінців. Наприклад, кон'юговатих молекул, а також до мономерних або багатоний пептид може бути сигнальною (або лідерною) мерних молекул, що містять злиті білки. Такі багаполіпептидною послідовністю в N-кінцевій ділянці томери можна отримати, використовуючи Fcбілка, яка одночасно з трансляцією або після ділянки або їх частини молекул Ig, які звичайно є трансляції направляє перенесення білка з сайту багатовалентними, такі як пентамери IgM або дисинтезу на функціональний сайт всередині або мери IgA. Очевидно, що для утворення і стабілізазовні клітинної мембрани або стінки (наприклад, ції пентамерів IgM і димерів IgA може бути потрілідерна послідовність альфа-фактора дріжджів). бен з'єднувальний поліпептид J. Альтернативно, Наприклад, сигнальний пептид може бути послібагатомери злитих білків IFN-b можуть бути утводовністю IFN-b, що включає, зокрема, амінокислорені з використанням білка, що володіє споріднети 1-21 SEQ ID NO:2, відповідні нуклеотидам 76ністю до Fc-ділянки молекул Ig, такого як білок А. 138 SEQ ID NO:1. Сигнальний пептид може також Наприклад, декілька злитих білків IFNмати послідовність VCAM, тобто включати аміноβ/імуноглобулін можна зв'язати з агарозними гракислоти 1-24 SEQ ID NO:12, яка кодована нуклеонулами, що містять білок А. тидами 1-72 SEQ ID NO:11. Вказані багатовалентні форми є вельми кориГетерологічний поліпептид (наприклад пептид) сними, оскільки вони мають декілька сайтів зв'язуабо іншу молекулу можна також використати як вання з рецепторами бета-інтерферону. Напримітку або для полегшення очищення препарату клад, двовалентний розчинний IFN-b може містити IFN-b. Такі пептиди добре відомі в даній галузі. два послідовних повтори амінокислот 1-166 SEQ Наприклад, полінуклеотид згідно з даним винахоID NO:4 (або повтори, кодовані нуклеїновими кисдом може бути злитий в рамці зчитування з марлотами 1-498 SEQ ID NO:3) (частина X в загальній керною послідовністю, що визначається також як формулі), розділених лінкерною ділянкою (частина «Tag-послідовність», що кодує «Tag-пептид», яка Y), причому вказані повтори зв'язані щонайменше дозволяє мітити і/або очищати поліпептид згідно з з однією частиною константного домену імуноглоданим винаходом. У переважному варіанті здійсбуліну (частина Z). Можна також створити альтернення винаходу маркерна послідовність являє нативні багатовалентні форми, наприклад, внаслісобою гексагістидинову мітку, наприклад, так, яка переноситься вектором PQE-9. Багато які інші Tagдок хімічного зв'язування злитих білків IFN-b/Ig з пептиди можна придбати комерційним шляхом. будь-якою клінічно прийнятною несучою молекуІнші, часто використовувані Tag-мітки включають лою, полімером, вибраним з групи, що складаєтьmyc-епітопи [див., наприклад, Ellison et al. (1991), ся з фіколу, поліетиленгліколю або декстрану, за J. Biol. Chem. 266:21150-21157], які містять послідопомогою звичайних методів зв'язування. Альтедовність із 10 залишків, виділену із с-mус, систему рнативно, IFN-b може бути хімічно зв'язаний з біоpFLAG (International Biotechnologies, Inc.), систему тином, і отриманий кон'югат біотину і Fc-ділянки pEZZ-білок A (Pharmacia, NJ) і частину білка гемабета-інтерферону потім зв'язують з авідином, внаглютиніну Haemophilias influenza, що складається з слідок чого утворюються тривалентні молекули 16 амінокислот. Крім того, як Tag-мітку можна виавідину/біотину/бета-інтерферону. Злиті білки IFNкористати будь-який поліпептид, якщо можна b/Ig можуть бути також ковалентно зв'язані з диніотримати або ідентифікувати реагент, наприклад, трофенолом (DNP) або тринітрофенолом (TNP), антитіло, специфічно взаємодіюче з Tagпісля чого отриманий кон'югат осаджують за дополіпептидом. помогою антитіла проти DNP або антитіла проти В одному варіанті здійснення винаходу білок TNP-IgM з утворенням декамерних кон'югатів з IFN-b або його варіант злитий біля N- або С-кінця з валентністю 10 для сайтів зв'язування рецепторів одним з нижченаведених пептидів: бета-інтерферону. HisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO:6), який може бути Похідні білків згідно з даним винаходом вклюкодований нуклеотидною послідовністю САТСАТчають також різні структурні форми первинного САТСАТСАТСАТ (SEQ ID NO:15); білка, що зберігають біологічну активність. ЗавдяSerGlyGlyHisHisHisHisHisHis (SEQ ID NO:18), який ки наявності аміно- і карбоксильних груп, що іоніможе бути кодований нуклеотидною послідовністю зуються, білки IFN-b і їх варіанти можуть знаходиTCCGGGGGCCATCATCATCATCATCAT (SEQ ID тися в формі кислих або основних солей або в NO:15) і нейтральній формі. Окремі амінокислотні залишки SerGlyGlyHisHisHisHisHisHisSerSerGlyAspAspA можуть бути також модифіковані окисленням або (SEQ ID NO:20), який може бути кодований нуклевідновленням. Крім того, первинна амінокислотна отидною послідовністю структура (включаючи N- і/або С-кінці) або глікан TCCGGGGGCCATCATCATCATCATCATAGCTCCG IFN-b може бути модифікована (з отриманням поGAGACGATGATGACAAG (SEQIDNO:19). хідних сполук) шляхом утворення ковалентних або Амінокислотна послідовність бетаагрегованих кон'югатів з іншими хімічними частиінтерферону може бути також пов'язана з пептинами, такими як глікозильні групи, поліалкіленглідом AspTyrLysAspAspAspAspLys (DYKDDDDK) колі, зокрема, поліетиленгліколь, ліпіди, фосфати, 21 86749 22 Незважаючи на те, що полімер можна приєд(SEQ ID NO:21) [Норр et al., Bio/Technology 6:1204, 1988]. Вказана послідовність є високоантигенною і нати в будь-якому місці ланцюга молекули IFN-b містить епітоп, що зворотно зв'язується специфічабо його варіанту або іншої амінокислоти, приєдним моноклональним антитілом, дозволяючи пронаної за допомогою прямого або посереднього водити експрес-аналіз і просте очищення експрезв'язку до молекули IFN-b, найбільш переважним сованого рекомбінантного білка. Крім того, вказана сайтом для зв'язування полімеру є N-кінець молепослідовність специфічно розщеплюється ентерокули IFN-b. Вторинні сайти розташовані біля Скіназою слизової оболонки великої рогатої худоби кінця або поруч з ним і на всіх сайтах ланцюга цуу залишку, що йде відразу ж за парою залишків крових частин. Таким чином, найбільш переважні Asp-Lys. варіанти здійснення даного винаходу включають: В іншому варіанті здійснення винаходу препа(і) кон'югати IFN-b або його варіанту з полімером, рат IFN-b містить білок IFN-b або його варіант, приєднаним біля N-кінця; (іі) кон'югати IFN-b або злитий з білком альбуміну, його варіантом або його варіанту з полімером, приєднаним біля Счастиною. Такий злитий білок можна отримати кінця; (ііі) кон'югати з полімером, зв'язані цукровиспособом, описаним, наприклад, в заявці WO ми частинами; (iv) кон'югати білків IFN-b або їх 01/77137. варіантів з полімером, приєднаним біля N-, С-кінця Препарат IFN-b може також містити молекулу, і за допомогою цукрових частин. яка не є поліпептидом. Наприклад, білок IFN-b або Звичайно використовують від близько 1,0 до його варіант може бути ковалентно або нековалеблизько 10 моль активованого полімеру на моль нтно зв'язаний з полімером, наприклад, з полімебілка в залежності від концентрації білка. Кінцева ром, що біологічно руйнується. Наприклад, білок кількість повинна являти собою баланс між максиIFN-b або його варіант може бути модифікований мальним збільшенням ефективності реакції і мініполіетиленгліколем, наприклад, зв'язаний з полімальним утворенням неспецифічних модифікацій етиленгліколем (ПЕГ) способом, описаним в заявці продукту, а також між створенням хімічної структуWO 00/23114. ри, що зберігає оптимальну активність, і оптимізаВідповідно до широкого об'єму даного винахоцією, якщо це можливо, напівперіоду існування ду для кон'югації з IFN-b може бути використана білка. Бажано зберегти щонайменше близько 50% одна молекула полімеру, хоча відомо, що до IFN-b біологічної активності білка і найбільш переважно 100%. може бути також приєднано декілька полімерних Вказані реакції можна виконувати будь-яким молекул. Очевидно, що для кон'югації полімеру прийнятним методом, що використовується для можна використати будь-які групи, частини або здійснення взаємодії біологічно активних речовин інші кон'юговані різновиди, відповідні кінцевому з інертними полімерами, переважно при рН близьзастосуванню. Як приклад можна зазначити, що ко 5-7, якщо реакційноздатні групи знаходяться в полімер можна використати в деяких застосуванположенні альфа-аміногрупи біля N-кінця. Вказанях для ковалентного зв'язування з функціональний процес звичайно включає отримання активоною частиною, що повідомляє полімеру стійкість ваного полімеру (який може мати щонайменше до деструкції під дією УФ-випромінювання, антиокодну кінцеву гідроксильну групу) і подальша взаєсидантні або інші властивості. Як інший приклад модія білка з активованим полімером з утворенможна зазначити, що в деяких застосуваннях баням розчинного білка, прийнятного для отримання жано активувати полімер, щоб зробити його реаклікарського засобу. Вищезгадана модифікація реаційноздатним або перехресно зшиваним з метою кції може бути виконана декількома методами, що посилення різних властивостей або характеристик включають одну або декілька стадій. кон'югованої речовини. Тому полімер може містити Як указано вище, в найбільш переважних вабудь-які функціональні групи, групи, що повторюріантах здійснення винаходу використовується Nються, зв'язки або інші структури, які не погіршукінець IFN-b як зв'язуюча ланка для полімеру. Ісють ефективність кон'югованої композиції IFN-b нують прийнятні методи для вибірного отримання для передбачуваного застосування. IFN-b з модифікованим N-кінцем. Одним методом IFN-b переважно кон'югують за допомогою кінє відновне алкілування, при виконанні якого викоцевої реакційноздатної групи в полімері, хоча ристовують різну реакційну здатність первинних кон'югацію можна також здійснювати у вигляді бічаміногруп різних типів (епсилон-аміногрупи лізину ного ланцюга за допомогою некінцевих реакційнов порівнянні з аміногрупами N-кінцевого метіоніну), здатних груп. Полімер, що має одну або декілька що використовуються для отримання похідних реакційноздатних груп, визначається в даному описі винаходу як «активований полімер». Реаксполук IFN-b. У відповідних вибірних умовах може ційноздатна група вибірно взаємодіє з вільними бути отримана похідна сполука IFN-b, до N-кінця аміногрупами або іншими реакційноздатними груякої приєднують полімер, що містить карбонільну пами в білку. Активований полімер піддають взаєгрупу. Вказану реакцію виконують при значенні рН, модії так, щоб його можна було приєднати по що дозволяє