Спосіб швидкого виявлення, виділення та підрахунку апоптичних клітин, що базується на аглютинації

1. Спосіб швидкого виявлення апоптичних клітин, що базується на аглютинації, який включає попередню підготовку зразка до досліджень шляхом внесення у суспензію досліджуваних клітин певної кількості лектинів, визначення кількості апоптичних клітин, який відрізняється тим, що лектини, взяті для аналізу, мають щонайменш дві вуглевод розпізнавальних ділянки, детекцію аглютинату клітин проводять в імунологічних мікропланшетах, наявність апоптичних клітин визначають за утворенням аглютинату методами візуалізації. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що кількість лектину, необхідна для утворення аглютинату апоптичних клітин, є меншою, ніж кількість лектину, що необхідна для утворення аглютинату інтактних клітин. 3. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що лектин мічений маркером, вибраним з групи: ферментативна мітка, біотин, флуоресцентна мітка або їх комбінації. 4. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що додатково включає встановлення мінімальної концентрації лектину, необхідної для спостереження аглютинату клітин, порівняння мінімальних кількостей лектину, необхідних для спостереження аглютинату інтактних і апоптичних клітин, встановлення наявності апоптичних клітин у досліджуваному зразку у випадку, якщо спостереження аглютинату апоптичних клітин вимагає меншої концентрації лектину, ніж спостереження аглютинату інтактних клітин. 5. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що лектин здатний одночасно зв’язувати щонайменш дві клітини. UA (21) a200807435 (22) 31.10.2006 (24) 25.06.2011 (86) PCT/US2006/042582, 31.10.2006 (31) 60/731,768 (32) 31.10.2005 (33) US (46) 25.06.2011, Бюл.№ 12, 2011 р. (72) СТОЙКА РОСТИСЛАВ СТЕПАНОВИЧ, БІЛИЙ РОСТИСЛАВ ОЛЕКСАНДРОВИЧ, АНТОНЮК ВОЛОДИМИР ОЛЕКСАНДРОВИЧ (73) ІНСТИТУТ БІОЛОГІЇ КЛІТИНИ НАН УКРАЇНИ (56) BILYY R.O. ET AL.: 'Lectinocytochemical Detection of Apoptotic Murine Leukemia L1210 Cells' CYTOMETRY PART A vol. 56A, 2003, pages 89 - 95. BILYY R O ET AL: "Cytochemical study of role of alpha-d-mannose- and beta-d-galactose-containing glycoproteins in apoptosis" JOURNAL OF MOLECULAR HISTOLOGY, vol. 35, no. 8-9, November 2004 (2004-11), pages 829-838. BILYY R. ET AL.: 'In vivo expression and characterization of novel alpha-D-mannose-rich glycoprotein arkers of apoptotic cells' CELL BIOLOGY INTERNATIONAL vol. 29, November 2005, pages 920 - 928. Білий Р.О. Мембранні глікопротеїни клітин за умов апоптозу: виявлення, характеристика, біомедичні аспекти дослідження. 03.00.11-цитологія, клітинна біологія, гістологія. Автореф… к.б.н. Львів-2007. WO97/31107 28.08.1997. DE10053521A1 8.05.2002. US5834196 10.11.1998 BILYY R.O. ET AL.: 'Some New Approaches to the Detection of Programmed Cell Death' PROC. OF SPIE vol. 6163, 21 July 2006, page 61630J-1. COHEN G.M. Caspases: the executioners of apoptosis. Biochem. J. (1997) 326 (1-16). Stuart L.M. et al. Mannose-Binding Lectin-Deficient Mice Display Defective Apoptotic Cell Clearance but No Autoimmune Phenotype The Journal of Immunology, 2005, 174: 3220-3226. NAUTA A.J. ET AL.: 'Mannose-binding lectin engagement with late apoptotic and necrotic cells' EUR. J. IMMUNOL. vol. 33, October 2003, pages 2853 - 2863. KIM M.S. ET AL.: 'Activation of caspase cascades in Korean mistletoe (Viscum album var. coloratum) 2 (19) 1 3 94920 4 6. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що лекnivalis (GNA), Ricinus communis (RCA-120), Viscum album (VAA) або їх поєднань. тин здатний зв’язувати α-D-манозовмісні глікопро19. