Спосіб лікування раку у ссавця за допомогою поліпептиду, що протидіє взаємодії april з його рецепторами

1. Спосіб лікування раку у ссавця, де ракові клітини експресують ліганд, який індукує проліферацію (APRIL), при цьому вказаний спосіб включає введення вказаному ссавцеві терапевтично ефективної кількості композиції, що містить щонайменше один із наступних компонентів: C2 2 UA 1 3 74798 4 на долю клітин і часто «запускають» кінцеву диУ імунологічних процесах агенти, які блокують ференціацію. Приклади клітинної диференціації передачу сигналів через TNF-рецептори (напривключають проліферацію, дозрівання, міграцію і клад, анти-TNF-mAb, розчинні злиті TNF-R-білки), загибель. використали для лікування захворювань, подібних Члени сімейства TNF представляють пов'язані ревматоїдному артриту і запальному захворюванз мембраною білки типу II, що мають короткий ню кишечнику. При цих патологіях TNF діє, індукувнутрішньоклітинний N-кінцевий домен, трансмеючи клітинну проліферацію і ефекторну функцію, мбранний домен і С-кінцеві зв'язуючі рецептор загострюючи тим самим аутоімунне захворювання, домени, які лежать на зовнішній клітинній поверхі в цьому процесі блокування зв'язування TNF з ні. У деяких випадках позаклітинна дільниця білка його рецептором(ами) має терапевтичну користь відщеплюється, створюючи секретовану форму [Beutler, 1999. J. Rheumatol 26 Suppl. 57:16-21]. цитокіну. Незважаючи на те, що пов'язані з мемВиявилося, що відкрита нещодавно система браною білки діють локально, ймовірно, через ліганд/рецептор піддається аналогічній регуляції. опосередковану клітинами контактну взаємодію з Лімфотоксин-бета (LT ), член сімейства TNF, який їх рецепторами, секретовані форми володіють утворює гетеродимери з LT , зв'язується з LT -R. потенційною можливістю циркулювати або дифунДеякі пухлинні клітини аденокарциноми, які ексдувати, отже, можуть діяти на віддаленні. Як попресують LT -R, можуть загинути або зазнати див'язані з мембраною, так і секретовані форми знаференціації при обробці агоністичними анти-LT ходяться у вигляді тримерів, і вважають, що вони R-mAb [Browning et аl., 1996. J. Exp. Med. 183:867передають свій сигнал рецепторам, сприяючи 878]. Було показано в імунологічний процесах, що утворенню рецепторних кластерів. анти-LT -mAb або розчинний злитий LT -R-IgСімейство рецепторних білків TNF характерибілок може блокувати розвиток запальних захвозується наявністю одного і більше багатих цистеїрювань кишечнику, можливо, діючи на взаємодію ном доменів. Кожний багатий цистеїном домен дендритних клітин і Т-клітин [Маскау et аl., 1998. утворює пов'язану через дисульфідний зв'язок Gastroenterology 115:1464-1475]. ядерний домен, який бере участь у створенні Система TRAIL також має потенційну можлитрьохмірної структури, яка утворює зв'язуючу лівість застосування як протипухлинної терапії. ганд «кишеню». Рецептори є пов'язаними з мемTRAIL взаємодіє з рядом пов'язаних з мембраною і браною білками типу І, в яких позаклітинний домен розчинних рецепторів. Два з цих рецепторів, кодується N-кінцем, потім трансмембранним доTRAIL-R1 і TRAIL-R2 (також названі DR4 і DR5) меном і С-кінцевим внутрішньоклітинним доменом. передають загибель, індукуючи сигнали пухлинВнутрішньоклітинний домен відповідальний за ним клітинам, але не нормальним клітинам, які передачу сигналу рецептором. Деякі рецептори експресують додаткові TRAIL-рецептори, які не включають внутрішньоклітинний «домен загибелі», індукують загибель. Вважають, що ці додаткові який може передавати клітинам сигнал про апопрецептори функціонують як пастки. Застосування тоз, і вони можуть являти собою ефективні індукрозчинного TRAIL для знищення пухлинних клітин тори загибелі клітин. Інша група рецепторів може в засноване на виборчій експресії рецепторів-пасток слабкій мірі індукувати загибель; виявляється, що в нормальній, але не пухлинній тканині [Gura, вони втрачають «домен загибелі». Третя група 1997. Science 277:768]. рецепторів не індукує загибель клітин. Всі групи Пухлинні клітини самі по собі часто експресурецепторів можуть передавати сигнали про проють різні рецептори-пастки, які блокують імунне ліферацію або диференціацію клітин замість загирозпізнавання або ефекторні функції. Дійсно, деякі белі, в залежності від типу клітин або наявності пухлини гіперекспресують рецептори-пастки інших сигналів. TRAIL, ймовірно, для того, щоб уникнути опосереДобре вивченим прикладом плюрипотентної дкованої TRAIL загибелі [Sheikh et al., 1999. природи активності сімейства TNF є номінантний Oncogene 18:4153-4159]. Це обмежує застосовчлен, TNF. TNF може існувати у вигляді пов'язаноність TRAIL як протипухлинного агента при деяких го з мембраною цитокіну або може бути відщеплепроцесах. Подібні спостереження були зроблені ний і секретований. Обидві форми зв'язуються з відносно рецептора-пастки для FAS-L, який гіпередвома TNF-рецепторами, TNF-R55 і TNF-R75. кспресується в пухлинних клітинах легень і ободоСпочатку описаний за його здатністю безпосередвої кишки [Pitti et al., 1998. Nature 396:699-703], і ньо вбивати пухлинні клітини, TNF також регулює для антагоніста IL-1-рецептора [Mantovani et al., велику множину імунних процесів, включаючи ін1998. Ann. NY Acad. Sei. 840:338-351]. Рецепторидукцію гострих запальних реакцій, а також підтрипастки також використовуються вірусними геномку гомеостазу в лімфоїдних тканинах. Внаслідок мами для захисту заражених клітин хазяїна від того, що даний цитокін може грати подвійну роль в захисних механізмів хазяїна. різних патологічних процесах, були розроблені APRIL (ліганд, що індукує проліферацію) є ноагоністи і антагоністи як модифікатори захворювим членом TNF-сімейства білків. На основі дослівання. Наприклад, TNF і LT (який також передає джень з експресії і функціонування APRIL можна сигнали через TNF-рецептори) використали для передбачити, що цей білок використовується пухлікування ракових захворювань, особливо з перилинними клітинами для індукції швидкої проліфеферичною локалізацією, таких, як лімбічна саркорації. Лінії пухлинних клітин, оброблені розчинним ма. При даному процесі безпосередня передача APRIL-білком, або трансфіковані кДНК APRIL, сигналів цитокінами через рецептор індукує загишвидко ростуть в умовах in vitro. Трансфіковані бель пухлинних клітин [Aggarwal and Natarajan, APRIL клітини, імплантовані мишам з імунодефі1996. Eur Cytokine Netw 7:93-124]. цитом швидко ростуть у вигляді пухлин. Нарешті, 5 74798 6 людські пухлинні клітини, але не нормальна ткабуваються частково внаслідок відкриття того, що нина, експресують високі рівні мРНК APRIL. На деякі агенти, які являють собою агенти для лікуоснові цих спостережень можна передбачити, що вання ракових захворювань, визначені тут як антаAPRIL зв'язується з рецептором, який також ексгоністи APRIL-R, включаючи, наприклад, антипресується пухлинними клітинами, приводами до APRIL-R-антитіла, можна застосовувати для лікуаутокринної або паракринної активації пухлинних вання суб'єктів при ризику розвитку ракового заклітин. Крім того, можливо, що APRIL діє при інших хворювання, як тут визначено, або при необхіднохворобливих станах так, що активування або блості лікування ракового захворювання. кування шляху з участю APRIL буде мати додаткоТерапевтичні агенти для лікування ракового ву застосовність. Наприклад, знижена або підвизахворювання можна вводити будь-яким шляхом щена експресія APRIL може грати роль в введення, який сумісний з вибраним агентом, і аномаліях розвитку, оскільки розвиток також часто можуть бути представлені з будь-яким фармацевхарактеризується ретельно регульованим балантично прийнятним носієм, який відповідає шляху сом між проліферацією клітин і загибеллю клітин. введення. Переважними шляхами введення є паАналогічно APRIL може діяти при захворюваннях, рентеральні і, зокрема, внутрішньовенний, внутріпов'язаних з проліферацією клітин таких, якi винишньоочеревинний і внутрішньосуглобний. Лікуванкають при деяких аутоімунних захворюваннях (наня також переважно провести протягом тривалого приклад, вовчаку) або при запальних захворюванперіоду часу амбулаторно. Вважається, що добові нях, де відбувається швидке збільшення клітинних дози агентів для лікування ракового захворювання популяцій (наприклад, бактеріальний сепсис). будуть знаходитися в межах приблизно 0,01Засновуючись на популярності використання 1000мкг/кг маси тіла, і більш переважно приблизно агоністів і антагоністів TNF і членів сімейства TNF10-300мкг/кг маси тіла, хоча точні дози будуть варецепторів як модуляторів захворювання, шлях з ріювати в залежності від конкретного агента, що участю APRIL сам по собі представляє важливу використовується для лікування ракового захвомішень для розробки лікарських препаратів. Це рювання і конкретного стану суб'єкта і анамнезу. особливо вірне для лікування ракових захворюЛікування за даним винаходом придатне для вань, оскільки, як виявилося, пухлинні клітини знищення в основному клональної популяції (копродукують і використовують APRIL для підтримки лонії) трансформованих клітин в