використати перевагу відмінностей будь-якій існуючій аміногрупі IFN-b, такій як альфаміж показниками рКа епсилон-аміногруп залишків аміногрупи або епсилон-аміногрупи лізинів. Вільні лізину і альфа-аміногрупи N-кінцевого залишку карбоксильні групи, належно активовані карбоніIFN-b. Хімічна реакція такого типу добре відома льні групи, гідроксильні, гуанідильні, окислені вугфахівцям в даній галузі. леводневі частини і меркаптогрупи IFN-b (при їх Наприклад, можна використати схему реакцій, наявності) можна також використати як сайти прив якій подібна вибірковість зберігається внаслідок єднання. виконання реакцій при низькому значенні рН (зви 23 86749 24 що даний тип хімічної структури придатний для чайно 5-6) в умовах, при яких ПЕГ-альдегідний модифікації поліалкіленгліколями, якщо в цукор полімер піддають взаємодії з IFN-b в присутності введений лінкер і поліалкіленгліколь приєднаний ціаноборогідриду натрію. Після очищення ΠΕΓдо вказаного лінкера. Хоч амінотіолові або гідраΙFΝ-b і аналізу методом SDS-PAGE, масзинвмісні лінкери придатні для додання однієї поспектрометрії MALDI і секвенування/картування лімерної групи, структура лінкера може бути зміпептиду отримують IFN-b, до N-кінця якого напранена з можливістю приєднання декількох влено приєднана частина ПЕГ. полімерів і/або зміни просторової орієнтації поліКристалічна структура IFN-b показує, що Ν- і меру відносно IFN-b. С-кінці розташовані близько один до одного [див. Типовими полімерами є водорозчинні полімеKarpusas et al., 1997, Proc. Natl. Acad Sci. ри, такі як поліалкіленгліколь. Необмежувальний 94:11813-11818]. Таким чином, модифікації С-кінця список таких полімерів включає інші гомополімери IFN-b повинні також впливати мінімальним чином поліалкіленоксиду, такі як поліпропіленгліколі, пона активність. Хоча не існує простого хімічного ліоксіетиленовані поліоли, їх співполімери і блоксметоду направленої доставки поліалкіленгліколю, півполімери. Інші приклади головного ланцюга такого як ПЕГ, до С-кінця, подібний результат моприйнятних водорозчинних і непептидних полімеже бути досягнутий внаслідок генетичного створів включають поліоксіетильований поліол, поліорення сайту, який можна використати для направлефіновий спирт, полівінілпіролідон, полігідроксиленого приєднання полімерної частини. пропілметакриламід, полі-a-гідроксикислоту, Наприклад, введення залишку Cys в положення, полівініловий спирт, поліфосфазен, поліоксазолін, розташоване біля С-кінця або поруч з ним, дозвополі-N-акрилоїлморфолін і їх співполімери, потрійляє отримати специфічну модифікацію з викорисні співполімери і суміші. В одному варіанті здійстанням іміду малеїнової кислоти, вінілсульфону нення винаходу полімерним кістяком є поліетиленабо поліалкіленгліколю (наприклад, ПЕГ), активогліколь або монометоксиполіетиленгліколь (мПЕГ) ваного гелогенацетатом. Вказані похідні можна із середньою молекулярною масою від близько специфічно використати для модифікації створе200Да до близько 400000Да. Повинно бути зрозуних цистеїнів завдяки високій селективності даних міло, що інші споріднені полімери також придатні реагентів відносно залишків Cys. Інші методи, такі для здійснення даного винаходу, і ПЕГ або поліяк введення гістидинової мітки, що володіє напраетиленгліколь входить в перелік таких полімерів. вленою дією [Fancy et al., (1996) Chem & Biol. 3: Термін ПЕГ означає поліетиленгліколь в будь-яких 551], або створення додаткового сайту глікозилюформах, включаючи алкокси-ПЕГ, біфункціональвання, являють собою інші альтернативи для моний ПЕГ, ПЕГ з множинним розгалуженням, ПЕГ з дифікації С-кінця IFN-b. роздвоєним ланцюгом, ПЕГ з розгалуженим ланГлікан в IFN-b також займає положення, яке цюгом, ПЕГ з бічними замісниками або ПЕГ із зв'ядозволяє проводити подальшу модифікацію без зками, що розщеплюються. зміни активності. Методи направленої доставки до В одному варіанті здійснення винаходу поліалцукрів, що використовується як сайти для хімічної кіленгліколеві залишки С1-С4 алкілполіалкіленглімодифікації, також добре відомі і тому певно, що колів, переважно поліетиленгліколю (ПЕГ), або поліалкіленгліколь може бути безпосередньо і поліоксіалкіленгліколеві залишки таких гліколів специфічно приєднаний до цукрів в IFN-b, які був входять в представляючі інтерес полімерні систеактивовані шляхом окислення. Наприклад, можна ми. Таким чином, полімер, до якого приєднують отримати гідразид поліетиленгліколю, який утвобілок, може бути гомополімером поліетиленглікорює відносно стійкі гідразонові зв'язки внаслідок лю (ПЕГ) або поліоксіетильованим поліолом, за конденсації з альдегідами і кетонами. Вказана умови, що у всіх випадках полімер розчиняється у властивість була використана для модифікації воді при кімнатній температурі. Необмежувальні білків за допомогою окислених олігосахаридних приклади таких полімерів включають гомополімезв'язків. [Див. публікацію Andresz, Η. et al., (1978), ри поліалкіленоксиду, такі як ПЕГ або поліпропілеMakromol. Chem. 179:301]. Зокрема, обробка карнгліколі, поліоксіетиленовані гліколі, їх співполімебоксиметилгідразиду поліетиленгліколю нітритом ри і блокспівполімери, за умови збереження дозволяє отримати карбоксиметилазид поліетилеводорозчинності блокспівполімеру. Приклади понгліколю, який являє собою електрофільно активліоксіетильованих поліолів включають, наприклад, ну групу, взаємодіючу з аміногрупами. Вказану поліоксіетильований гліцерин, поліоксіетильовареакцію можна використати також для отримання ний сорбіт, поліоксіетильовану глюкозу і тому побілків, модифікованих поліалкіленгліколем. Див. дібні. Гліцериновий кістяк поліоксіетильованого патенти США №№ 4101380 і 4179337. гліцерину аналогічний природному кістяку, існуюХімічна структура, створена за допомогою тічому, наприклад, у тварин і людини в моно-, ди- і олового лінкера, може далі полегшити перехресне тригліцеридах. Тому таке розгалуження необов'яззшиття білків. Вказану реакцію можна виконати ково повинно бути чужорідним для організму. шляхом створення реакційноздатних альдегідів у Як альтернатива поліалкіленоксидам можна вуглеводневих частинах за допомогою періодату використати декстран, полівінілпіролідони, поліакнатрію, утворення кон'югатів цистаміну з викорисриламіди, полівінілові спирти, вуглеводневі політанням альдегідів і індукції перехресного зшиття мери і тому подібні. Фахівцям в даній галузі повиза допомогою тіолових груп в цистамінах [див. нно бути зрозуміло, що приведений вище список є Pepinsky, В. et al., (1991), J. Biol. Chem., 266: ілюстративним і в об'єм винаходу входять всі по18244-18249 and Chen, L.L. et al., (1991) J. Biol. лімери, що володіють описаними властивостями. Chem., 266: 18237-18243]. Тому передбачається, 25 86749 26 О-п-фенілпропіональдегід 20кДа і мПЕГ-О-мПолімер може мати будь-яку молекулярну мафенілацетальдегід 20кДа, отримуючи при цьому су, але переважна молекулярна маса знаходиться в межах від близько 300 до 100000, більш переваIFN-b, модифікований мПЕГ-О-2жно від 10000 до 40000. Зокрема, молекулярна метилпропіональдегідом 20кДа, IFN-b, модифікомаса, що дорівнює 20000 або більше, краще усьований мПЕГ-О-п-метилфеніл-О-2го дозволяє запобігти втраті білка внаслідок фільметилпропіональдегідом 20кДа, IFN-b, модифікотрації в нирках. ваний мПЕГ-О-м-метилфеніл-О-2Похідні сполуки поліалкіленгліколю володіють метилпропіональдегідом 20кДа, IFN-b, модифікорядом властивостей, корисних для отримання ваний мПЕГ-О-п-фенілацетальдегідом 20кДа, IFNкон'югатів полімер-ΙFΝ-β при здійсненні даного b, модифікований мПЕГ-О-пвинаходу, таких як: краща водорозчинність при фенілпропіональдегідом 20кДа, і IFN-b, модифікоодночасному збереженні антигенної або імуногенваний мПЕГ-О-м-фенілацетальдегідом 20кДа. Доної реакції; висока міра біосумісності; відсутність кладний опис отримання і дослідження людського біорозкладення похідних поліалкіленгліколю in vivo IFN-b, модифікованого мПЕГ-О-2і більш легке виведення з живих організмів. метилпропіональдегідом 20кДа і мПЕГ-О-пКрім того, іншим об'єктом даного винаходу є фенілацетальдегідом 20кДа, наведений нижче, а використання IFN-b, ковалентно пов'язаного з потакож в заявці на міжнародний патент лімером, причому в цьому випадку кон'югація до№PCT/US03/01559. сягається за рахунок ковалентних хімічних зв'язків, В одному варіанті здійснення винаходу пегищо розщеплюються. Така кон'югація дозволяє конльований IFN-b отримують таким чином. IFN-b, тролювати час, після закінчення якого полімер наприклад AVONEXÒ (нерозфасований проміжний може бути відщеплений від IFN-b. Ковалентний продукт IFN-b-1а, (клінічна партія нерозфасованозв'язок між препаратом IFN-b і полімером може го лікарського засобу, що пройшла всі випробубути розщепленим внаслідок хімічної або ферменвання для використання при лікуванні людини) в тативної реакції. Продукт, що являє собою IFN-bкількості 250мкг/мл в 100мМ фосфату натрію, рН полімерний кон'югат, зберігає активність на прийн7,2, 200мМ NaCl) розводять рівним об'ємом 100мМ ятному рівні. Одночасно з цим в кон'югуючому поMES, рН 5,0, і доводять показник рН до 5,0, додалімері присутні частини поліетиленгліколю, що ючи НСl. Зразок вводять в колонку FF SPнадають IFN-b-полімерному кон'югату високу воSepharoseÒ (Pharmacia, Piscataway, NJ) при 6мг дорозчинність і більш тривале збереження в кроIFN-b/мл смоли. Колонку промивають 5мМ фосфавотоці. Завдяки поліпшеним характеристикам IFNту натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, і продукт елююють b-полімерного кон'югату даний винахід робить мо30мМ фосфату натрію, рН 6,0, 600мМ NaCl. Елюжливою парентеральну, назальну і пероральну йовані фракції аналізують, вимірюючи оптичну доставку активного IFN-b-полімерного кон'югату з густину при 280нм, і на основі оптичної густини подальшим гідролітичним розщепленням зв'язків, визначають концентрацію інтерферону в зразках, поліпшує біологічну доступність IFN-b при застосувикористовуючи коефіцієнт екстинкції, що дорівванні in vivo. нює 1,51 для 1мг/мл розчину. Взаємодію полімеру і IFN-b з утворенням кон'До IFN-b, отриманому з елюату SP, в кількості югатів, наприклад, продуктів, кон'югованих біля N1мг/мл розчину, додають 0,5Μ фосфату натрію, рН кінця, можна легко здійснити за допомогою цілого 6,0, до 50мМ, ціаноборогідрид натрію (Aldrich, ряду схем реакцій. Активність і стійкість кон'югатів Milwaukee, WI) до 5мМ і ПЕГ-альдегід з молекуляIFN-b можна змінювати різними способами, викорною масою 20000 (Shearwater Polymers, ристовуючи полімери з різною молекулярною маHuntsville, AL) до 5мг/мл. Зразок інкубують при сою. Розчинність