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що теїни, β-D-галактозовмісні глікопротеїни або ж лектин взято із Viscum album (VAA). обидва типи глікопротеїнів. 7. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що лек20. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що тин вибрано із наступної групи: Pisum sativum підрахунок кількості апоптичних клітин включає в (PSL), Polygonatum multiforum (PMRL), Galanthus себе встановлення їх кількості після 12 годин після nivalis (GNA), Ricinus communis (RCA-120), Viscum індукції апоптозу. 21. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що album (VAA) або їх поєднань. 8. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що лекпопередньо встановлена кількість лектину, яка тин взято із Viscum album. спричиняє утворення аглютинату інтактних та апо9. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що виптичних клітин на різних стадіях після індукції апоявлення апоптичних клітин включає визначення птозу, визначається з кореляції із кількостями леквмісту апоптичних клітин після 12 годин після індутину, що спричиняє утворення аглютинату кції апоптозу. контрольних зразків клітин із відомим вмістом апо10. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що птичних клітин. використовують лектин Pisum sativum (PSL) і по22. Спосіб швидкого виділення апоптичних клітин, передньо встановлена кількість лектину для спощо базується на аглютинації, який включає забезстереження аглютинату інтактних клітин у 8 разів печення взаємодії зразку клітин із кон’югованим перевищує таку кількість для апоптичних клітин. лектином, відрізняється тим, що забезпечує виді11. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що лення фракції клітин, що зв’язані із кон’югованим використовують лектин з Polygonatum multiforum лектином, і фракції клітин, що не зв’язані із (PMRL) і попередньо встановлена кількість лектикон’югованим лектином, та відділення фракцій ну для спостереження аглютинату інтактних клітин клітин, що зв’язані із кон’югованим лектином, вивіу чотири рази перевищує таку кількість для апопльнення їх із кон’югату і створення фракції клітин, тичних клітин. що містить апоптичні клітини. 12. Спосіб за п. 4, який відрізняється тим, що 23. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що використовують лектин Viscum album (VAA) і попекон’югований лектин – це лектин-кон’югований редньо встановлена кількість лектину для спостеносій. 24. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що реження аглютинату інтактних клітин перевищує таку кількість для апоптичних клітин у 4-128 разів. лектин мічений маркером, вибраним з групи: фер13. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що ментативна мітка, біотин, флуоресцентна мітка зразок клітин представлений людськими лімфоциабо їх комбінації. 25. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що тами. 14. Спосіб швидкого виявлення апоптичних клітин, лектин здатний одночасно зв’язувати щонайменш що базується на аглютинації, який додатково дві клітини. 26. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що включає: а) встановлення мінімальної концентрації лектину, лектин здатний зв’язувати α-D-манозовмісні глікощо спричинює аглютинацію клітин досліджуваного протеїни, β-D-галактозовмісні глікопротеїни або ж зразка, обидва їх типи. 27. Спосіб за п. 22, який відрізняється тим, що б) порівняння встановлених в п. а) мінімальних лектин вибрано із наступної групи: Pisum sativum концентрацій лектину для зразків інтактних та апо(PSL), Polygonatum multiforum (PMRL), Galanthus птичних клітин, nivalis (GNA), Ricinus communis (RCA-120), Viscum в) визначення залежності мінімальної концентрації album (VAA) або їх