організмі ссавця їх власного зростання і, отже, мало ймовірно, що або придушення або ослаблення зростання коловони продукують рецептори-пастки або інші антанії, яку звичайно відносять як до пухлини. Як такі гоністи шляху з участю APRIL. Таким чином, шлях вони придатні для продовження життя і для підтз участю APRIL унікально відрізняється, наприримки якості життя у суб'єктів при ризику виникклад, від шляхів з участю TRAIL або FAS-L, яким нення або вже уражених раковим захворюванням. можна перешкоджати за допомогою пухлинних На Фігурі 1 показана послідовність (SEQ ID рецепторів-пасток. NO:1) нуклеїнової кислоти кДНК мишачого APRIL і Види лікування ракових захворювань, що існа основі її амінокислотна послідовність (SEQ ID нують в цей час, є неадекватними для багатьох NO:3) у вигляді карти у векторі рССМ213.10. типів пухлин за рахунок слабкої ефективності, неПредставлене підкресленим є myc-епітопом і амізначного впливу на виживаність, токсичності, яка нокислотами з FasL. Початок послідовності, що викликає важкі побічні ефекти, або їх комбінацій. кодує позаклітинний домен APRIL, вказаний стрілОтже, є потреба в ідентифікації і розробці додатками. кових способів лікування розвитку ракових захвоНа Фігурі 2 показана послідовність (SEQ ID рювань, які можуть забезпечити ефективність, не NO:4) нуклеїнової кислоти і на основі її амінокисвикликаючи важких побічних ефектів. Отже, анталотна послідовність (SEQ ID NO:6) конструкції гоністи шляху з участю APRIL, включаючи антиFLAG-людського APRIL для експресії в клітинах APRIL-mAbs, анти-APRIL рецепторні-mAbs, розссавців. Карта вказує сигнальну послідовність (1чинні APRIL рецепторні-Ig злиті білки, природні 15); FLAG-епітоп (АА 16-23) і початок послідовносантагоністи, невеликі молекули-антагоністи і хімічті, що кодує позаклітинний домен людського APRIL ні, фармацевтичні або інші антагоністи будуть ко(32-кінець). рисними. На Фігурі 3А показана послідовність (SEQ ID Для цієї мети заявники ідентифікували опосеNO:7) нуклеїнової кислоти і амінокислотна посліредкований В-клітинами білок (ВСМ або ВСМА) як довність (SEQ ID NO:8) повної довжини людського рецептор APRIL. ВСМА. На Фігурі 3В показана послідовність (SEQ Заявники встановили, що ВСМА є рецептором ID NO:11) нуклеїнової кислоти pJST538, плазміди, для фактора некрозу пухлин, APRIL. APRIL предщо кодує людську злиту конструкцію APRIL-Rставляє ту ж молекулу, описану раніше в hlgGFc, і на основі її амінокислотна послідовність WO9912965, яка включена тут для відома. APRIL(SEQ ID NO:12). рецептор визначений надалі як «APRIL-R». Даний На Фігурі 4 показано зв'язування mycвинахід направлений на способи лікування і фармишачого APRIL з мишачою В-клітинною лімфомацевтичні препарати для застосування з метою мою лінії А20. У трьох окремих дослідах була полікування видів ссавців, що вже мають ракове заказана наявність специфічного зв'язування APRIL хворювання або при ризику його розвитку. Дані з клітинами А20 у порівнянні з А) незабарвленими суб'єкти включають суб'єктів, вже уражених ракоклітинами і клітинами, забарвленими тільки R1532, вим захворюванням, або які вже піддавались проВ) клітинами, забарвленими RANKL-L і R1532 і С) типухлинній терапії. клітинами, забарвленими APRIL, і невідповідною Способи і композиції за даним винаходом відкролячою сироваткою. 7 74798 8 На Фігурі 5 показано зв'язування mycклітини NIH3T3 утворюють фібросаркому. мишачого APRIL з людською В-клітинною лімфоНа Фігурі 14 показане зростання людської кармою лінії RAJI. У двох окремих дослідах була поциноми ободової кишки SW480, імплантованої казана наявність специфічного зв'язування APRIL підшкірно мишам з імунодефіцитом (Nu/Nu), оброз клітинами RAJI у порівнянні з А) незабарвленими блених контрольними реагентами або злитим білклітинами і клітинами, забарвленими тільки R1532, ком hBCMA-Ig. і клітинами, забарвленими RANK-1 і R1532 і В) На Фігурі 15А показане зростання людської клітинами, забарвленими APRIL, і невідповідною карциноми ободової кишки НТ29, імплантованої кролячою сироваткою. підшкірно мишам з імунодефіцитом, оброблених На Фігурі 6 показано, що зв'язування APRIL з контрольними реагентами або злитим білком клітинами А20 (А) і клітинами RAJI (В) є конкуренhBCMA-Ig. На Фігурі 15В показане зростання людтним з використанням розчинного білка BAFF або ської карциноми легень А549, імплантованої підшрозчинного білка BCMA-Ig. кірно мишам з імунодефіцитом (Nu/Nu), оброблеНа Фігурі 7 показано зв'язування FLAGних контрольними реагентами або злитим білком людського APRIL з клітинами різних ліній: А) клітиhBCMA-Ig. нами А20, В) клітинами НТ29, С) клітинами Визначення NIH3T3. Специфічне зв'язування показане з викоДля того, щоб більш чітко і стисло з'ясувати ристанням детекції біотинільованих анти-FLAGсуть заявленого винаходу, надаються наступні mAb М2 у порівнянні зі зв'язуванням, що спостерівизначення спеціальних термінів, використаних в гається з невідповідними ізотипними контрольниподальшому описі і прикладеній формулі винахоми mАЬ і без додавання FLAG-APRIL. ду. На Фігурі 8 показана імунопреципітація mycДалі винахід буде описаний при зверненні до inAPRIL з використанням злитого BCMA-Fc-білка. подальшого докладного опису, в який включені Верхня ліва панель показує специфічну hBMCAнаступні визначення: Fc/myc-mAPRIL і позитивну контрольну імунопреТерміни «APRIL-рецептор» або «APRIL-R», що ципітації у порівнянні з верхніми правими негативвикористовуються тут, включають природну посліними контролями. У нижніх панелях показано, що довність APRIL-R і варіанти APRIL-R. APRIL-R мокількості навантаженого білка були еквівалентнижна виділити з різних джерел таких, як типи мишами. чих або людських тканин або з іншого джерела, На Фігурі 9 показані досліди з ELISA, що деабо одержати рекомбінантними або синтетичними монструють, що FLAG-h APRIL зв'язується зі злиметодами. Крім того, термін APRIL-R додатково тим hBCMA-Fc-білком. Різні рецепторні злиті Fcвідноситься до поліпептиду, який здатний зв'язубілки наносили на планшети для ELISA і зв'язуваватися з членом сімейства фактора некрозу пухли з FLAG-міченими лігандами. А) Детектування лини, APRIL, або його гомологами, або фрагменпов'язаних лігандів виявило, що тільки APRIL і тами. Прикладом APRIL-R є ВСМА. hBAFF специфічно зв'язуються з hBCMA-Fc, але Термін «ВСМА» або «ВСМ» відноситься до не hCD40-Fc. В) Титрування дози, що показує, що нового білка для дозрівання В-клітин, як описано у сигнал ELISA, виявлений після зв'язування hAPRIL [Gras et al. (1995), International Immunology, 7:1093або hBAFF на покритих hBCMA-Fc планшетах, мав 1106, «BCMAp»: an integral membrane protein in the лінійну залежність по відношенню до кількості доgolgi apparatus of human mature В lymphocytes; Y. даного білка. Laabi et al. (1995), EMBO J., 11, 3897-3904, «A new На Фігурі 10 показана імунопреципітація FLAGgene BCM on Chromosome 16 is fused to the hAPRIL і FLAG-hBAFF злитим hBCMA-Fc-білком. interleukin 2 gene by a t (4; 16) (q26:pl3) Верхні 4 панелі показують еквівалентність білкоtranslocation in a malignant Τ cell lymphoma»]. вих навантажень при кожній реакції імунопреципі«Природна послідовність APRIL-R» включає тації, в той час, як нижні панелі показують, що поліпептид, що має таку ж амінокислотну послідоhAPRIL і hBAFF імунопреципітувались hBCMA-Fc, вність, як APRIL-R, виділений з природи. Подібну але не hTRAIN-Fc. природну послідовність APRIL-R можна виділити з На Фігурі 11 показаний аналіз ВіаСоге зв'язуприродних джерел або можна одержати рекомбівання myc-mAPRIL, FLAG-hBAFF і FLAG-mBAFF з нантними або синтетичними методами. Природна hBCMA, hLТбета-рецептором або hTNF-R80 або послідовність APRIL-R може представляти усічені контролем, що показує специфічне зв'язування або секретовані форми APRIL-R (тобто розчинні тільки з hBCMA. форми, що включають, наприклад, послідовність На Фігурі 12 показано зв'язування APRIL з позаклітинного домену), що є в природних умовах, трансфікованими ВСМА клітинами. Клітини варіантні форми (наприклад, альтернативно 293EBNA трансфікували плазмідою, яка експресує сплайсовані форми), що є в природних умовах, і повну довжину hBCMA. Клітини збирали через природні алельні варіанти APRIL-R. У одному вті48год. з використанням 5мМ ЕДТА і забарвлювали ленні винаходу природна послідовність APRIL-R є myc-hAPRIL. Панель А показує, що міра фарбузрілою або природною послідовністю поліпептиду вання залежить від дози. Панель В показує, що APRIL-R повної довжини, що включає амінокислофарбування знижувалося до фонового рівня з вити 1-184 за SEQ ID NO:8, або його фрагмента. користанням розчинного білка BCMA-Ig. «Позаклітинний домен APRIL-R» або «APRILНа Фігурі 13 показане зростання клітин R ECD» відноситься до форми APRIL-R, яка в осNIH3T3, імплантованих підшкірно мишам з імуноновному вільна від трансмембранного або цитодефіцитом (Nu/Nu), оброблених контрольними плазматичного доменів APRIL-R. Звичайно позакреагентами або білком BCMA-Ig. На даній моделі літинний домен APRIL-R буде включати менше 1% 9 74798 10 таких трансмембранного і