Вакцина проти респіраторно-репродуктивного синдрому свиней

Вакцина против респираторно-репродуктивного синдрома свиней, содержащая активное вещество и целевые добавки, отличающаяся тем, что в качестве активного вещества она содержит парагриппозные вирусы 2 типа, в частности, штамма SER, в живой, мертвой, ослабленной или полученной путем рекомбинантной технологии форме, целиком или в виде частей или фрагментов, в эффективном количестве. (19) (21) 96103815 (22) 22.02.1995 (24) 16.07.2001 (86) PCT/EP95/00642, 22.02.1995 (31) P 44 07 489.1 (32) 07.03.1994 (33) DE (46) 16.07.2001, Бюл. № 6 , 2001 р. (72) Хайнен Ернст , DE, Шмеєр Норберт , DE, Хербст Вернер , DE (73) БАЙЄР АКЦІЄНГЕЗЕЛЬШАФТ, DE 3 39975 4 виде частей или фрагментов; сов может находиться в смеси с антигенным ма2. Антигенный материал на основе парагриптериалом из других вирусов или бактерий. В капозных вирусов, вызывающих заболевания ресчестве таковых следует назвать: хламиды, в осопираторного и репродуктивного трактов свиней; бенности Chlamydia psittaci и Chlamydia pecorum 3. Способ получения антигенного материала в концентрациях 105-1010 ЕВЕ/доза, Erysipelothrix на основе парагриппозных вирусов, вызывающих rhusiopathiae в концентрациях 107-1012 КВЕ/доза, заболевания респираторного и репродуктивного СРРС-вирусы в концентрациях 104-109 КИД50/дотрактов свиней, отличающийся тем, что парагриза, свиной парвовирус в концентрациях 104-109 ппозные вирусы размножают и антигенный матеКИД50/доза. риал обычным образом изолируют из таким обОсобенно предпочтительна смесь из ПГВ-2 и разом полученных вирусных суспензий; хламид, в особенности Chlamydia psittaci или 4. Применение антигенного материала на осChlamydia pecorum. нове парагриппозных вирусов, вызывающих заВ нижеследующем тексте описания испольболевания респираторного и репродуктивного зуют следующие понятия: трактов свиней, для диагноза и/или предохране— котрансфекция: одновременный перенос ния от этих заболеваний; двух различных последовательностей ДНК в кле5. Применение антигенного материала на остки, в которых могут размножаться вирусы, с ценове парагриппозных вирусов, вызывающих залью индуктировать рекомбинации вируса, котоболевания респираторного и репродуктивного рые содержат последовательности чужеродной трактов свиней, для получения диагностических ДНК. Различными последовательностями ДНК средств с целью установления этих заболеваний являются (1) чужеродная ДНК, которая может и для приготовления вакцин для предохранения быть вставлена в шаттл-векторы, и (2) очищенот этих заболеваний. ный геном векторного вируса; В качестве антигенного материала следует — геномный вектор: живые возбудители, в указать: особенности вирусы, которые пригодны для вста1. Полные, живые вирусные частицы, получавки чужеродной ДНК и инфицируют клетки или емые путем размножения вируса в культурах организмы с помощью вставленной в их геном клеток или эмбрионированных куриных яйцах; чужеродной ДНК или экспрессируют в них чуже2. Полные, живые, ослабленные вирусные родную ДНК; частицы, получаемые путем длительных пасса— иммуногены: пептиды или протеины, котожей вируса в первичных культурах клеток, пермарые в более высшем организме вызывают иммунентных линиях клеток, эмбрионированных птинологическую реакцию и могут экспрессироватьчьих яйцах или подопытных животных с последуся в векторах за счет последовательностей чужеющим размножением в культурах клеток или эмродной ДНК; брионированных куриных яйцах; — клонирование: введение в векторы после3. Полные, умерщвленные вирусные частидовательностей чужеродной ДНК; цы, получаемые обычными способами, как хими— плазмида: экстрахромосомальные, кольческая или физическая инактивация; цеобразные последовательности ДНК, которые 4. части (субъединицы) вирусных частиц, пореплицируются в клетках низших или более выслучаемые из вируса, который размножается в ших организмов; культурах клеток или эмбрионированных куриных — шаттл-вектор: бактериофаги или плазмияйцах; ды, в особенности бактериальные плазмиды, ко5. Части (субъединицы) вирусных частиц, которые содержат вставленную чужеродную ДНК, торые экспрессируются на основании рекомбинафланкированную последовательностью ДНК векнтных генных технологий систем клеток и кототорного вируса; рые в случае необходимости можно отделять от — трансфекция: перенос последовательносних или изолировать из них; тей ДНК в клетки низших или более высших орга6. Вирусные антигены, которые экспрессирунизмов с целью индуцирования рекомбинации ются через векторные системы, причем с помоклеточного генома с введенными последовательщью рекомбинантных генных технологий геном ностями ДНК; вируса или его частивводят в геномные векторы, — векторы: плазмиды, бактериофаги или викак вирусы вакцин, вирусы герпеса, аденовирусы русы, которые в своей генетической информации или другие пригодные векторные системы. содержат последовательности чужеродной ДНК. Предпочтительно применяют парагриппозРазмножение вирусов для получения полных ные вирусы типа 2 (ПГВ-2). живых вирусных частиц осуществляют обычным Особенно предпочтительны ПГВ-2, которые образом, с одной стороны, в культурах тканей изолируют из респираторного или репродуктивклеток животных в качестве первичных клеток ного тракта свиней, у которых обнаруживают поили перманентных линий клеток, например, в добную СРРС симптоматику. Особенно пригоден клетках свиней, обезьян или крупного рогатого штамм ПГВ-2, называемый SER, который депоскота, предпочтительно в клетках почек свиней, нирован 12.06.1993 г. в Национальной коллекции как, например, клонированные, перманентные культур и микроорганизмов (Институт Пастера, клетки почек свиней РК15 (АТСС CCL33 или их Париж, Франция) под номером 1-1331 согласно потомки) или первичные клетки почек свиней Будапештскому Соглашению. ЕРК, или в клетках почек обезьян, как перманентВ предлагаемой согласно изобретению вакные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или цине антигенный материал парагриппозных вируих потомки) или Vero (АТСС CCL81 или их потом 2 5 39975 6 ки), или в клетках почек крупного рогатого скота, мощью центрифугирования с ускорением вплоть как перманентные клетки почек крупного рогатого до 10000 g. скота MDBK (АТСС CCL22 или их потомки), и, с Размножение в эмбрионированных куриных другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют само по себе известным обяйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фиразом в аллантоидной полости инкубационных рма Лохман). куриных яиц, которые предварительно инкубируРазмножение в культурах клеток осуществют в течение 9-12 дней, предпочтительно в течеляют само по себе известным образом в стационие 10 дней, при температуре 37-39°С, предпочнарных роллерных культурах или культурах на тительно 38,5°С, и при относительной влажности носителе в форме сплошных соединений клеток воздуха 30-90 %, предпочтительно 50-60 %, в (монослои) или в суспендированных культурах. В стандартном термостате, предпочтительно в инкачестве сред для размножения клеток использукубаторе. ют любые сами по себе известные среды для Служащие для размножения вирусов инкубакультур клеток, например, описанные в каталоге ционные яйца за 1-3 часа, предпочтительно за 2 продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрачаса до инфицирования помещают в термостат в ссе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности мивертикальном положении на острый конец яйца и нимальная необходимая среда (MEM), которая в затем после подготовки места инъекции инфицикачестве основных составных частей содержит руют с помощью 10-200 мкл, предпочтительно аминокислоты, витамины, соли и углеводы, допо75-25 мкл вирусной суспензии. В вирусной сулняемая буферными веществами, как, например, спензии вирус находится в среде для его размногидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперажения в концентрации 101-107 КИД50/мл (инфекзин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае ционная для 50 % культуры доза на мл суспензии необходимости сыворотками (крови) животных, = степень разбавления, при которой инфицируюкак, например, сыворотки крупного рогатого скотся еще 50 % используемых культур клеток), та, лошадей, соответственно, их плодные сывопредпочтительно 104-105 КИД50/мл. В качестве ротки. Особенно предпочтительно используют среды для размножения вируса используют люминимальную необходимую среду Игла с содербые, сами по себе известные среды для культур жанием гидрокарбоната натрия 0,1-5 г/л, предпоклеток, как, в особенности вышеуказанная миничтительно 0,5-3 г/л, а также плодной телячьей мальная необходимая среда. сыворотки в концентрации 1-30 объемн.%, предИнфицирование и размножение вируса осупочтительно 2-10 объемн.%. ществляют при вышеуказанных условиях инкубаСлужащие для размножения вирусов клетки ции в течение нескольких дней, предпочтительно и расы клеток размножаются обычным образом в течение 2-5 дней, особенно предпочтительно в почти вплоть до слияния или вплоть до оптиматечение 3 дней. льной плотности клеток. Перед их инфицированСодержащую вирус аллантоидную жидкость ием с помощью вирусов предпочтительно удаляполучают путем отсасывания после вскрытия изют среду для размножения клеток и клетки предвестковой скорлупы, а также подскорлуповой почтительно промывают с помощью среды для оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, размножения вируса. В качестве среды для рази можно проводить ее обработку дальше, напримножения вируса используют любые, сами по семер, посредством фильтрации при использовабе известные среды для культур клеток, как в нии фильтров с размерами пор, например, 0,1особенности вышеуказанная минимальная необ0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования ходимая среда. Затем проводят инфицирование при ускорении вплоть до 10000g. с помощью вирусной суспензии. В вирусной суОслабленный, живой вирус получают обычспензии вирус разбавлен в среде для его размным образом путем длительных пассажей и/или ножения так, что происходит инфицирование с переменных пассажей, с одной стороны, в кульМИ (= множественность инфекции, соответствуютурах тканей клеток животных в качестве первичщая соотношению числа инфекционных вирусных клеток или перманентных линий клеток, наных частиц к числу имеющихся клеток), соответспример, в клетках свиней, обезьян или крупного твующей 0,01-50, предпочтительно 0,1-10. рогатого скота, предпочтительно в клетках почек Размножение вирусов осуществляют с добасвиней, как, например, клонированные, перманевкой или без нее сывороток животных. В том слунтные клетки почек свиней РК15 (АТСС CCL33 чае, когда используют сыворотку, ее добавляют к или их потомки) или первичные клетки почек свисреде для размножения в концентрации 1-30 обней ЕРК, или в клетках почек обезьян, как пермаъемн.%, предпочтительно 2-10 объемн.%. нентные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 Инфицирование и размножение вируса осуили их потомки) или Vero (АТСС CCL81 или их ществляют при температурах от комнатной до потомки), или в клетках почек крупного рогатого 40°С, предпочтительно при 32-39°С, особенно скота, как перманентные клетки почек крупного предпочтительно при 37°С, в течение нескольких рогатого скота MDBK (АТСС CCL22 или их потомдней, предпочтительно вплоть до полного разруки), или в клетках почек собак, как перманентные шения инфицированных клеток. клетки почек собак MDCK (АТСС CCL34 или их Содержащую вирус среду инфицированных потомки), и, с другой стороны, в эмбрионированклеток обрабатывают далее, например, путем ных яйцах кур, голубей или уток, предпочтительудаления клеток и остатков клеток посредством но в эмбрионированных куриных яйцах (наприфильтрации при использовании фильтров с размер, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман), мерами пор, например, 0,1-0,45 мкм и/или с поили в подопытных животных, предпочтительно в 3 7 39975 8 маленьких лабораторных животных, например, ние 10 дней, при температуре 37-39°С, предпочкак морские свинки, крысы или мыши, в которых тительно 38,5°С, и при относительной влажности вирус размножается, не вызывая серьезных симвоздуха 30-90 %, предпочтительно 50-60 %, в птомов заболевания. стандартном термостате, предпочтительно в инПассирование в культурах клеток осуществкубаторе. ляют само по себе известным образом в стациоСлужащие для пассирования вирусов инкунарных культурах в форме сплошных соединебационные яйца за 1-3 часа, предпочтительно за ний клеток (монослои). В качестве сред для раз2 часа до инфицирования помещают в термостат множения клеток используют любые сами по сев вертикальном положении на острый конец яйца бе известные среды для культур клеток, наприи затем после подготовки места инъекции инфимер, описанные в каталоге продуктов фирмы Гицируют с помощью 10-200 мкл, предпочтительно бко БРЛ Гмбх, Диезельштрассе 5, 76344, Эггенш75-125 мкл вирусной суспензии. В вирусной сутейн, как в особенности минимальная необходиспензии вирус находится в среде для его размномая среда (MEM), которая в качестве основных жения в концентрации 101-107 КИД50/мл (инфексоставных частей содержит аминокислоты, витационная для 50 % культуры доза на мл суспензии мины, соли и углеводы, дополняемая буферны= степень разбавления, при которой инфицируюми веществами, как, например, гидрокарбонат тся еще 50 % используемых культур клеток), натрия или гидроксиэтилпиперазин-N-2-предпочтительно 104-105 КИД50/мл. В качестве этансульфокислота (Гепес), и в случае необходисреды для размножения вируса используют люмости сыворотками (крови) животных, как, наприбые сами по себе известные среды для культур мер, сыворотки крупного рогатого скота, лошаклеток, как, в особенности вышеуказанная минидей, соответственно, их плодные сыворотки. мальная необходимая среда. Особенно предпочтительно используют минимаИнфицирование и размножение вируса осульную необходимую среду Игла с содержанием ществляют при вышеуказанных условиях инкубагидрокарбоната натрия 0,1-5 г/л, предпочтительции в течение нескольких дней, предпочтительно но 0,5-3 г/л, а также плодной телячьей сыворотки в течение 2-5 дней, особенно предпочтительно в в концентрации 1-30 объемн.