поєднань. лектину, за п. а), від відносного вмісту апоптичних клітин у зразку, визначеного з використанням ста28. Набір для швидкого виявлення апоптичних ндартних суспензій, що містять відомий відсоток клітин, який базується на аглютинації, відрізняєтьапоптичних клітин, та з використанням розчину ся тим, що містить певну кількість лектину, який лектину однієї партії, має щонайменш два вуглеводрозпізнавальних г) визначення вмісту апоптичних клітин у зразку домени, та вказівки для застосування цього лектиклітин за визначеною залежністю (за п. в). ну для виявлення і/або підрахунку апоптичних клі15. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що тин. 29. Набір за п. 28, який відрізняється тим, що лектин мічений маркером, вибраним з групи: ферментативна мітка, біотин, флуоресцентна мітка лектин здатний одночасно зв’язувати щонайменш або їх комбінації. дві клітини. 16. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що 30. Набір за п. 28, який відрізняється тим, що лектин здатний одночасно зв’язувати щонайменш лектин, здатний зв’язувати α-D-манозовмісні глікодві клітини. протеїни, β-D-галактозовмісні глікопротеїни або ж 17. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що обидва їх типи. 31. Набір за п. 28, який відрізняється тим, що лектин здатний зв’язувати α-D-манозовмісні глікомістить лектин із наступної групи: Pisum sativum протеїни, β-D-галактозовмісні глікопротеїни або (PSL), Polygonatum multiforum (PMRL), Galanthus обидва типи глікопротеїнів. 18. Спосіб за п. 14, який відрізняється тим, що nivalis (GNA), Ricinus communis (RCA-120), Viscum лектин, вибрано із наступної групи: Pisum sativum album (VAA) або їх поєднання. (PSL), Polygonatum multiforum (PMRL), Galanthus 5 94920 6 32. Набір за п. 28, який відрізняється тим, що та апоптичних клітин на різних стадіях після індукмістить лектин, отриманий із Pisum sativum (PSL) ції апоптозу, з метою визначення кількості апоптичи Viscum album (VAA). чних клітин. 33. Набір за п. 28, який відрізняється тим, що 39. Набір за п. 38, який відрізняється тим, що вказівки до використання певної кількості лектину попередньо встановлена кількість лектину, що для виявлення апоптичнх клітин зокрема включаспричиняє утворення аглютинату інтактних та апоють вказівки до додавання кількості лектину до птичних клітин на різних стадіях після індукції апозразка клітин, виявлення аглютинату у зразку кліптозу визначається із порівняння з кількостями тин, де кількість лектину менша, ніж така кількість, лектину, що спричиняють утворення аглютинату що викликає появу аглютинату інтактних клітин, а контрольних зразків клітин із відомим вмістом апонаявність апоптичних клітин визначають за утвоптичних клітин. ренняи аглютинату методами візуалізації. 40. Спосіб швидкого виділення апоптичних клітин, 34. Набір за п. 33, який відрізняється тим, що що базується на їх взаємодії з лектином(ами), відвказівки зокрема включають визначення мінімальрізняється тим, що виділення апоптичних клітин ної кількості лектину, що спричинює утворення здійснюють за допомогою кон’югованих α-Dаглютинату клітин; порівняння найменшої кількості манозоспецифічних лектинів, β-Dлектину із попередньо встановленими кількостями, галактозоспецифічних лектинів або обох типів лещо спричиняють утворення аглютинату інтактних ктинів. 41. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що та апоптичних клітин, де мінімальна кількість лектину менша, ніж попередньо встановлена кількість кон’югований лектин – це лектин-кон’югований лектину, яка викликає утворення аглютинату інтакносій. 42. