Спосіб біосинтезу l – глутамінової кислоти

Способ биосинтеза L-глутаминовой кислоты путем культивирования Corynebactcnam glutamicum 3144, включающий приготовление посевной среды с использованием мелассы и питатель ных солеи, выращивание посевного материала в инокуляторе и собственно ферментацию в асептических, аэробных условиях с дробным добавлением в ферментер мочевины и источника углерода, отличающийся тем, что стадию выращивания посевного материала совмещают со стадией ферментации и осуществляют в одном аппарате, при этом мелассу, предназначенную для биосинтеза глутаминовой кислоты, делят в соотношении 1 5, в меньшую часть мелассы вносят все количество питательных солей, разбавляют водой до концентрации 4 - 6% сухого вещества и используют для выращивания культуры до достижения фазы замедления роста, после чего остальную часть мелассы вводят в ферментер с периодичностью, обеспечивающей содержание сухих веществ в среде 4 - 6% О Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к микробиологическому синтезу глутаминовой кислоты Известен способ биосинтеза глутаминовой кислоты ( Микробиологическое производство биологически активных веществ и препаратов /В А Быков, И Н Крылов, М Н Манаков и др //Биотехнология, 1987 № 6 ) , предусматривающий получение посевного материала, приготовление питательной среды, ее стерилизацию, охлаждение и засев готовым посевным материалом, выращивание продуцента в ферментере до накопления максимального количества глутаминовой кислоты Процесс биосинтеза ведут на питательной среде с содержанием мелассы до 20%, мочевины до 2% в течение 48 - 52ч и при интенсивной аэрации с расходом воздуха I объем на I объем среды в мин Готовая культуральная жидкость содержит до 45г/дм3 глутаминовой кислоты, выход ее по отношению к потребленным сахарам составляет 45 50% Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ биосинтеза L-глутаминовой кислоты (Еникеев Э Ш Влияние солей фосфора на биосинтез глутаминовой кислоты НТИСС ВНИИСЭНТИ "Передовой производственный опыт в медицинской промышленности рекомендованный для внедрения", 1991, вып 11 - 12, С 1-5), включающий получение посевного материала, приготовление питательной среды, ее стерилизацию, охлаждение и засев готовым посевным материалом, выращивание продуцента и ферментацию с периодической подпиткой источником углерода 50%-ный раствор мелассы и раствором солей фосфора Исходная концентрация мелассы в ферментационной среде составляет 20% В результате применения такого способа биосинтеза глутаминовой кислоты сокращает фазу роста культуры и повышение скорости биосинтеза глутаминовой кислоты Причиной, препятствующей дальнейшему повышению продуктивности процесса по глутаминовой кислоте, является ингибирование культуры избытком питательного субстрата в первые 48 часов ферментации, что снижает выход глутаминовой кислоты и экономический коэффициент использования углеводов и удлиняет продолжительность процесса ферментации Кроме того, высокая концентрация углеводов в среде в сочетании с повышенным содержанием биотина спо 1 го Ю О 20537 собствует увеличению расхода углеводов на построение клеточной биомассы Задачей изобретения является усовершенствование известного способа получения глутаминовои кислоты путем создания оптимальных условий для выращивания культуры Corynebactenum glutamicum 3144 и продуцирования ею целевого продукта Техническим результатом использования предлагаемого изобретения является повышение биосинтетической активности культуры Corynebactenum glutamicum 3144 Потребительские свойства объекта изобретения, связанные с техническим результатом - повышение выхода целевого продукта и снижение его себестоимости за счет уменьшения углеводов на построение бактериальной биомассы Достигается технический результат тем, что в известном способе, включающем приготовление посевной среды с использованием мелассы и питательных солей, выращивание посевного материала в инокуляторе и собственно ферментацию в асептических, аэробных условиях с дробным добавлением в ферментер мочевины и источников углерода, стадию выращивания посевного материала совмещают со стадией ферментации и осуществляют в одном аппарате, при этом мелассу, предназначенную для биосинтеза Lглутаминовой кислоты, делят в соотношении 1 5, в меньшую часть мелассы вносят все количество питательных солей, разбавляют водой до концентрации 4 - 6% сухих веществ и используют для выращивания культуры до достижения фазы замедления роста, после чего остальную часть мелассы вводят в ферментер каждые 3 часа в количестве, обеспечивающем содержание сухих веществ в ферментационной среде 4 - 6% Предложенный в заявленном техническом решении неизвестный в микробиологии прием совмещение в одном аппарате стадии выращивания посевного материала и собственно ферментации обеспечивает возможность приготовления посевной среды в объеме 75 - 80% от рабочего объема ферментера, снижения концентрации углеводов на фоне повышенных концентраций аммонийного азота, ведение подпитки при ферментации концентрированным