%, предпочтительно течение 3 дней. 2-10 объемн.%. Содержащую вирус аллантоидную жидкость Служащие для пассирования вирусов клетки получают путем отсасывания после вскрытия изи расы клеток размножаются обычным образом вестковой скорлупы, а также подскорлуповой почти вплоть до слияния или вплоть до оптимаоболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца. льной плотности клеток. Перед их инфицироваЕе применяют для инфицирования свежих, преднием с помощью вирусов предпочтительно удаварительно инкубированных, эмбрионированных ляют среду для размножения клеток и клетки яиц (последующий пассаж). предпочтительно промывают с помощью среды Пассирование в подопытных животных осудля размножения вируса. В качестве среды для ществляют само по себе известным образом пуразмножения вируса используют любые, сами по тем парентерального введения вирусной суспенсебе известные среды для культур клеток, как в зии и выделения вируса снова из органов и ткаособенности вышеуказанная минимальная необней подопытных животных. ходимая среда. Затем проводят инфицирование Для пассирования в подопытных животных с помощью вирусной суспензии. В вирусной суиспользуют предпочтительно ювенильных, малеспензии вирус разбавлен в среде для его размньких лабораторных животных, которых специаножения так, что происходит инфицирование с льно выращивают в беспатогенных условиях, наМИ (= множественность инфекции, соответствуюпример, как морские свинки (Hsd/Win: DH, фирма щая соотношению числа инфекционных вирусХарлан-Винкельман Гмбх, Борхен), крысы ных частиц к числу имеющихся клеток), соответс(Hsd/Win: WU, фирма Харлан-Винкельман Гмбх, твующей 0,01-50, предпочтительно 0,1-10. Борхен) или мыши (Hsd /Win: NMR 1, фирма ХарРазмножение вирусов осуществляют с добалан-Винкельман Гмбх, Борхен, Бальб/С/ЛСО, вкой или без нее сывороток животных. В том слуИффа Кредо, Бельгия). Подопытных животных чае, когда используют сыворотку, ее добавляют к инфицируют с помощью 0,1-2,0 мл вирусной сусреде для размножения в концентрации 1-30 обспензии парентерально, например, путем чрескоъемн.%, предпочтительно 2-10 объемн.%. жного, внутримышечного, внутриносового, интраИнфицирование и размножение вируса осуперитонеального, внутривенного или подкожного ществляют при температурах от комнатной до введения. В вирусной суспензии вирус в среде 40°С, предпочтительно при 32-39°С, особенно для размножения вируса находится в таком колипредпочтительно при 37°С, в течение нескольких честве, что подопытные животные, смотря по обдней, предпочтительно вплоть до полного разрустоятельствам, получают дозу вируса 101-107 шения инфицированных клеток. КИД50, предпочтительно 103-105 КИД50 (инфекциСодержащую вирус среду инфицированных онная доза для 50 % культур на мл суспензии = клеток применяют для инфицирования свежей степень разбавления, при которой инфицируются культуры клеток (последующее пассирование). еще 50 % используемых культур клеток). В качесПассирование в эмбрионированных куриных тве среды для размножения вируса используют яйцах осуществляют само по себе известным облюбые сами по себе известные среды, как в осоразом в аллантоидной полости инкубационных бенности вышеуказанная минимальная необхокуриных яиц, которые предварительно инкубирудимая среда. ют в течение 9-12 дней, предпочтительно в течеРазмножение вируса осуществляют в тече 4 9 39975 10 ние нескольких дней, предпочтительно в течение другой стороны, в эмбрионированных куриных 1-12 дней. яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фиВирус снова выделяют известным образом рма Лохман). из тканей, предпочтительно из внутренних оргаРазмножение в культурах клеток осуществнов подопытных животных. Для этого у подопытляют само по себе известным образом в стационых животных извлекают внутренние органы, нанарных роллерных культурах или культурах на пример, легкие, печень или селезенку. Из органосителе в форме сплошных соединений клеток нов или частей органов путем механического раз(монослои) или в суспендированных культурах. В мельчения, например, с помощью ножниц и ступкачестве сред для размножения клеток используки, готовят высокодисперсную суспензию в среде ют любые сами по себе известные среды для для размножения вируса, которую обрабатывают культур клеток, например, описанные в каталоге далее, например, путем удаления клеток и остатпродуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезелылтраков клеток посредством фильтрации при испольссе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности мизовании фильтров с размерами пор, например, нимальная необходимая среда (MEM), которая в 0,1-0,45 мкм и/или с помощью центрифугировакачестве основных составных частей содержит ния с ускорением вплоть до 10000 g. В качестве аминокислоты, витамины, соли и углеводы, допосреды для размножения вируса используют люлняемая буферными веществами, как, например, бые, сами по себе известные среды для культур гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпипераклеток, как в особенности вышеуказанная минизин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае мальная необходимая среда. необходимости сыворотками (крови) животных, Полученную, содержащую вирус среду прикак, например, сыворотки крупного рогатого скоменяют для инфицирования новых подопытных та, лошадей, соответственно, их плодные сывоживотных (последующие пассажи). ротки. Особенно предпочтительно используют Процесс последующего пассажа повторяют минимальную необходимую среду Игла с содермногократно, предпочтительно 10-20 раз в одижанием гидрокарбоната натрия 0,1-5 г/л, предпонаковой системе размножения (гомологичные пачтительно 0,5-3 г/л, а также плодной телячьей ссажи) или в различных системах размножения сыворотки в концентрации 1-30 объемн.%, пред(гетерологичные пассажи). почтительно 2-10 объемн.%. Повторный контроль вируса на ослабление Служащие для размножения вирусов клетки осуществляют путем экспериментального инфии расы клеток размножаются обычным образом цирования полностью восприимчивых подопытпочти вплоть до слияния или вплоть до оптиманых животных, предпочтительно свиней, с помольной плотности клеток. Перед их инфицированщью вирусной суспензии, которую получают из ном с помощью вирусов предпочтительно удаляпоследнего пассажа ряда последующих пассают среду для размножения клеток и клетки преджей. почтительно промывают с помощью среды для Если еще появляются типичные симптомы размножения вируса. В качестве среды для раззаболевания, например, выкидыши или рождемножения вируса используют любые, сами по сения мертвых поросят у супоросных свиноматок бе известные среды для культур клеток, как в или респираторные заболевания, то исходя из особенности вышеуказанная минимальная необвирусов последнего последующего пассирования ходимая среда. Затем проводят инфицирование осуществляют дельнейшие гомологичные или гес помощью вирусной суспензии. В вирусной сутерологичные длительные пассирования. спензии вирус разбавлен в среде для его размЕсли более не появляются никакие типичные ножения так, что происходит инфицирование с симптомы заболевания, то вирусы последнего МИ (= множественность инфекции, соответствуюпоследующего пассирования размножают как щая соотношению числа инфекционных вирусописано выше и фильтраты или надосадочные ных частиц к числу имеющихся клеток), соответсжидкости после центрифугирования содержащих твующей 0,01-50, предпочтительно 0,1-10. вирус надосадочных жидкостей культур или алРазмножение вирусов осуществляют с добалантоидных жидкостей применяют для приготоввкой или без нее сывороток животных. В том слуления вакцин. чае, когда используют сыворотку, ее добавляют к Размножение вирусов для получения умерщсреде для размножения в концентрации 1-30 обвленных вирусных частиц осуществляют обычъемн.%, предпочтительно 2-10 объемн.%. ным образом, с одной стороны, в культурах ткаИнфицирование и размножение вируса осуней клеток животных в качестве первичных клеществляют при температурах от комнатной до ток или перманентных линий клеток, например, в 40°С, предпочтительно при 32-39°С, особенно клетках свиней, обезьян или крупного рогатого предпочтительно при 37°С, в течение нескольких скота, предпочтительно в клетках почек свиней, дней, предпочтительно вплоть до полного разрукак, например, клонированные, перманентные шения инфицированных клеток. клетки почек свиней РК15 (АТСС CCL33 или их Содержащую вирус среду инфицированных потомки) или первичные клетки почек свиней клеток обрабатывают далее, например, путем ЕРК, или в клетках почек обезьян, как перманентудаления клеток и остатков клеток посредством ные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или фильтрации при использовании фильтров с разих потомки) или Vero (АТСС CCL81 или их потоммерами пор, например, 0,1-0,45 мкм и/или с поки), или в клетках почек крупного рогатого скота, мощью центрифугирования с ускорением вплоть как перманентные клетки почек крупного рогатого до 10000 g. скота MDBK (АТСС CCL22 или их потомки), и, с Размножение в эмбрионированных куриных 5 11 39975 12 яйцах осуществляют само по себе известным обИнактивацию осуществляют при 4-40°С, разом в аллантоидной полости инкубационных предпочтительно при 23-37°С, особенно предпокуриных яиц, которые предварительно инкубиручтительно при 36-37°С, в течение 6-48 часов, ют в течение 9-12 дней, предпочтительно в течепредпочтительно 16-20 часов. ние 10 дней, при температуре 37-39°С, предпочПосле окончания инактивации избыточный тительно 38,5°С, и при относительной влажности 2-бром-этиламин-гидрохлорид нейтрализуют пувоздуха 30-90 %, предпочтительно 50-60 %, в тем добавки гидролизующих агентов. Для этой стандартном термостате, предпочтительно в инцели пригоден в особенности тиосульфат накубаторе. трия, который добавляют в конечной концентраСлужащие для размножения вирусов инкубации 40-80 ммоль/л, предпочтительно 50 ммоль/л. ционные яйца за 1-3 часа, предпочтительно за 2 Нейтрализацию проводят при 4-40°С, предпочтичаса до инфицирования помещают в термостат в тельно при 2-8°С, в течение 2-16 часов, предпочвертикальном положении на острый конец яйца и тительно 4-8 часов. затем после подготовки места инъекции инфициРазмножение вирусов для получения субъеруют с помощью 10-200 мкл, предпочтительно диниц осуществляют обычным образом, с одной 75-125 мкл вирусной суспензии. В вирусной сустороны, в культурах тканей клеток животных в спензии вирус находится в среде для его размнокачестве первичных клеток или перманентных жения в концентрации 101-107 КИД50/мл (инфеклиний клеток, например, в клетках свиней, обезционная для 50 % культуры доза на мл суспензии ьян или крупного рогатого скота, предпочтитель= степень разбавления, при которой инфицируюно в клетках почек свиней, как, например, клонится еще 50 % используемых культур клеток), рованные, перманентные клетки почек свиней предпочтительно 104-105 КИД50/мл. В качестве РК15 (АТСС CCL33 или их потомки) или первичсреды для размножения вируса используют люные клетки почек свиней ЕРК, или в клетках побые сами по себе известные среды для культур чек обезьян, как перманентные клетки почек клеток, как, в особенности вышеуказанная миниобезьян BGM (Flow 03-240 или их потомки) или мальная необходимая среда. Vero (АТСС CCL81 или их потомки), или в клетИнфицирование