цитоплазматичного докоротким, щоб не заважати активності APRIL-R. менів і переважно буде мати менше 0,5% таких Мічений поліпептид переважно також є досить доменів. Необов'язково APRIL-R ECD буде вклюунікальним в тому плані, що антитіла в основному чати амінокислотні залишки 1-51 або 1-52, або 1не реагують перехресно з іншими епітопами. Від53 SEQ ID NO:8. У переважному втіленні APRILповідні мічені епітопи звичайно включають щонайECD включає амінокислотні залишки 4-51 за SEQ менше 6 амінокислотних залишків і звичайно приID NO:8 або більш переважно амінокислотні залиблизно від 8 до приблизно 50 амінокислотних шки 8-41 за SEQ ID NO:8. Фахівцям в даній обласзалишків (переважно приблизно від 10 до приблиті, очевидно, зрозуміло, що трансмембранний дозно 20 залишків). мен, встановлений для поліпептиду APRIL-R за «Виділений», коли використовується для опиданим винаходом, ідентифікований відповідно до су різних поліпептидів, розкритих тут, означає покритеріїв, що звичайно використовуються в даній ліпептид, який був ідентифікований і виділений області для ідентифікації даного типу гідрофобних і/або витягнутий з компонента його природного доменів. Точні межі трансмембранного домену оточення. Забруднюючими компонентами його можуть варіювати, але найбільш ймовірно не природного оточення є речовини, які звичайно більш, ніж приблизно на 5 амінокислот з кожного будуть заважати діагностичним або терапевтичкінця домену, детально вказаного тут. ним застосуванням поліпептиду, і можуть включа«Варіант APRIL-R» означає активний APRIL-R, ти ферменти, гормони і інші білкові і не білкові як визначено нижче, що має ідентичність амінокирозчинені речовини. У переважних втіленнях поліслотної послідовності щонайменше на 80% з пептид повинен бути очищеним (1) до міри, достаAPRIL-R, що має виведену амінокислотну послідотньої для одержання щонайменше 15 залишків Nвність, показану в SEQ ID NO:5 для повної довжикінцевої або внутрішньої амінокислотної послідовни природної послідовності APRIL-R, або з посліності з використанням секвенатора з чашкою, що довністю APRIL-R ECD. Подібні варіанти APRIL-R обертається, або (2) до гомогенності при провевключають, наприклад, поліпептиди APRIL-R, в денні SDS-PAGE в невідновлюючих і невідновлюяких один або більш амінокислотних залишків ючих умовах з використанням Кумасі синього або, вставлені або видалені в кінці або на С-кінці посліпереважно, срібного забарвлення. Виділений полідовності за SEQ ID NO:8. Звичайно варіант APRILпептид включає поліпептид in situ всередині рекоR буде мати ідентичність амінокислотної послідомбінантних клітин, оскільки щонайменше один вності щонайменше приблизно на 80% або 85%, компонент з природного оточення APRJL-R не більш переважно ідентичність амінокислотної посбуде бути присутнім. Однак, звичайно виділений лідовності щонайменше приблизно на 90% і ще поліпептид буде одержаний щонайменше з однією більш переважно ідентичність амінокислотної посстадією очищення. лідовності щонайменше на 95% з амінокислотною Термін «антитіло» використовується в самому послідовністю SEQ ID NO:8. широкому значенні і, зокрема, включає окремі мо«Процент (%) ідентичності амінокислотної поноклональні антитіла проти APRIL-R (включаючи слідовності» по відношенню до послідовностей агоністичні, антагоністичні і нейтралізуючі антитіAPRIL-R, ідентифікованих тут, визначається як ла) і композиції на основі анти-APRIL-R-антитіл з процент амінокислотних залишків в послідовностіполіепітопною специфічністю. Термін «моноклонакандидатові, які співпадають з амінокислотними льне антитіло», в тому значенні, як він тут викоризалишками в послідовності APRIL-R, після розтастовується, відноситься до антитіла, одержаного з шування послідовностей і введення «проломів», популяції в основному гомогенних антитіл, тобто якщо необхідно, для досягнення максимальної окремі антитіла, що складають популяцію, є іденпроцентної ідентичності послідовності і без урахутичними, за винятком можливих мутацій, що мавання будь-яких консервативних заміщень як часють місце в природних умовах, які можуть бути тини ідентичності послідовності. Розташування з присутніми в мінорних кількостях. метою визначення процента ідентичності аміноки«Очищений препарат» або «в основному очислотної послідовності можна досягнути різними щений препарат» поліпептиду, в тому значенні, як шляхами, які відомі фахівцям в даній області, нацей термін тут використовується, означає поліпепприклад, з використанням широко доступного комтид, який відділений від інших білків, ліпідів і нукп'ютерного програмного забезпечення такого, як леїнових кислот, з якими він знаходиться в приропрограмне забезпечення BLAST, ALIGN або дних умовах. Переважно поліпептид також Megalign (DNASTAR). Фахівці в даній області мовідділений від інших речовин, наприклад, антитіл, жуть визначити відповідні параметри для визнаматриксів і т.д., які використовуються для його чення розташування, включаючи будь-які алгориочищення. тми, необхідні для максимального розташування Терміни «проведення лікування», «лікування» на повній довжині послідовностей, які порівнюютьі «терапія», в тому значенні, як вони тут викорисся. товуються, відносяться до лікувальної терапії, Термін «мічений епітоп», коли тут використопрофілактичної терапії і превентивної терапії. вується, відноситься до химерного поліпептиду, Терміни «пептиди», «білки» і «поліпептиди» що включає APRIL-R, або послідовність його довикористовуються тут рівнозначно. мену, злиті з «міченим поліпептидом». Мічений «Біологічно активний», в тому значенні, як цей поліпептид має достатню кількість залишків для термін тут використовується, означає той, що возабезпечення епітопу, проти якого можна одержалодіє активністю in vivo або in vitro, яка може здійти антитіла, або який може бути ідентифікований снюватися прямо або опосередковано. Біологічно якимсь іншим агентом, який, до того ж, є досить активні фрагменти можуть мати, наприклад, 70% 11 74798 12 амінокислотну гомологію з активним сайтом рецещонайменше до частини клітинної мРНК, яка коптора, більш переважно щонайменше 80% і найдує Кay-ліганд. Альтернативно «антисмислова» більш переважно 90% гомологію. Ідентичність або конструкція може бути олігонуклеотидним зондом, гомологія по відношенню до рецептора визначаякий одержують ex vivo. Такі олігонуклеотидні зонється тут у вигляді процента амінокислотних зади переважно являють собою модифіковані оліголишків в послідовності-кандидатові, які ідентичні нуклеотиди, які стійкі до ендогенних нуклеаз і тому залишкам APRIL-R в SEQ ID NO:8. стабільні в умовах in vivo. Прикладами молекул Термін «ссавець», в тому значенні, як він тут нуклеїнових кислот для використання як «антисвикористовується, відноситься до будь-якої тваримислових» олігонуклеотидів є фосфорамідатні, ни, віднесеної до ссавця, включаючи людей, корів, фосфотіоатні і метилфосфонатні аналоги ДНК коней, собак, мишей і кішок. У переважному вті[дивись, наприклад, патенти США 5176996, ленні винаходу ссавець є людиною. 5264564 і 5256775]. Крім того, є огляд із загальних У практиці даного винаходу будуть використопідходів до конструювання олігомерів, придатних вуватися, якщо не указано інакше, звичайні методля «антисмислової» терапії, наприклад, у [Van ди клітинної біології, культивування клітин, молеDer Krol et al. (1988) Biotechniques 6:958-976; і кулярної біології, трансгенної біології, Stein et al. (1988) Cancer Res 48:2659-2668], спецімікробіології, рекомбінантної ДНК і імунології, які ально включених тут для відома. відомі в даній області. Такі методи описані в літеAPRIL-R за винаходом, як обговорювалося ратурі. вище, є членом сімейства TNF-рецепторів. Білок, Далі будуть детально представлені переважні його фрагменти або гомологи можуть мати широкі втілення даного винаходу. Даний винахід віднотерапевтичні і діагностичні застосування. ситься до використання APRIL-R і пов'язаних з Поліпептиди за винаходом специфічно взаєAPRIL-R молекул для впливу на зростання і дозрімодіють з APRIL, поліпептидом, раніше описаним вання В-клітин і клітин, що не відносяться до Bв WO99/12964, включеної тут для відома. Однак клітин, особливо, якщо вони відносяться до пухпептиди і способи, розкриті тут, створюють можлилинних клітин. Винахід також відноситься до виковість для ідентифікації молекул, які специфічно ристання APRIL-R і пов'язаних з APRIL-R молекул взаємодіють з APRIL-R або його фрагментами. для впливу на відповіді імунної системи, що є неЗаявлений винахід в деяких втіленнях включає обхідним при порушеннях, пов'язаних з імунною способи застосування пептидів, похідних APRIL-R, системою. Крім того, винахід включає лікування які володіють здатністю зв'язуватися з APRIL. Фраракового захворювання і імунних порушень за догменти APRIL-R можна одержати декількома шляпомогою використання APRIL-R або пов'язаного з хами, наприклад, рекомбінацією, з допомогою APRIL-R гена за допомогою методів генної терапії. ПЛР, протеолітичним розщепленням або хімічним APRIL-R і його гомологи, продуковані хазяями, синтезом. Внутрішні або