Гідролази, кодуючі їх нуклеїнові кислоти і способи їх одержання і застосування

Реферат: Винахід належить до гідролаз, включаючи ліпази, і кодуючих їх полінуклеотидів, а також способів одержання і застосування цих полінуклеотидів і поліпептидів, способів одержання олій з низьким вмістом насичених жирних кислот або з низьким вмістом транс-ізомерів жирних кислот, таких як тваринні жири або рослинні олії з низьким вмістом насичених жирних кислот або низьким вмістом транс-ізомерів жирних кислот. UA 101214 C2 (12) UA 101214 C2 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За даною заявкою вимагається пріоритет по патентній заявці США № 12/202204, поданій 29 серпня 2008 року, яка, таким чином, включена в повному обсязі в даний опис як посилання. Список послідовностей Дана заявка подана зі списком послідовностей, представленим у вигляді файла з ім'ям 011631-0045-228_SeqListing.txt розміром 46086 байтів, що створений 25 серпня 2009 року. Список послідовностей включений у дану заявку як посилання в повному обсязі. Галузь техніки Винахід стосується поліпептидів, що мають гідролазну активність, включаючи ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, кодуючих їх полінуклеотидів і способів одержання і застосування цих полінуклеотидів і поліпептидів. Також винахід стосується пептидів і поліпептидів, наприклад, ферментів, що мають гідролазну активність, наприклад, ліпаз, сатураз, пальмітаз і/або стеаратаз, і способів обробки жирів і олій з використанням таких пептидів і поліпептидів для одержання продуктів гідролізу олій, таких як тваринні жири або рослинні олії з низьким вмістом насичених жирних кислот, наприклад, соєва олія або олія каноли, продуктів такої обробки олій і продуктів, що містять такі оброблені олії. Передумови винаходу В основному гідролази, наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази, використовують у промисловості, включаючи виробництво напоїв і продуктів харчування, як інгібітори черствіння для хлібобулочних виробів, а також у виробництві маргарину й інших пастоподібних сумішей з натуральними ароматизаторами олії; у системах видалення відходів; і у фармацевтичній промисловості, де їх використовують як засоби, що сприяють травленню. Перероблені олії і жири являють собою основні компоненти продуктів харчування, харчові добавки і харчові технологічні добавки, а також важливу відновлювану сировину для хімічної промисловості. Вони доступні у великих кількостях у результаті переробки насіння олійних культур, наприклад, рисового борошенця, кукурудзи, рапсу, каноли, соняшника, оливи, пальми або сої. Інші джерела цінних олій і жирів включають рибу, відходи ресторанів і топлені тваринні жири. Ці жири й олії являють собою суміші триацилгліцеридів або ліпідів, тобто, жирні кислоти (ЖК), етерифіковані на гліцериновому кістяку. Будь-які олія або жир містять широкий спектр ліпідів з різною структурою, що характеризується вмістом ЖК і їх регіохімічним розподілом на гліцериновому кістяку. Ці властивості окремих ліпідів визначають фізичні властивості чистого триацилгліцериду. Таким чином, вміст триацилгліцериду в жирі або олії у великій мірі визначає фізичні, хімічні і біологічні властивості олії. Цінність ліпідів значно зростає залежно від їх чистоти. Високої чистоти можна домогтися фракційною або хроматографією дистиляцією, відділивши бажаний триацилгліцерид від фонової суміші джерела жиру або олії. Однак це має високу вартість, а вихід часто обмежений тим, що в природі триацилгліцерид зустрічається в низькій концентрації. Крім того, очищення продукту часто ускладнюється присутністю множини структурно і фізично або хімічно схожих триацилгліцеридів в олії. Альтернативою очищення триацилгліцеридів або інших ліпідів із природного джерела є синтез ліпідів. Продукти таких процесів називають структурованими ліпідами, оскільки вони містять визначений набір жирних кислот, розташованих певним чином на гліцериновому кістяку. Також цінність ліпідів значно зростає за рахунок керування вмістом і розподілом жирних кислот у ліпіді. Усунення з тригліцеридів жирів або олій небажаних ЖК або заміна ЖК із небажаними властивостями на жирні кислоти з більш гарними або більш бажаними хімічними, фізичними або біологічними властивостями збільшує цінність ліпідів. Зокрема, існує потреба в ліпазах, які можуть відщеплювати за допомогою гідролізу, наприклад, вибірково відщеплювати за допомогою гідролізу, насичену жирну кислоту ("сатураза"), або в ліпазах, які, зокрема, можуть відщеплювати за допомогою гідролізу, наприклад, вибірково відщеплювати за допомогою