и размножение вируса осуках почек крупного рогатого скота, как перманентществляют при вышеуказанных условиях инкубаные клетки почек крупного рогатого скота MDBK ции в течение нескольких дней, предпочтительно (АТСС CCL22 или их потомки), и, с другой сторов течение 2-5 дней, особенно предпочтительно в ны, в эмбрионированных куриных яйцах (напритечение 3 дней. мер, Вало-инкубационные яйца, фирма Лохман). Содержащую вирус аллантоидную жидкость Размножение в культурах клеток осуществполучают путем отсасывания после вскрытия изляют само по себе известным образом в стациовестковой скорлупы, а также подскорлуповой нарных роллерных культурах или культурах на оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, носителе в форме сплошных соединений клеток и можно проводить ее обработку дальше, напри(монослои) или в суспендированных культурах. В мер, посредством фильтрации при использовакачестве сред для размножения клеток использунии фильтров с размерами пор, например, 0,1ют любые сами по себе известные среды для 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования культур клеток, например, описанные в каталоге при ускорении вплоть до 10000 g. продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, ДиезельштраИнактивацию вируса осуществляют обычным ссе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности миобразом с помощью физических способов, нанимальная необходимая среда (MEM), которая в пример, путем воздействия нагрева, ультрафиокачестве основных составных частей содержит аминокислоты, витамины, соли и углеводы, дополетового или g-облучения, или предпочтительно лняемая буферными веществами, как, например, с помощью химических способов, например, пугидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиператем воздействия этанола, формальдегида, b-прозин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае пиолактона и предпочтительно с помощью этиленеобходимости сыворотками (крови) животных, наминов. как, например, сыворотки крупного рогатого скоХимическую инактивацию осуществляют сата, лошадей, соответственно, их плодные сывомо по себе известным образом в пригодных реакротки. Особенно предпочтительно используют ционных сосудах, которые оснащены устройстминимальную необходимую среду Игла с содервом для поддерживания постоянной реакционной жанием гидрокарбоната натрия 0,1-5 г/л, предпотемпературы, а также для постоянного движения чтительно 0,5-3 г/л, а также плодной телячьей реакционной смеси (например, ферментер). В касыворотки в концентрации 1-30 объемн.%, предчестве инактивирующего средства используют почтительно 2-10 объемн.%. предпочтительно этиленамины, особенно предСлужащие для размножения вирусов клетки почтительно 2-бром-этиламин-гидробромид (2и расы клеток размножаются обычным образом БЭА) в концентрации 1-10 ммоль/л, предпочтитепочти вплоть до слияния или вплоть до оптимально 2,5-7,5 ммоль/л. льной плотности клеток. Перед их инфицироваПеред добавкой раствора 2-бром-этиламин-нием с помощью вирусов предпочтительно удагидрохлорида в вирусной суспензии с концентраляют среду для размножения клеток и клетки цией 104,0-109,0 КИД50/мл, предпочтительно 105,0предпочтительно промывают с помощью среды 108,0 КИД50/мл, которую получают из одного или для размножения вируса. В качестве среды для нескольких процессов размножения вируса, устаразмножения вируса используют любые, сами по навливают значение рН, равное 8,1-8,7, предпочсебе известные среды для культур клеток, как в тительно 8,3-8,5. 6 13 39975 14 особенности вышеуказанная минимальная необ0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования ходимая среда. Затем проводят инфицирование при ускорении вплоть до 10000 g. с помощью вирусной суспензии. В вирусной суВирус выделяют путем изопикнического или спензии вирус разбавлен в среде для его размзонального центрифугирования, например, с граножения так, что происходит инфицирование с диентами плотности сахарозы. Для этой цели соМИ (= множественность инфекции, соответствуюдержащую вирус среду, соответственно, алланщая соотношению числа инфекционных вирустоидную жидкость после удаления остатков кленых частиц к числу имеющихся клеток), соответсток подвергают зональному центрифугированию твующей 0,01-50, предпочтительно 0,1-10. с ускорением 100000 g вплоть до седиментации Размножение вирусов осуществляют с добавирусных частиц. В более чистом виде вирусные вкой или без нее сывороток животных. В том случастицы получают путем зонального центрифугичае, когда используют сыворотку, ее добавляют к рования в водном растворе с более высокой плосреде для размножения в концентрации 1-30 обтностью, чем содержащая вирус среда. В качестъемн.%, предпочтительно 2-10 объемн.%. ве водного раствора может служить, например, Инфицирование и размножение вируса осу30-60 % масс., предпочтительно 35-50 % масс. ществляют при температурах от комнатной до буферированный раствор сахарозы. Еще более 40°С, предпочтительно при 32-39°С, особенно высокой степени чистоты достигают путем предпочтительно при 37°С, в течение нескольких центрифугирования с градиентом плотности. Для дней, предпочтительно вплоть до полного разруэтой цели освобожденный от клеток и остатков шения инфицированных клеток. клеток, сконцентрированный с помощью зональСодержащую вирус среду инфицированных ного центрифугирования вирус выделяют путем клеток обрабатывают далее, например, путем изопикнического или зонального центрифугироудаления клеток и остатков клеток посредством вания с градиентом плотности, например, 30-50 фильтрации при использовании фильтров с раз% масс. сахарозы в буферированном водном рамерами пор, например, 0,1-0,45 мкм и/или с постворе при ускорении центрифугирования, намощью центрифугирования с ускорением вплоть пример, 100000-150000 g. до 10000 g. Таким образом, полученные вирусные концеРазмножение в эмбрионированных куриных нтраты обрабатывают детергентами. яйцах осуществляют само по себе известным обПригодными детергентами являются: аниоразом в аллантоидной полости инкубационных ноактивные поверхностно-активные агенты, как куриных яиц, которые предварительно инкубирулаурилсульфат натрия, сульфаты простых эфиют в течение 9-12 дней, предпочтительно в течеров спиртов жирного ряда, моноэтаноламинная ние 10 дней, при температуре 37-39°С, предпочсоль сложного эфира ортофосфорной кислоты и тительно 38,5°С, и при относительной влажности простого моно-/ди-алкилполигликолевого эфира, воздуха 30-90 %, предпочтительно 50-60 %, в алкиларилсульфонат кальция, дезоксихолят настандартном термостате, предпочтительно в интрия; катионоактивные поверхностно-активные кубаторе. агенты, как цетилтриметиламмонийхлорид; амСлужащие для размножения вирусов инкубафотерные поверхностно-активные агенты, как ционные яйца за 1-3 часа, предпочтительно за 2 ди-натрий-N-лаурилиминодипропионат или лецичаса до инфицирования помещают в термостат в тин; неионные поверхностно-активные агенты, вертикальном положении на острый конец яйца и например, полиоксиэтилированное касторовое затем после подготовки места инъекции инфицимасло, полиоксиэтилированный сорбитан-монооруют с помощью 10-200 мкл, предпочтительно леат, сорбитан-моностеарат, глицеринмоностеа75-125 мкл вирусной суспензии. В вирусной сурат, полиоксиэтиленстеарат, алкилфенолполигспензии вирус находится в среде для его размноликолевый простой эфир. жения в концентрации 101-107 КИД50/мл (инфекПредпочтительно следует назвать следуюционная для 50 % культуры доза на мл суспензии щие неионные детергенты: неионные, водораст= степень разбавления, при которой инфицируюворимые эмульгаторы с ГЛБ (значение гидрофится еще 50 % используемых культур клеток), льно-липофильного баланса) более 10, наприпредпочтительно 104-105 КИД50/мл. В качестве мер, эмульгатор НП 40 (Байер АГ), алкиларилпосреды для размножения вируса используют люлигликолевый простой эфир; Ренекс 678 (Атлас бые сами по себе известные среды для культур Кемикал Индастри), полиоксиэтиленалкиларилоклеток, как, в особенности вышеуказанная минивый простой эфир; Твин 20 (Атлас), полиоксиэтимальная необходимая среда. ленсорбитанмонопальмитат; Майри 53 (Атлас), Инфицирование и размножение вируса осуполиоксиэтиленстеарат; Атлас Г 3707, полиоксиществляют при вышеуказанных условиях инкубаэтиленлауриловый простой эфир; Атлас Г 3920, ции в течение нескольких дней, предпочтительно полиоксиэтиленолеиловый простой эфир; Атлас в течение 2-5 дней, особенно предпочтительно в Г 9046 Т, полиоксиэтиленманнитанмонолаурат; течение 3 дней. эмульгатор 1371 Б (Байер АГ), алкилполигликоСодержащую вирус аллантоидную жидкость левый простой эфир; эмульгатор 1736 (Байер получают путем отсасывания после вскрытия изАГ), алкилполигликолевый простой эфир (олеилвестковой скорлупы, а также подскорлуповой полигликолевый простой эфир); эмульгатор ОКС оболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, (Байер АГ), алкилполигликолевый простой эфир и можно проводить ее обработку дальше, напри(додецилполигликолевый простой эфир); Нинокс мер, посредством фильтрации при использоваБМ-2 (Стэпан Кемикал Ко.), этоксиэтилированнии фильтров с размерами пор, например, 0,1ный нонилфенол; Тритон Х-100 (Ром и Хаас Ко.), 7 15 39975 16 изооктилфенолполиэтоксиэтанол; Кремофор ЕЛ, ция стабилизирующих лектин солей известна из Нонидет П 40 (Шелл). уровня техники и специфична для используемых Детергенты применяют в виде водных разбалектинов. Сверх того, лектиновый раствор, леквленных растворов. Следует указать растворы с тиновую суспензию или лектиновый гель смешиконцентрацией 0,1-10 объемн.%, предпочтительвают с используемым для обработки лизатов дено 0,5-5 объемн.%. особенно предпочтительно тергентом в такой же концентрации, так что лизат примерно 1 объемн.% детергента. и лектиновый раствор имеют одинаковые конценРаствор детергента добавляют к вирусному трации соли и детергента. концентрату в объемном соотношении примерно Применяют примерно 1-150 мг, предпочтитеот 1:1 до примерно 10:1. Предпочтительно соотльно 1-50 мг, особенно предпочтительно 5-20 мг, ношение раствора детергента к вирусному концечистого лектина на мл раствора, суспензии или нтрату составляет примерно 3:1. геля. К лизату добавляют столько этого раствоОбработку детергентом осуществляют при ра, суспензии или геля лектина, чтобы на мг обпостоянном перемешивании смеси при темперащего количества протеина приходилось 0,01турах от 0°С до примерно 24°С, предпочтительно 50 мг, предпочтительно 0,1-20 мг, особенно предпри 2-8°С. Обработка детергентом продолжается почтительно 0,5-5 мг лектина. Обработку лектиот 15 минут до 2 дней, предпочтительно в теченом осуществляют при температуре от 0°С до ние 6-18 часов. Для улучшения обработки детерпримерно 24°С, предпочтительно при 2-8°С, в тегентом смесь можно дополнительно подвергать чение времени примерно от 10 минут до 3 дней, ультразвуковой обработке. предпочтительно в течение времени от 1 часа до Нерастворившиеся при этой обработке час2 дней. тицы удаляют, предпочтительно путем фильтраРеакцию лектинов с гликопротеинами также ции или центрифугирования, например, при можно проводить с помощью колоночной хрома150000 g. Таким образом полученный фильтрат, тографии, причем лизат вводят в контакт с лектисоответственно, надосадочную жидкость после ном, иммобилизированным на гелеобразной матцентрифугирования можно хранить вплоть до ее рице в хромотографической колонке. дальнейшей переработки при низких температуКомплекс гликопротеина с лектином обычрах (от 0°С до -70°С). ным образом отделяют от общего количества раСодержащиеся в лизате гликопротеины вируствора или суспензии. Это можно осуществлять сных частиц выделяют путем обработки с помопутем центрифугирования, фильтрации или в щью лектинов. Лектины представляют собой прослучае хроматографии — путем промывок. теины или гликопротеины из растений, особенно В полученных по этим способам суспензиях их семян, микроорганизмов, позвоночных и бесили гелях, которые содержат комплексы лектина позвоночных, которые специфически связывают с гликопротеином, путем фильтрации, центрифусахара и их конъюгаты. Применяют пектины, когирования, диализа или других процессов промыторые распознают и связывают гликопротеины из вки можно изменять концентрацию детергента парамиксовирусов. Предпочтительно применяют и/или соли в физиологически приемлемой обласлектины, которые распознают маннозу и/или глюти или вплоть до удаления. козу, а также их конъюгаты. В частности, следует Таким образом полученные суспензии или назвать лектины из Canavalia ensiformis, Lens гели комплексов лектина с гликопротеином можculinaris, Lathygros odoratus, Pisum sativum, Vicia но применять непосредственно в качестве антиfaba, Sambucus nigra, Glycine max, Ulex генного