кінцеві фрагменти політрансформованими послідовностями за винахопептиду можна одержати видаленням одного або дом, а також нативний APRIL-R, очищений способільше нуклеотидів з одного кінця або обох кінців бами, відомими в даній області, або одержаний з нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид. Ексвідомих амінокислотних послідовностей, придатні пресія ДНК, що мутувала, дає фрагменти поліпепв різних способах протиракових, протипухлинних і тиду. імунорегуляторних застосувань. Вони також приФрагменти поліпептиду також можна синтезудатні при терапії і способах, направлених на інші вати хімічним шляхом з використанням методів, захворювання. відомих в даній області, таких, як звичайний спосіб Інший аспект винаходу відноситься до застоМерріфілда з використанням f-moc-або t-boc в сування поліпептиду, кодованого виділеною нуклетвердій фазі. Наприклад, пептиди і послідовності їновою кислотою, що кодує APRIL-R, в «антисмисДНК за даним винаходом можна довільно розділиловій» терапії. У тому значенні, як цей термін тут ти на фрагменти бажаної довжини без перекриття використовується, «антисмислова» терапія віднофрагмента або розділити на фрагменти бажаної ситься до введення або продукції in situ олігонукдовжини, що перекриваються. Способи такі, як ці, леотидів або їх похідних, які специфічно гібридиописані більш детально нижче. зують в клітинних умовах з клітинною мРНК і/або Одержання розчинних форм APRIL-R ДНК, що кодує ліганд, який цікавить, для того, щоб Розчинні форми APR1L-R часто можуть ефекінгібувати експресію кодованого білка, тобто шлятивно передавати сигнали, і, отже, їх можна ввохом інгібування транскрипції і/або трансляції. Зв'ядити як лікарський препарат, який вже імітує призування може відбуватися на основі комплементародну мембранну форму. Можливо, що заявлені рності пар основ або, наприклад, у разі тут APRIL-R секретуються в природних умовах у зв'язування з ДНК-дуплексами за допомогою спевигляді розчинних цитокінів, однак, якщо немає, то цифічних взаємодій в основному жолобку подвійможна переконструювати ген для вимушеної секної спіралі. В основному «антисмислова» терапія реції. Для створення розчинної секретованої форвідноситься до ряду методів, як правило, що викоми APRIL-R необхідно видалити на рівні ДНК Nристовуються в даній області, і включає будь-яку кінцеві трансмембранні області і деяку дільницю терапію, засновану на специфічному скріпленні з стовбурової області і замінити їх лідерною посліолігонуклеотидними послідовностями. довністю типу І і, альтернативно, лідерною послі«Антисмислову» конструкцію за даним винадовністю типу II, що дозволить протікати ефективходом можна доставити, наприклад, у вигляді ексному розщепленню у вибраній експресуючій пресуючої плазміди, яка, при транскрипції в клітисистемі. Фахівці в даній області можуть змінювати ні, продукує РНК, яка є комплементарною розміри стовбурової області, що залишилася в 13 74798 14 експресуючій конструкції для секреції з метою опактивністю. Таким чином, як моноклональні, так і тимізації як властивостей зв'язування ліганду, так і поліклональні антитіла (Ab), направлені проти ефективності секреції. Наприклад, конструкції, що APRIL-R і їх корецепторів, і фрагменти антитіл включають всі можливі стовбурові довжини, тобто такі, як Fab' і F(ab')2 можна використати для блокуN-кінцеве усікання, можна приготувати таким чивання дії APRIL-R і його відповідних корецепторів. ном, що вийдуть білки, що починаються з амінокиРізні форми антитіл можна також приготувати слот 1-52. З даного типу аналізу будуть одержані з використанням стандартних методів рекомбінанстовбурові послідовності з оптимальною довжитної ДНК [Winter and Milstein, Nature 349:293-299 ною. (1991), спеціально включений тут для відома]. НаОдержання антитіл, реагуючих з APRIL-R приклад, можна сконструювати химерні антитіла, в Винахід також включає антитіла, специфічно яких домен зв'язування антигену з антитіла твариреагуючі із заявленим APRIL-R і його корецептони пов'язаний з людським константним доменом рами. Антибілок/антипептид-антисироватку або [наприклад, Cabilly et al., патент США №4816567, моноклональні антитіла можна одержувати станвключений тут для зведення]. Химерні антитіла дартними методами [дивись, наприклад, можуть знизити імуногенні відповіді, що спостеріAnibodies: A Laboratory Manual ed. by Harlow and гаються на антитіла тваринного походження, коли Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)]. Ссавця, використовуються в клініці для лікування людини. такого як миша, хом'ячок і кролик, можна імунізуКрім того, можна синтезувати рекомбінантні вати імуногенною формою пептиду. Методи для «гуманізовані антитіла», які розпізнають APRIL-R надання імуногенності білку або пептиду включаабо його корецептори. «Гуманізовані» антитіла є ють кон'югацію на носіях або інші методи, добре химерами, що включають в основному людські відомі в даній області. послідовності IgG, в які вставлені області, відповіІмуногенну дільницю APRIL-R або його коредальні за специфічне зв'язування з антигеном. цепторів можна вводити в присутності ад'юванта. Тварин імунізують бажаним антитілом, виділяють За протіканням імунізації можна простежувати за відповідні антитіла і видаляють дільницю послідовстановленням титрів антитіл в плазмі або сировностей варіабельної області, відповідальної за ватці. Можна використати стандартні ELISA або специфічне зв'язування з антигеном. Області зв'яінші імуноаналізи з імуногеном як антигеном для зування антигену від тварин потім клонують у відоцінки рівнів антитіл. повідне положення генів людських антитіл, в яких У переважному втіленні цільові антитіла є імувидалені області зв'язування антигену. «Гуманізоноспецифічними для антигенних детермінант вані» антитіла зводять до мінімуму застосування APRJL-R або його корецепторів, наприклад, антигетерологічних (тобто міжвидових) послідовностей генних детермінант поліпептиду за SEQ ID NО:8 в людських антитілах і, таким чином, малоймовірабо тісно пов'язаного людського або надлюдського но, що вони будуть викликати імунні відповіді у гомолога ссавців (наприклад, на 70, 80 або 90% обробленого суб'єкта. гомологічного, більш переважно на 95% гомологіКонструкцію різних груп рекомбінантних античного). У ще одному переважному втіленні даного тіл також можна провести приготуванням химервинаходу анти-APRIL-R або aHTH-APRILних або «гуманізованих» антитіл, що включають корецептори-антитіла значною мірою не реагують варіабельні домени і людські константні домени перехресно (тобто реагують специфічно) з білком, (СН1, СН2, СН3), виділені з різних класів імуногякий, наприклад, менше, ніж на 80% гомологічний лобулінів. Наприклад, антитіла з підвищеними по відношенню до SEQ ID NО:8, переважно менвалентностями сайту зв'язування антигену можна ше, ніж на 90% гомологічний по відношенню до одержати рекомбінантним методом при клонуванні SEQ ID NО:8 і найбільш переважно менше, ніж на сайту зв'язування антигену у вектори, що несуть 95% гомологічний по відношенню до SEQ ID NО:8. людські константні області ланцюгів [Arulanandam Вираз «значною мірою не реагують перехресно» et al., J. Exp. Med. 177:1439-1450 (1993), включеозначає, що антитіло має афінність зв'язування ний тут для відома]. для негомологічного білка, яка складає менше Крім того, звичайні методи рекомбінантної 10%, більш переважно менше 5% і навіть більш ДНК можна використати для зміни афінності зв'япереважно менше 1% афінності зв'язування для зування рекомбінантних антитіл з їх антигенами білка за SEQ ID NО:8. зміною амінокислотних залишків в оточенні сайтів Термін «антитіло», в тому значенні, як він тут зв'язування антигену. Афінність зв'язування антивикористовується, призначений для включення гену «гуманізованого» антитіла може бути підвийого фрагментів, які також є специфічно реагующена мутагенезом, заснованим на молекулярному чими з APRIL-R або його рецепторами. Антитіла моделюванні [Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sei. можуть бути фрагментовані з використанням зви86:10029-33 (1989)], включений тут для відома. чайних методів, і фрагменти піддані скринінгу на Одержання аналогів: продукція змінених ДНК і застосовність таким же чином, як описано вище пептидних послідовностей для суцільних антитіл. Наприклад, F (аb')2Аналоги APRIL-R можуть відрізнятися від того, фрагменти можна одержати обробкою антитіла що є в природних умовах APRIL-R за амінокислотпепсином. Одержаний F (аb')2-Фрагмент можна ною послідовністю або іншим властивостям, не обробити для відновлення дисульфідних зв'язків з пов'язаним з послідовністю, або за обома. Не поодержанням Fab1-фрагментів. Антитіла за даним в'язані з послідовністю модифікації включають винаходом додатково призначені для включення хімічну дериватизацію APRIL-R in vivo або in vitro. біоспецифічних і химерних молекул, що володіє Не пов'язані з послідовністю модифікації включаанти-APRIL-Rабо анти-APRIL-корецепториють, але не обмежуються змінами внаслідок аце 15 74798 16 тилювання, метилювання, фосфорилювання, карвідомими в