источником углерода и поддержание концентрации сухих веществ в процессе 4 - 6% Деление мелассы в соотношении 1 5 дает возможность из одной меньшей части приготовить необходимый объем (75 - 80%) мелассного сусла концентрацией 4 - 6%, а рабочий ввод большей части мелассы позволяет поддерживать указанную концентрацию сухих веществ на протяжении всего процесса биосинтеза глутаминовои кислоты Концентрация сусла менее 4 % СВ (2% сахара Технологические Время параметры процесса ферментации, ч Добавление, см'5 рН мелассы мочевины 0 7,0 18 210 75 7,2 ) лимитирует рост культуры недостатком источника углерода и замедляет процесс накопления бактериальной биомассы, повышение концентрации сусла более 6% СВ ведет к непроизводительным потерям сахара на построение биомассы и поддержание жизнедеятельности культуры Концентрация сусла в заявляемых пределах 4 - 6% СВ на стадии выращивания посевного материала и на стадии ферментации является наиболее оптимальной, обеспечивает соотношение углерод-азот в среде 1 8 - 2 0 1, при котором культура находится в состоянии разобщенного роста и поддерживается высокая скорость катаболических реакций синтеза глутаминовои кислоты Использование предложенных микробиологических и технологических приемов и параметров в сочетании с известными позволяет создать оптимальные условия жизнедеятельности продуцента целевого продукта и за счет этого повысить биосинтетическую активность культуры Предлагаемый способ осуществляет следующим образом Для ферментера с рабочим объемом 7,5дм3 и при концентрации сусла 20% СВ берут 2062г мелассы, делят ее в соотношении 375 и 1687г В первую часть ( 375г) вносят все ингредиенты питательной среды и растворяют водой до объема 6,0дм3 и концентрации сухих веществ 4 6% Полученное сусло стерилизуют, засевают культурой Corynebactenum glutamicum 3144 в количестве 2,5об % и ведут ее выращивание в течение 14-18 часов при аэрации один объем воздуха на один объем среды в минуту Через 14 - 18 часов, когда наступает стадия замедления роста и начинается активный синтез глутаминовои кислоты вводят оставшуюся часть мелассы порциями, обеспечивающими содержание сухих веществ в среде 4 - 6% с одновременным внесением мочевины в количестве, обеспечивающем рНстатирование процесса В ходе ферментации контролируют рН среды, содержание сухих веществ, накопление биомассы и содержание глутаминовои кислоты Пример І В ферментере готовят 6,0дм3 посевной среды со всеми ингредиентами и содержанием сухих веществ 5% Полученную среду стерилизуют, засевают культурой Corynebactenum glutamicum 3144 в количестве 2,5об % и ведут ее выращивание в течение 18 часов при аэрации один объем воздуха на один объем среды в минуту Через 18 часов роста начинают вводить оставшуюся часть мелассы порциями по 210г через каждые три часа процесса с одновременным внесением мочевины Показатели, характеризующие процесс биосинтеза глутаминовои кислоты по предлагаемому способу приведены втабл 1 Таблица 1 Биохимические показатели процесса Оптическая плотность 3,5 8,0 Остаточные углеводы, г/дм3 39 27,5 Количество глутаминовои кислоты, г/дм3 2,3 Коэффициент конверсии, % 20537 Продолжение таблицы 1 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48 210 210 210 210 210 210 210 60 30 30 30 30 20 7,0 7,4 7,2 7,1 7,2 7,3 7,2 7,0 7,1 7,0 51,0 55,0 60,0 66,0 68,0 70,0 70,0 70,0 70,0 70,0 25,0 26,0 22,0 23,0 20,0 19,2 13,0 8,6 6,8 4,8 9,7 15,9 17,0 22,7 23,9 26,4 40,9 49,2 57,3 57,6 63,3 Показатели, характеризующие кинетику накопления глутаминовой кислоты и ее содержание в культуральной жидкости по известному и предлагаемому способам приведены в таблице 2 Таблица 2 №№ По известному По предлагаемому Характеристика процесса пп способу способу 1 Концентрация сусла посевной среды, % 10 5 2 Объем посевного материала, % 2,5 75 3 Содержание биомассы в посевном 11,4 11,0 материале, г/дм'5 4 Содержание сухих веществ в ферментационной среде, % на начало ферментации 20 5,0 через 24 часа 18 6,0 через 36 часов 12 6,5 через 48 часов 5,5 5,5 5 Количество глутаминовой кислоты, г/дм'5 через 24 часа ферментации 2,4 12,8 через 36 часов ферментации 25,0 36,9 через 48 часов ферментации 42,8 55,0 Экономический коэффициент использования углеводов на 48 ча6 47,0 57,8 сов, % 5 7 Введено углеводов с подпитками, г/дм' 21,4 21,4 8 Дополнительно получено глутаминовой кислоты, г/дм'5 14,4 14,0 9 Суммарно получено глутаминовой кислоты, г/дм'5 61,4 71,8 10 Продолжительность ферментации, ч 70 62 Экономический коэффициент использования углеводов на конеі. 11 58 65,2 ферментации, % Как видно из данных таблицы 2, при одинаковой продолжительности ферментации предлагаемый способ биосинтеза позволяет увеличить выход глутаминовой кислоты на 12,6% и повысить коэффициент использования углеводов на 10,8% на 48 час ферментации и на 7,2% к 62 часу ферментации по сравнению с известным способом, продолжительность которого составила 70 часов ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна (044) 456 - 20 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71