гідролізу, пальмітинову кислоту ("пальмітаза") або стеаринову кислоту ("стеаратаза") від гліцеринового кістяка. Ліпази, такі як сатурази, наприклад, пальмітази і/або стеаратази, можна використовувати для здійснення такого контролю, де ЖК, що видаляються, додаються або заміщуються, являють собою насичені жирні кислоти, наприклад, пальмітинову кислоту або стеаринову кислоту. Суть винаходу Винахід стосується поліпептидів, які мають гідролазну активність, включаючи ліпазну активність. В одному з аспектів винахід стосується нових класів ліпаз, названих "сатурази", "пальмітази" і "стеаратази". Також винахід стосується полінуклеотидів, які кодують поліпептиди, що мають сатуразну, наприклад, пальмітазну і/або стеаратазну, активність, і способів одержання і застосування цих полінуклеотидів і поліпептидів. В одному з аспектів винахід стосується поліпептидів, наприклад, ферментів, які мають гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, і термостабільну і/або 1 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 термостабільну ферментативну (каталітичну) активність. Ферментативні активності поліпептидів і пептидів за винаходом включають (містять або складаються з) сатуразну активність або ліпазну активність, включаючи гідроліз ліпідів, реакції ацидолізу (наприклад, для заміщення етерифікованої жирної кислоти вільною жирною кислотою), реакції трансетерифікації (наприклад, обмін жирними кислотами між триацилгліцеридами), синтез складних ефірів, реакції переетерифікації й активність ацилгідролаз ліпідів (АГЛ). В іншому аспекті поліпептиди за винаходом використовують для синтезу енантіомерно чистих хіральних продуктів. Поліпептиди за винаходом можна використовувати в різних фармацевтичних, сільськогосподарських і промислових застосуваннях, включаючи виробництво косметичних засобів і нутрицевтиків. Додатково поліпептиди за винаходом можна використовувати в обробці харчових продуктів, пивоварінні, добавках для ванн, виробництві спирту, синтезі пептидів, енантіоселективності, виготовленні шкур у шкіряній промисловості, обробці відходів і розщепленні тваринних відходів, відновленні срібла у фотопромисловості, медичній допомозі, дегумуванні шовку, розкладанні біоплівок, перетворенні біомаси в еанол, біозахисті, протимікробних засобах і дезинфікуючих засобах, особистій гігієні і косметичних засобах, біотехнологічних реактивах, у підвищенні виходу крохмалю з зерна вологого помелу і як фармацевтичні препарати, такі як засоби, що сприяють травленню, і протизапальні засоби. У деяких варіантах здійснення винахід стосується композицій (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) і способів одержання олій з низьким вмістом насичених жирних кислот, наприклад, олій з низьким вмістом насичених жирних кислот, що містять олії з низьким вмістом пальмітинової, стеаринової, міристинової, лауринової або масляної жирної кислоти і/або каприлової кислоти (октанової кислоти). Будь-яку рослинну олію, наприклад, олію каноли, соєву олію або тваринний жир, наприклад, сало, можна обробити з використанням композиції або за допомогою способу за винаходом. Будь-які харчові продукти, їстівні продукти або печені, смажені або термічно оброблені продукти (наприклад, соуси, маринади, приправи, олії для змазування розбризкуванням, маргарини, пекарні олії, майонез, кулінарні олії, олії для салату, заправки, які можна черпати ложкою і наливати, і т. п., і продукти, одержані з їх використанням) можуть містити рослинну олію або тваринний жир, які оброблені з використанням композиції або способу за винаходом. Модифіковані рослинні олії зі зниженим вмістом насичених жирних кислот можна використовувати в будь-яких продуктах харчування, їстівних продуктах, печених або термічних оброблених продуктах, наприклад, у соусах, маринадах, приправах, оліях для змазування розбризкуванням, маргаринах, пекарних оліях, майонезі, кулінарних оліях, оліях для салату, заправках, які можна черпати ложкою і наливати і т. п. В одному з варіантів здійснення винахід стосується олій, таких як рослинні олії, наприклад, олія каноли або соєва олія, і продуктів харчування або печених або термічно оброблених продуктів, включаючи соуси, маринади, приправи, олії для змазування розбризкуванням, маргарини, майонез, пекарні олії, кулінарні олії, олії для смаження, олії для салату, заправки, які можна черпати ложкою і наливати, і т. п., де олія або продукт харчування, печений або термічно оброблений продукт модифікований з використанням ферменту за винаходом. В одному з аспектів ці рослинні олії, наприклад, олія каноли, рицинова олія, кокосова