кон'югатів можна варіювати шлякімнатній температурі протягом 20 годин. Пегихом зміни пропорції і розміру фрагменту льований інтерферон очищають від продуктів реаполіетиленгліколю, введеного в полімерну компокції, виконуючи послідовні стадії хроматографії в зицію. сортувальній колонці 6 FPLC SuperoseÒ В одному варіанті здійснення винаходу кон'ю(Pharmacia) з використанням 5мМ фосфату нагати згідно з даним винаходом отримують, здійстрію, рН 5,5, 150мМ NaCl як рухомої фази і SPнюючи взаємодію білка з активованою сполукою SepharoseÒ FF. У сортувальній колонці відбуваполіалкіленгліколю (PCG). Наприклад, IFN можна ється розділення модифікованого і немодифіковапіддати взаємодії з ПЕГ-альдегідом в присутності ного IFN-b. Елюат, що містить пегильований бетавідновника (наприклад, ціаноборогідриду натрію) інтерферон, зібраний після гель-фільтрації, розвоза допомогою відновного алкілування для отридять водою у відношенні 1:1 і вводять в кількості мання ПЕГ-білкового кон'югату, сполученого амід2мг бета-інтерферону/мл смоли в колонку SPним зв'язком. Див., наприклад, європейський паSepharoseÒ. Колонку промивають 5мМ фосфату тент №0154316 В1 і заявку на міжнародний патент натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, після чого пегильова№PCT/US03/01559. ний бета-інтерферон елююють з колонки 5мМ фоУ деяких варіантах здійснення винаходу людсфату натрію, рН 5,5, 800мМ NaCl. Елюйовані ський IFN-b ПЕГ-модифікують з використанням фракції аналізують відносно вмісту білка на основі наступних активованих поліалкіленгліколів: мПЕГоптичної густини при 280нм. Концентрація пегиО-2-метилпропіональдегід 20кДа, мПЕГ-О-пльованого інтерферону вказана в еквівалентах метилфеніл-О-2-метилпропіональдегід 20кДа, інтерферону, оскільки ПЕГ не впливає на оптичну мПЕГ-О-м-метилфеніл-О-2-метилпропіональдегід густину при 280нм. Вказаний метод і дослідження 20кДа, мПЕГ-О-п-фенілацетальдегід 20кДа, мПЕГпегильованого IFN-b описані в заявці WO 27 86749 28 дини, в кількості 250мкг/мл в 100мМ фосфату на00/23114. Кон'югація IFN-b з ПЕГ, мабуть, не змітрію, рН 7,2, 200мМ NaCl) розводять 24мл 165мМ нює антивірусну активність. Крім того, питома акMES, рН 5,0, 100мкл 5н розчину НСl і 24мл води. тивність пегильованого IFN-b значно вище (приЗразок вводять в 600мкл колонку FF SP-Sepharose близно в 10 разів), ніж у IFN-b, не модифікованого (Pharmacia). Колонку двічі промивають 900мкл поліетиленгліколем (WO 00/23114). 5мМ фосфату натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl і елююIFN-b можна також модифікувати ПЕГють білок 5мМ фосфату натрію, рН 5,5, 600мМ альдегідною частиною з молекулярною масою NaCl. Елюйовані фракції аналізують відносно оп5000, що виробляється, наприклад, компанією тичної густини при 280нм і визначають концентраFluka, Inc (№ за каталогом 75936, Ronkonkoman, цію IFN-b в зразках, використовуючи коефіцієнт NY), відповідно до способу, наведеного вище для екстинкції, що дорівнює 1,51 для 1мг/мл розчину. ПЕГ-альдегіду з молекулярною масою 20000. Відповідні піку фракції збирають, отримуючи при IFN-b, модифікований мПЕГ-О-2цьому IFN-b в концентрації 2,3мг/мл. До 1,2мл IFNметилпропіональдегідом 20кДа, можна отримати b-1а, отриманого з елюату, зібраного з колонки таким чином. 10мл AVONEXÒ (нерозфасований SP-Sepharose, додають 0,5Μ фосфату натрію, рН проміжний продукт IFN-b-1а, (клінічна партія неро6,0, до 50мМ, ціаноборогідрид натрію (Aldrich) до зфасованого лікарського засобу, що пройшла всі 5мМ і мПЕГ-О-п-фенілацетальдегід 20кДа до випробування для використання при лікуванні лю10мг/мл. Зразок інкубують при кімнатній темперадини) в кількості 250мкг/мл в 100мМ фосфату натурі протягом 18 годин в темряві. Пегильований трію, рН 7,2, 200мМ NaCl) розводять 12мл 165мМ IFN-b можна очистити від реакційної суміші в MES, рН 5,0, і 50мкл 5н розчину НСl. Зразок вво0,75мл колонці FF SP-Sepharose таким чином: дять в 300мкл колонку FF SP Sepharose 1,5мл реакційної суміші розводять 7,5мл 20мМ (Pharmacia). Колонку тричі промивають 300мкл MES, рН 5,0, 7,5мл води і 5мкл 5н розчину HCl і 5мМ фосфату натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl і елюювводять в колонку SP-Sepharose. Колонку промиють білок 5мМ фосфату натрію, рН 5,5, 600мМ вають фосфатом натрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, після NaCl. Елюйовані фракції аналізують відносно опчого пегильований IFN-b елююють з колонки 20мМ тичної густини при 280нм і визначають концентраMES, рН 6,0, 600мМ NaCl. Потім пегильований цію IFN-b в зразках, використовуючи коефіцієнт IFN-b очищають в сортувальній колонці Superose 6 екстинкції, що дорівнює 1,51 для 1мг/мл розчину. HR 10/30 FPLC, використовуючи 5мМ фосфату Відповідні піку фракції збирають, отримуючи при натрію, рН 5,5, 150мМ NaCl як рухому фазу. Очицьому IFN-b в концентрації 3,66мг/мл, який потім щення в сортувальній колонці (25мл) виконують з розбавляють водою до 1,2мг/мл. швидкістю 20мл/година і збирають 0,5мл фракції. До 0,8мл IFN-b, отриманого з розбавленого Елюйовані фракції аналізують відносно вмісту білелюату з колонки SP-Sepharose, додають 0,5Μ ка на основі оптичної густини при 280нм, збирають фосфату натрію, рН 6,0 до 50мМ, ціаноборогідрид і визначають концентрацію білка в елюаті. Конценнатрію (Aldrich) до 5мМ і мПЕГ-О-2трація пегильованого IFN-b вказана в еквівалентах метилпропіональдегід 20кДа до 5мг/мл. Зразок IFN після внесення поправки на ПЕГ (мПЕГ-О-пінкубують при кімнатній температурі протягом 16 фенілацетальдегід 20кДа має коефіцієнт екстинкгодин в темряві. Пегильований IFN-b очищають від ції при 280нм, що дорівнює 0,5 для 1мг/мл розчиреакційної суміші в 0,5мл колонці FF SP-Sepharose ну) в оптичну густину при 280нм, використовуючи таким чином: 0,6мл реакційної суміші розбавляють коефіцієнт екстинкції, що дорівнює 2 для 1мг/мл 2,4мл 20мМ MES, рН 5,0, і вводять в колонку SPрозчину пегильованого IFN-b. Відбирають зразки Sepharose. Колонку промивають фосфатом надля аналізу і іншу частину зібраного продукту розтрію, рН 5,5, 75мМ NaCl, після чого пегильований водять до 30мкг/мл HAS-вмісним буфером, відбиIFN-b елююють з колонки 25мМ MES, рН 6,4, рають аліквоти в кількості 0,25мл/пробірка і збері400мМ NaCl. Пегильований IFN-b потім очищають гають при -70°С. в сортувальній колонці Superose 6 HR 10/30 FPLC, Глікозильований IFN-b, пов'язаний з штучним використовуючи 5мМ фосфату натрію, рН 5,5, полімером, можна використати при здійсненні спо150мМ NaCl як рухому фазу. Очищення в сортувасобів згідно з даним винаходом. Полімер може льній колонці (25мл) здійснюють з швидкістю містити поліалкіленгліколеву частину. Поліалкіле20мл/година і збирають 0,5мл фракції. Елюйовані нова частина може бути зв'язана з бетафракції аналізують відносно вмісту білка на основі інтерфероном за допомогою групи, вибраної з оптичної густини при 280нм, збирають і визначаальдегідної групи, малеімідної групи, вінілсульфоють концентрацію білка в зібраному елюаті. Коннової групи, галогенацетатної групи, декількох центрація пегильованого IFN-b вказана в еквівазалишків гістидину, гідразинової групи і амінотіолентах IFN, оскільки ПЕГ не впливає на оптичну лової групи. IFN-b може бути зв'язаний з поліетигустину при 280нм. Відбирають зразки для аналізу ленгліколевою частиною, причому IFN-b зв'язують і іншу частину елюату розводять до 30мкг/мл HASз поліетиленгліколевою частиною за допомогою вмісним буфером, відбирають аліквоти в кількості нестійкого зв'язку, який розщеплюється в резуль0,25мл/пробірка і зберігають при -70°С. таті біохімічного гідролізу і/або протеолізу. ПоліIFN-b, модифікований мПЕГ-O-пмер може мати молекулярну масу від близько 5 до фенілацетальдегідом 20кДа, можна отримати таÒ близько 40кДальтон. Інший IFN-b, який можна виким чином. 20мл AVONEX (нерозфасований прокористати, є фізіологічно активним бетаміжний продукт IFN-b, клінічна партія нерозфасоінтерфероном композиції, що включає фізіологічно ваного лікарського засобу, що пройшла всі активний глікозильований бета-інтерферон, Nвипробування для використання при лікуванні лю 29 86749 30 кінець якого зв'язаний з полімером, що містить послідовність, яка кодує препарат IFN-b. Наприполіалкіленгліколеву частину, при цьому фізіологіклад, можна синтезувати декілька невеликих олічно активний бета-інтерферон і поліалкіленглікогонуклеотидів, що кодують частини необхідного лева частина розташовані так, що фізіологічно поліпептиду, і потім лігувати їх один з одним. активний бета-інтерферон, що входить до складу Окремі олігонуклеотиди звичайно містять 5'- або композиції, володіє по суті такою ж активністю, що 3'-кінцеві виступи для комплементарної зборки. і фізіологічно активний бета-інтерферон, який не В нуклеїнові кислоти, що кодують білки IFN-b, має вказаної частини, про що свідчать результати можна внести зміни методами, добре відомими в вимірювання методом антивірусного аналізу. даній галузі. Наприклад, можна здійснити зміни за Гетерологічні поліпептиди або інші молекули допомогою сайт-специфічного мутагенезу, описаможуть бути ковалентно або нековалентно зв'язані ного, наприклад, в [публікації Mark et al. «Siteз білком IFN-b або його варіантом. Термін «коваspecific Mutagenesis Of the Human Fibroblast лентно зв'язаний» означає, що різні частини молеInterferon Gene», Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, pp. кули згідно з даним винаходом ковалентно зв'язані 5662-66 (1984)] і патенті США №4588585. одна з одною прямим зв'язком або ковалентно Іншим методом створення нуклеїнової кислозв'язані одна з одною посереднім зв'язком за доти, що кодує препарат IFN-b, є хімічний синтез. помогою однієї або декількох проміжних частин, Наприклад, ген, який кодує необхідний препарат таких як місток, спейсер, одна або декілька лінкерIFN-b, можна синтезувати хімічним шляхом в синних частин. Одну або декілька проміжних частин тезаторі олігонуклеотидів. Такі олігонуклеотиди іменують «зв'язуючою групою». Термін «кон'югостворюють на основі амінокислотної послідовності ваний» має взаємозамінне значення з терміном необхідного препарату IFN-b. «ковалентно зв'язаний». При виборі нуклеїнової кислоти для експресії в Бета-інтерферони, призначені для викорисекспресуючій системі бажано вибрати такі кодони, тання в даному винаході, можуть бути глікозильоякі сприятливі для клітини-хазяїна або експресуюваними або неглікозильованими. Неглікозильовані чої системи, в якій буде продукований препарат IFN-b можна продукувати в прокаріотичній клітинірекомбінантного IFN-b. Відомо, наприклад, що хазяїні. певні кодони більш переважно експресуються в Білки IFN-b і їх варіанти можна