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що тних клітин, а наявність апоптичних клітин визначають за утворенням аглютинату методами візуапередбачає підготовку зразку клітин, взаємодії лізації. зразку клітин із кон’югованим лектином для утво35. Набір за п. 34, який відрізняється тим, що рення фракції клітин, що зв’язані із кон’югованим лектин отримують із Pisum sativum (PSL) і поперелектином, і фракції клітин, що не зв’язані із дньо встановлена його кількість для утворення кон’югованим лектином; розділення фракцій кліаглютинату інтактних клітин, у вісім разів вища, ніж тин, що зв’язані із кон’югованим лектином та кліаналогічна кількість для апоптичних клітин. тин, що не зв’язані із кон’югованим лектином; від36. Набір за п. 34, який відрізняється тим, що ділення фракції клітин, що зв’язані із кон’югованим лектин отримують із Polygonatum multiforum лектином від кон’югованого лектину. 43. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що (PMRL) і попередньо встановлена його кількість для утворення аглютинату інтактних клітин, у чомістить лектин, мічений маркером, вибраним з тири-вісім разів вища, ніж аналогічна кількість для групи: ферментативна мітка, біотин, флуоресцентапоптичних. клітин. на мітка або їх комбінації. 37. Набір за п. 34, який відрізняється тим, що 44. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що лектин отримують із Viscum album (VAA) і поперемістить лектин, здатний одночасно зв’язувати щодньо встановлена його кількість для утворення найменш дві клітини. 45. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що аглютинату інтактних клітин, у 4-128 разів вища, ніж аналогічна кількість для апоптичних клітин. містить лектин, здатний зв’язувати α-D38. Набір за п. 28, який відрізняється тим, що манозовмісні глікопротеїни, β-D-галактозовмісні вказівки щодо використання певної кількості лекглікопротеїни або ж обидва типи глікопротеїнів. 46. Спосіб за п. 40, який відрізняється тим, що тину для кількісного підрахунку апоптичних клітин містить лектин із наступної групи: Pisum sativum зокрема включають вказівки до: визначення най(PSL), Polygonatum multiforum (PMRL), Galanthus меншої кількості лектину, що спричинює утворення nivalis (GNA), Ricinus communis (RCA-120), Viscum аглютинату клітин; порівняння найменшої кількості album (VAA) або їх поєднання. лектину із попередньо встановленими кількостями, що спричиняють утворення аглютинату інтактних Винахід відноситься до області біології та медицини та може знайти застосування для діагностичних цілей у медицині. Апоптоз - це фізіологічний процес запрограмованої смерті клітини, котрий повинен підтримувати відповідну кількість клітин в живому організмі. Апоптоз характеризується чіткою послідовністю подій, які врешті призводять до загибелі клітини і є головним процесом, відповідальним за знищення існуючих клітин. Через це апоптоз відіграє ключову роль в оновленні застарілих клітин і видаленні "хворих" або вірус-інфікованих клітин. Порушення цього процесу можуть призводити до різноманітних патологічних станів, наприклад, автоімунних розладів або раку. За останнє десятиліття було описано ряд характеристичних маркерів апоптозу, і бони використовуються у практичних цілях для виявлення апоптичного процесу. Більшість маркерів апоптозу належить до біохімічних маркерів, локалізованих у ядрі, цитоплазмі або мітохондріях клітини. (Trauth ВС, Keesey J. Cell death. Guide to cell proliferation and apoptosis methods. Mannheim: Boehringer Mannheim; 1995. р. 34-62; Molecular Biology of the Cell, 4th ed, Alberts В.; Johnson A.; Lewis j.; Raff M., Roberts K.; Walter P., 2002, New York, Garland Science, 1536 p.). Найбільш характеристичними цитоморфологічними змінами, що можуть бути виявленими світловою