материала. В зависимости от содержаeuropaens, Helix promatia, Phytolacca americana, ния связанного с лектином гликопротеина их моLycopersicon esculentum, Datura stramonium, жно далее концентрировать или разбавлять. Bandeiraea simplicifolia. Суспензии или гели комплексов пектина с Лектины используют в водорастворимой и гликопротеином можно хранить при температунерастворимой в воде форме. В нерастворимой рах ниже 8°С. Их также можно подвергать сушке в воде форме их предпочтительно иммобилизивымораживанием. руют за счет связывания с инертной матрицей, Из полученных суспензий или гелей комплеккак, например, декстраны, агарозы, целлюлозы, сов лектина с гликопротеином можно выделять используемые в виде суспензий. В частности, гликопротеины для получения антигенного матеследует назвать конканавалин-А-агарозу, конкариала. Для этой цели суспензии или гели обрабанавалин-А-сефарозу, лентил-лектин-сефарозу, тывают содержащим соль водным раствором саагароза-лектин из пшеничных зерен, Helix хара. pomatia-лектин-сефарозу. Род используемого сахара выбирают в завиЛектины используют в виде содержащего десимости от специфичности применяемых лектитергент и соль раствора, суспензии или геля. Для нов. Концентрация сахара составляет 0,1этой цели как лизат, так и также используемый 1 моль/л, предпочтительно 0,1-0,5 моль/л, осолектиновый раствор, лектиновую суспензию или бенно предпочтительно 0,3-0,5 моль/л. Концентлектиновый гель предварительно смешивают с рация и состав соли соответствует таковым сотаким количеством хлорида натрия, а также изведержащих гликопротеин-лектиновый комплекс стных, стабилизирующих лектин солей, чтобы суспензий или гелей. концентрация хлорида натрия составляла 0,5-2, Обработку раствором сахара осуществляют предпочтительно 0,7-1,2 моль/л. Установление при температуре от 0°С до примерно 24°С, предконцентрации лизатов осуществляют предпочтипочтительно при 2-8°С. Обработка занимает вретельно путем диализа. Необходимая концентрамя от примерно 15 минут до 4 дней, предпочтите 8 17 39975 18 льно от 1 часа до 2 дней, особенно предпочтитепочти вплоть до слияния или вплоть до оптимально 10-24 часа. льной плотности клеток. Перед их инфицироваЭлюированные при этом гликопротеины отнием с помощью вирусов предпочтительно удаделяют от лектинов путем центрифугирования, ляют среду для размножения клеток и клетки фильтрации или других обычных способов разпредпочтительно промывают с помощью среды деления (например, хроматографии). В получендля размножения вируса. В качестве среды для ных в результате препаратах концентрации детеразмножения вируса используют любые, сами по ргента, соли и сахара можно изменять описансебе известные среды для культур клеток, как в ным уже выше образом. особенности вышеуказанная минимальная необТаким образом полученные выделенные глиходимая среда. Затем проводят инфицирование копротеины можно применять в качестве антис помощью вирусной суспензии. В вирусной сугенного материала. Содержание гликопротеина спензии вирус разбавлен в среде для его размможно изменять путем концентрирования или раножения так, что происходит инфицирование с збавления. МИ (= множественность инфекции, соответствуюХранение препаратов осуществляют в виде щая соотношению числа инфекционных вирусих растворов при температурах ниже 0°С или в ных частиц к числу имеющихся клеток), соответслиофилизированной форме. твующей 0,01-50, предпочтительно 0,1-10. Для получения субъединиц вирусных частиц Размножение вирусов осуществляют с добарекомбинантным путем сначала получают вирусвкой или без нее сывороток животных. В том слуный геном. чае, когда используют сыворотку, ее добавляют к Для получения вирусного генома сначала среде для размножения в концентрации 1-30 обосуществляют размножение вирусов обычным ъемн.%, предпочтительно 2-10 объемн.%. образом, с одной стороны, в культурах тканей Инфицирование и размножение вируса осуклеток животных в качестве первичных клеток ществляют при температурах от комнатной до или перманентных линий клеток, например, в 40°С, предпочтительно при 32-39°С, особенно клетках свиней, обезьян или крупного рогатого предпочтительно при 37°С, в течение нескольких скота, предпочтительно в клетках почек свиней, дней, предпочтительно вплоть до полного разрукак, например, клонированные, перманентные шения инфицированных клеток. клетки почек свиней РК15 (АТСС CCL33 или их Содержащую вирус среду инфицированных потомки) или первичные клетки почек свиней клеток обрабатывают далее, например, путем ЕРК, или в клетках почек обезьян, как перманентудаления клеток и остатков клеток посредством ные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или фильтрации при использовании фильтров с разих потомки) или Vero (АТСС CCL81 или их потоммерами пор, например, 0,1-0,45 мкм и/или с поки), или в клетках почек крупного рогатого скота, мощью центрифугирования с ускорением вплоть как перманентные клетки почек крупного рогатого до 10000 g. скота MDBK (АТСС CCL22 или их потомки), и, с Размножение в эмбрионированных куриных другой стороны, в эмбрионированных куриных яйцах осуществляют само по себе известным обяйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фиразом в аллантоидной полости инкубационных рма Лохман). куриных яиц, которые предварительно инкубируРазмножение в культурах клеток осуществют в течение 9-12 дней, предпочтительно в течеляют само по себе известным образом в стационие 10 дней, при температуре 37-39°С, предпочнарных роллерных культурах или культурах на тительно 38,5°С, и при относительной влажности носителе в форме сплошных соединений клеток воздуха 30-90 %, предпочтительно 50-60 %, в (монослои) или в суспендированных культурах. В стандартном термостате, предпочтительно в инкачестве сред для размножения клеток использукубаторе. ют любые сами по себе известные среды для Служащие для размножения вирусов инкубакультур клеток, например, описанные в каталоге ционные яйца за 1-3 часа, предпочтительно за 2 продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштрачаса до инфицирования помещают в термостат в ссе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности мивертикальном положении на острый конец яйца и нимальная необходимая среда (MEM), которая в затем после подготовки места инъекции инфицикачестве основных составных частей содержит руют с помощью 10-200 мкл, предпочтительно аминокислоты, витамины, соли и углеводы, допо75-125 мкл вирусной суспензии. В вирусной сулняемая буферными веществами, как, например, спензии вирус находится в среде для его размногидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпиперажения в концентрации 101-107 КИД50/мл (инфекзин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае ционная для 50 % культуры доза на мл суспензии необходимости сыворотками (крови) животных, = степень разбавления, при которой инфицируюкак, например, сыворотки крупного рогатого скотся еще 50 % используемых культур клеток), та, лошадей, соответственно, их плодные сывопредпочтительно 104-105 КИД50/мл. В качестве ротки. Особенно предпочтительно используют среды для размножения вируса используют люминимальную необходимую среду Игла с содербые сами по себе известные среды для культур жанием гидрокарбоната натрия 0,1-5 г/л, предпоклеток, как, в особенности вышеуказанная миничтительно 0,5-3 г/л, а также плодной телячьей мальная необходимая среда. сыворотки в концентрации 1-30 объемн.%, предИнфицирование и размножение вируса осупочтительно 2-10 объемн.%. ществляют при вышеуказанных условиях инкубаСлужащие для размножения вирусов клетки ции в течение нескольких дней, предпочтительно и расы клеток размножаются обычным образом в течение 2-5 дней, особенно предпочтительно в 9 19 39975 20 течение 3 дней. Предпочтительны рН-значения 6-8,5, особенно Содержащую вирус аллантоидную жидкость предпочтительны 7-8. получают путем отсасывания после вскрытия изВ качестве рибонуклеазных ингибиторов слувестковой скорлупы, а также подскорлуповой жат, например, рибонуклеозид-ванадильные комоболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, плексы, протеиновые ингибиторы (например, и можно проводить ее обработку дальше, наприРНК guard/Фармациа) или предпочтительно диэмер, посредством фильтрации при использоватилпирокарбонат (ДЭПК), в концентрациях 0,01-2 нии фильтров с размерами пор, например, 0,1объемн.%, предпочтительно 0,1-0,5 объемн.%. 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования Липофильные вещества вирусных лизатов при ускорении вплоть до 10000 g. затем экстрагируют растворителем, как, наприОчистки, соответственно, выделения вируса мер, фенол, хлороформ или их смеси. Экстракдостигают путем изопикнического или зонального цию осуществляют в одну или несколько стадий. центрифугирования, например, с градиентами В остающейся водной фазе РНК осаждают с плотности сахарозы. Для этой цели содержащую помощью водных растворов, которые содержат вирус среду, соответственно, аллантоидную жидспирты, как, например, этанол или изопропанол, кость после удаления остатков клеток подвергаили хлориды или ацетаты одновалентных метают зональному центрифугированию с ускорением ллов, как, например, хлорид натрия, ацетат на100000 g вплоть до седиментации вирусных частрия или ацетат калия. тиц. В более чистом виде вирусные частицы поКонцентрация спиртов составляет 40-100 облучают путем зонального центрифугирования в ъемн.%, предпочтительно 60-80 объемн.%, а конводном растворе с более высокой плотностью, центрация хлоридов или ацетатов составляет чем содержащая вирус среда. В качестве водно0,01-1 моль/л, предпочтительно 0,1-0,8 моль/л. го раствора может служить, например, 30-60 % Осадившуюся РНК отделяют от водного расмасс., предпочтительно 35-50 % масс. буфериротвора, например, путем центрифугирования и ванный раствор сахарозы. Еще более высокой снова растворяют в водном растворе, например, степени чистоты достигают путем центрифугироводном растворе диэтилпирокарбоната. Этот вования с градиентом плотности. Для этой цели дный раствор содержит предпочтительно буферосвобожденный от клеток и остатков клеток, сконые вещества, как, например, трис(гидроксименцентрированный с помощью зонального центритил)аминометан, в концентрациях 1-100 ммоль/л, фугирования вирус выделяют путем изопикничепредпочтительно 10-50 ммоль/л, возможно при ского или зонального центрифугирования с градобавке этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в диентом плотности, например, 30-50 % масс. саконцентрациях 0,1-10 ммоль/л, предпочтительно харозы в буферированном водном растворе при 1-10 ммоль/л, или дитиотреита в концентрациях ускорении центрифугирования, например, 0,1-10 ммоль/л, предпочтительно 1-10 ммоль/л. 100000-150000 g. Выделенную РНК хранят при температурах Для получения пригодных генов, которые ниже -65°С. кодируют иммуногенные протеины, сначала выДругим методом выделения РНК является, деляют вирусный геном из очищенных вирусных например, экстракция РНК с помощью гуанидичастиц. Природную вирусную рибонуклеиновую нийтиоцианата и последующее центрифугировакислоту (РНК) предпочтительно получают путем ние вирусного лизата с градиентом плотности обработки очищенных вирусных частиц содерхлорида цезия. жащими детергенты и протеазы водными растМетоды выделения РНК описываются ворами. J. Sambrook, E.F. Fritsh и Т. Maniatis, Molecular Используют анионные, катионные, амфотерCloning, Лабораторное руководство, второе изданые и неионные детергенты. Предпочтительно ние, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. применяют ионные детергенты, предпочтительно Идентифицирование пригодных генов осущедодецилсульфат натрия, в концентрации 0,1-10 ствляют при применении выделенного вирусного объемн.%, предпочтительно 0,5-3 объемн.