даній області, або одержаний за відобоксилювання або глікозилювання. мими амінокислотними послідовностями, є придаПереважні аналоги включають біологічно актними в різних способах протиракових застосутивні фрагменти APRIL-R, чиї послідовності відрізвань. няються від послідовності, представленої в SEQ У одному втіленні винаходу забезпечується ID NO:8, однією або більше консервативною заміспосіб лікування ссавця від стану, пов'язаного з ною амінокислот або однією або більше неконсернебажаною проліферацією клітин, призначенням вативною заміною амінокислот, делеціями або ссавцеві терапевтично ефективної кількості комвставками, які не приводять до втрати активності позиції, що включає антагоніст APRIL-R, де антаAPRIL-ліганду. Консервативні заміни звичайно гоніст APRIL-R містить поліпептид, який протидіє включають заміну однієї амінокислоти на іншу з взаємодії між APRIL-R і його спорідненим рецеподнаковими властивостями, наприклад, заміни тором або рецепторами, з фармакологічно прийнвсередині наступних груп: валін, гліцин; гліцин, ятним наповнювачем. аланін; валін, ізолейцин, лейцин; аспарагінова У переважному втіленні спорідненим рецептокислота, глутамінова кислота; аспарагін, глутамін; ром APRIL на поверхні клітини є ВСМА. серин, треонін; лізин, аргінін; і фенілаланін, тироСпосіб можна використати з будь-яким антагозин. ністом APRIL-R, який має поліпептид, який протиЗастосування діє взаємодії між APRIL і його спорідненим рецепПовну довжину гена APRIL-R (SEQ ID NO:8) тором або рецепторами. Приклади антагоністів або його дільниці можна використати як зонди гібAPRIL-R включають, але не обмежуються розчинридизації для бібліотеки кДНК для виділення, наним поліпептидом APRIL-R, включаючи але не приклад, ще інших генів, які володіють бажаною обмежуючись розчинним ВСМА; розчинними хиідентичністю послідовності по відношенню до посмерними молекулами APRIL-R, включаючи, але не лідовності APRIL-R, розкритої в SEQ ID NO:6. Нукобмежуючись BCMA-IgG-Fc, і гомологами aHTHлеотидні послідовності, що кодують APRIL-R, таAPRIL-R-airarmia, включаючи, але не обмежуюкож можна використати для конструювання зондів чись анти-ВСМА моноклональним антитілом. гібридизації з метою картування гена, який кодує Спосіб за винаходом можна використати при APRIL-R, і для генетичного аналізу індивідуумів з будь-якому стані, пов'язаному з небажаною пролігенетичними порушеннями. Скринінг може бути ферацією клітин. Зокрема, способи за даним випобудований таким чином, щоб знайти основні находом можна використати для обробки пухлинсполуки, які наслідують біологічну активність них клітин, яких експресують APRIL і/або APRIL-R APRIL-R. Подібний скринінг буде включати тести, (тобто ВСМА). призначені для скринінгу з високою пропускною Приклади ракових захворювань, де проліфеспроможністю хімічних бібліотек, роблячи їх особрація клітин модулюється під дією APRIL, можна ливо придатними для ідентифікації невеликих мотестувати при визначенні в умовах in vitro рівня лекул, кандидатів для лікарських препаратів. ПемРНК, APRIL і/або APRIL-R (тобто ВСМА), експрередбачувані невеликі молекули включають сованої в бібліотеках пухлинних тканин. Бібліотеки синтетичні органічні або неорганічні сполуки. Нукпухлинних тканин, в яких є висока експресія мРНК леїнові кислоти, які кодують APRIL-R або його моAPRIL і/або APRIL-R (тобто ВСМА) будуть кандидифіковані форми, можна також використати для датами. Альтернативно, можна провести скринінг одержання або трансгенних тварин, або «сконсткандидатів при пошуку в загальнодоступних або руйованих» тварин, які, в свою чергу, придатні при приватних базах даних (тобто база даних Incyte) розробці і скринінгу терапевтичних корисних реаза допомогою, наприклад, повної довжини послігентів, включаючи, наприклад, реагенти проти радовності кДНК APRIL. З використанням цих метокового захворювання. дів було встановлено, наприклад, що експресія APRIL-R і гомологи, одержані від хазяїв, транмРНК APRIL виявлена у великому ряді типів пухсформованих послідовностями за винаходом, а лин, включаючи, але не обмежуючись такими, також нативний APRIL-R, очищений способами, знайденими в таблиці 1 нижче: Таблиця 1 Опис бібліотеки Лінія пухлини простати LNCaP, СА, 50М, нелікована, TIGR Т-лімфоцитарна пухлина, лімфома, TIGR Пухлина яєчника, папілярна серозна цистаденоСА Легеня, mw/аденоСА, COPD, 47M Пухлина молочної залози, аденоСА, 46F, SUB, m/BRSTNOT33 Ганглій, дорсальний корінь, цервікальний, aw/ лімфома, 32М, NORM Пухлина мозку, лобна, нейронна неоплазма, 32М Пухлина простати, аденоСА, 59М, SUB, m/PROSNOST19 Пухлина ободової кишки, печінковий вигин, аденоСА, 55М, SUB, m/COLATMTOl Пухлина підшлункової залози, TIGR Пухлина параганглію, парагангліома, aw/нирковоклітинна СА, 46М Молочна залоза, mw/ проточна СА, 43F, m/BRSTTUT16 17 74798 18 Пухлина нирки, нирковоклітинна СА, 51F Сечовий міхур, mw/TCCA, СА in situ, 60M, m/BLADTUT04 Пухлина матки, ендометріальна, F, TIGR Простата, ДГП, mw/аденоСА, PIN, 59M Легеня, mw/аденоСА, 53М, m/LUNGTUT17 Кісткова пухлина /лінія, MG-63, ocTeoSAR/гігантоклітинна, M/F, пул, RP Мозок, лобна кора, am/ легенева СА, 77М Пухлина ободової кишки, аденоСА, NORM, SUB, CGAP Пухлина легень, плоскоклітинна СА, 57М Легеня, mw/аденоСА, 63М Простата, АН, mw/аденоСА, 50М, m/PROSTUTOl Периферична кров, B-лімфоцити, CLL, пул, NORM, 3'CGAP Пухлина ободової кишки, аденоСА, пул, NORM, 3' /5' CG АР Нирка, mw/нирковоклітинна СА, 8,53 F, пул, NORM Яєчник, дермоїдна кіста, 22F Пухлина ободової кишки, аденоСА, NORM, 3'CGAP Пухлина ободової кишки, аденоСА, 3'CGAP Простата, ДГП, mw/аденоСА, 70М, SUB Пухлина яєчника, метастази аденоСА ободової кишки, 58F Матка, міометрій, mw/лейоміома, 43F Тонкий кишечник, клубова кишка, mw/CUC, 25F Лімфатичний вузол, періпанкреатичний, aw/ підшлункової залоза аденоСА, 65М Яєчник, aw/лейоміома, 36F, NORM Легеня, mw/веретеноклітинна карцинома, 62F Пухлина легені, шюскоклітинна СА, 50М Пухлина мозку, менінгиома, ЗбМ Пухлина, аденоСА, 65F, m/ PANCNOT 0 8 Пухлина, mw/ендобронхіальна карциноїдна пухлина, 33М Надниркова, mw/феохромоцитома, 43F, m/ADRETUT07 Пухлина мозку, лобна, менінгіома, 5 ОМ Пухлина нирки, ракове захворювання з чітким типом клітин, пул, NORM, 3'CGAP Молочна залоза, mw/часточкова СА,67 F Легеня, mw/метастаз ocTeoSAR, aw/плевральні метастази, 58М, NORM Пухлина простати, аденоСА, 59М, SUB, m/PROSNOT!9 Пухлина тонкого кишечнику, клубова кишка, метастази ендометріальної аденоСА, 64 F Пухлина яєчника, аденоСА, 58F Молочна залоза, захворювання молочної залози NF, 46F Пухлина мозку, лобна, метастази гіпернефроми, 58М Пухлина нирки, Wilms, пул, WM/WN Легеня, mw/метастаз СА щитовидної залози, 79М, m/LUNGTUTQ2 Пухлина легені, метастази СА щитовидної залози, 79М, m/LUNGNOT03 Пухлина паращитової залози, аденома, M/F, NORM, WM Пухлина підшлункової залози, анапластична СА, 45F Яєчник, mw/муцинозна цистаденоСА, 43F, m/OVARTUTOl Пухлина легені, плоскоклітинна СА, пул, NORM, CGAP Пухлина молочної залози, аденоСА, 46F, m/BRSTNOT17 Матка, mw/лейоміома, aw/аденоСА ободової кишки, 45F Легеня, mw/аденоСА, aw/вузловий, діафрагмальні метастази, 63F Пухлина молочної залози, аденоСА, 46F, m/BRSTNOT33 Пухлина простати, аденоСА, 66М, m/PROSNOT15, PROSDIN01 Пухлина молочної залози, аденоСА, 54F, m/BRSTNOT03 Ембріональна пухлина, пул, SUB, 3'CGAP Кістковий мозок, велика гомілкова кістка, aW/метастаз альвеолярної рабдоміо SAR, 16М Простата, АН, mw/аденоСА, 57М, m/PROSTUT04 Молочна залоза, PF зміни, mw/аденоСА, 55F, m/BRSTTUTOl Пухлина матки, серозна папілярна СA, F, пул, 3'CGAP Пухлина яєчника, муцинозна цистаденоСА, 43F, m/OVARNOT03 Молочна залоза, PF зміни, mw/аденоСА, внутрішньопроточна СА, 43F Молочна залоза, mw/проточний СА, СА in situ, aw/метастаз лімфатичних вузлів, 62F Пухлина нейроганглію, гангліоневрома, 9М Пухлина підшлункової залози, аденоСА, 3'CGAP 19 74798 Пухлина матки, ендометріальна аденоСА, F, пул, 3'CGAP Пухлина легені, нейроендокринна карциноїдна пухлина, пул, NORM, 3'CGAP 20 СА - карцинома; SAR - саркома Антагоністи APRIL-R, як об'єкт винаходу, використовуються при лікуванні станів, пов'язаних з небажаною проліферацією клітин, зокрема, при лікуванні пухлин, переважно інгібують зростання пухлинних клітин більш, ніж на 10%, 20%, 30% або 40% і найбільш переважно більш, ніж на 50%. Антагоністи APRIL-R одержують в результаті скрінингу (дивись, наприклад, обговорення в прикладі 6). Наприклад, антагоністи APRIL-R можна відібрати на основі активності інгібувати зростання (тобто більш, ніж на 10%, 20%, 30%, 40% або 50%) карциноми ободової кишки НТ29 людини або карциноми легень А549 людини (дивись, наприклад, обговорення на Фігурі 15), які походять відповідно з пухлини ободової кишки і легені. Інше втілення винаходу забезпечує способи інгібування зростання B-клітин і клітин, що не відносяться до B-клітин, індукованого дендритними клітинами зростання B-клітин і дозрівання або продукції імуноглобулінів у тварини з використанням поліпептиду APRIL-R. В іншому втіленні винахід забезпечує способи застосування APRIL-R при лікуванні