олія, коріандрова олія, кукурудзяна олія, бавовняна олія, олія лісового горіха, конопельна олія, лляна олія, олія пінника лугового, маслинова олія, пальмова олія, кісточкова пальмова олія, арахісова олія, рапсова олія, рисова олія, сафлорова олія, олія сасанкви, соєва олія, олія соняшника, талова олія, олія цубаки, різні "натуральні" олії, що мають змінений склад жирних кислот, за рахунок генетично модифікованих організмів (ГМО) або традиційної "селекції", такі як олії з високим вмістом олеїнової кислоти, з низьким вмістом ліноленової кислоти або з низьким вмістом насичених жирних кислот (олія каноли з високим вмістом олеїнової кислоти, соєва олія з низьким вмістом ліноленової кислоти або олія соняшника з високим вмістом стеаринової кислоти), тваринні жири (сало, лярд, жир коров'ячого масла і курячий жир), риб'ячий жир (жир тихоокеанського талеїхта, жир печінки тріски, жир хоплостета, жир сардини, жир оселедця і жир менхадена) або суміші будь-яких зазначених вище компонентів і продукти харчування або печені, смажені або термічно оброблені продукти містять олії зі зниженим вмістом насичених жирних кислот, включаючи олії з низьким вмістом пальмітинової кислоти, міристинової кислоти, лауринової кислоти, стеаринової кислоти, каприлової кислоти (октанової кислоти) і т. д., оброблені за допомогою використання композиції або способу за винаходом. В одному з аспектів винахід стосується поліпептидів, наприклад, ферментів і каталітичних антитіл, які мають гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, включаючи термостабільні і термостабільні ферментативні активності, і активності зі специфічністю до жирних кислот або вибірковістю до жирних кислот, і ферментативні активності з високою або низькою стійкістю до pН, і полінуклеотидів, кодуючих ці 2 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поліпептиди, включаючи вектори, клітини-хазяїни, трансгенні рослини і тварини, що не належать до людини, і способів одержання і застосування цих полінуклеотидів і поліпептидів. В іншому аспекті винахід стосується виділених, синтетичних або рекомбінантних нуклеїнових кислот, які містять: (a) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид), яка кодує щонайменше один поліпептид, де нуклеїнова кислота містить послідовність, що має щонайменше приблизно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше, або повну (100%) ідентичність послідовностей з: (і) SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 або SEQ ID NO:23, або (ii) нуклеїновою кислотою SEQ ID NO:1, яка містить одну або декілька нуклеотидних замін (або їх еквівалентів), що кодують одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять одну, двадцять дві, двадцять три, двадцять чотири, двадцять п'ять або більше, або всі амінокислотні заміни (або їх еквіваленти), як зазначено в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23, де нуклеїнова кислота за п. (і) або (ii) кодує щонайменше один поліпептид, який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, або кодує поліпептид або пептид, що дозволяє створити специфічне антитіло до гідролази (наприклад, до ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) (поліпептид або пептид, який виконує функцію епітопа або імуногена), (b) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид) за п. (a), де ідентичність послідовностей визначають: (a) за допомогою аналізу з використанням алгоритму порівняння послідовностей або за допомогою візуального дослідження, або (b) на ділянці довжиною щонайменше приблизно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 або більше залишків або по всій довжині кДНК, транскрипту (мРНК) або гена, (c) нуклеїнову кислоту (поліпептид) за п. (a) або (b), де алгоритмом порівняння послідовностей є алгоритм BLAST версії 2.2.2, де встановлені наступні настроювання фільтрації blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, а всі інші опції мають значення за замовчуванням, (d) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид), яка кодує щонайменше один поліпептид або пептид, що має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, де нуклеїнова кислота містить послідовність, що гібридизується в суворих умовах з комплементарною послідовністю нуклеїнової кислоти за п. (a), (b) або (c), де суворі умови включають стадію відмивання, що включає відмивання в 0,2×SSC при температурі приблизно 65 °C протягом приблизно 15 хвилин, (e) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид), яка кодує щонайменше один поліпептид, що має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, де поліпептид