%. генома, например, следующими путями: В качестве протеаз используют такие, котоа) гибридизация РНК/ДНК (дезоксирибонукрые эффективны в присутствии детергентов, леиновая кислота) генома при применении извескак, например, проназа, и предпочтительно истных генных зондов. В качестве пригодных генпользуют протеиназу К. Протеазы применяют в ных зондов служат ДНК-зонды с нуклеотидными концентрации 0,01-10 мг/мл, предпочтительно последовательностями известных генов для им0,05-0,5 мг/мл. муногенов родственных вирусных штаммов, как, Предпочтительно применяют водные, буфенапример, обезьяний вирус 5 или собачий парагрированные растворы с добавкой рибонуклеазриппозный вирус 2; ных ингибиторов. б) получение комплементарной ДНК (кДНК), В качестве буферных веществ применяют клонирование кДНК, например, в бактериальных соли слабых кислот с сильными основаниями, плазмидах, как, например, pBR 322, для накоплекак, например, трис(гидроксиметил)аминометан, ния вирусной ДНК и гибридизация клонировансоли сильных кислот со слабыми основаниями, ной ДНК с помощью известных генных зондов. В как, например, первичные фосфаты или их смекачестве пригодныхгенных зондов служат ДНКси. Предпочтительно применяют трис(гидроксизонды с нуклеотидными последовательностями метил)аминометан. Буферные вещества испольизвестных генов для иммуногенов родственных зуют в концентрациях, обеспечивающих рН-знавирусных штаммов, как, например, обезьяний вичение, при котором РНК не денатурируется. рус 5 или собачий парагриппозный вирус 2; 10 21 39975 22 гуляторные элементы для экспрессии чужеродв) получение комплементарной ДНК (кДНК) ной ДНК в клетках более высших организмов. и клонирование кДНК в плазмидных экспрессиПригодными плазмидными экспрессирующирующих векторах, как, например, pUC18/19 или ми векторами являются, например, плазмидные pUC118/119, или в l-бактериофаговых экспресвекторы на основе ОВ40, как pMSG, pSVT7 или сирующих векторах, как, например, lgtII и его рМТ2, или плазмидные векторы на основе вируса потомки или lZAP или lORF8. Идентификацию Эпстайна-Барра, как рНЕВо или р205. генов осуществляют путем обнаружения их эксКлонированную ДНК выделяют и очищают с прессированных иммуногенов с помощью антипомощью вышеописанных методов и вводят в клеттел, которые прямо или косвенно обнаруживаюки более высших организмов путем трансфекции. тся, например, путем иммунофлуоресценции Пригодными клетками являются клетки живоили иммуноосаждения. Пригодными антителами тных, в особенности перманентные линии клеток, являются такие, которые реагируют с иммуногекак, например, клетки почек свиней РК15 (АТСС нами родственных вирусных штаммов, как, наCCL33 и их потомки), клетки почек обезьян BGM пример, обезьяний вирус 5 или собачий параг(Flow 03-240 или их потомки) или Vero (АТСС риппозный вирус 2; CCL81 или их потомки), клетки почек крупного рог) получение комплементарной ДНК (кДНК) и гатого скота MDBK (АТСС CCL22 или их потомклонирование кДНК, например, в бактериальных ки), клетки почек собак MDCK (АТСС CCL34 или плазмидах для накопления вирусной ДНК. Вирусих потомки) или клетки почек кроликов RK-13 ную ДНК клонов секвенируют и исследуют в от(АТСС CCL37). ношении гомологий последовательностей с извеТрансфекцию осуществляют, например, в фостными генами родственных вирусных штаммов, рме соосаждения ДНК с фосфатом калия или с как, например, обезьяний вирус 5 или собачий помощью диэтиламиноэтилдекстранового метода, парагриппозный вирус 2; липосомного метода или путем электропорации. д) секвенирование кДНК при ее получении и Методы клонирования выбранных генов в приисследование в отношении гомологий последогодных векторах, а также трансфекции клонированвательностей с известными генами родственных ными генами клеток более высших организмов повирусных штаммов, как, например, обезьяний видробно описываются J. Sambrook, E.F. Fritsch и рус 5 или собачий парагриппозный вирус 2; Т. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное рукое) сочетание методов а) - д). водство, второе издание, Cold Spring Harbor Методы гибридизации РНК/ДНК и ДНК/ДНК, Laboratory Press, 1989, и F.M. Ausubel, Current получение кДНК, клонирование ДНК в плазмидprotocols in molecular biology 1987-1988, изд. Jonn ных и бактериофаговых векторах, секвенироваWiley and Sons, Нью-Йорк, 1987. ние ДНК, а также методы иммунологического обНадосадочные жидкости культур клеток, соонаружения экспрессированных иммуногенов опитветственно, клеточные лизаты таким образом сываются в: обработанных клеток испытывают на наличие экJ. Sambrook, E.F. Fritsch и Т. Maniatis, Molecular спрессированных иммуногенов с помощью антиCloning, Лабораторное руководство, второе издател, которые прямо или косвенно обнаруживаютние, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; ся, например, путем иммунофлуоресценции или F.M. Ausubel, Current protocols in molecular иммуноосаждения. Пригодными антителами явbiology 1987-1988, изд. Jonn Wiley and Sons, Ньюляются такие, которые реагируют с иммуногенаЙорк, 1987; ми родственных вирусных штаммов, как, наприA. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, том III, мер, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппоизд. Густав Фишер, Штутгарт, 1989. зный вирус 2. Выбирают такие гены, в случае которых выб) Клонирование генов в форме комплементашеуказанными методами можно обнаружить нукрной ДНК в пригодных экспрессирующих векторах леотидную последовательность, которая кодирудля клеток низших и более высших организмов. ет один или несколько иммуногенов. В качестве Пригодны, например, (I) бактериальные плазпримера в Протоколе последовательностей (нимидные экспрессирующие векторы, (II) вирусные же) приводятся нуклеотидные последовательноэкспрессирующие векторы для бактерий или (III) сти с соответствующими аминокислотными повирусные экспрессирующие векторы для клеток следовательностями гемагглютинин-нейраминиболее высших организмов, в которых экспрессидаза-гена и генаслитого белка парагриппозного руется клонированный ген. вируса 2, депонированного в Национальной колК пункту (I): лекции культур и микроорганизмов (Институт ПаПригодными бактериальными плазмидными стера, Париж, Франция) под номером 1-1331. экспрессирующими векторами являются, наприЭкспрессию генов для получения иммуногенов мер, pUC18/19 или pUC118/119. После клонироосуществляют, например, следующими путями: вания ДНК в плазмиде ее вводят в прокариотные а) Стабильная интеграция генов в форме клетки, предпочтительно бактерии, и размножакомплементарной ДНК в клеточном наследственют. Пригодна, например, Escherichia coli К 12 и ее ном материале клеток более высших организмов. потомки. Прежде всего гены клонируют в пригодных шатДля введения плазмиды в прокариотную клетл-векторах. Для этой цели пригоден, например, тку пригодно, например, соосаждение ДНК с фособезьяний вирус 40 (ОБ40), а также плазмидные фатом кальция или электропорация. экспрессирующие векторы, которые пригодны К пункту (II): для селекционирования и размножения в прокаПригодными вирусньми экспрессирующими риотах (например, Е. Coli), а также содержат ре 11 23 39975 24 продуктов фирмы Гибко БРЛ Гмбх, Диезельштравекторами для бактерий являются l-бактериофассе 5, 76344, Эггенштейн, как в особенности миговые векторы, как, например, lgtII и его потомки, нимальная необходимая среда (MEM), которая в lZAP или lORF8. Размножение l-бактериофагокачестве основных составных частей содержит вых векторов осуществляется в особенности в аминокислоты, витамины, соли и углеводы, допоEscherichia coli, например, Escherichia coli К 12 и лняемая буферными веществами, как, например, ее потомках. гидрокарбонат натрия или гидроксиэтилпипераК пункту (III): зин-N-2-этансульфокислота (Гепес), и в случае Пригодными вирусными экспрессирующими необходимости сыворотками (крови) животных, векторами для клеток более высших организмов как, например, сыворотки крупного рогатого скоявляются, например, обезьяний вирус 40, аденота, лошадей, соответственно, их плодные сывовирусы, вирус простого герпеса или бакуловируротки. Особенно предпочтительно используют сы. Размножение вирусных векторов происходит минимальную необходимую среду Игла с содерв соответствующих системах клеток. жанием гидрокарбоната натрия 0,1-5 г/л, предпоМетоды клонирования выбранных генов в чтительно 0,5-3 г/л, а также плодной телячьей пригодных экспрессирующих векторах, а также сыворотки в концентрации 1-30 объемн.%, предих введение в соответствующие экспрессионные почтительно 2-10 объемн.%. системы подробно описывается J. Sambrook, E.F. Служащие для размножения вирусов клетки Fritsch и Т. Maniatis, Molecular Cloning, Лаборатои расы клеток размножаются обычным образом рное руководство, второе издание, Cold Spring почти вплоть до слияния или вплоть до оптимаHarbor Laboratory Press, 1989, и F.M. Ausubel, льной плотности клеток. Перед их инфицированCurrent protocols in molecular biology 1987-1988, ном с помощью вирусов предпочтительно удаляизд. Jonn Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987. ют среду для размножения клеток и клетки предЭкспрессированные иммуногены применяют почтительно промывают с помощью среды для в качестве антигенного материала либо непосразмножения вируса. В качестве среды для разредственно в виде систем экспрессии (культурамножения вируса используют любые, сами по сельный субстрат и/или клетки), либо после полубе известные среды для культур клеток, как в чения и очистки посредством биохимических особенности вышеуказанная минимальная необи/или иммунологических методов и в случае неходимая среда. Затем проводят инфицирование обходимости после концентрирования или разбас помощью вирусной суспензии. В вирусной сувления. спензии вирус разбавлен в среде для его размПригодными для очистки являются, наприножения так, что происходит инфицирование с мер, способы аффинной или гель-хроматограМИ (= множественность инфекции, соответствуюфии, при которых иммуногены отделяют или выщая соотношению числа инфекционных вирусделяют из системы экспрессии, в случае необхоных частиц к числу имеющихся клеток), соответсдимости после ее переведения в растворимую твующей 0,01-50, предпочтительно 0,1-10. форму путем обработки детергентом. Размножение вирусов осуществляют с добаДля получения вирусных антигенов, которые вкой или без нее сывороток животных. В том слуэкспрессируются векторными системами, прежде чае, когда используют сыворотку, ее добавляют к всего получают вирусный геном. среде для размножения в концентрации 1-30 обДля получения вирусного генома сначала ъемн.%, предпочтительно 2-10 объемн.%. осуществляют размножение вирусов обычным Инфицирование и размножение вируса осуобразом, с одной стороны, в культурах тканей ществляют при температурах от комнатной до клеток животных в качестве первичных клеток 40°С, предпочтительно при 32-39°С, особенно или перманентных линий клеток, например, в предпочтительно при 37°С, в течение нескольких клетках свиней, обезьян или крупного рогатого дней, предпочтительно вплоть до полного разрускота, предпочтительно в клетках почек свиней, шения инфицированных клеток. как, например, клонированные, перманентные Содержащую вирус среду инфицированных клетки почек свиней РК15 (АТСС CCL33 или их клеток обрабатывают далее, например, путем потомки) или первичные клетки почек свиней удаления клеток и остатков клеток посредством ЕРК, или в клетках почек обезьян, как перманентфильтрации при использовании фильтров с разные клетки почек обезьян BGM (Flow 03-240 или мерами пор, например, 0,1-0,45 мкм и/или с поих потомки) или Vero (АТСС CCL81 или их потоммощью центрифугирования с ускорением вплоть ки), или в клетках почек крупного рогатого скота, до 10000 g. как перманентные клетки почек крупного рогатого Размножение в эмбрионированных куриных скота MDBK (АТСС CCL22 или их потомки), и, с яйцах осуществляют само по себе известным обдругой стороны, в эмбрионированных куриных разом в аллантоидной полости инкубационных яйцах (например, Вало-инкубационные яйца, фикуриных яиц, которые предварительно инкубирурма Лохман). ют в течение 9-12 дней, предпочтительно в течеРазмножение в культурах клеток осуществние 10 дней, при температуре 37-39°С, предпочляют само по себе известным образом в стациотительно 38,5°С, и при относительной влажности нарных роллерных культурах или культурах на воздуха 30-90 %, предпочтительно 50-60 %, в носителе в форме сплошных соединений клеток стандартном термостате, предпочтительно в ин(монослои) или в суспендированных культурах. В кубаторе. качестве сред для размножения клеток используСлужащие для размножения вирусов инкубают любые сами по себе известные среды для ционные яйца за 1-3 часа, предпочтительно за 2 культур клеток, например, описанные в каталоге 12 25 39975 26 часа до инфицирования помещают в термостат в объемн.%, предпочтительно 0,5-3 объемн.