також модифіпрокаріотичних клітинах в порівнянні з іншими кувати, приєднуючи полісахариди, які звичайно («перевага кодонів»). відсутні в IFN-b. Послідовність ДНК, що кодує препарат IFN-b, 3. Методи отримання препаратів IFN-b може включати або не включати послідовність Препарати IFN-b згідно з даним винаходом ДНК, що кодує сигнальну послідовність. Така сигможна отримати будь-якими прийнятними метональна послідовність, у разі її наявності, є послідами, які включають отримання нуклеїнової кислодовністю, пізнаваною кліткою, вибраною для ексти, що кодує препарат IFN-b, і експресію вказаної пресії препарату IFN-b. Сигнальна послідовність нуклеїнової кислоти в прийнятному трансформоможе бути прокаріотичною, еукаріотичною або ваному хазяїні. За допомогою такого методу можкомбінацією обох послідовностей. Сигнальні пона отримати препарати рекомбінантного IFN-b. слідовності добре відомі в даній галузі, де описано декілька різних послідовностей. Сигнальна посліПрепарати IFN-b можна також отримати хімічним довність може бути послідовністю нативного (тобсинтезом або комбінацією хімічного синтезу і мето природного) IFN-b. Введення сигнальної послітодів рекомбінантних ДНК. довності залежить від бажання секретувати В одному варіанті здійснення винаходу нуклеїпрепарат IFN-b в рекомбінантних клітинах, в яких нову кислоту, що кодує препарат IFN-b, отримують він продукований. Якщо вибрані клітини є прокарішляхом виділення або синтезу послідовності ДНК, отичними, звичайно бажано, щоб послідовність що кодує IFN-b або його варіант. Наприклад, злиДНК не кодувала сигнальну послідовність. Якщо тий білок IFN-b можна отримати методом, розглявибрані клітини є еукаріотичними, звичайно бажанутим в даному описі винаходу. Природну нуклеїно мати кодовану сигнальну послідовність і особнову кислоту IFN-b можна отримати методами, ливо переважно використати сигнальну послідовдобре відомими в даній галузі. Наприклад, нуклеїність IFN-b дикого типу. нову кислоту можна виділити за допомогою поліПісля збирання (шляхом синтезу, сайтмеразної реакції синтезу ланцюга із зворотною направленого мутагенезу або іншим методом) транскриптазою (RT-PCR), використовуючи РНК, нуклеїнову кислоту, що кодує препарат IFN-b, ввоотриману з клітини, яка, як відомо, експресує IFNдять в експресуючий вектор, в якому вона функціb, наприклад лейкоцита, і затравки на основі поонально пов'язана з експресуючою регулярною слідовності гена IFN-b, наприклад, SEQ ID NO:1. послідовністю, придатною для експресії препарату Нуклеїнові кислоти, що кодують білки IFN-b, можна IFN-b в необхідному трансформованому хазяїні. також отримати внаслідок скринінгу бібліотек, наПравильність збирання може бути підтверджена приклад, бібліотек кДНК, створених з клітин, що секвенуванням нуклеїнової кислоти, рестрикційекспресують IFN-b, за допомогою зонда, наприним картуванням і експресією біологічно активного клад, олігонуклеотиду, який містить частину посліполіпептиду в прийнятному хазяїні або клітинідовності IFN-b. хазяїні. Як відомо в даній галузі, для досягнення Альтернативно, повну амінокислотну послідовисоких рівнів експресії трансфікованого гена в вність можна використати для створення гена, хазяїні або клітині-хазяїні вказаний ген повинен трансльованого в зворотному напрямі. Можна синбути функціонально пов'язаний з експресуючими тезувати олігомер ДНК, що містить нуклеотидну 31 86749 32 регулярними послідовностями транскрипції і ями є штами Е. coli, Pseudomonas, Bacillus, трансляції, що функціонують у вибраному експреStreptomyces, грибні клітини, дріжджові клітини, суючому хазяїні. клітини комах, таких як Spodoptera fruaiperda Вибір експресуючої регулярної послідовності і (SF9), тваринні клітини, такі як клітини яєчника експресуючого вектора залежить від вибору клітикитайського хом'ячка (СНО), клітини мишей, такі як ни-хазяїна. Можна використати різні комбінації NS/0, клітини африканської зеленої мавпи, такі як експресуючого хазяїна/вектора. Прийнятними ексCOS I, COS 7, BSC 1, BSC 40 і ВМТ 10, і клітини пресуючими векторами для еукаріотичних хазяїв, людини, а також рослинні клітини в культурі тканинаприклад, еукаріотичних клітин-хазяїв, є вектори, ни. Такі клітини можна отримати з Американської що містять експресуючі регулярні послідовності, колекції типових культур (АТСС). Переважні клітивиділені з SV40, вірусу папіломи великої рогатої ни-хазяї для експресії в тваринних клітинах вклюхудоби, аденовірусу і цитомегаловірусу, зокрема, чають культивовані клітини СНО і COS 7 і особлинижченаведені вектори: pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, во лінію клітин CHO-DDUKY-b1. pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, Повинно бути зрозуміло, що не всі вектори і pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo і pHyg. Альтерекспресуючі регулярні послідовності однаково донативно, для тимчасової експресії білків в еукаріобре експресують послідовності ДНК, розглянуті в тичних клітинах можна використати похідні вірусів, даному описі винаходу. Точно так само не всі хазяї таких як вірус папіломи великої рогатої худоби однаково добре підходять для однієї і тієї ж екс(BPV-1) або вірус Епштейна-Барра (рНЕВо, видіпресуючої системи. Однак фахівець в даній галузі лений з pREP і р205). У даній галузі відомі різні може вибрати необхідні вектори, експресуючі реметоди отримання плазмід і трансформації органігулярні послідовності і хазяїв без зайвого експезмів-хазяїв. Для ознайомлення з іншими експрериментування. При цьому необхідно також врахусуючими системами [див. публікацію Molecular вати число піків вектора, здатність контролювати Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by дане число піків і експресію будь-яких інших білків, Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor кодованих даним вектором, таких як маркер стійLaboratory Press: 1989), Chapters 16 and 17]. кості до антибіотиків. Наприклад, переважні вектоПрийнятні експресуючі вектори для бактерійри для даного винаходу включають вектори, що них хазяїв включають відомі бактерійні плазміди, дозволяють ампліфікувати ДНК, що кодує препазокрема, плазміди, отримані з Е. соlі, що включарат IFN-b, у вигляді декількох піків. Такі ампліфікоють col E1, pCR1, pBR322, pMB9 і їх похідні, плазвані вектори добре відомі в даній галузі. До таких міди з більш широким спектром хазяїв, такі як RP4, векторів відносяться, наприклад, вектори, які можфагові ДНК, наприклад, численні похідні лямбдана ампліфікувати методом ампліфікації DHFR фага, такі як NM989, і інші ДНК-вмісні фаги,· такі як [див., наприклад, Kaufman, патент США М13 і нитчасті одноланцюгові ДНК-вмісні фаги. №4470461, публікацію Kaufman and Sharp, Прийнятні експресуючі вектори для дріжджових «Construction of a Modular Dihydrafolate Reductase клітин включають плазміду 2.mu. і її похідні. ПриcDNA Gene: Analysis of Signals Utilized for Efficient йнятні вектори для клітин комах включають pVL Expression», Mol. Cell. Biol., 2, pp. 1304-19 (1982)] 941. [Див. також публікацію Gate et al., «Isolation of або ампліфікації глутамінсинтетази («GS») (див., the Bovine And Human Genes For Mullerian Inhibiting наприклад, патент США №5122464 і опубліковану Substance And Expression of the Human Gene In заявку на європейський патент №338841). Animal Cells», Cell, 45, pp. 685-98 (1986)]. При виборі експресуючої регулярної послідовКрім того, у вказаних векторах можна викорисності необхідно взяти до уваги ряд чинників. Такі тати різні експресуючі регулярні послідовності. чинники включають, наприклад, відносну міцність Придатні експресуючі регулярні послідовності послідовності, її регульованість і сумісність з давключають експресуючі регулярні послідовності, ною послідовністю ДНК, що кодує препарат IFN-b, зв'язані зі структурними генами вищезгаданих ексзокрема, відносно можливих вторинних структур. пресуючих векторів. Приклади прийнятних експреПри виборі хазяїв необхідно враховувати їх суміссуючих регулярних послідовностей включають, ність з вибраним вектором, токсичність продукту, наприклад, ранні і пізні промотори SV-40 або адекодованого послідовностями ДНК згідно з даним новірусу, Іас-системи, trp-системи, систему ТАС винаходом, характеристики секреції, здатність або TRC, головні операторні і промоторні ділянки здійснювати правильне укладання поліпептидних лямбда-фага, наприклад PL, контрольні ділянки ланцюгів, вимоги, що пред'являються до ферменбілка оболонки вірусу fd, промотор 3тації або культури, і простоту очищення продуктів, фосфогліцераткінази або інші гліколітичні фермекодованих послідовностями ДНК. нти, промотори кислої фосфатази, наприклад, З урахуванням вищезгаданих параметрів фаPho5, промотори системи альфа-спаровування хівець в даній галузі може вибрати різні комбінації дріжджів і інші послідовності, які, як відомо, контвектора/експресуючої регулярної послідовносролюють експресію генів прокаріотичних або еукаті/хазяїна, які будуть експресувати необхідні поріотичних клітин або їх вірусів і різних їх комбінаслідовності ДНК в ферментаційній або великомацій. сштабній тваринній культурі, наприклад, з Для продукування препаратів IFN-b можна вивикористанням клітин СНО або COS 7. Викорискористати будь-якого прийнятного хазяїна, вклютання лінії клітин СНО, такої як CHO-KUKX-B1 чаючи бактерії, гриби (в тому числі дріжджі), росDHFR sup, для експресії варіантів IFN-b детально линні клітини, клітини комах, клітини ссавців і інші описано в патенті США №6127332. відповідні тваринні клітини або лінії клітин, а також Препарат IFN-b можна також продукувати в трансгенних тварин або рослини. Типовими хазясистемі in vitro, наприклад, системі трансляції, та 33 86749 34 приклад, білки і фрагменти інтерферону можна кій як клітинний лізат, зокрема, лізат ретикулоциочистити, пропускаючи розчин через колонку, що тів. Термін «система трансляції in vitro», що має містить іммобілізований рецептор інтерферону взаємозамінне значення з терміном «безклітинна (див. патент США №4725669). Зв'язану молекулу система трансляції», означає систему трансляції, інтерферону потім можна елюювати, проводячи яка являє собою безклітинний екстракт, що місобробку хаотропною сіллю або водним розчином тить щонайменше мінімум елементів, необхідних оцтової кислоти. Злиті білки імуноглобуліну можна для трансляції молекули РНК в білок. Системи очистити, пропускаючи розчин, що містить злитий трансляції in vitro звичайно включають макромолебілок, через колонку, заповнену білком А або білкули, такі як ферменти, фактори трансляції, ініціаком G, який вибірково зв'язується з Fc-частиною ції і елонгації, хімічні реагенти і рибосоми. Напризлитого білка. [Див., наприклад, публікацію Reis, клад, система трансляції in vitro може містити KJ. et al., J. Immunol. 