містить послідовність SEQ ID NO:2 або її ферментативно активні фрагменти, яка містить щонайменше одну, дві, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять, тринадцять, чотирнадцять, п'ятнадцять, шістнадцять, сімнадцять, вісімнадцять, дев'ятнадцять, двадцять, двадцять одну, двадцять дві, двадцять три, двадцять чотири або більше, або всі амінокислотні заміни (або їх еквіваленти), як зазначено в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23, (f) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид), яка кодує щонайменше один поліпептид, що має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, де поліпептид містить послідовність SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 або SEQ ID NO:20, або її ферментативно активні фрагменти, (g) (a) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид) за будь-яким з пп. з (a) до (f), яка кодує поліпептид, що містить щонайменше одну консервативну амінокислотну заміну і зберігає свою гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, або (b) нуклеїнову кислоту за п. (g) (a), де щонайменше одна консервативна амінокислотна заміна включає заміну амінокислоти на іншу амінокислоту зі схожими характеристиками; або консервативна заміна включає: заміну аліфатичної амінокислоти на іншу аліфатичну амінокислоту; заміну серину на треонін або навпаки; заміну кислотного залишку на інший кислотний залишок; заміну залишку, що несе аміногрупу, на інший залишок, що несе 3 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 аміногрупу; заміну основного залишку іншим основним залишком; або заміну ароматичного залишку іншим ароматичним залишком, (h) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид) за будь-яким з пп. з (a) до (g), яка кодує поліпептид, що має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, але не містить сигнальну послідовність, (і) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид) за будь-яким з пп. з (a) до (h), яка кодує поліпептид, що має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, що додатково містить гетерологічну послідовність, (j) нуклеїнову кислоту (полінуклеотид) за п. (і), де гетерологічна послідовність складається з або містить послідовність, яка кодує: (a) гетерологічну сигнальну послідовність, (b) послідовність за п. (a), де гетерологічну сигнальну послідовність одержують з гетерологічного ферменту, або (c) мітку, епітоп, таргетинг-пептид, розщеплювану послідовність, фрагмент або ділянку, що піддається виявленню, або (k) послідовність нуклеїнової кислоти (полінуклеотид), повністю (абсолютно) комплементарну послідовності за будь-яким з пп. з (a) до (j). В одному з аспектів виділена, синтетична або рекомбінантна нуклеїнова кислота кодує поліпептид або пептид, що має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, що є термостабільною. Поліпептиди і пептиди, кодовані нуклеїновими кислотами за винаходом, або будь-який поліпептид або пептид за винаходом можуть зберігати ферментативну або зв’язувальну активність (наприклад, зв'язування із субстратом) в умовах, що включають температурний діапазон приблизно від 100 °C приблизно до -80 °C, приблизно від -80 °C приблизно до -40 °C, приблизно від -40 °C приблизно до -20 °C, приблизно від -20 °C приблизно до 0 °C, приблизно від 0 °C приблизно до 5 °C, приблизно від 5 °C приблизно до 15 °C, приблизно від 15 °C приблизно до 25 °C, приблизно від 25 °C приблизно до 37 °C, приблизно від 37 °C приблизно до 45 °C, приблизно від 45 °C приблизно до 55 °C, приблизно від 55 °C приблизно до 70 °C, приблизно від 70 °C приблизно до 75 °C, приблизно від 75 °C приблизно до 85 °C, приблизно від 85 °C приблизно до 90 °C, приблизно від 90 °C приблизно до 95 °C, приблизно від 95 °C приблизно до 100 °C, приблизно від 100 °C приблизно до 105 °C, 5 приблизно 105 °C приблизно до 110 °C, приблизно від 110 °C приблизно до 120 °C або 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C, 99 °C, 100 °C, 101 °C, 102 °C, 103 °C, 104 °C, 105 °C, 106 °C, 107 °C, 108 °C, 109 °C, 110 °C, 111 °C, 112 °C, 113 °C, 114 °C, 115 °C або більше. Винахід стосується термостабільних поліпептидів, які зберігають гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, при температурі в описаних вище діапазонах, приблизно при pН 3,0, приблизно при pН 3,5, приблизно при pН 4,0, приблизно при pН 4,5, приблизно при pН 5,0, приблизно при pН 5,5, приблизно при pН 6,0, приблизно при pН 6,5, приблизно при pН 7,0, приблизно при pН 7,5, приблизно при pН 8,0, приблизно при pН 8,5, приблизно при pН 9,0, приблизно при pН 9,5, приблизно при pН 10,0, приблизно