мікроскопією, є конденсація цитоплазми, агрегація хроматину, "зморщування" 7 94920 8 цитоплазматичної мембрани з формуванням апоby staining of acid-treated apoptotic cells with FITCптичних тілець, вкритих інтактною плазматичною labeled lectin from Narcissus pseudonarcissus. мембраною і фрагментація ядра. Найтиповішими Cytometry 55A:86-93). Обробка людських апоптичбіохімічними маркерами апоптозу є: експресія них лімфоцитів FITC-міченим СоnА показала зросспецифічних каспаз і поява у цитоплазмі цитохротання рівня певних вуглеводів на плазматичній му с (ChangHY, Yang X. Proicases for cell suicide: мембрані цих клітин (Chionna A, Dwikat Μ, functions and regulation of caspases. Microbiol Mol Panzarini E, Tenuzzo Β, Carla EC, Verri Τ, Pagliara Biol Rev 2000; 64:821-846; Coher GM. Caspases: Ρ, Abbro L, Dini L, 2003. Cell shape and plasma the executioners of apoptosis. Biochem J 1997; membrane alterations after static magnetic fields 326:1-16; fujimura M, Morita-Fujimura Y, et al. exposure. Eur J Histochem 47:299-308). Cyiosolic redistribution of cylochrcme с after focal Відомі білки, які специфічно зв'язуються із вугcerebral ischemia in rats. J. Cereb Blood Flow Metab леводами певної специфічності - лектини (Луцик 1998; 18:1239-1247; Perez-Pinzon MA, Xu GP, Born М.Д., Панасюк Е.Н., Луцик А.Д. Лектины. - Львов.: J, et al. Cytochrome С is released from mitochondria Вища школа, 1981. - 146 с.). Вони широко застосоinto the cytosol after cerebral anoxia or ischemia. J вуються у гістології і цитології для різноманітних Cereb Blood Flow Metab 1999; 19:39-43), експресія цілей, як наприклад, ідентифікація вуглеводневих про- і антиапоптичних білків родини ВсІ-2 у мітохозалишків мембранних компонентів (Kawiak J, ндріях (Reed JC. Bcl-2 and the regulation of Skorski T, Ciechanowicz A, et al. Cytochemical programmed cell death. J Cell Biol 1994; 124:1), і characterization of mouse L1210 leukemia. Immunol фраіменгація ДНК у ядрі (Wуllie A. GlucocorticoidInvest 1988; 17:543-550), руйнування пухлинних induce thymocyte apoptosis is associaied with клітин (Khopade AJ, Nandakumar KS. Jain NK. endogenous endonuclease activation. Nature 1980; Lectin-functionalized multiple emulsions for improved 284:555-556). Цитоплазматична мембрана апоптиcancer therapy. J Drug Target 1998; 6:285-292), та чної клітини, як вважалось, залишається відносно індукція клітинного росту і диференціації (Lucas T, інтактною. Krugluger W, Samorapoompichit Ρ, et al. SelfНа противагу цитоплазмі, ядру та мітохондріrenewal, maturation, and differentiation of the rat ям, де виявлено численні зміни після індукції апоmyelomonocytic hematopoietic stem cell. FASEB J птозу, лише декілька маркерів апоптичного проце1999; 13:263-272). су було знайдено у плазматичній мембрані. Найбільш близьким за технічною суттю до Єдиною добре описаною зміною у плазматичній способу, що заявляється, є спосіб детектування мембрані була транслокація фосфатидилсерину із апоптичних та некротичних клітин шляхом детеквнутрішнього на зовнішній бік плазматичної мемтування методом проточної цитометрії взаємодії брани, яку можна виявити Аннексин Vвуглеводів у складі глікокон'югатів, що містяться специфічним зв'язуванням (Fadok VA, Voelker DR, на мембрані апоптичних та некротичних клітин із Campbbell PA, et al. Exposure of phosphatidylserine лектинами, до яких приєднанні флуоресцентні on the surface of apoptotic lymphocytes triggers мітки, такі як флюресцеїнізотіоціанат (FITC), проspecific recognition and removal by macrophages. J підіq йодид, або трипановий синій (Патент Immunol 1992; 148:2207-2216; Zhang G, Gurtu V, ЕР1366362В1 від 13.12. 