132:3098-3102 (1984); заявку щонайменше рибосоми, тРНК, що ініціює метіонілРСТ, публікація №WO 87/00329]. Химерне антитітРНКМеt, білки або комплекси, що беруть участь в ло можна потім елюювати, проводячи обробку трансляції, наприклад, eIF2, eIF3, кепхаотропною сіллю, або водним розчином оцтової зв'язувальний (СВ) комплекс, що включає кепкислоти. зв'язувальний білок (СВР) і еукаріотичний фактор Альтернативно білки інтерферону і молекули, ініціації 4F (eIF4F). У даній галузі добре відомі різні злиті з імуноглобуліном, можна очистити в колонсистеми трансляції in vitro, які включають комерках з антитілом проти інтерферону або в колонках ційно доступні набори. Прикладами систем трансз антитілом проти імуноглобуліну, отримавши при ляції in vitro є лізати еукаріотичних клітин, такі як цьому по суті чистий білок. Термін «по суті чистий» лізати ретикулоцитів кролика, лізати ооцитів кроозначає, що білок не містить забруднюючих речолика, лізати клітин людини, лізати клітин комах і вин, які пов'язані з ним в природних умовах. Про екстракти паростків пшениці. Лізати виробляються істотну чистоту свідчить одна смуга, отримана при на комерційній основі такими компаніями як виконанні електрофорезу. Promega Corp, Madison, Wis; Stratagene, La Jolla, Calif.; Amersham, Arlington Heights, 111.; і Продукований і очищений IFN-b можна досліGIBCO/BRL, Grand Island, N.Y. РНК, що використодити методом пептидного картування. Наприклад, вується в системах трансляції in vitro, можна прозразок препарату IFN-b можна гідролізувати ендодукувати in vitro, наприклад, за допомогою промопротеїназою Lys-C і дослідити методом ВЕРХ із торів SP6 або Т7 методами, відомими в даній оберненою фазою відповідно до опису, приведегалузі. ного в патенті США №6127332. Відповідно до іншого способу препарат IFN-b У переважному варіанті здійснення винаходу експресують з ендогенного гена в клітині-хазяїні. препарат IFN-b по суті не містить інший клітинний Даний спосіб може включати введення гетерологіматеріал, наприклад, білки. Термін «по суті чисчного промотору вгорі від кодуючої області гена тий» або «очищені препарати IFN-β» означає преIFN-b, наприклад, промотору, що індукується, експарат IFN-b, що містить менше приблизно 20% (в пресуючого ендогенний ген IFN-b, і виділення проперерахунку на суху масу) забруднюючих клітиндукованого IFN-b. Гетерологічний промотор можна них матеріалів, наприклад, нуклеїнових кислот, білків і ліпідів, і переважно містить менше прибливвести в клітини шляхом «забиття» методами, зно 5% забруднюючого клітинного матеріалу. Певідомими в даній галузі, або альтернативно шляреважні препарати IFN-b містять менше за прихом введення промотору в ген IFN-b. близно 2% забруднюючих клітинних матеріалів; Препарат IFN-b, отриманий способом згідно з ще переважніше, менше за приблизно 1% забрудданим винаходом, може бути глікозильованим або нюючих клітинних матеріалів і, найбільш переважнеглікозильованим в залежності від організмуно, менше за приблизно 0,5, 0,2, 0,1, 0,01, 0,001% хазяїна, використаного для продукування даного забруднюючих клітинних матеріалів. препарату. Якщо як хазяїн були вибрані бактерії, Переважні композиції на основі препарату IFNпродукований препарат IFN-b буде неглікозильоb також по суті не містять інших клітинних білків ваним. Еукаріотичні клітини, з іншого боку, глікози(що визначаються також як «забруднюючі білки»), люють препарати IFN-b. тобто вказані композиції містять менше приблизно Препарат IFN-b, продукований трансформова20% (в перерахунку на суху масу) забруднюючих ним хазяїном, можна очистити будь-яким прийнятбілків і, переважно, містять менше приблизно 5% ним способом. Відомі різні способи очищення IFNзабруднюючих білків. Переважні препарати поліb. Див., наприклад, патенти США №№ 4289689, пептидів згідно з даним винаходом містять менше 4359389, 4172071, 4551271, 5244655, 4485017, приблизно 2% забруднюючих білків; ще переваж4257938, 4541952 і 6127332. У переважному варініше, менше приблизно 1% забруднюючих білків і, анті здійснення винаходу препарат IFN-b очищанайбільш переважно, менше приблизно 0,5, 0,2, ють за допомогою імуноафінної хроматографії, 0,1, 0,01, 0,001% забруднюючих білків. описаної, наприклад, в [публікації Okamura et al., Чистоту і концентрацію препаратів IFN-b мож«Human Fibroblastoid Interferon: Immunosorbent на визначити методами, відомими в даній галузі, Column Chromatography and N-Terminal Amino Acid наприклад за допомогою гель-електрофорезу, і Sequence». Biochem, 19, pp. 3831-35 (1980)]. методами, описаними в [публікації Robert K. Наприклад, білки IFN-b і їх варіанти можна виScopes, Protein Purification, Principles and Practice, ділити і очистити відомими методами, такими як Third Ed., Springer Verlag New York, 1993 і в посиекстракція, преципітація, хроматографія, афінна ланнях, приведених в даній публікації]. хроматографія, електрофорез або подібними. На 35 86749 36 зько 1 року, щонайменше близько 3 років, щонайБіологічну активність препаратів IFN-b можна менше близько 5 років або довше. дослідити будь-яким прийнятним методом, відоПотребуючим суб'єктом може бути тварина, мим в даній галузі, наприклад, шляхом нейтралізокрема, ссавець. Приклади ссавців включають зації антитілом антивірусної активності, індукції людей, велику рогату худобу, овець, свиней, коактивності протеїнкінази, олігоаденілат-2,5-Аней, собак, кішок, приматів, крім людини, мишей і синтетази або фосфодіестерази, відповідно до щурів. опису, приведеного в заявках ЕР-В1-41313 і WO У деяких варіантах здійснення винаходу пре00/23472. Такі аналізи включають також імуномопарат IFN-b вводять потребуючому суб'єкту у видуляторні аналізи (див., наприклад, патент США гляді додаткової терапії, тобто при одночасному №4753795), аналізи методом гальмування росту і проведенні іншого лікування. Наприклад, суб'єкт, вимірювання зв'язування з клітинами, експресуюстраждаючий CIDP, може пройти курс лікування чими рецептори інтерферону. Типові антивірусні IVIg; стероїдами, такими як преднізолон; імунодеаналізи описані в патенті США №6127332 і заявці пресантом, таким як азотіоприн, циклоспорин або WO 00/23472. циклофосфамід; або плазмаферезом крім введенПридатність препаратів IFN-b для лікування ня препарату IFN-b. Комбінована терапія з викоригломерулонефриту можна також оцінити з використанням тваринних моделей, наприклад, описаних станням препарату IFN-b може звести до мінімуму в прикладах і далі в даному описі винаходу. Дослізастосування інших лікарських засобів, які можуть дження може бути здійснено відповідно до опису, бути більш шкідливими (наприклад стероїди), приведеного в прикладах. більш дорогими (наприклад, IVIg) або менш зручПрепарати IFN-b можна також придбати коменими (заміна плазми). Тому в деяких варіантах здійснення винаходу введення суб'єкту препарату рційним шляхом під наступними торговими назваIFN-b дозволяє зменшити дозу і/або частоту ввеми: AVONEXÒ (IFN-b-1a) (Biogen, Inc., Cambridge, дення іншого лікарського засобу. Наприклад, дозу MA); REBIFb (IFN-b-1a) (Serono, S.A., Geneva, і/або частоту введення можна зменшити щонайSwitzerland) і BETAFERONb (IFN-(B-1b) (Schering менше приблизно на 10%, 30%, 50%, 75%, 100% Aktiengesellschaft, Berlin, Germany), який також (тобто в два рази), п'ять разів, 10 разів або більше. представлений на ринку під назвою BETASERONb Ò Ò Нижче наведені діючі нормативи лікування CIDP. (Berlex, Montville, NJ; IFN-b-1b). AVONEX і REBIF Один варіант здійснення винаходу відноситься являють собою рекомбінантний глікозильований до способу лікування хронічної демієлінізуючої людський IFN-b дикого типу, продукований в клітиневропатії, наприклад CIDP, у суб'єкта, що прохонах яєчника китайського хом'ячка. BETAFERONÒ дить основний курс лікування CIDP, вибраний з продукований в бактеріях. групи, що складається з введення стероїду, вве4. Способи лікування препаратами IFN-b дення протизапального засобу, введення IVIg і Даний винахід відноситься до способів лікупроведення плазмаферезу, який крім основного вання і профілактики невропатії у потребуючого лікування CIDP включає введення суб'єкту препасуб'єкта, що включають введення вказаному сурату IFN-b в кількості, достатній для значного змеб'єкту терапевтично ефективної кількості препараншення дози або частоти проведення основного ту IFN-b необов'язково як допоміжний засіб при лікування CIDP, для досягнення ефективного лікуванні іншим препаратом. В одному варіанті ослаблення симптомів CIDP. здійснення винаходу невропатія є демієлінізуючою У цей час для лікування CIDP використовують невропатією, такою як хронічна демієлінізуюча імунодепресанти. Наприклад, встановлено, що невропатія. Приклади хронічної демієлінізуючої стероїди надають сприятливий ефект при лікуванневропатії включають CIDP і багатоосередкову ня CIDP. Позитивна реакція звичайно спостерігарухову невропатію. У переважному варіанті здійсється через 4 тижні. Звичайно стероїдом, що виконення винаходу невропатія є CIDP. ристовується є преднізон (дельтазон, оразон, Потребуючим суб'єктом може бути суб'єкт, у метикортен). Преднізон є пероральним кортикоякого виявлена невропатія. Невропатія може бути стероїдом, який придушує запальну і імунну реакдіагностована у суб'єкта методами, відомими в ції і, як вважають, змінює функцію медіатора на даній галузі. Зокрема, CIDP може бути діагностосайті придушення запальних і імунних реакцій при вана методами, відомими в даній галузі, які більш захворюванні CIDP. Хоча дози, що вводяться, модетально описані нижче. Лікування суб'єкта з діагжуть бути різними, більшість дорослих суб'єктів нозом невропатії може бути розпочате препаратом починають з дози 0,5-1мг/кг/доба при пероральноIFN-b в будь-який час. Крім того, лікуванню може му введенні (РО) (від близько 30-40 до 60бути підданий суб'єкт, у якого не виявлена невро80мг/добу). Поліпшення може спостерігатися пропатія, але, мабуть, може виникнути. Такі суб'єкти тягом наступних 2 місяців. Потім вказану дозу моможуть бути виявлені генетичними методами обжна вводити через день з подальшим зменшенням стеження. Суб'єкти, в яких може виникнути невродози до досягнення найменшої ефективної дози, патія, є також суб'єктами, у яких виявлені деякі, що дозволяє підтримувати у суб'єкта стан ремісії. але не всі симптоми, характерні для невропатії, Іншим імунодепресантом, який був визнаний тому в деяких випадках може бути неясно, чи дійефективним для