%. вертикальном положении на острый конец яйца и В качестве протеаз используют такие, котозатем после подготовки места инъекции инфицирые эффективны в присутствии детергентов, как, руют с помощью 10-200 мкл, предпочтительно например, проназа, и предпочтительно использу75-125 мкл вирусной суспензии. В вирусной суют протеиназу К. Протеазы применяют в концентспензии вирус находится в среде для его размнорации 0,01-10 мг/мл, предпочтительно 0,05-0,5 жения в концентрации 101-107 КИД50/мл (инфекмг/мл. ционная для 50 % культуры доза на мл суспензии Предпочтительно применяют водные, буфе= степень разбавления, при которой инфицируюрированные растворы с добавкой рибонуклеазтся еще 50 % используемых культур клеток), ных ингибиторов. предпочтительно 104-105 КИД50/мл. В качестве В качестве буферных веществ применяют среды для размножения вируса используют люсоли слабых кислот с сильными основаниями, бые сами по себе известные среды для культур как, например, трис(гидроксиметил)аминометан, клеток, как, в особенности вышеуказанная минисоли сильных кислот со слабыми основаниями, мальная необходимая среда. как, например, первичные фосфаты или их смеИнфицирование и размножение вируса осуси. Предпочтительно применяют трис(гидроксиществляют при вышеуказанных условиях инкубаметил)аминометан. Буферные вещества испольции в течение нескольких дней, предпочтительно зуют в концентрациях, обеспечивающих рН-знав течение 2-5 дней, особенно предпочтительно в чение, при котором РНК не денатурируется. течение 3 дней. Предпочтительны рН-значения 6-8,5, особенно Содержащую вирус аллантоидную жидкость предпочтительны 7-8. получают путем отсасывания после вскрытия изВ качестве рибонуклеазных ингибиторов слувестковой скорлупы, а также подскорлуповой жат, например, рибонуклеозид-ванадильные комоболочки и хориоаллантоидной мембраны яйца, плексы, протеиновые ингибиторы (например, и можно проводить ее обработку дальше, наприРНК guard / Фармация) или предпочтительно диэмер, посредством фильтрации при использоватилпирокарбонат (ДЭПК), в концентрациях 0,01-2 нии фильтров с размерами пор, например, 0,1объемн.%, предпочтительно 0,1-0,5 объемн.%. 0,45 мкм и/или с помощью центрифугирования Липофильные вещества вирусных лизатов при ускорении вплоть до 10000 g. затем экстрагируют растворителем, как, наприОчистки, соответственно, выделения вируса мер, фенол, хлороформ или их смеси. Экстракдостигают путем изопикнического или зонального цию осуществляют в одну или несколько стадий. центрифугирования, например, с градиентами В остающейся водной фазе РНК осаждают с плотности сахарозы. Для этой цели содержащую помощью водных растворов, которые содержат вирус среду, соответственно, аллантоидную жидспирты, как, например, этанол или изопропанол, кость после удаления остатков клеток подвергаили хлориды или ацетаты одновалентных метают зональному центрифугированию с ускорением ллов, как, например, хлорид натрия, ацетат на100000 g вплоть до седиментации вирусных частрия или ацетат калия. тиц. В более чистом виде вирусные частицы поКонцентрация спиртов составляет 40-100 облучают путем зонального центрифугирования в ъемн.%, предпочтительно 60-80 объемн.%, а конводном растворе с более высокой плотностью, центрация хлоридов или ацетатов составляет чем содержащая вирус среда. В качестве водно0,01-1 моль/л, предпочтительно 0,1-0,8 моль/л. го раствора может служить, например, 30-60 % Осадившуюся РНК отделяют от водного расмасс., предпочтительно 35-50 % масс. буфериротвора, например, путем центрифугирования и ванный раствор сахарозы. Еще более высокой снова растворяют в водном растворе, например, степени чистоты достигают путем центрифугироводном растворе деэтилпирокарбоната. Этот вования с градиентом плотности. Для этой цели дный раствор содержит предпочтительно буферосвобожденный от клеток и остатков клеток, сконые вещества, как, например, трис(гидроксименцентрированный с помощью зонального центритил)аминометан, в концентрациях 1-100 ммоль/л, фугирования вирус выделяют путем изопикничепредпочтительно 10-50 ммоль/л, возможно при ского или зонального центрифугирования с градобавке этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в диентом плотности, например, 30-50 % масс. саконцентрациях 0,1-10 ммоль/л, предпочтительно харозы в буферированном водном растворе при 1-10 ммоль/л, или дитиотреита в концентрациях ускорении центрифугирования, например, 0,1-10 ммоль/л, предпочтительно 1-10 ммоль/л. 100000-150000 g. Выделенную РНК хранят при температурах Для получения пригодных генов, которые кониже -65 °С. дируют иммуногенные протеины, сначала выдеДругим методом выделения РНК является, ляют вирусный геном из очищенных вирусных чанапример, экстракция РНК с помощью гуанидистиц. Природную вирусную рибонуклеиновую кинийтиоцианата и последующее центрифугироваслоту (РНК) предпочтительно получают путем ние вирусного лизата с градиентом плотности обработки очищенных вирусных частиц содержахлорида цезия. щими детергенты и протеазы водными раствораМетоды выделения РНК описываются ми. J. Sambrook, E.F. Fritsh и Т. Maniatis, Molecular Используют анионные, катионные, амфотерCloning, Лабораторное руководство, второе изданые и неионные детергенты. Предпочтительно ние, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. применяют ионные детергенты, предпочтительно Идентифицирование пригодных генов осущедодецилсульфат натрия, в концентрации 0,1-10 ствляют при применении выделенного вирусного 13 27 39975 28 же) приводятся нуклеотидные последовательногенома, например, следующими путями: сти с соответствующими аминокислотными поа) гибридизация РНК/ДНК (дезоксирибонукследовательностями гемаглютинин-нейраминилеиновая кислота) генома при применении извесдаза-гена и гена слитого белка парагриппозного тных генных зондов. В качестве пригодных генвируса 2, депонированного в Национальной колных зондов служат ДНК-зонды с нуклеотидными лекции культур и микроорганизмов (Институт Папоследовательностями известных генов для имстера, Париж, Франция) под номером 1-1331. муногенов родственных вирусных штаммов, как, Эти гены, которые кодируют один или несконапример, обезьяний вирус 5 или собачий параглько иммуногенов (чужеродная ДНК), вставляют риппозный вирус 2; в геномный вектор, который в случае инфекции б) получение комплементарной ДНК (кДНК), клетки или организма экспрессирует чужеродный клонирование кДНК, например, в бактериальных ген. Для этого пригодны векторные вирусы и векплазмидах, как, например, pBR 322, для накоплеторные бактерии. Находят применение, наприния вирусной ДНК и гибридизация клонированмер, апатогенные ДНК-вирусы, которые включаной ДНК с помощью известных генных зондов. В ют стабильный геном с известными областями качестве пригодных генных зондов служат ДНКвставок для приема 0,1-20 т.н. (1000 пар нуклеозонды с нуклеотидными последовательностями тидов) чужеродной ДНК, как, например, вирусы известных генов для иммуногенов родственных вакцины, вирусы герпеса или аденовирусы. вирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2; Для этого необходимо (a) сначала вставить в) получение комплементарной ДНК (кДНК) и ген или гены в шаттл-вектор, который содержит клонирование кДНК в плазмидных экспрессируючужеродную ДНК, фланкированную от ДНК-посщих векторах, как, например, pUC18/19 или ледовательностей векторного вируса. Затем (b) pUC118/119, или в l-бактериофаговых экспрессиген или гены вставляют в геном векторного вирурующих векторах, как, например, lgtII и его потомса, например, путем котрансфекции шаттл-вектора и векторного вируса. ки или lZAP или lORF8. Идентификацию генов Пригодными шаттл-векторами являются плаосуществляют путем обнаружения их экспрессизмидные и бактерифаговые векторы. рованных иммуногенов с помощью антител, котоПримерами обычных плазмидных векторов рые прямо или косвенно обнаруживаются, наприявляются pBR322, pUC18/19, рАТ153, pACYC184 мер, путем иммунофлуоресценции или иммунооили pSP64/65, и примерами бактерифаговых вексаждения. Пригодными антителами являются таторов являются lgt10/11, lZAP или M13mp18/19. кие, которые реагируют с иммуногенами родственных вирусных штаммов, как, например, обезьяний (a) Вставка гена или генов в шаттл-вектор. вирус 5 или собачий парагриппозный вирус 2; Сначала фрагмент ДНК, который содержит г) получение комплементарной ДНК (кДНК) и область вставки векторного вируса, вставляют в клонирование кДНК, например, в бактериальных ДНК шаттл-вектора. Для этой цели как ДНК-посплазмидах для накопления вирусной ДНК. Вируследовательности известных областей вставок геную ДНК клонов секвенируют и исследуют в отнома векторного вируса, так и также ДНК шаттл-ношении гомологий последовательностей с извевектора обрабатывают с помощью рестрикционстными генами родственных вирусных штаммов, ных эндонуклеаз (ферменты рестрикции), чтобы как, например, обезьяний вирус 5 или собачий определить пассирующие концы последовательпарагриппозный вирус 2; ности для вставки. Такого рода подготовленную д) секвенирование кДНК при ее получении и ДНК шаттл-вектора смешивают с избытком встаисследование в отношении гомологии последовляемого фрагмента ДНК, например, примерно в вательностей с известными генами родственных соотношении 1:5. ДНК-смесь обрабатывают ДНКвирусных штаммов, как, например, обезьяний вилигазами, чтобы связать ковалентно фрагмент рус 5 или собачий парагриппозный вирус 2; ДНК в векторе. е) сочетание методов а) - д). При применении шаттл-плазмиды, ее вводят Методы гибридизации РНК/ДНК и ДНК/ДНК, в прокариотные или эукариотные клетки, предпополучение кДНК, клонирование ДНК в плазмидчтительно бактерии, и размножают. Пригодна, ных и бактериофаговых векторах, секвенированапример, Escherichia coli К 12 и ее потомки. ние ДНК, а также методы иммунологического обОтбирают бактерии, которые включают несунаружения экспрессированных иммуногенов опищую ДНК-фрагмент плазмиду. сываются в: Клонирование области вставки в шаттл-плазJ. Sambrook, E.F. Fritsch и Т. Maniatis, мидном геноме, его вставка в прокариотные или Molecular Cloning, Лабораторное руководство, эукариотные клетки, размножение и селекция второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory трансформированных бактерий подробно описыPress, 1989; F.M. Ausubel, Current protocols in ваются J. Sambrook, E.F. Fritsch и Т. Maniatis, molecular biology 1987-1988, изд. Jonn Wiley and Molecular Cloning, Лабораторное руководство, Sons, Нью-Йорк, 1987; второе издание, Cold Spring Harbor Laboratory A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, том III, Press, 1989, и F.M. Ausubel, Current protocols in изд. Густав Фишер, Штутгарт, 1989. molecular biology 1987-1988, изд. Jonn Wiley and Выбирают такие гены, в случае которых выSons, Нью-Йорк, 1987. шеуказанными методами можно обнаружить нукЕсли необходимо, используют так называелеотидную последовательность, которая кодирумый "полилинкер" в областях вставок векторного ет один или несколько иммуногенов. В качестве вируса. Полилинкерами являются ДНК-последопримера в Протоколе последовательностей (нивательности по меньшей мере с двумя опреде 14 29 39975 30 ленными местами расщепления ферментом ресдной векторной вирусной ДНК; трикции. (II) трансфекция пригодных клеток с помоДля этого фрагмент ДНК, который содержит щью шаттл-векторной ДНК и инфицирование с область вставки, обрабатывают с помощью такопомощью векторного вируса; го фермента рестрикции, чтобы фрагмент откры(III) инфицирование пригодных клеток с повался (расщеплялся) только в одной области. Тамощью векторного вируса и трансфекция с помоким образом подготовленный фрагмент вместе с щью шаттл-вирусной ДНК. полилинкером и ДНК-лигазой инкубируют для цеПригодные для этой цели методы подробно левой вставки в определенные места расщеплеописываются J. Sambrook, E.F. Fritsch и ния ферментом рестрикции. Т. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное рукоПолилинкер можно вставлять в выделенный водство, второе издание, Cold Spring Harbor или несущий клонированные в шаттл-векторе обLaboratory Press, 1989, и F.M. Ausubel, Current ласти вставок фрагмент ДНК. protocols in molecular biology 1987-1988, изд. Jonn Если в выделенные фрагменты ДНК вводят Wiley and Sons, Нью-Йорк, 1987. полилинкер, то их затем нужно вставлять в шатПредпочтительно используют метод (I), кототл-вектор. При применении шаттл-плазмиды ее рый осуществляют по методике осаждений ДНК вставляют в прокариотные или эукариотные клефосфатом кальция. Для этого необходимы слетки, предпочтительно бактерии, и размножают. дующие стадии: Пригодна, например, Escherichia coli К 12 и ее по(1) Шаттл-вектор размножают, выделяют и томки. Отбирают бактерии, которые включают далее очищают. Очистку шаттл-векторной ДНК содержащую фрагмент ДНК плазмиду. проводят, например, с помощью изопикнического Если в клонированный в шаттл-векторе фрацентрифугирования с градиентом плотности, нагмент ДНК вводят полилинкер, то его размножапример, с градиентом плотности хлорида цезия. ют и селекционируют. Векторный вирус размножают и очищают. Гены, которые кодируют один или несколько Вирусный геном выделяют и далее очищают. иммуногенов (чужеродная ДНК), вставляют в обОчистку векторной вирусной ДНК осуществляют, ласти вставок. например, с помощью изопикнического центриЕсли необходимо, прежде всего удаляют чафугирования с градиентом плотности, например, стичные последовательности ДНК-фрагмента, градиентом плотности хлорида цезия. который несет область вставки. Для этой цели (2) Для котрансфекции применяют кольцеДНК-фрагмент обрабатывают с помощью фермевую или предпочтительно линейную шаттл-векнтов рестрикции и полученные фрагменты ДНК торную ДНК. отделяют. Линейную шаттл-векторную ДНК получают, Для вставки чужеродной ДНК сначала выденапример, путем обработки очищенной ДНК с поленный или клонированный в шаттл-векторе мощью ферментов рестрикции. Предпочтительны фрагмент ДНК, который несет область вставки, ферменты рестрикции, которые не содержат никаобрабатывают с помощью одного или нескольких кого места распознавания (места расщепления) ферментов рестрикции и фрагмент раскрывают в во вставленной чужеродной ДНК, то есть последообласти вставки, соответственно, во введенном вательность чужеродной ДНК не расщепляется. полилинкере. Чужеродную ДНК вставляют в та(3) Векторную вирусную ДНК и шаттл-векторким образом подготовленную область вставки, ную ДНК смешивают, например, в соотношении например, с помощью ДНК-лигаз. 