аутоімунних захворювань, гіпертензії, серцево-судинних порушень, ниркоподібних порушень, B-клітинних лімфо-проліферативних порушень, імуносупресорних захворювань, при трансплантації органів, запалення і захворювання, пов'язаного з вірусом імунодефіциту людини. Також включені способи застосування агентів для лікування, придушення або зміни імунної відповіді, що включає шляхи передачі сигналів між APRIL-R і його лігандом. Даний винахід також забезпечує фармацевтичні композиції, що включають поліпептид APRIL-R і фармацевтично прийнятний наповнювач. Відповідні носії для поліпептиду APRIL-R, наприклад, і їх композиції, описані в [Remington' Pharmaceutical Sciences, 16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.] Як правило, в композиції використовується відповідна кількість фармацевтичної прийнятної солі для того, щоб зробити композицію ізотонічною. Приклади носія включають буфери такі, як фізіологічний розчин, розчин Рінгера і розчин декстрози. Значення pH розчину переважно дорівнює від приблизно 5 до приблизно 8, і більш переважно від приблизно 7,4 до приблизно 7,8. Додаткові носії включають препарати для безперервного вивільнення такі, як напівпроникні матриці з твердих гідрофобних полімерів, коли матриці знаходяться у вигляді частинок, що мають певну форму, наприклад, ліпосом, плівок або мікрочастинок. Фахівцям в даній області, очевидно, буде зрозуміло, що деякі носії будуть більш переважними в залежності, наприклад, від шляху введення і концентрації поліпептиду APRIL-R, який вводиться. Введення можна здійснювати ін'єкцією (наприклад, внутрішньовенною, внутрішньоочеревинною, підшкірною, внутрішньом'язовою) або іншими способами такими, як інфузія, для забезпечення доставки в кров'яне русло в ефективній формі. У практиці даного винаходу будуть використовуватися, якщо не указано інакше, звичайні методи клітинної біології, культивування клітин, молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантної ДНК, хімії білків і імунології, які відомі фахівцям в даній області. Ці методи описані в літературі. Дивись, наприклад, [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition. (Sambrook, Fritsch and Maniatis, eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; DNA Cloning: Volumes I and II (D.N. Glover, ed.), 1985; Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait, ed.), 1984; патент США №4683195 (Mullis et al.); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Transcription and Translation (B.D. Hames and S.J. Higgins, eds.), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, ed.). Alan R. Liss, Inc., 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984; Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., eds.), Academic Press, New York: Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and M.P. Calos, eds.), 1987; Cold Spring Harbor Laboratory: Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, eds.), Academic Press, London, 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1986]. Наступні приклади надані для ілюстрації даного винаходу, і їх не треба розглядати, як такі, що обмежують його. Приклади У прикладах, розкритих нижче, використали наступні методи. Методи Клонування і експресія myc-міченого мишачого APRIL (CCM776) в Pichia pastoris Експресуючий вектор рССМ213.10 конструювали, взявши PDR004 (Н98 muAPRIL з включаючим вищий FAS-ліганд «стовбуром», сполученим з N-кінцем разом з FLAG-епітоп-міткою) і вирізавши кодуючу послідовність mu APRIL з Sac I в Notl. Синтетичні олігонуклеотиди LTB-559 і 560 утворюють лінкер Xho-1-Sacl, який включає лідерну послідовність з альфа-чинником схрещування, mус-епітоп-мітку, а також мотив KEL з FAS-ліганду. Фрагмент muAPRIL і лінкер лігували в сайтах Xho1-Notl в pccm211, що експресує плазміди Pichia pastoris. РССМ213.10 лінеаризували Stul, піддавали електропорації в штам GS115 (his4-) і висівали в мінімальному середовищі, що містить декстрозу. HIS4-трансформанти аналізували на експресію білка посівом одиничної представницької колонії в збагачене середовище (BMGY: забуферене, складне середовище, що містить гліцерин) і давали можливість рости до щільності протягом 48год. при 30°С. Культури центрифугували і клітинні осадки ресуспендували (1:5) в збагаченому індукційному середовищі, що містить 1,5% метанолу 21 74798 22 (BMMY: забуферене, складне середовище, що підтримували в середовищі, як запропоновано містить метанол). Через двоє діб індукції при 30°С, постачальником (АТСС Bethesda, MD). Клітини супернатанти піддавали SDS-PAGE і оцінювали на BJAB культивували в HEPES-забуференому сереприсутність muAPRIL. Фарбування Кумассі і весдовищі RPMI з додаванням 10% FBS і L-глутаміну. терн-блотінг (з анти-mус-mАb9Е10) показували, У конкурентних тестах додавали 450нг/мл mycщо один штам, ССМ776, продукував адекватні мишачого APRIL з 1мкг/мл конкурентного білка. кількості глікозильованої форми білка mусПриклад 1: Детектування зв'язування APRIL з міченого Н98 muAPRIL. APRIL-R з використанням тесту чашок Очищення myc-mAPRIL У даному прикладі аналізували зв'язок ВСМА з Myc-mAPRIL, білок з 149 амінокислот, експреAPRIL. сували в pichia. Даний білок має ізоелектричну Для того, щоб тестувати, наскільки ВСМА зв'яточку 7,45. 175мл супернатанту pichia діалізували зується з APRIL, заявники провели дослід на коіпроти 10мМ Тріс буфера, pH 6,8 протягом ночі і мунопреципітацію. У даному прикладі використали потім пропускали через колонку SP місткістю розчинні білки hBCMA-Fc і myc-mAPRIL. 20мл. Колонку ретельно промивали 10мМ ТрисHBCMA-Fc і LTbR-Fc додавали з різними TNFНСІ буфером, pH 6,8 і елюювали 250мМ NaCl в лігандами: myc-inAPRIL; myc-CD40L і myc-RANKL PBS. Другу стадію очищення проводили з викорисв середовище, що містить 10% FBC, на 1/2год. при танням колонкової гель-фільтрації (S300). кімнатній температурі. Fc-білки зв'язували з грануФракції, що містять myc-APRIL, з колонки SP лами, навантаженими білком А, протягом 1-2год., місткістю 20мл концентрували центрифугуванням промивали три рази 1мл PBS, аналізували імунодо об'єму 7мл. Після гель-фільтрації заявники блотінгом з мишачими моноклональними 9Е10 одержували 8мг myc-APRIL, який детектували за (анти-myc) антитілами і виявляли з використанням оптичною щільністю і забарвленим Кумасі гелем. посиленої хемілюмінесценції. Заявники також провели вестерн-блотінг з викориЗаявники виявляли myc-APRIL в імунопреципістанням мишачих моноклональних антитіл 9Е10 татах hBCMA-Fc, що вказує на те, що ВСМА взає(анти-myc), в якому було показано, що mус-мітка модіє з APRIL специфічним чином, оскільки інші була інтактною після стадій очищення. N-кінцева TNF-ліганди, myc-CD40L і myc-RANKL не володіли послідовність підтверджувала, що очищений білок здатністю зв'язуватися з ВСМА. Myc-APRIL не відповідає myc-mAPRIL. зв'язується з LTbR-Fc. Очищення FLAG-людського APRIL Ту ж мембрану очищали і повторно ставили Плазміду рз429(в подальшому названу p1448) блотінг з анти-hlG-HRP для того, щоб показати, що використали для тимчасової трансфекції клітин ту ж кількість LTbR-Fc з BCMA-Fc використали в 293Т з використанням ліпофектаміну (Gibco-Brl) і імунопреципітатах. середовища, що не містить сироватку. Плазміду, Приклад 2: яку конструювали в експресуючому векторі ссавців У даному прикладі описується, що hBCMA-Fc PCR3 (Invitrogen), кодує домен зв'язування рецепвзаємодіє з FLAG-hAPRIL. тора людського APRIL, з N-кінцевим білком в кліАналіз ELISA: покриті рецепторними злитими тинному культуральному середовищі. Білок FLAGFc-білками планшети (hBСМА-Fc-739 або hTNFR2APRIL виділяли з середовища, що не містить сиFc-492) з концентрацією 1мкг/мл в карбонатному роватку, з використанням колонки з анти-FLAGбуфері, pH 9,6 протягом ночі, при 4°С. Блокували mAb M2 і надлишку пептиду FLAG, слідуючи рекопротягом 2год. при кімнатній температурі з викомендаціям виробника (Kodak). ристанням PBS/5% знежиреного сухого молоОчищення HCBCA-Fc ка/0,5% Твіна-20. Готували двократне послідовне HBCMA-Fc тимчасово трансфікували в клітини розведення лігандів в 100мкл блокуючого буфера 293. Кондиціоноване середовище від клітин 293 з (TNFa-197 з 1000нг/мл, muBAFF-657 з 1000нг/мл, гіперекспресією hBCM-Fc наносили на колонку з hAPRIL-507 з 2000нг/мл (неактивний), hAPRIL-429 білком А. Білок елюювали з використанням 25мМ з п'ятикратно концентрованого середовища). Після фосфатного 100нМ NaCl, pH 2,8 з подальшою інкубування з лігандами планшет промивали нейтралізацією 1/20 об'єму 0,5Μ NaPCu, pH 8,6. PBS/5% Твін-20 і зондували 0,5мкг/мл анти-FLAGВідібрані за оптичною щільністю при 280нм фракmAb М2 в буфері для розведення. Антитіла детекції піддавали SDS-PAGE у відновлюючих і невідтували з використанням анти-мишачих-РО 1/2000 новлюючих умовах і вестерн-блотінгу для ідентиз ензиматичним виявленням (OPD). фікації очищеного білка. З 500мл Досліди на імунопреципітацію: клітини 293Т кондиціонованого середовища було одержано 3мг трансфікували вказаною експресуючою плазмідою білка. (Rec-Fc або FLAG-ліганд) в чашці діаметром 9см. Myc-mAPRIL зв'язується з різними клітинними Трансфіковані клітини залишали на 5 діб в 8мл лініями в аналізі FACS середовища Optimem (Gibco-BRL). Імунопреципі450нг/мл очищеного myc-mAPRIL зв'язували з тацію проводили при змішуванні 200мкл кондиціоклітинними лініями в 100мкл PBS/2%FBC+Fcнованого середовища, що містить кожний рецепблокувати реагенти (FcBlock @ 20мкг/мл тор, з 200мкл кондиціонованого середовища, що (Pharmingen) і очищеного людського IgG @ містить кожний ліганд, + 400мкл PBS + 10мкл 10мкг/мл (Sandoz) на льоду протягом 1год. ПозиProtG-сефарози. Все це обертали протягом 1год. тивне зв'язування виявляли з використанням спена роторі, 4 рази промивали 1мл PBS, потім кип'яцифічної кролячої антимишачої до APRIL антиситили в 50мкл буфера для зразка (+DTT). 