лікування CIDP, є азатіоприн сно у суб'єкта може виникнути невропатія. Ліку(імуран), аналог пурину, що зменшує метаболізм вання може проводитися протягом щонайменше пуринів і інгібуючий синтез ДНК і РНК. Вважається, близько 1 місяця, щонайменше близько 3 місяців, що азатіоприн підвищує працездатність і ослабляє щонайменше близько 6 місяців, щонайменше блисимптоми CIDP, придушуючи імуноопосередковане ураження нервів. Початкова доза складає бли 37 86749 38 зько 50мг при пероральному введенні на добу більш високої дози, що дорівнює, наприклад, 2г/кг, (щодня протягом місяця), яку поступово збільшуяку поступово знижують до 0,5-1г/кг. Частота ввеють до загальної добової дози, яка дорівнює 2дення вказаних доз може бути різною, причому 3мг/кг/доба при пероральному введенні. Хоча тебільшість суб'єктів приймають вказані дози кожні рапевтичні дози азатіоприну важко визначити для 2-8 тижнів. Наприклад, IVIG можна вводити в дозі кожного суб'єкта, деякі дані дозволяють передбавід 0,4г/кг протягом декількох днів до 1-2г/кг кожні чити, що показником терапевтичної дози є підви1-4 тижня. щення еритроцитів (MCV). Реакція на лікування Іншим визнаним методом лікування CIDP є може бути отримана більш ніж через 6 місяців. плазмаферез (або заміна плазми). Вважається, Ще одним імунодепресантом, який використощо вказаний метод лікування дозволяє видалити вується в цей час для лікування CIDP, є мікофеноантитіла і комплементи, відповідальні за імуноополят (CellCept), який є проліками для такого імуносередковане ураження периферичних нервів. Пладепресанту як мікофенольна кислота. Вважається, зму видаляють з крові методом, подібним до діаліщо мікофенолят інгібує синтез пурину в лімфоцизу. тах, придушуючи фермент інозинмонофосфатдеЕфективність даного методу, мабуть, аналогігідрогеназу. Типова доза для дорослої людини чна ефективності IVIg при лікуванні CIDP. Потрескладає від 250мг до 3г/добу з можливістю зміни буючим суб'єктам звичайно замінюють плазму три дози в залежності від клінічного ефекту. рази на тиждень протягом перших двох тижнів; Циклоспорин (сандимун, неорал), який є цикпотім частоту лікування визначають по клінічній лічним поліпептидом, що містить 11 амінокислот, реакції. можна також використати для лікування CIDP. Препарат IFN-b можна вводити суб'єкту разом Циклоспорин інгібує першу фазу активації Т-клітин з введенням імунодепресанту, наприклад стероїі не впливає на гуморальний імунітет. Вважається, ду, введенням IVIg і/або виконанням плазмаферещо, придушуючи Т-клітини, циклоспорин може зу. Препарат IFN-b і допоміжний засіб можна ввоінгібувати клітинно-опосередковане ураження нердити одночасно або послідовно. При послідовному вів на сайті запальної/імунної реакції. Циклоспорин введенні допоміжний засіб можна вводити в той починають вводити в дозі 5мг/кг/доба при перораже день або в інші дні. При об'єднанні лікування льному введенні (два рази на день протягом місяпрепаратом IFN-b з плазмаферезом препарат IFNця) і збільшують дозу в залежності від реакції. Неb вводять після виконання плазмаферезу, щоб обхідно контролювати мінімальні і максимальні уникнути виведення препарату IFN-b з організму в рівні для визначення ефективності і щоб уникнути процесі виконання плазмаферезу. При об'єднанні токсичності; хоча спеціально для CIDP не був вилікування препаратом IFN-b з лікуванням IVIg два значений необхідний мінімальний рівень, при імурізних лікарських засоби переважно вводять рознологічних порушеннях нижня межа звичайно додільно з проміжком часу, що дорівнює щонайменрівнює 100-250. ше одній або двом годинам. Іншим імунодепресантом є циклофосфамід В іншому варіанті здійснення винаходу препа(цитоксан), який являє собою антинеопластичний рат IFN-b вводять суб'єктам, не сприйнятливим до агент, що не надає специфічного впливу на певну інших описаних вище методів лікування CIDP. В фазу клітинного циклу, і імунодепресант, діючий як інших ситуаціях препарат IFN-b вводять суб'єктам, алкілуючий агент. Доза вказаного препарату звив яких не виявлена несприйнятливість до інших чайно становить 1-2мг/кг/доба при пероральному методів лікування CIDP. Наприклад, препарат IFNвведенні. b можна вводити суб'єктам, які сприйнятливі до Іншим стандартним методом лікування хворих одного або декількох інших методів лікування. В CIDP є внутрішньовенне введення імуноглобуліну інших варіантах здійснення винаходу препарат (IVIg). Розчин для внутрішньовенного вливання IFN-b вводять суб'єктам, які раніше не зазнавали звичайно в основному містить гетерологічний IgG, ніякого лікування CIDP. Якщо суб'єкт раніше не а також невеликі кількості IgA і IgM. У деяких варізазнавав лікування CIDP, методи лікування препаантах здійснення винаходу розчин для внутрішратом IFN-b можуть спочатку включати виявлення ньовенного введення є гетерогенним по відношену суб'єкта CIDP або імовірність захворювання ню до епітопів, які упізнаються антитілами, CIDP. наприклад, такий розчин не є препаратом антитіЛікування може являти собою наступне: прела, отриманим внаслідок імунізації тварини певпарат IFN-b вводять суб'єкту, що проходить осноним антигеном. Передбачуваний механізм дії таковний курс лікування CIDP, наприклад, препаратом го препарату оснований на тому, що IVIg містить IVIG, при цьому комбіноване лікування продовжудовільні набори антитіл, нейтралізуючих імунні ють протягом певного періоду часу, після закінфактори, що спричиняють ураження перифериччення якого основне лікування CIDP припиняють. ного нерва у випадку CIDP. У середньому поліпОсновне лікування CIDP може бути припинене шення спостерігається на 10-й день і продовжупоступово, наприклад, шляхом зменшення дози ється до 42-го дня. Напівперіод існування і/або частоти проведення основного лікування вказаного препарату в сироватці становить приCIDP. В ілюстративному варіанті здійснення винаблизно 21-29 днів. Потребуючі суб'єкти звичайно ходу суб'єкту вводять IVIG один раз кожні два тижповинні пройти повторні курси лікування через ні або один раз кожні чотири тижні. Потім суб'єкт кожні декілька тижнів або місяців для збереження разом з лікуванням IVIg проходить курс лікування ремісії або лікування рецидивів. Звичайна доза IFN, який включає введення препарату IFN-b один складає від 0,4 до 2г/кг, яку ділять на 5 добових раз на тиждень або на два тижні. Комбіноване лідоз по 400мг/кг. Лікування може бути почате з 39 86749 40 кування може бути продовжене протягом приблиздоставці необхідного препарату IFN-b в організм но 10-20 тижнів, наприклад, протягом приблизно потребуючого суб'єкта. Так, водне середовище 16 тижнів. Під час комбінованого лікування препадля препарату IFN-b може містити нормальний рати IVIg і IFN-b бажано вводити з проміжком часу, фізіологічний розчин (наприклад, 0,9% NaCl, що дорівнює щонайменше 1-3 годинам, напри0,15Μ, ρΗ 7-7,4). Прийнятні розчини для парентеклад, приблизно 2 годинам. Приблизно через 16 рального введення можна отримати будь-якими тижнів основне лікування CIDP припиняють або методами, добре відомими в фармацевтичній гаскорочують. Наприклад, суб'єкту потім вводять лузі, які описані, наприклад, в [публікації менші дози IVIg або попередні дози, але набагато Remington's Pharmaceutical Sciences (Gennaro, Α., рідше. Якщо у суб'єктів не спостерігається поліпed.), Mack Pub., 1990]. шення після припинення або скорочення основноФармацевтичні композиції можуть бути в форго лікування CIDP, можна відновити основне лікумі стерильного препарату для ін'єкцій, наприклад, вання CIDP і продовжити лікування препаратом стерильної ін'єкційної водної або масляної суспенIFN-b. зії. Вказана суспензія може бути отримана методами, відомими в даній галузі, з використанням Препарати IFN-b можна вводити будь-яким прийнятних диспергуючих або змочувальних агенспособом. Наприклад, препарати IFN-b можна затів і суспендуючих агентів. Стерильний препарат стосовувати місцево у вигляді ін'єкції або наносити для ін'єкцій може також являти собою стерильний безпосередньо на уражену тканину або системно, ін'єкційний розчин або суспензію в нетоксичному наприклад, парентерально або перорально. Міспридатному для парентерального введення розріцеве застосування включає, наприклад, введення джувачі або розчиннику, наприклад, розчин в 1,3безпосередньо в уражений м'яз. Парентеральне бутандіолі. Прийнятними наповнювачами і розчинвведення включає аерозолі, підшкірні, внутрішньониками, які можуть бути використані в даному вивенні, внутрішньом'язові, внутрішньосуглобні, внунаході, є вода, розчин Рінгера і ізотонічний розчин трішньочеревинні, внутрішньогрудинні, підоболонхлориду натрію. Крім того, як розчинник або сукові, внутрішньопечінкові, внутрішньосередкові і спендуюче середовище звичайно використовують внутрішньочерепні ін'єкції або вливання. Можна стерильні нелеткі масла. Для вказаної мети можна періодично ін'єктувати ударні дози препарату IFNвикористати будь-яке м'яке нелетке масло, вклюb або проводити більш тривале внутрішньовенне чаючи синтетичні моно- і дигліцериди. Для отриабо внутрішньочеревинне введення із зовнішнього мання препаратів для ін'єкцій можна використати резервуара (наприклад балона для внутрішньожирні кислоти, такі як олеїнова кислота і її гліцевенного вливання) або внутрішнього резервуара ридні похідні, а також природні фармацевтично (наприклад, біорозкладального імплантату або прийнятні масла, такі як оливкова олія або кастоімплантованого насоса). рова олія, зокрема, їх поліоксіетильовані форми. Препарати IFN-b переважно вводять у вигляді Вказані масляні розчини або суспензії можуть тастерильної фармацевтичної композиції, що містить кож містити довголанцюговий спиртовий розріджуфармацевтично прийнятний носій. Термін «носій» вач або диспергатор. в значенні, що використовується тут, означає приФармацевтичні композиції, що містять препайнятні ад'юванти і наповнювачі. рати IFN-b, можна також вводити перорально. НаФармацевтично прийнятні носії, які можуть буприклад, їх можна вводити у вигляді будь-яких ти використані в фармацевтичних композиціях дозованих лікарських форм, прийнятних для перозгідно з даним винаходом, включають, не обмерального введення, які включають, не обмежуюжуючись ними, іонообмінники, оксид алюмінію, чись ними, капсули, таблетки, водні суспензії або стеарат алюмінію, лецитин, сироваткові білки, такі розчини. У випадку таблеток для перорального як сироватковий альбумін людини, буферні речовведення носії, що використовуються, звичайно вини, такі як фосфати, гліцин, сорбінова кислота, включають лактозу і сухий кукурудзяний крохмаль. сорбат калію, суміші неповного гліцериду