0,01-0,1 х 10-12 моль/л векторной вирусной ДНК к Если чужеродную ДНК вставляют в выделен1-3 х 10-12 моль/л шаттл-векторной ДНК. ные фрагменты ДНК, то их затем нужно вставлять в (4) Смесь ДНК соосаждают, например, с фосшаттл-вектор. При применении шаттл-плазмиды ее фатом кальция и переносят в пригодные клетки. вставляют в прокариотные или эукариотные клетки, Пригодными клетками являются клетки живопредпочтительно бактерии, и размножают. тных, в особенности перманентные линии клеток, Пригодна, например, Escherichia coli К 12 и как, например, клетки почек свиней РК15 (АТСС ее потомки. Отбирают бактерии, которые содерCCL33 и их потомки), клетки почек обезьян BGM жат включающие чужеродную ДНК плазмиды. (Flow 03-240 или их потомки) или Vero (АТСС Если чужеродную ДНК вставляют в клонироCCL81 или их потомки), клетки почек крупного рованный в шаттл-векторе фрагмент ДНК, то ее рагатого скота MDBK (АТСС CCL22 или их потомзмножают и селекционируют. ки), клетки почек собак MDCK (АТСС CCL34 или Методы получения шаттл-векторов подробно их потомки) или клетки почек кроликов RK-13 описываются J. Sambrook, E.F. Fritsch и (АТСС CCL37). Т. Maniatis, Molecular Cloning, Лабораторное рукоКотрансфекцию можно осуществлять также с водство, второе издание, Cold Spring Harbor помощью других методов. В качестве таковых Laboratory Press, 1989, и F.M. Ausubel, Current следует, например, назвать диэтиламиноэтилдеprotocols in molecular biology 1987-1988, изд. Jonn кстрановый метод, липосомный метод или электWiley and Sons, Нью-Йорк, 1987. ропорацию. (5) Клетки культивируют, например, согласно (b) Введение чужеродной ДНК в геном вектоподробно описанным выше методам. При появрного вируса: лении цитопатогенетического эффекта клоны веДля вставки чужеродной ДНК в геном векторнокторного вируса выделяют по однозональному го вируса можно применять следующие методы: методу очистки и размножают далее. (I) котрансфекция пригодных клеток с помоМетоды однозональной очистки описываются щью шаттл-векторной ДНК и выделенной приро 15 31 39975 32 A. Mayr, Virologische Arbeitsmethoden, том I, изд. вирусных частиц в такой концентрации, что на Густав Фишер, Штутгарт, 1974. одну дозу для вакцинации содержатся 10-250 мг (6) Селекцию рекомбинантных векторных випротеина, предпочтительно 10-100 мг протеина. русов осуществляют (I) путем обнаружения экспАнтигенный материал в вакцине находится в рессии чужеродного гена или (II) путем обнарусмеси с обычными вспомогательными для форжения вставленной чужеродной ДНК в векторный мулирования веществами, как растворители и вирусный геном, например, за счет ДНК/ДНК-гибразбавители, добавки, консерванты, суспендируридизации: ющие агенты или агенты растворения, регулиру(I) Обнаружение экспрессии чужеродной ДНК ющие рН-значение средства и в случае необхоосуществляют, например, с помощью антител. димости антивспениватели. Пригодными антителами являются такие, котоВ качестве растворителей и разбавителей рые реагируют с иммуногенами родственных виследует назвать дистиллированную воду, очирусных штаммов, как, например, обезьяний вирус щенную воду, физиологически приемлемые со5 или собачий парагриппозный вирус 2. Генный левые растворы, а также среды для культур клепродукт чужеродной ДНК можно обнаружить, наток. В особенности находят применение вышеупример, путем иммунофлуоресценции или иммуказанная минимальная необходимая среда Игла, ноосаждения. а также буферированный фосфатом раствор (II) Обнаружение вставленной чужеродной хлорида натрия. ДНК осуществляют путем гибридизации с генныВ качестве добавок следует назвать: ми зондами соответствующего чужеродного гена. 1) минеральные соли, как гидроксид алюмиСтабильные рекомбинантные векторные виния, фосфат алюминия, фосфат кальция, каолин русы размножают, выделяют и обрабатывают даили кремний. Предпочтительно используют 10-50 лее по обычным известным способам, как подрообъемн.%, предпочтительно 25-35 объемн.% гебно описанные выше, и применяют в качестве ля гидроксида алюминия с долей гидроксида антигенного материала. алюминия 1-5 %масс, предпочтительно 2-3 % В предлагаемых согласно изобретению вакмасс. на объем; цинах антигенный материал находится индивиду2) масляные добавки, как нетоксичные минеально или в смеси с обычными, вспомогательныральные масла (например, Драцеол, парафиноми для формулирования веществами. В качестве вое масло), растительные масла (например, летаковых следует назвать фармакологически прицитин, арахисовые масла) или животные масла емлемые растворители или разбавители, добав(сквалан, сквален), которые используются в конки, консерванты, суспендирующие агенты или центрации 1-40 объемн.%, предпочтительно 1-15 агенты растворения, как эмульгаторы. объемн.%; Антигенный материал используют в качестве 3) гидрофильные и гидрофобные полимеры, биологически активного вещества при формуликак полиэтиленоксид и полипропиленоксид. ровании вакцин. Предпочтительно используют синтетически полуДля приготовления живой вакцины применяченные блоксополимеры (например, Плюроник Л ют антигенный материал в форме живых вирус101, Плюроник Л 121, Плюроник Л 122, Тетроник ных частиц, к которому для стабилизации добав1501) в концентрации 1-10 объемн.%; ляют добавки и в случае необходимости также 4) добавки бактериального происхождения, антивспениватели и консерванты. Для лучшей как Pertussis-токсин (Bordetella pertussis), митоген сохраняемости живую вакцину лиофилизируют Salmonella-typhimurium, или бактериальные эндопутем сушки вымораживанием. Перед применетоксины, как липополисахариды (ЛПС, например, нием этой вакцины лиофилизированный продукт из микобактерий или сальмонелл), а также анареконструируют с помощью растворителя, как, логи или производные липополисахаридов, как, например, дистиллированная вода, очищенная например, липид-А, монофосфорил-липид-А вода или 0,9 %-ный раствор хлорида натрия. (МФЛ), дифосфорил-липид-А (ДФЛ), трегалозоОсвобожденные от клеточного субстрата видимиколат (ТДМ), мурамилдипептид (МДП) или русные частицы в концентрации по меньшей меадамантилдипептид (АлДП), а также их произворе 106 КИД50/мл смешивают вместе с защитными дные. Предпочтительно используют производколлоидами, соответственно, стабилизаторами, ные мурамилдипептида или адамантилдипептид как, например, целлюлозы, декстраны, желатив концентрации 0,0001-10 % масс./объем; ны, коллидоны или стеараты, и в случае необхо5) органические, диспергируемые в воде добадимости при добавке антивспенивателей, как, навки, как холестерин, желатина, фосфатидилхолин, пример, трибутилфосфат, изопропанол или силиполисахариды (например, зимозан, агар), алифатиконовое масло, а также консервантов, как, напрические амины(например, диметилдиоктадециламер, мертиолат или тимеросал, в водном, с бумин /ДДА/, N,N-диотадецил-N',N'-бис(2-гидроксиэферированным рН-значением растворе, вносят в тил)пропандиамин /Авридин/), диэтиламиноэтилдесоответствующие емкости и подвергают сушке кстраны или сапонин (из коры Quillaja saponaria вымораживанием. Molina) и производные сапонина (Квил А); Для приготовления убитых вакцин (инактиви6) монокины и лимфокины, как, например, инрованные вакцины) в качестве антигенного матетерлейкин-1, интерлейкин-2 или g-интерферон; риала применяют полные, умерщвленные вирус7) возможные сочетания из 1) - 6). ные частицы в концентрации 104,0-109,0 КИД50/мл, В качестве консервантов следует назвать предпочтительно 105,0-108,0 КИД50/мл, перед инаформалин в концентрациях вплоть до 1 %, фективацией, или отдельные части (субъединицы) нол и бензиловый спирт в концентрациях вплоть 16 33 39975 34 до 0,5 %, сорбиновую кислоту, бензойную кислотемпературе, в течение 2-8 часов. Неподвергшиту, бензоат натрия, а также их производные, как, еся гидролизу составные части ткани отделяют например, натриевая соль 2-(этилмеркурио-путем фильтрации через крупнопористый тио)бензойной кислоты (Мертиолат, Тимеросал, фильтр. Подвергнувшиеся гидролизу трипсином Тиомерсал) или натриевая соль 4-(этилмеркуклетки выделяют путем центрифугирования при рио-тио)бензойной кислоты (Тиомерфонат). 500-1500 g. Осадок клеток снова суспендируют в Предпочтительно используют Мертиолат в конпригодной среде для выращивания, как, наприцентрациях 0,01-0,5 %. мер, в описанной минимальной необходимой В качестве суспендирующих агентов следует среде Игла, и в концентрации 105-106 клеток на назвать нетоксичные поверхностно-активные вещемл среды высевают в емкости для культивироваства, как растительные протеины, альгинаты, целния. В зависимости от скорости роста среду для люлозы, фосфолипиды и в особенности вещества выращивания меняют каждые 3-7 дней. Рост клена основе простых гликолевых эфиров, как полиэток и появление цитопатогенного эффекта исслетиленгликоли и их производные. Предпочтительно дуют ежедневно. Дополнительно можно анализииспользуют полиэтиленгликоль (ПЭГ) с молекулярровать в отношении гемагглютинирующих ными массами 200, 300, 400, 600 и 900, а также свойств надосадочную жидкость культур клеток в производные полиэтиленгликоля (Спан, Арлацел, постоянные промежутки времени 2-7 дней. Твин, Майри, Бриж), особенно предпочтительно Надосадочные жидкости после центрифугиТвин 80, в концентрации 0,05-5 обьемн.%, предпочрования, соответственно, фильтраты гомогенатительно 0,2-1 объемн.%. тов органов, а также надосадочные жидкости В качестве регулирующих значение рН векультур клеток из полученных первичных культур ществ следует назвать, например, гидроксид наорганов при разбавлении от 1:1 до 1:1000, предтрия и гидроксид калия, карбонат натрия и карбопочтительно от 1:10 до 1:100, наносят на первичнат калия, уксусную кислоту, винную кислоту и ные или перманентные культуры клеток молочлимонную кислоту или гидроксиэтилпиперазин-Nной железы и инкубируют при 32-39°С, предпоч2-этансульфокислоту (ГЕПЕС). тительно при 37°С, в течение нескольких дней. В качестве антивспенивателей следует наДля этой цели применяют расы клеток, которые звать трибутилфосфат, изопропанол, силиконовыросли до слияния на 20-100 %, предпочтительвое масло, Антифоам или Байсилон, антивспенино 80-100 %. Культуры клеток ежедневно исслеватель EBZ. дуют в отношении появления цитопатогенного Предлагаемые согласно изобретению парагэффекта. Дополнительно можно анализировать в риппозные вирусы, которые вызывают заболеваотношении гемагглютинирующих свойств надосания респираторного и репродуктивного трактов дочную жидкость культуры клеток в постоянные свиней, можно получать, например, следующим промежутки времени 2-7 дней. Если не появляюобразом: тся никакие признаки размножения вируса, то наУ свиней, которые больны с подобными досадочные жидкости культуры клеток пассируют СРРС симптомами, извлекают органы и выделядалее в указанных разбавлениях на свежих кульют вирус. Особенно пригодны нежизнеспособные турах клеток. Этот процесс можно повторять или больные поросята из инфицированного погомногократно. ловья. У пригодного животного извлекают внутПри появлении признаков размножения вируренние органы, в особенности легкие, печень, поса путем дальнейших пассажей вирус адаптиручки и селезенку. Части этих органов или смесей ют к применяемой культуре клеток. органов гомогенизируют с физиологически приУ абортирующей свиноматки, которая проиемлемыми водными растворами до получения сходит из поголовья с подобными СРРС симптосуспензий, причем доля частей органов составмами, путем аутопсии извлекают еще находивляет примерно 10 % масс. на объем. В качестве шегося в матке поросенка. Из легких этого поросуспендирующего агента особенно пригодна высенка путем получения первичной культуры клешеописанная минимальная необходимая среда ток легких и путем пассажей с получающейся их Игла. Суспензии освобождают от клеток и остатнее культуральной надосадочной жидкости в ков клеток путем центрифугирования с ускоренилиниях клеток животных выделяют цитопатогенем примерно 