20мкл з роватки (1:500) і ослиног антикролячого IgG-FITC кожної реакції імунопреципітації наносили доріжку. (Jackson). Клітинні лінії А20, Raji, NIH3T3 і НТ29 Оцінку результатів блотінгу проводили за допомо 23 74798 24 гою 1мкг/мл анти-FLAG-mAb М2 (Sigma, St Louis використовуються в біотехнології, включаючи дріМО) і антимишачими-РО (1/2000). Також блотінг жджі, клітини комах, клітини бактерій і ссавців, і перевіряли з антилюдськими-РО: 100мкл кондицііснують приклади для всіх типів експресії. Можна онованого середовища осаджували сумішшю Меприєднати різні людські Fc-домени для оптимізації ОН/СНСl3/лізоцим. Цю суміш кип'ятили в 50мкл або елімінації FcR і комплементарних взаємодій за буфера для зразка (+DTT) і 20мкл навантажували. бажанням. Альтернативно можна використати фоОцінку блотінгу проводили з анти-FLAG-mAb М2 рми даних Fc-доменів, які мутували, для виборчо(1мкг/мл) і анти-мишачими-РО (1/2000). го видалення FcR або комплементарних взаємодій Приклад 3: або приєднання N-пов'язаних цукрів до Fc-домену, У даному прикладі описується зв'язування який має деякі переваги. myc-mAPRIL; hKayL-440 (hBAFF) і FLAG-mBAFF з Приклад 5: одержання агоністичних або антаhBCMA-Ig, hLT-R-Ig або hp80 TNFR-Ig. Всі досліди гоністичних антитіл проводили при 25°С зі швидкістю потоку 10мкл/хв. Вищеописані розчинні форми рецепторів можКожний дослід проводили з використанням на використати для імунізації мишей і приготуванHBS буфера (10мМ HEPES, 150мМ NaCl, 0,005% ня моноклональних антитіл звичайними методами. поверхнево-активних речовини Р20 при pH 7,4). Одержані mAbs, які ідентифікуються ELISA, можна Цей же розчин використали як елююючий буфер і потім піддати скринінгу на агоністичну активність як розріджувач для проб. або у вигляді розчинних антитіл, або імобілізоваСпочатку поверхню чипів СМ5 активували Nних на пластмасі в різних клітинних тестах in vitro. гідрокси-сукцинімід/N-етил-N'-(3Часто загибель клітинної лінії НТ29 представляє діетиламінопропіл)-карбодіімідом гідрохлоридом відповідну систему, яка чутлива до передачі сиг(ВІАсоге). 20мкл hBCMA-Ig, 15мкл hLT-R05-Ig і налів через багато які TNF-рецептори. Якщо дана 10мкл hp80-TNFR, розбавлені до 30мкг/мл 10мМ лінія не має рецептор, що цікавить, повну довжину оцтовою кислотою, потім блокували один раз даного рецептора можна стабільно трансфікувати 30мкл і повторно 15мкл етанол-аміну-НСІ (pH 8,5). в лінію НТ29 для того, щоб надати можливість Це призводило до поверхневої щільності 1600протікати тесту на цитотоксичність. Альтернатив3700 резонансних одиниць (RU). Чипи регенеруно, ці клітини можна використати в апараті вали 20мкл 1мМ мурашиної кислоти. Ці видалення Cytosensor для оцінки того, наскільки активація повторювали п'ять разів для встановлення і стабірецептора може спричиняти зміну pH, що свідчить льного фону, що відтворюється. про передачу сигналу. Сімейство TNF-рецепторів Для досліду 100мкл myc-mAPRIL, hKayL-400 і передає сигнали в такому форматі, і для даного FLAG-mBAFF, кожного, розбавляли до 30мкл/мл методу не потрібно знати, які дійсні біологічні події буфером для розбавлення і наносили по поверхні «запускаються» рецептором. Агоністичні mAbs чипів. Відразу ж після кожного нанесення чипи слідує «гуманізувати» перед використанням в кліпромивали 500мкл буфера для розбавлення. Поніці. Цей метод можна також використати для виверхню регенерували між дослідами нанесенням значення антагоністичних mAbs. Подібні mAbs 20мкл 1мМ мурашиної кислоти, потім ще нанесенбудуть визначатися за відсутністю атомістичної ням 15мкл мурашиної кислоти. Після регенерації активності і здатності інгібувати взаємодії рецепчипи врівноважували буфером для розведення. тор-ліганд, що простежується ELISA, класичними Приклад 4: одержання розчинних форм рецепметодами зв'язування або ВІАсоrе. Нарешті, індутора кція секреції хемокінів різними клітинами у відпоДля приготування інгібітору рецептора для завідь на атомістичне антитіло може бути тестом стосування у людей необхідна послідовність кДНК для скрінингу. позаклітинного домену людського рецептора. ЯкПриклад 6: скринінг інгібіторів взаємодії рецещо мишача форма відома, бібліотеки людської птор-ліганд. кДНК можна легко піддати скринінгу з використанВикористовуючи рецепторний-lg-злитий білок, ням послідовності мишачої кДНК і подібні маніпуможна тестувати комбінаторні бібліотеки на молеляції звичайно проводять в даній області. З послікули, які можуть безпосередньо зв'язуватися з довністю людської кДНК можна приготувати рецептором. Потім дані молекули можна тестувати олігонуклеотидні праймери для ампліфікації в ПЛР в ELISA з використанням рецепторного-Ig-злитого позаклітинного домену рецептора при відсутності білка і розчинної форми ліганду на здатність інгітрансмембранного і внутрішньоклітинного домебувати взаємодію рецептор-ліганд. ELISA можна нів. Як правило, він включає велику частину амінобезпосередньо використати для скрінингу бібліокислот між останнім пов'язаним дисульфідним тек різних природних продуктів і т.д. на інгібуючі зв'язком «TNF-доменом» і трансмембранним досполуки. Рецептор можна трансфікувати в клітинменом. Можна змінювати кількість включеної «стону лінію таку, як лінія НТ29, для постановки біоловбурової» області для оптимізації активності одегічного тесту (в цьому випадку за цитотоксичнісржаного розчинного рецептора. Дану тю), який потім може дати тест для скрінингу. ампліфіковану дільницю потрібно перебудувати Приклад 7: інгібування зростання пухлин in для включення відповідних сайтів рестрикції для vivo надання можливості клонування в різні С-кінцеві Ефективність BCMA-Ig як антагоніста зростанIg-злиті химерні вектори. Альтернативно можна ня пухлин тестували з використанням ряду різних вставити стоп-сигнал в 3'-кінці і приготувати розліній пухлинних клітин в умовах in vivo. Для цих чинну форму рецептора без повторного сортінгу досліджень використали безтімусних мишей для використання Ig-злитої химери. Одержані век(Nu/Nu) з імунодефіцитом і пухлинні клітини імтори можна експресувати в більшості систем, що плантували підшкірно. Для пухлинної лінії SW480, 25 74798 26 яка володіє агресивним зростанням, заявники імне утримуючого пірогенів, стерильного PBS імплантували підшкірно і схема введення була анаплантували 8 105 клітин в 100мкл не утримуючого логічною описаній для SW480. Пальповані пухлипірогенів, стерильного PBS. Одну контрольну груни виявляли через 7 діб, і в контрольних групах пу залишили необробленою (n=5), в той час як велика частина пухлин росла дуже швидко. Через іншим групам ввели 100мкг контрольного-Ig (n=6) і 42 діб середній об'єм пухлин в контрольних групах 100мкг BCMA-Ig (n=6). Введення почали безпосе(необроблені і оброблені контрольним-Ig, n=12) редньо перед імплантацією з подальшим введендорівнював 0,485см3, в той час, як середній розмір ням кожні 7 діб. Діаметр пухлин визначали мікропухлин в обробленій BCMA-Ig групі (n=5) становив метром, і обчислювали об'єм з використанням 0,095см3, зниження пухлинного навантаження на формули об'єм = 4/3Пr3. 