насичеКрім того, до складу таблеток звичайно додають них рослинних жирних кислот, вода, солі або елекмастильні агенти, такі як стеарат магнію. Прийняттроліти, такі як сульфат проламіну, динатрійгідроні розріджувачі, що використовуються для перорафосфат, калійгідрофосфат, хлорид натрію, солі льного введення у вигляді капсул, звичайно вклюцинку, колоїдний кремнезем, трисилікат магнію, чать лактозу і сухий кукурудзяний крохмаль. Якщо полівінілпіролідон, речовини на целюлозній основі, необхідно отримати водні суспензії для пероральполіетиленгліколь, натрійкарбоксиметилцелюлозу, ного введення, активний інгредієнт об'єднують з поліакрилати, віск, блокспівполімери поліетилену і емульгуючими і суспендуючими агентами. При поліоксипропілену, поліетиленгліколь, ланолін, бажанні можуть бути також додані певні підсолодекстрозу, гліцерин, етанол і тому подібні або їх джувачі, ароматизатори або барвники. Крім того, комбінації. Препарати IFN-b можна отримати у можна також використати черезшкірні пластири вигляді композиції, що містить один або декілька для місцевого застосування. інших білків, що використовуються, наприклад для Фармацевтичні композиції згідно з даним вистабілізації препарату IFN-b. Наприклад, препаранаходом можна також вводити у вигляді аерозолів ти IFN-b можуть бути змішані з альбуміном. або інгаляції в ніс за допомогою розпилювача, При парентеральному введенні препарату інгалятора сухого порошку або дозуючого інгаляIFN-b частину композиції переважно складає водтора. Такі композиції отримують методами, добре ний розчин. Вказаний розчин повинен бути фізіовідомими в фармацевтичній галузі, у вигляді розлогічно прийнятним, щоб не впливати шкідливим чинів в фізіологічному розчині, з використанням чином на електролітний і/або об'ємний баланс при бензилового спирту або інших прийнятних консер 41 86749 42 вантів, стимуляторів абсорбції, що посилюють біонаприклад, близько 3, 6, 9 або 12 ММО в одній логічну доступність, фторвуглеців і/або інших відозі. домих солюбілізуючих або диспергуючих агентів. В одному варіанті здійснення винаходу амінокислотним стабілізуючим агентом є аргінін, який Препарати IFN-b можна вводити у вигляді лівводять в кислій формі (аргінін-НСІ) в розчинах з посомних систем доставки, таких як дрібні однорН близько 5,0. У цьому випадку переважними є шарові пухирці, великі одношарові або багатошаполііонні наповнювачі. Рідка композиція може знарові пухирці. Ліпосоми можуть бути утворені з ходитися в посудині, такій як шприц, в якому поверізних фосфоліпідів, що містять холестерин, стеархня контактування з рідиною покрита матеріалом, риламін або фосфатидилхоліни. У деяких варіанінертним до IFN-b, наприклад, силіконом або політах здійснення винаходу плівку ліпідних компонентів гідратують водним розчином лікарського засобу тетрафторетиленом. Переважні композиції мають для утворення ліпідного шару, що інкапсулює лізначення рН від 4,0 до 7,2. У деяких варіантах карський засіб, як це описано в патенті США здійснення винаходу розчин, що містить стабілізу№5262564. Ліпосоми можуть містити поверхневі ючий агент, не ліофілізують і/або не піддають молекули, які направляють їх в певні клітини або впливу кисневмісного газу під час отримання і тканини. Такі модифіковані ліпосоми можна отризберігання. мати методами, відомими в даній галузі. Буфери з органічними кислотами і фосфатні буфери, призначені для використання в даному IFN-b або їх варіанти можуть бути також пов'явинаході для збереження показника рН в межах зані з розчинними полімерами, що використовувід близько 4,0 до близько 7,2, зокрема, від близьються як носії лікарського засобу, що направлено ко 4,5 до близько 5,5, наприклад 5,0, можуть бути доставляється. Такі полімери можуть включати прийнятними буферами, що отримуються з органіполівінілпіролідон, співполімер пірану, полігідрокчних кислот і їх солей, такими як цитратні буфери сипропілметакриламідофенол, полігідроксіетилас(наприклад, суміш мононатрійцитрату і динатрійпанамідофенол або поліетиленоксидполілизин, цитрату, суміш лимонної кислоти і тринатрійцитразаміщений пальмітоїльними залишками. IFN-b або ту, суміші лимонної кислоти і мононатрійцитрату), їх варіанти можуть бути також пов'язані з білками, сукцинатні буфери (наприклад, суміш янтарної такими як, наприклад, рецепторні білки і альбумін. кислоти і мононатрійсукцинату, суміш янтарної Крім того, IFN-b і їх варіанти можуть бути пов'язані кислоти і гідроксиду натрію, суміш янтарної кислоз біорозкладальними полімерами, що використоти і динатрійсукцинату), тартратні буфери, фумавуються для регульованого вивільнення лікарськоратні буфери, глюконатні буфери, оксалатні буфего засобу, такими як, полімер молочної кислоти, ри, лактатні буфери, фосфатні буфери і ацетатні поліепсилон-капролактон, полігідроксимасляна буфери, описані в заявці WO 98/28007. кислота, поліортоефіри, поліацеталі, полідигідроТипові склади, які можуть бути отримані спопірани, поліціаноакрилати і перехресно зшиті або собами, описаними в заявці WO 98/38007, містять: амфіпатичні блокспівполімери гідрогелів. (і) 20мМ ацетатного буфера з рН 5,0, який пеПрепарат IFN-b може бути також отриманий у реважно не був заздалегідь ліофілізований і місвигляді рідкої композиції, що містить стабілізуючий тить IFN-b і щонайменше один інгредієнт, вибраагент. Стабілізуючий агент може бути присутнім в ний з (а) 150мМ аргінін-НСІ; (b) 100мМ хлориду кількості від близько 0,3% до 5мас.% препарату натрію і 70мМ гліцину; (с) 150мМ аргінін-НСІ і IFN-b. Як стабілізуючий агент можна використати 15мг/мл сироваткового альбуміну людини; (d) амінокислоту, таку як кисла амінокислота (напри150мМ аргінін-НСІ і 0,1% плуронік F-68; (e) 140мМ клад, глутамінова кислота або аспарагінова кислохлориду натрію; (f) 140мМ хлориду натрію і та), аргінін або гліцин. Якщо стабілізуючим аген15мг/мл сироваткового альбуміну людини і (g) том є аргінін-НСІ, його концентрація, переважно, 140мМ хлориду натрію і 0,1% плуронік F-68; знаходиться в межах від 0,5% (мас/об.) до 5% і, (іі) рідина з рН 5,0, яка включає IFN-b або його найбільш переважно дорівнює 3,13% (що еквіваваріант, 170мМ L-глутамінової кислоти і 150мМ лентно 150мМ аргінін-НСІ). Якщо стабілізуючим гідроксиду натрію, причому вказана рідина переагентом є гліцин, його концентрація переважно важно не була заздалегідь ліофілізована; і знаходиться в межах від 0,5% (мас/об.) до 2,0% і (iii) 20мМ фосфатного буфера з рН 7,2, який найбільш переважно дорівнює 0,52% (що еквівапереважно не був заздалегідь ліофілізований і лентно 66,7мМ-266,4мМ і найбільш переважно містить IFN-b і щонайменше один інгредієнт, виб70мМ). Якщо стабілізуючим агентом є глутамінова раний з: (а) 140мМ аргінін-НСІ і (b) 100мМ хлориду кислота, її концентрація переважно знаходиться в натрію і 70мМ гліцину. межах від 100мМ до 200мМ і найбільш переважно Переважні композиції містять також полісордорівнює 170мМ (що еквівалентно 1,47%-2,94% бат, наприклад, 0,005% (мас/об.) полісорбату 20. (мас/об.) і найбільш переважно дорівнює 2,5%). У IFN-b або його варіант можна також вводити деяких варіантах здійснення винаходу концентраразом з розчинним рецептором IFN типу І або його ції препаратів IFN-b в рідких складах знаходяться частиною, такою як IFN-зв'язувальний ланцюг рев межах від близько 30мкг/мл до близько цептора, способом, описаним в патенті США 250мкг/мл, зокрема дорівнює 48-78мкг/мл, напри№6372207. Як указано в даному патенті, введення клад, близько 60мкг/мл. Вказана кількість залеIFN типу І у вигляді комплексу з IFN-зв'язувальним жить, наприклад, від питомої активності конкретноланцюгом рецептора поліпшує стійкість IFN і посиго препарату IFN-b. Дозування звичайно лює дію IFN. Вказаний комплекс може бути комзнаходиться в межах від близько 1 мільйона міжплексом, з'єднаним нековалентним або ковалентнародних одиниць (ММО) до близько 50 ММО, ним зв'язком. 43 86749 44 маси тіла до близько 20мг/кг маси тіла або від Препарати IFN-b можна отримати у вигляді сублизько 1мг/кг маси тіла до близько 3мг/кг маси хого порошку, який може бути солюбілізований тіла. Вказані дози можна вводити з інтервалами в або суспендований, а також не солюбілізований 1-14 днів, наприклад, кожний день, через день, або суспендований до введення потребуючому кожний третій день, кожний п'ятий день, один раз суб'єкту. Зокрема встановлено, що препарати IFNна тиждень або один раз на два тижні. У залежноb, кон'юговані з полімером, наприклад, ПЕГ, є осості від питомої активності препарату IFN-b його бливо стійкими в сухій формі (див., наприклад, можна також вводити в дозі від близько 10 до близаявки WO 00/23114 і PCT/US/95/06008). зько 100мкг/доза, зокрема, від близько 20 до блиОтримані композиції можуть містити терапевзько 50мкг/доза, наприклад, близько 30мкг/доза. тично ефективні кількості препарату IFN-b, тобто При обчисленні в міжнародних одиницях превони можуть містити препарат IFN-b в таких кільпарат IFN-b можна вводити в дозі від близько 1 до костях, які забезпечують відповідні концентрації 30 ММО/доза, зокрема, від 3 до 20 ММО/доза, напрепарату IFN-b в м'язових або інших тканинах приклад, від 3 до 12 ММО. Переважні дози містять протягом періоду часу, достатнього для запобіганблизько 3 ММО, 6 ММО і 12 ММО з розрахунку на ня, придушенню, сповільненню або ослабленню одну дозу. Такі дози переважно вводять приблизпостійної або прогресуючої втрати м'язової функції но один або два рази на тиждень. Дозу, що ввоабо наданню іншої терапевтичної дії. Фахівцям в диться, можна оптимізувати, наприклад шляхом даній галузі повинно бути зрозуміло, що концентвведення препарату IFN-b з подальшим визначенрація препаратів IFN-b в лікарській композиції моням концентрації препарату IFN-b в кровотоці або же змінюватися в залежності від ряду факторів, локальній концентрації. що включають біологічну ефективність вибраного У деяких варіантах здійснення винаходу препрепарату IFN-b, хімічні властивості (наприклад парат IFN-b вводять у вигляді підшкірної ін'єкції, гідрофобність) використовуваного препарату IFNщо забезпечує доставку 0,01-100мкг/кг або, більш b, застосовних наповнювачів, спосіб введення і переважно, 0,01-10мкг/кг IFN-b, наприклад, пегипередбачуваний спосіб лікування, наприклад, ввельованого IFN-b, протягом одного тижня, причому дення препарату IFN-b безпосередньо в тканину дві ін'єкції в дозі 0,005-50мкг/кг або, більш переваабо системне введення. Переважна доза може жно, 0,005-5мкг/кг можна вводити в 0-й період часу також залежати від таких змінних факторів, як стан і через 72 години. Крім того, одним способом патканин