1500 g. Дальнейшую очистку надоный действующий фактор. Он характеризуется садочной жидкости после центрифугирования как содержащий оболочку, гемагглютинируюможно осуществлять путем фильтрации. Для щий, размером примерно 200 нм, однонитевой этой цели пригодны фильтры с размерами пор РНК-вирус, который согласно анализу на элект0,2-5 мкм, предпочтительно 0,2-0,45 мкм. ронном микроскопе имеет морфологию парамиИз извлеченных органов, предпочтительно из ксовируса. Протеины этого вируса распознаютлегких, также можно получать первичную культуся путем Вестерн-блотирования антисыворотки ру клеток, которую исследуют в отношении появпо отношению к парагриппозному вирусу типа 2 ления цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). Для этой (ПГВ-2). В одной и той же тест-системе полученцели грубо размельченную ткань подвергают феная по отношению к изолированному вирусу анрментативному разложению с помощью протеаз. тисыворотка распознает штамм парагриппозноДля этого особенно пригоден трипсин в концентго вируса типа 2 "OB 5", что говорит о серологирации 0,1-0,5 % масс./объем, предпочтительно ческом родстве выделенного вируса с парагрип0,125-0,25 % масс./объем, в физиологическом вопозным вирусом типа 2. дном растворе. Гидролиз трипсином осуществляЭтот парагриппозный изолят с названием ют при 20-37°С, предпочтительно при комнатной "SER" хранится с 12.06.1993 г. в "Национальной 17 35 39975 36 коллекции культур и микроорганизмов" Института Часть извлеченных в стерильных условиях Пастера, Париж, Франция, под номером 1-1331. легких поросенка грубо размельчают с помощью Выделенный вирус может размножаться в боножниц и подвергают ферментативному разлольшом масштабе при применении культур клеток жению в 0,25 %-ном растворе трипсина. Гидроживотных. Из таким образом полученных вируслиз с помощью трипсина осуществляют при пеных суспензий с помощью пригодного техническоремешивании при комнатной температуре в течего способа (центрифугирование, тангенциальная ние 4 часов. Крупные куски ткани отделяют в стефильтрация) можно приготовлять очищенные анрильном фильтре из тканого сита. Фильтрат протигенные препараты. Их можно использовать в камывают трижды с помощью буферированного честве исходного материала для диагноза и префосфатом раствора хлорида натрия при центридохранения свиней от респираторных и репродукфугировании с небольшим числом оборотов тивных заболеваний, в особенности свиного ре(1000 g, 10 минут). Клетки высевают в Е-МЕМ продуктивного и респираторного синдрома. при добавке 5 % плодной телячьей сыворотки в Пример 1 концентрации 105 клеток на мл на поверхность Выделение парагриппозного изолята "SER" для культивирования 80 см2 и инкубируют при Парагриппозный изолят "SER" можно выде37°С. Среду для выращивания заменяют каждые лить из легких поросенка, извлеченного из матки 4-5 дней. За ростом этой первичной культуры при аутопсии эвтаназированной, абортирующей следят ежедневно путем наблюдения в микроссвиноматки, которая происходит из поголовья с коп. При этом в особенности обращают внимание подобными СРРС симптомами. на появление цитопатогенного эффекта (ЦПЭ). РК 15 Клетки (клонированные клетки свиных Спустя примерно две недели можно обнаружить почек, АТСС № CCL33) цитопатогенный эффект в форме округляющихМинимальная необходимая среда Игла с сося, сморщивающихся клеток с медленной тенделями Эрле (Е-МЕМ): нцией к распространению. Культуральную надоЕ-МЕМ-порошок с феноловым для 100 л садочную жидкость первичных клеток разбавлякрасньм (например. Гибко БРЛ ют 1:10 поддерживающей средой и инфицируют 072-0110) слившийся монослой культурами РК-15 клеток на поверхности культуры 80 см2 (инкубационный обзаменимые аминокислоты, го1000 мл ъем: 40 мл). Для контроля от каждой клетки остатовый раствор, 100-кратное вляют неинфицированную культуру. После инкуразбавление бации в течение 7 дней развивается цитопатонеомицинсульфат 3г генный эффект с начинающимся перфорироваполимиксин-Б-сульфат 3 МЕ нием. Культуру подвергают процессу замораживания-оттаяния и инфицируют надосадочную жиочищенная вода (ЕР 8) до 100 мл дкость, разбавленную в соотношении 1:10 свезаменимые аминокислоты, готовый раствор, жей культурой, эту надосадочную жидкость спус100-кратное разбавление: тя 6-7 дней исследуют в тесте на гемагглютинааланин (ЕР 752) 8,9 г цию при применении куриных эритроцитов. В чемоногидрат аспарагина (DAB 15,0 г твертом пассаже после инкубации в течение 6 10) дней, обнаруживают культуры примерно со 100 L-аспарагиновая кислота 13,2 г %-ным цитопатогенным эффектом. Положительглицин (ЕР 614) глутаминовая кислота (ЕР 750) пролин (ЕР 785) серии (ЕР 788) очищенная вода (ЕР 8) 7,5 г ные в тесте на гемагглютинацию надосадочные культуральные жидкости хранят при -70°С. Пример 2 Размножение парагриппозного изолята "SER" для 100 л Материал: парагриппозный изолят "SER", базисный посевной материал Клетки РК-15 (клонированные клетки почек свиней, АТСС № CCL33) минимальная необходимая среда Игла с солями Эрле (Е-МЕМ) порошок Е-МЕМ с феноловым красным (например. Гибко БРЛ 072-0110) 14,5 г 11,5 г 10,5 г до 10 л плодная телячья сыворотка (ПТС, например. Гибко БРЛ 012-06290) среда для выращивания: Е-МЕМ с 2,0 г/л гидрокарбоната натрия и 2 % ПТС поддерживающая среда: Е-МЕМ с 0,85 г/л гидрокарбоната натрия и 5 % ПТС 0,25 %-ный раствор трипсина (например. Гибко БРЛ 043-05050) буферированный фосфатом раствор хлорида натрия: хлорид натрия 8,0 г хлорид калия 0,2 г дигидрофосфат калия 0,2 г заменимые аминокислоты, готовый раствор, 100-кратное разбавление динатрийфосфат с 12 молекулами воды очищенная вода (ЕР 8) 2,9 г неомицинсульфат 1000 мл 3г полимиксин-Б-сульфат очищенная вода (ЕР 8) до 1000мл Поверхность тканевой культуры 80 см2, (Раукс - поверхность, например, Грейнер 658170) 3 МЕ до 100 л плодная телячья сыворотка (ПТС, например. Гибко БРЛ 012-06290) 18 37 39975 38 среда для выращивания: Е-МЕМ с 2,0 г/л гидких сборов вирусов, переносят в стерильный сорокарбоната натрия и 2 % ПТС суд. Устанавливают рН-значение равным 8,4 с поддерживающая среда: Е-МЕМ с 0,85 г/л гипомощью 2н раствора гидроксида натрия. При дрокарбоната натрия и 5 % ПТС постоянном перемешивании добавляют такое коповерхность тканевой культуры 80 см2 (Раукс личество 0,5 М раствора 2-бромметиламин-гид- поверхность, например, Грейнер 658 170) робромида, чтобы достичь конечной концентраванный штабель, 6000 см2 (например, Нунк ции 2-бромметиламин-гидробромида, равной 5 164 327) Методика: ммоль/л. Инактивацию вируса осуществляют в Среду для выращивания декантируют с поветечение 18 часов при 37°С. Затем инактивируюрхности тканевой культуры, обросшей конфлюэнщий агент нейтрализуют при 4°С путем добавки тно клетками РК-15 и поверхность тканевой куль2,5 М раствора тиосульфата натрия вплоть до туры покрывают 40 мл базисного посевного вируконечной концентрации 50 ммоль/л. сного материала, разбавленного в среде для поК 31 мл стерильной суспензии гидроксида лучения 1:50. После инкубации в течение 7 дней алюминия (3 % гидроксида алюминия, рН = 7,3) при 37°С подвергнутое процессу замораживания добавляют 62 мл инактивированной вирусной су- оттаяния и суспендированное с помощью ульспензии и перемешивают в течение 2 часов при развука содержимое поверхности тканевой куль4°С. После добавки 1,25 мл Квила А (2 %-ный ратуры дополняют поддерживающей средой до обствор) и 0,1 мл Тимеросала (2 %-ный раствор) ъема 3000 мл и инфицируют конфлюэнтно обродополняют до 100 мл с помощью буферировансший клетками РК-15 ванный штабель. После инного фосфатом раствора хлорида натрия и перекубации в течение 7 дней при 37°С надосадочмешивают следующие 20 часов при 4°С. Готовой ную культуральную жидкость собирают и хранят вакциной заполняют емкости, включающие мнопри -70°С вплоть до дальнейшей переработки. гократные дозы вакцины, и хранят при 4°С. Пример 3 Вакцинацию свиней всех возрастов проводят Приготовление убитой вакцины (парагриппопутем подкожного введения 2 мл этой вакцины. зный изолят "SER") Публикации, относящиеся к нуклеотидным Материал: последовательностям, которые кодируют иммуПарагриппозный изолят "SER", надосадочная ногены обезьяньего вируса 5: жидкость культуры клеток из процесса размножеHiebert, S.W., Paterson, R.G. and Lamb, R.A. ния вируса (1985). Hemagglutinin-neuraminidase protein of the 0,5 М готовый раствор 2-бромметиламин-гидparamyxovirus simian virus 5: nucleotide sequence робромида: of the mRNA predicts a N-terminal membrane 2-бромметиламин-гидробро102,5 г anchor. Journal of Virology, 54,1-6. мид (ВrСН2СН2NH2HВr, Мерк Hiebert, S.W., Paterson, R.G. and Lamb, R.A. 820176) (1985). Identification and predicted sequence of a previously unrecognized small hydrophobic protein, очищенная вода (ЕР 8) до 1000 мл SH, of the paramyxovirus simian virus 5. Journal of 2,5 М готовый раствор тиосульфата натрия: Virology, 55, 744 - 751. пентагидрат тиосульфата 620,5 г Paterson,R.G., Harris, T.J.R. and Lamb, R.A. натрия (ЕР 414) (1984). Analysis and gene assignment of mRNAs очищенная вода (ЕР 8) до 1000 мл of a paramyxovirus, simian virus 5. Virology, 138, 3 %-ная суспензия гидроксида алюминия (на310 - 323. пример, Суперфос) Paterson, R.G., Harris, T.J.R. and Lamb, R.A. 1 %-ный готовый раствор Квил А: (1984). Fusion protein of the paramyxovirus simian Квил А (например, Супер10,0 г virus 5: nucleotide sequence of the mRNA predicts a фос) highly hydrophobic glycoprotein. Proc. Natl. Acad. очищенная вода (ЕР 8) до 1000 мл Sci. USA, 81, 6706 - 6710. Paterson, R.G., Hiebert, S.W. and Lamb, R.A. 2 %-ный готовый раствор тимеросала (1985). Expression at the cell surface of biologically тимеросал (C9H9HgNaO2S) 50,0 г active fusion and hemagglutinin/neuraminidase очищенная вода (ЕР 8) до 1000 мл proteins of the paramyxovirus simian virus 5 from буферированный фосфатом раствор хлориcloned cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 7520 да натрия: 7524. хлорид натрия 8,0 г Thomas, S., Lamb, R.A. and Paterson, R.G. хлорид калия 0,2 г (1988). Two mRNAs that differ by two nontemplated nucleotides encode the amino coterminal proteins P дигидрофосфат калия 0,2 г and V of the the paramyxovirus SV5. Cell, 54, 891 динатрийгидрофосфат с 12 2,9 г 902. молекулами воды Протокол последовательностей очищенная вода (ЕР 8) до 1000 мл (1) Общие сведения: (I) Заявитель: Надосадочную жидкость размноженного на (а) фирма: Байер АГ культурах клеток вируса освобождают от клеток (б) улица: Байерверк и остатков клеток путем центрифугирования при (в) город: Леверкузен 10000 g. Таким образом очищенную вирусную су(г) страна: Германия спензию с концентрацией вирусных частиц 106,0 (д) почтовый индекс: D-51368 КИД50/мл, происходящих из одного или несколь 19 39 39975 40 (е) телефон: 0214/30 66400 последовательности № 1: (ж) телефакс: 0214/30 3482 (I) Характеристики последовательности: (з) телекс: 85 101-265 by d (а) длина: 1698 пар оснований (II) Название изобретения: Вакцина для пре(б) тип: нуклеотид дохранения свиньи от респираторных и репроду(в) число нитей: однонитевая ктивных заболеваний (г) конфигурация: линейная (III) Количество последовательностей: 4 (II) Тип молекул: геномная ДНК (IV) Редактор на компьютере: (III) Гипотетический тип: нет (а) носитель данных: дискета (IX) Отличительный признак: (б) компьютер: персональный компьютер, со(а) название / код: С вместимый с машинами фирмы ИБМ (б) положение: 1.... 1695 (в) операционная система: ПК-ДОС/МС-ДОС (XI) Описание последовательнос (г) программное обеспечение: патентная рети № 1: дакция # 1.0, версия # 1.30 (ЕРА) (2) Сведения о 20 41 39975 21 42 43 39975 22 44 45 39975 (2) Сведения о последовательности № 2: (I) Характеристики последовательности: (а) длина: 565 аминокислот (б) тип: аминокислота 46 (г) конфигурация: линейная (II) Тип молекул: протеин (XI) Описание последовательности № 2: 23 47 39975 (2) Сведения о последовательности № 3: (I) Характеристики последовательности: (а) длина: 1656 пар оснований (б) тип: нуклеотид (в) число нитей: однонитевая (г) конфигурация: линейная (II) Тип молекул: геномная ДНК 48 (III) Гипотетический тип: нет (IX) Отличительный признак: (а) название / код: С (б) положение: 1.... 1653 (XI) Описание последовательности № 3: 24 49 39975 25 50 51 39975 (2) Сведения о последовательности № 4: (I) Характеристики последовательности: (а) длина: 551 аминокислота (б) тип: аминокислота 52 (г) конфигурация: линейная (II) Тип молекул: протеин (XI) Описание последовательности № 4: 26 53 39975 27 54 55 39975 56 __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 456-20-90 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ __________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 __________________________________________________________ 28