2003, МПК G01N33/50; Kain SR, Yan G. Early detection of apoptosis using a G01N33/569. Method for the identification of fluorescent conjugate of annexin V. Biotechniques apoptotic and necrotic cells. Також опублікований як 1997; 23:525-531). Здатність білка Аннексину V Патенг DE10053521A1 Німеччини від 8.05.2002, специфічно зв'язувати фосфатидилсерин була МПК C12Q1/02: С12N5/00. Verfahrcn zum Nachweis використана для розвитку нових методів виявленapoptotischer und necrotischer Zellen). ня апоптозу (Патент 5834196 США від 11.10.1998, Спосіб здійсюється в наступні етапи. У зразок МПК G01N33/566; G01N33/569H. Method for суспензії досліджуваних клітин вносять почергово detecting and/or optionally quantifying and/or лектини, до яких приєднанні флуоресцентні мітки, separating apoptotic cells in or from a sample). спочатку, для збільшення кислотності розчину, Недоліком даного методу є його висока вармурашину кислоту у такій кількості, щоб мембрана тість та складність проведення аналізу, Оскільки апоптичних клітин стала проникливою, а мембравимагає використання специфічного білка Аннекна живих клітин залишалась непроникливою, посину V, отримання якого біотехнологічними методальше, для збільшення величини рН або лужносдами є дорогим, а природні джерела (морська меті розчину, фосфатний буфер або карбонатний дуза) майже недоступні. Його вартість становить розчин, та реєструють зміни кількості лектину, близько 500 доларів США за набір для 96 аналізів. зв'язаного із мембраною досліджуваних клітин, Відомі інші способи виявлення апоптозу, в осметодом проточної цитометрії. нові яких є зміни плазматичної мембрани. ГлікопНедоліком даною способу є його висока варротеїни плазматичної мембрани складають дуже тість аналізу і необхідність використання складних складну систему, і експресія деяких глікопротеїнів та громіздких приладів для виявлення, таких, як плазматичної мембрани змінюється впродовж проточні цитометри, що потребує спеціально обапоптозу. Встановлено, що короткочасна дія кисладнаних лабораторій та технічно підготовленого лоти на апоптичні клітини, пізніше забарвлені персоналу для проведення такою аналізу. ПропоFITC-міченим лектином з Narcissus нований спосіб перед операцією виявлення апопpseudonarcissus може бути надійним інструментом тичних клітин передбачає спочатку кислотну обродля раннього виявлення апоптозу (Heyder Ρ, Gaipl бку клітин, а в подальшому збільшення лужності US, Beyer TD, Voll RE, Kern PM, Stach C, Kalden розчину, що ускладнює проведення аналізу і може JR, Herrmann M, 2003. Early detection of apoptosis привести до зростання на порядок похибок визна 9 94920 10 чення концентрації апоптичних клітин. Окрім того, можна застосовувати лектин, що зв'язує -Dпропонований метод вимагає суворого дотриманманнозовмісні глікопротеїни, -D-галактозовмісиі ня часових інтервалів додавання реактивів триваглікопротеїни, або ж обидва ці типи глікопротеїнів. лістю у 10 с., що часто є перешкодою для точних У іншому втіленні лектин можна підбирати із групи та масових досліджень (Heyder P, Gaipl US, Beyer лектинів, що включає в себе наступні: Pisum TD, Voll RE, Kern PM, Stach C, Kalden JR, sativum (PSL), Polygonatum multiforum (PMRL), Herrmann M, 2003. Early detection of apoptosis by Galanthus nivalis (GNA), Ricinus communis (RCAstaining of acid-treated apoptotic cells with FITC120), Viscum album (VAA), або ж їх комбінації. У Іabeled lectin from Narcissus pseudonarcissus. іншому випадку використовуються лектини з Pisum Cytometry 55A:86-93). sativum (PSL) або Viscum album (VAA). В основу винаходу поставлено завдання удоУ одному втіленні підрахунок кількості апоптисконалити спосіб виявлення, виділення та