суб'єкта, міра втрати м'язової функції і зарентерального введення є імплантація системи з гальний стан здоров'я конкретного суб'єкта. Доза повільним або відстроченим вивільненням лікарможе також залежати від віку, маси тіла, статі, ського засобу, забезпечуючої підтримку постійного загального стану здоров'я, обміну речовин суб'єкрівня дози, яка описана в патенті США № 3710795. та, а також від сприйнятливості суб'єкта до побічДози для перорального введення згідно з даних ефектів і введення препарату IFN-b спільно з ним винаходом, переважно для препаратів пегиіншими лікарськими засобами. Лікуючий лікар або льованого IFN-b, знаходяться в межах близько ветеринар може легко визначити і призначити 0,01-100мкг/кг/доба при пероральному введенні ефективну кількість препарату IFN-b, необхідну або, більш переважно, 0,01-10мкг/кг/доба при педля запобігання, протидії або сповільнення розвироральному введенні. Композиції переважно тку захворювання. отримують в формі рифлених таблеток, що місПризначені дози можна вводити постійно або тять 0,5-5000мкг або, більш переважно, 0,5-500мкг щодня, але в цей час вказані дози переважно ввопрепарату IFN-b. У переважному варіанті здійсдять один, два або три рази на тиждень протягом нення винаходу суб'єкту, страждаючому невропавсього часу збереження задовільної реакції (що тією, наприклад CIDP, препарат IFN-b вводять у вимірюється, наприклад на основі стабілізації і/або вигляді внутрішньом'язових ін'єкцій. Препарат IFNослаблення симптомів захворювання за допомоb можна вводити один раз на тиждень. У більш гою відповідних медичних маркерів і/або індексів переважному варіанті здійснення винаходу препаякості життя). Дози препарату можна вводити ще рідше, наприклад, один раз на місяць. Щоб полеграт IFN-b вводять суб'єкту один раз на тиждень в шити переносимість частих вливань, можна порадозі близько 6 ММО. В інших варіантах здійснення дити імплантувати напівпостійний стент (напривинаходу потребуючому суб'єкту один раз на тижклад, внутрішньовенний, внутрішньочеревинний день вводять близько 6 ММО препарату IFN-b, або внутрішньокапсульний). причому введення необов'язково є внутрішньом'яБудь-які вищезгадані фармацевтичні композизовим. ції можуть містити 0,1-99%, 1-70% або, переважно, У деяких варіантах здійснення винаходу пре1-50% препарати IFN-b як активний інгредієнт. парат IFN-b вводять відповідно до однієї схеми При будь-якому способі введення можна викопротягом певного періоду часу і потім відповідно ристати розділені або однократні дози. Наприклад, до іншої схеми. Наприклад, суб'єкт може приймати препарати IFN-b можна вводити один раз на день препарат IFN-b один раз на тиждень протягом або на тиждень у вигляді однократної дози, або двох місяців і потім два рази на тиждень протягом загальну дозу можна розділити на дві, три або подальших місяців. Препарат можна спочатку чотири дози. вводити підшкірно і потім внутрішньом'язово. ВідПрепарати IFN-b можна вводити в кількості від повідно до інших схем лікування дозу, спосіб ввеблизько 0,001 до близько 100мг/кг маси тіла з роздення або препарат IFN-b змінюють при кожному рахунку на одну дозу, наприклад, від близько 0,1 подальшому введенні. до близько 50мг/кг маси тіла, від близько 0,1мг/кг 45 86749 46 ser, продукують в Е. coli. Вказаний неглікозильоваУ найбільш переважному варіанті здійснення ний IFN-b є менш активним, ніж AVONEXÒ або винаходу IFN-b є препаратом AVONEXÒ. Ò REBIFÒ, які продукують в клітинах СНО. Вказані AVONEX представлений на ринку у вигляді ліопрепарати продають в 250мкг (8 ММО) дозах у філізованого порошку, що має наступний склад: вигляді ліофілізованих і рідких препаратів, признаСклад з розрахунку на 1мл дозу: чених для підшкірних ін'єкцій, що вводяться через 30мкг інтерферону-b-1а (6 мільйонів міжнародних одиниць (ММО)) день. BETAFERONÒ є ще одним комерційно до50мМ фосфату натрію ступним препаратом IFN-b, який можна вводити 100мМ хлориду натрію підшкірно відповідно до інструкцій виробника. 15мг сироваткового альбуміну людини Крім препарату IFN-бета і необов'язково іншорН 7,2 го лікарського засобу потребуючим суб'єктам моПитома активність інтерферону AVONEXÒ жуть бути також призначені лікарські засоби від становить 2x108одиниць/мг, тобто 200 ММО антиневропатичних болів, наприклад антиепілептичні вірусної активності на міліграм білка IFN-b-1a. Позасоби. Двома лікарськими засобами, що найчастребуючий суб'єкт відновлює порошок стерильною тіше використовуються, є габапентин (нейронтин) і водою до виконання внутрішньом'язової ін'єкції в карбамазепін (тегретол). Альтернативно, для ліку1мл дозі один раз на тиждень. AVONEXÒ може вання невропатичних болів можна також використати трициклічні антидепресанти, наприклад, амітбути також отриманий у вигляді рідкого препарату, риптилін (елавіл). що має наступний склад: Протікання хвороби і реакцію на лікарські заСклад з розрахунку на 0,5мл дозу: соби можна контролювати за допомогою клінічних 30мкг IFN-b-1a (6 мільйонів міжнародних одидосліджень і лабораторних аналізів. Ефективність ниць (ММО)) лікування згідно з даним винаходом визначають за 20мМ ацетату (ацетат натрію і оцтова кислота) ослабленням раніше описаних ознак і симптомів 150мМ аргінін-HCl захворювання і по усуненню або значному змен0,005% (мас/об.) полісорбату 20 шенню природних побічних ефектів інтерферону вода для ін'єкцій (тобто симптомів, що нагадують грип, таких як лирН 4,8 хоманка, головний біль, озноб, міалгія, втома і т.д., Препарат може бути упакований в заздалегідь і симптомів, що відносяться до центральної нернаповнений шприц. Потребуючий суб'єкт може вової системи, таких як депресія, парестезія, повикористати шприц вручну або за допомогою авторушення концентрації уваги і т.д.). інжектора. Препарат вводять в кількості 6 ММО Даний винахід далі проілюстрований нижчена(тобто 30мкг) внутрішньом'язово один раз на тижведеними прикладами, які не обмежують об'єм день. винаходу. Зміст всіх приведених посилань (вклюВ іншому варіанті здійснення винаходу IFN-b є чаючи наукові публікації, видані патенти, опублікопрепаратом REBIFÒ, який отримують у вигляді вані заявки на патент) включений в даний опис ліофілізованого порошку або рідкого препарату. винаходу як посилання. Ліофілізований порошок має наступний склад: При здійсненні даного винаходу можна викоСклад з розрахунку на 2,0мл дозу: ристати, за винятком особливо обумовлених виIFN-b-1a в кількості 3 ММО падків, звичайні методи, що застосовуються в біоманіт логії клітини, культивуванні клітин, молекулярній сироватковий альбумін людини (HSA) біології, трансгенній біології, мікробіології, генній ацетат натрію інженерії і імунології, які відомі в даній галузі. Такі РН 5,5 методи всебічно описані в науковій літературі. Питома активність інтерферону REBIFÒ стано[Див., наприклад, нижченаведені публікації: вить 2,7x108одиниць/мг, тобто 270 МО антивірусMolecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. ної активності на міліграм білка IFN-b-1a. Потреby Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring буючий суб'єкт відновлює порошок розчином Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, хлориду натрію (0,9% NaCl) до виконання підшкірVolumes I and II (D.N. Glover ed., 1985); них ін'єкцій три рази на тиждень. Рідкий препарат Oligonucleotide Synthesis (MJ. Gait ed., 1984); Mullis RELIF має наступний склад: et al. патент США №4683195; Nucleic Acid Склад з розрахунку на 0,5мл дозу: Hibridization (B.D. Hames & SJ. Higgins eds. 1984); 6 або 12 ММО IFN-b-1a Transcription and Translation (B.D. Hames & SJ. 4 або 2мг сироваткового альбуміну людини Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R.I. (HSA) Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells 27,3мг маніту And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A 0,4мг ацетату натрію Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the вода для ін'єкцій treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Рідкий препарат, упакований в заздалегідь наInc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian повнений шприц, вводять підшкірно за допомогою Cells (J.H. Miller and M.P. Calos eds., 1987, Cold автоінжектора (Rebiject) або без нього (6 або 12 Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, ММО, що відповідає 66мкг/тиждень або Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical 132мкг/тиждень) 3 рази на тиждень. Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and В іншому варіанті здійснення винаходу IFN-b є Ò Walker, eds., Academic Press, London, 1987); препаратом BETASERON (компанії Berlex), в Handbook Of Experimental Immunology, Volumes Iякому IFN-b, що має мутацію із заміною cys-17 на IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds., 1986); 47 86749 48 комбінованого лікування протягом 16 тижнів, і проManipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor тягом вказаного періоду часу у них оцінюють розLaboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)]. виток хвороби приблизно через кожні чотири тижПриклади ні. У кінці 16-й тижня хворим припиняють вводити Приклад 1. Лікування хворих CIDP препаратом IVIg і продовжують лікування препаратом IFN-b-1a IFN-b-1a відповідно до схеми лікування, що раніше застоХворих CIDP, що проходять курс лікування совувалася. IVIg, переводять на лікування препаратом IFN-b У випробуваних суб'єктів продовжують контнаступним чином. ролювати розвиток хвороби. Якщо суб'єкти відчуСуб'єктів з встановленим діагнозом CIDP, що вали себе краще при комбінованому лікуванні, проходять курс лікування, який включає постійне поновлюють курс лікування IVIg. Потім можна повведення IVIg один раз на два тижні або один раз ступово зменшувати введення IVIg, скорочуючи на чотири тижні, переводять на одну з нижченавекількість або частоту введення IVIg. дених схем введення IFN-b-1a за допомогою внутЕквіваленти рішньом'язових ін'єкцій: 30мкг (6 ММО) AVONEXÒ Фахівці в даній галузі повинні визнати або один раз на тиждень; 30мкг (6 ММО) AVONEXÒ встановити внаслідок звичайного експериментудва рази на тиждень; 60мкг (12 ММО) AVONEXÒ вання наявність багатьох варіантів, еквівалентних один раз на тиждень або 60мкг (12 ММО) конкретним варіантам здійснення винаходу, розAVONEXÒ два рази на тиждень. При введенні IVIg і глянутим в даному описі винаходу. Всі такі еквіваIFN-b-1a в один і той же день обидва препарати ленти входять в наведену нижче формулу винаховводять з проміжком часу, що дорівнює щонаймеду. нше двом годинам. Суб'єкти проходять даний курс 49 86749 50 51 86749 52 53 86749 54 55 86749 56 57 86749 58 59 86749 60