80%. Через 50 діб 30% мишей в контрольній групі Карцинома ободової кишки SW480 росте дуже були оцінені, як такі, що знаходяться на термінашвидко на моделі мишей Nu/Nu, і пальповані пухльній стадії за рахунок розміру пухлин більше лини виявляли через 10 діб. Через 24 діб середній 1,5см3, і дослід був зупинений. У протилежність об'єм пухлин в контролі становив 0,3см3, в той час контрольній групі 0% мишей в групі, обробленій середній об'єм пухлин у мишей, оброблених BCMA-Ig, було оцінено, як такі, що знаходяться на BCMA-Ig, дорівнював 0,19см3, зниження пухлиннотермінальній стадії. Ці результати представлені в го навантаження на 46%. Карцинома ободової таблиці 2. кишки НТ29 також росте агресивно на моделі мишей Nu/Nu. Для цих дослідів 1 106 клітин в 100мкл Таблиця 2 Об'єми пухлин і летальність на моделі НТ29 через 50 діб лікування Контрольні тварини (необроблені і оброблені контрольним Ig) Об'єм пухлин Термінальна стадія 0,22 0,22 0,35 0,61 0,73 1,74 + 2,53 + 1,51 + 0,90 0,44 0,32 1,92 + У середньому: 0,96 %:30 Вона показує 70% зниження об'єму пухлини і достовірний вплив на смертність на моделі зростання пухлини НТ29 з використанням обробки BCMA-Ig. Лінія карциноми легені А549 росте повільніше, ніж лінії карциноми ободової кишки, описані вище. Для цієї клітинної лінії заявники імплантували 1 106 клітин в 100мкл не утримуючого пірогенів, стерильного PBS і обробляли з використанням схеми, описаної вище. Пальповані пухлини виявляли приблизно через 20 діб після імплантації. Через 50 діб після імплантації пухлин середній об'єм пухлин в контрольних групах (необроблені і оброблені контрольним Ig; n=16) становив 0,2см3, в той час, як середній об'єм в групі, обробленій BCMA-Ig (n=7) дорівнював 0,1см3, зниження об'єму пухлин на 50%. У групі, обробленій BCMA-Ig, у 57% мишей об'єм пухлин був менше 0,1см3 через 50 діб, в той час, як тільки 6% контрольних оброблених мишей зберігали таке невелике пухлинне навантаження. Через 60 діб після імплантації пухлин середній об'єм пухлин в контрольній групі збільшувався до 0,3см3. У протилежність середній об'єм пухлин в групі, обробленій BCMA-Ig, складав як і раніше менше 0,2см3 (0,188). Оброблені BCMA-Ig Об'єм пухлин Термінальна стадія 0,11 0,32 0,13 0,56 0,33 У середньому: 0,29 %:0 Для мишачої лінії NIH3T3, яка також росте повільніше, ніж лінії карциноми ободової кишки, заявники імплантували 5 106 клітин в 100мкл не утримуючого пірогенів, стерильного PBS і обробляли, як описано вище. Клітини NIH3T3 утворювали фібросаркому при підшкірній імплантації у мишей Nu/Nu. Через 4 тижні виявляли пальповані пухлини, і в контрольних групах (n=11) ці пухлини зростали протягом подальших 10 діб до об'єму, що досягає середнього значення 0,136см3. У протилежність об'єм пухлин в групі, обробленій BCMA-Ig (n=5), досягав значення тільки 0,03см3, 78% зниження пухлинного навантаження. На 48 добу після імплантації середній об'єм пухлин в контрольних групах досягав 1,6см3, в той час, як середній об'єм пухлин в групі, обробленій BCMAIg, дорівнював тільки 0,8см3, 50% зниження об'єму пухлин. До 52 доби 82% (9/11) тварин в контрольних групах було оцінено, як такі, що знаходяться на термінальній стадії, засновуючись на об'ємі пухлин, який складав більше 1,5см3, тільки 18% тварин залишалося живими. У протилежність 40% (2/5) тварин в групі, обробленій BCMA-Ig, мало пухлини такого об'єму, що їх необхідно було вбити, живими залишалося ще 60% тварин. Ці ре 27 зультати представлені в таблиці 3. 74798 28 CD45R/B220, анти-синдекан/СD138 і анти-В7.2 і ФІТЦ-кон'югованого анти-IgM і анти-СD45R/В220Таблиця 3 антитіло. Все mAbs одержували від Pharmingen (San Diego, CA). Стисло, Fc-рецептори блокували Дані щодо виживаності на моделі NIH3T3 10мкг/мл Fc-блоку (Pharmingen) протягом 15хв. на льоду з подальшим додаванням РЕ- і ФІТЦкон'югованих mAbs, і інкубували на льоду протяДні після імплантації гом 20-30хв. Клітини промивали 1 раз і суспендуВиживаність, % 38 42 48 52 вали в 0,5% параформальдегіді. Дані з флуоресКонтроль 100 90 64 18 ценції клітин одержували на проточному цитометрі BCMA-Ig 100 100 80 60 FACSCalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA) і аналізували з використанням програмного забезДані, що показують зростання пухлин NIH3T3 печення CELLQuest (Becton Dickinson). протягом часу, представлені на Фігурі 13. Дані, що Після обробки hBCMA-Ig було відмічено прибпоказують зростання пухлин SW480 протягом чализно 50% зниження кількості B-клітин в перифесу, представлені на Фігурі 14. Дані, що показують ричній крові і в досліджених периферичних лімфозростання пухлин НТ29 протягом часу, і діаграма їдних органах. В220високі j IgMнизькі В-клітини розсіювання, що показує окремих тварин на 42 складали відповідно 23,4% і 21,5% клітин у мишей, добу після імплантації пухлини, представлена на оброблених PBS і HulgG, в той час, як дана попуФігурі 15А. Дані, що показують зростання пухлин ляція становила тільки 9,9% клітин у мишей, оброА549 у окремих тварин на 50 і 60 добу після імблених hBCMA-Ig. Виявилося, що число плазмаплантації, представлені на Фігурі 15В. тичних клітин (синдекан/СD138+) було декілька Дані з інгібування зростання пухлин для лінії знижено при відповідно 5,7% і 4,8% в крові мишей, пухлинних клітин NIH3T3 представлені на Фігурі оброблених PBS і HulgG, у порівнянні з 3,9% у 13. Дані з інгібування зростання пухлин для лінії мишей, оброблених hBCMA-Ig. Молекула В7.2 пухлинних клітин SW480 представлені на Фігурі 14. позитивно регулювалася відповідно при 3,1% і Дані з інгібування зростання пухлин для лінії пух4,5% В220+ клітин у мишей, оброблених PBS і линних клітин НТ29 і А549 представлені на Фігурі HulgG, у порівнянні з 1,9% у мишей, що одержали 15. обробку hBCMA-Ig. Приклад 8: BCMA-Ig спричиняє зниження кільУ селезінці кількість В220високих-В-клітин була кості B-клітин у нормальних мишей помітна нижче у мишей, оброблених hBCMA-Ig, і Мишей BALB/c самиць у віці восьми тижнів дорівнювало 18,8% у порівнянні з відповідно одержували з Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). 36,7% і 40% у мишей, оброблених PBS і HulgG. Миші (3 групи) одержували внутрішньоочереДане зниження спостерігали в обох IgMвисоких і винно або PBS, з 400мкг людського злитого білка IgMнизьких субпопуляціях (дивись таблицю 1). Не BCMA-huIgCl (hBCMA-Ig) (від Teresa Cachero, було змін в кількості щойно утворених B-клітин в Biogen) або 400мкг очищеного людського IgG селезінці, В220високих IgMнизьких (Дані не представ(HulgG) (Sandoz, Basel, Швейцарія) на дні -8, -5, -1 лені). Виявилося, що кількість плазматичних клітин і +2. Миші одержували 100мкл 10% суспензії ове(синдекан/СD138+) була декілька знижена при чих еритроцитів (SRBC) (Colorado Serum Company, відповідно 3,3% і 3,4% в селезінці мишей, обробDenver, СО) на 0 день. лених PBS і HulgG, у порівнянні з 2,4% у мишей, При розкритті при пункції серця збирали кров в що одержали hBCMA-Ig. пробірки, що містять ЕДТА, і еритроцити лізували У MLN було встановлене зниження В220+ Bв гіпотонічному буфері. Кров також збирали без клітин при 14,1% у мишей, оброблених hBCMA-Ig, ЕДТА для приготування сироватки. Готували у порівнянні з відповідно 26,7% і 35,8% у мишей з окремі клітинні суспензії з селезінки і брижових обробкою PBS і HulgG. Дані представлені в таблилімфатичних вузлів (MLN) і еритроцити лізували в ці 4. гіпотонічному буфері. Проводили проточну цитометрію з використанням РЕ-кон'югованих антиТаблиця 4 Популяції B-клітин у мишей, оброблених hBCMA-Ig, PBS і HulgG Кров Забуферений фосфатом фізіологічний розчин (PBS) HulgC HBCMA-Ig Селезінки Забуферений фосфатом фізіологічний розчин (PBS) HulgC HBCMA-Ig Брижові лімфатичні вузли Забуферений фосфатом фізіологічний розчин (PBS) HulgC HBCMA-Ig В220високi, IgMнизькі 23,4±5,7 21,514,5 9,9±1,8 В220високі, IgMнизькі 27,811,6 30,5±2 10,610,2 В220+ 26,7 35,8±3,3 14,115,9 Синдекан 5,711,5 4,8±0,9 3,910,6 В220високі, IgM+ 11,911,6 11,811,0 8,4±0,2 В7.2/В220низькі 3,110,5 4,511,0 1,910,5 Синдекан 3,3±0,8 3,4±0,7 2,4±0,2 29 Мишей обробляли, як описано в розділі «Матеріали і методи», і дані представлені у вигляді процента ± стандартне відхилення На основі зниженого рівня В7.2+ B-клітин в крові і плазматичних клітин в крові і селезінці мишей, оброблених hBCMA-Ig, після імунізації SRBC, можна передбачити, що є інгібування активації і/або дозрівання B-клітин і потенційно підвищена елімінація активованих B-клітин. Дуже невеликий процент антиген-специфічних B-клітин буде активуватися і давати відповідь на будь-який антиген, і в цьому випадку на SRBC. Внаслідок того, що обробка hBCMA-Ig приводить до такого помітного зниження процента B-клітин у всіх досліджених тканинах, на 50%, виявилося, що активність hBCMA-Ig розповсюджується також на зрілі Вклітини, що знаходяться в спокої. Отже, очікується, що злитий ВСМА-білок можна використати як лікувальний препарат з клінічним застосуванням при опосередкованих Вклітинами захворюваннях. Захворювання будуть включати такі, які є аутоімунними за своєю природою, такими, як системний червоний вовчак, важка, псевдопаралітична міастенія, аутоімунна гемо 74798 30 літична анемія, ідіопатична тромбоцитопенічна пурпура, антифосфоліпідний синдром, хвороба Чагаса, хвороба Грейвса, грануломатоз Вегенера, поліартеріїт нодозний і швидко прогресуючий гломерулонефрит. Терапевтичний агент буде також мати застосування при порушеннях, пов'язаних з плазматичними клітинами, таких, як множинна мієлома, макроглобулінемія Вальденстрема, захворювання, пов'язане з важким ланцюгом імуноглобулінів, первинний або пов'язане з імуноцитами амілоїдоз, моноклональна гамапатія невизначеного значення (MGUS). Онкологічні мішені будутьвключати В-клітинну карциному, лейкемію і лімфому. Фахівцям в даній області, очевидно, буде зрозуміло, що можна зробити різні модифікації і варіації в поліпептидах, композиціях і способах за винаходом, не змінюючи суті або об'єму винаходу. Таким чином, мається на увазі, що даний винахід включає модифікації і варіації даного винаходу за умови, що вони співпадають з об'ємом прикладеної формули винаходу і її еквівалентами. Список послідовностей 31 74798 32 33 74798 34 35 74798 36 37 74798 38 39 74798 40 41 74798 42 43 74798 44 45 74798 46 47 74798 48 49 74798 50 51 Комп’ютерна верстка О. Гапоненко 74798 Підписне 52 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601