підрачних клітин може включати в себе підрахунок кільхунку апоптичних клітин шляхом використання кості апоптичних клітин через 12 годин після індукаглютинуючих властивостей лектинів та забезпеції апоптозу. чити швидке та надійне проведення аналізу без У одному з втілень лектин можна отримувати з використання складного, громіздкого та дорогого Pisum sativum (PSL) і попередньо відомі кількості обладнання. лектину, необхідного для аглютинації інтактних Поставлене завдання вирішується так, що у клітин у вісім разів вищі, ніж для апоптичних. У відомому способі виявлення, виділення та підраіншому втіленні застосовувався лектин з хунку апоптичних клітин, що базується на аглютиPolygonatum multiforum (PMRL) і попередньо відомі нації, який включає внесення у суспензію дослікількості лектину, необхідного для аглютинації джуваних клітин певної кількості лектинів, і інтактних клітин у чотири рази вищі, ніж для апопвідрізняється тим, що лектини, взяті для аналізу, тичних. У іншому втіленні можна застосовувати мають щонайменш дві вуглевод розпізнавальних лектин Viscum album (VAA) для якого попередньо ділянки (а отже, можуть зв'язувати принаймні дві відомі кількості лектину, необхідного для аглютиклітини), а спостереження аглютинації клітин в нації інтактних клітин у 4-128 разів вищі, ніж такі досліджуваному зразку свідчить про наявність для апоптичних клітин. апоптичних клітин. У одному з варіантів втілення винаходу можна Даний винахід включає способи та набори редля порівняння із зразком клітин використовувати активів для виявлення, підрахунку та виділення людські лімфоцити. апоптичних клітин з використанням аглютинуючих Інші способи даного винаходу забезпечують властивостей лектинів. Винахідники встановили, визначення кількості апоптичних клітин. У одному що концентрація необхідного для аглютинації лекіз втілень спосіб кількісної оцінки вмісту апоптичтину обернено пропорційна кількості -D-маннзоних клітин включає в себе забезпечення лектином, та -D-галактозовмісних глікокон'югатів у клітинній що має щонайменш два вуглевод-зв'язуючих домембрані. мени, визначення мінімальної кількості лектину, Різноманітні втілення даного винаходу забезщо спричинює аглютинацію досліджуваного зразка печують методи виявлення апоптичних клітин у і порівняння отриманого значення із значенням зразках клітин. У одному з втілень метод виявлендля попередньо визначених концентрацій лектину, ня апоптичних клітин в зразку включає взаємодію з що аглютинував контрольні та апоптичні клітини лектином, що містить принаймні дві вуглеводна різних стадіях цього процесу. Це дозволяє зв'язувальні ділянки; та додавання певної кількості встановити кількість апоптичних клітин у дослілектину до зразка клітин, при цьому наявність агджуваному зразку. лютинації в зразку свідчить про присутність апопУ одному з втілень лектин може бути марковатичних клітин. ним однією з наступних типів міток: ферментативВ одному з втілень кількість лектину може бути на мітка, біотинова мітка, флуоресцентний маркер меншою за кількість лектину, здатну викликати або їх комбінації, і спосіб, відповідно, грунтується аглютинацію інтактних клітин. на виявленні мітки, що свідчитиме про присутність У одному з втілень лектин може бути мічений апоптичних клітин. маркером ферментної природи, біотином, флуоУ одному з втілень лектин повинен бути здатресцентним маркером або комбінацією цих міток, і ним одночасно зв'язуватись із двома клітинами. спосіб, у свою чергу, полягатиме у виявленні цієї У іншому втіленні можна застосовувати лекмітки в досліджуваному зразку, що свідчитиме про тин, що зв'язує -D-маннозовмісні глікопротеїни, присутність в ньому апоптичних клітин. D-галактозовмісні глікопротеїни, або ж обидва ці У іншому втіленні спосіб полягатиме у визнатини глікопротеїнів. ченні мінімальної кількості лектину, необхідної для У іншому втіленні лектин можна підбирати із аглютинації клітин, і порівняння її із мінімальною групи лектинів, що включає в себе наступні: Pisum кількістю лектину, необхідною для аглютинації sativum (PSL), Polygonatum multiforum (PMRL), інтактних або апоптичних клітин, де мінімальна Galanthus nivalis (GNA), Ricinus communis (RCAкількість лектину - це менша за попередньо вста120), Viscum album (VAA), або ж їх комбінації. У новлену кількість лектину, котра спричинює аглюодному втіленні можна використовувати лектин з тинацію інтактних клітин, що свідчитиме про приViscum album (VAA). сутність апоптичних клітин у досліджуваному В одному втіленні підрахунок кількості апоптизразку. чних клітин може включати в себе підрахунок кільУ одному з втілень лектин може зв'язувати одкості апоптичних клітин за 12 годин після індукції ночасно щонайменш дві клітини. У іншому втіленні апоптозу. 11 94920 12 У одному втіленні наперед відомі кількості лелектину це найменша попередньо визначена кільктину, що спричиняють аглютинацію інтактних та кість лектину, що спричинює аглютинацію і свідапоптичних клітин на різних стадіях цього процесу, чить про наявність апоптичних клітин. можуть визначатись із кореляції кількостей лектиУ одному з втілень, лектин можна отримувати ну, що спричиняє аглютинацію контрольних зразків з Pisum sativum (PSL) і попередньо відомі кількості клітин із відомою часткою апоптичних. лектину, необхідного для аглютинації інтактних Інші втілення даного винаходу забезпечують клітин у вісім разів вищі, ніж для апоптичних. У способи виділення апоптичних клітин зі зразка інакшому втіленні застосовувався лектин з клітин. В одному з втілень спосіб виділення клітин Polygonatum multiforum (PMRL) і попередньо відомі зі зразка включає в себе підготовку кон'югованого кількості лектину, необхідного для аглютинації лектина, контакт зразку клітин із кон'югованим лекінтактних клітин у чотири рази вищі, ніж для апоптином для створення фракції клітин, що зв'язалась тичних. У іншому втіленні можна застосовувати з лектином, і фракції клітин, незв'язаних із лектилектин Viscum album (VAA) для якого попередньо ном. Згодом проводиться розділення цих клітинвідомі кількості лектину, необхідного для аглютиних фракцій і отримання фракції апоптичних клінації інтактних клітин у 4-128 разів вищі, ніж для тин, які зв'язані з лектином. апоптичних. У одному із втілень кон'югований лектин може Зразки втілення винаходу ілюстровані на опибуги лектин-кон'югованим носієм. В інших втіленсаних нижче рисунках, з наміром розкриття варіаннях кон'югат може бути міткою, наприклад, фертів втілення, як ілюстрації, а не обмеження. ментативним маркером, біотином, флуоресцентНа Фіг. 1 зображено результати денситометним маркером або їх комбінацією, і спосіб може ричного аналізу (середнє±стандартна похибка) включати в себе виявлення мітки, а вже наявність інтактних (прозорі стовпці) та апоптичних (чорні мітки визначатиме наявність апоптичних клітин. стовпці) мишачих лейкемічних клітин лінії L1210S У одному з втілень лектин може зв'язувати од(апоптоз індукувався 100 мкг/мл метотрексату) ночасно щонайменш дві клітини. У іншому втіленні відповідно до втілення даного винаходу. Клітини забарвлювались різноманітними лектинами, мічеможна застосовувати лектин, що зв'язує -Dними пероксидазою хрону (HRP). І: цукор-інгібітор маннозовмісні глікопротеїни, -D-галактозовмісні (35 mМ; ММаn для PSL і лактоза для RCA-120). глікопротеїни. або ж обидва ці тини глікопротеїнів. *Р