при pН 10,5, приблизно при pН 11,0, приблизно при pН 11,5, приблизно при pН 12,0 або більше. В одному з аспектів поліпептиди за винаходом можуть бути термостабільними і можуть зберігати гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, після впливу температури в діапазоні приблизно від -100 °C приблизно до -80 °C, приблизно від -80 °C приблизно до -40 °C, приблизно від -40 °C приблизно до -20 °C, приблизно від -20 °C приблизно до 0 °C, приблизно від 0 °C приблизно до 5 °C, приблизно від 5 °C приблизно до 15 °C, приблизно від 15 °C приблизно до 25 °C, приблизно від 25 °C приблизно до 37 °C, приблизно від 37 °C приблизно до 45 °C, приблизно від 45 °C приблизно до 55 °C, приблизно від 55 °C приблизно до 70 °C, приблизно від 70 °C приблизно до 75 °C, приблизно від 75 °C приблизно до 85 °C, приблизно від 85 °C приблизно до 90 °C, приблизно від 90 °C приблизно до 95 °C, приблизно від 95 °C приблизно до 100 °C, приблизно від 100 °C приблизно до 105 °C, приблизно від 105 °C приблизно до 110 °C, приблизно від 110 °C приблизно до 120 °C або 95 °C, 96 °C, 97 °C, 98 °C, 99 °C, 100 °C, 101 °C, 102 °C, 103 °C, 104 °C, 105 °C, 106 °C, 107 °C, 108 °C, 109 °C, 110 °C, 111 °C, 112 °C, 113 °C, 114 °C, 115 °C або більше. У деяких варіантах здійснення термостабільні поліпептиди зберігають гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, після впливу температури в описаних вище діапазонах, приблизно при pН 3,0, приблизно при pН 3,5, приблизно при pН 4,0, приблизно при pН 4,5, приблизно при pН 5,0, приблизно при pН 5,5, приблизно при pН 6,0, приблизно при pН 6,5, приблизно при pН 7,0, приблизно при pН 7,5, приблизно при pН 8,0, приблизно при pН 8,5, приблизно при pН 9,0, приблизно при pН 9,5, приблизно при pН 10,0, приблизно при pН 10,5, приблизно при pН 11,0, приблизно при pН 11,5, приблизно при pН 12,0 або більше. 4 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 В одному з варіантів здійснення виділені, синтетичні або рекомбінантні нуклеїнові кислоти містять послідовність, яка гібридизується в суворих умовах з нуклеїновою кислотою за винаходом, наприклад, зі зразковою нуклеїновою кислотою за винаходом, що містить послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:22 або SEQ ID NO:23, або послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:1, що включає заміни одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти, одинадцяти або дванадцяти або більше або всіх залишків (модифікації послідовності SEQ ID NO:1), зазначені в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23, або їх фрагменти або підпослідовності і послідовності, (повністю) комплементарні ним. В одному з аспектів нуклеїнова кислота кодує поліпептид, який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність. Довжина нуклеїнової кислоти може складати щонайменше приблизно 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700 або більше залишків або відповідати повній довжині гена або транскрипту, що містить SEQ ID NO:1, і містити послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:1, що містить заміни одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти, одинадцяти або дванадцяти або більше, або усіх залишків (модифікації амінокислотної послідовності) SEQ ID NO:1, що зазначені в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23; і послідовності, (повністю) комплементарні ним. В одному з аспектів строгі умови включають стадію відмивання, що включає відмивання в 0,2×SSC при температурі приблизно 65 °C протягом приблизно 15 хвилин. В одному з варіантів здійснення зонд із нуклеїнової кислоти, наприклад, зонд для ідентифікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, включає зонд, що містить або складається щонайменше приблизно з 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000 або більше послідовних основ послідовності за винаходом або її фрагментів або підпослідовностей, де зонд дозволяє ідентифікувати нуклеїнову кислоту за допомогою зв'язування або гібридизації. Зонд може містити олігонуклеотид, який містить щонайменше приблизно від 10 до 50, приблизно від 20 до 60, приблизно від 30 до 70, приблизно від 40 до 80 або приблизно від 60 до 100 послідовних основ послідовності, що містить послідовність за винаходом або її фрагменти або підпослідовності. Зонд може містити олігонуклеотид, який містить щонайменше приблизно від 10 до 50, приблизно від 20 до 60, приблизно від 30 до 70, приблизно від 40 до 80 або приблизно від 60 до 100 послідовних основ послідовності нуклеїнової кислоти за винаходом або її підпослідовність. В одному з варіантів здійснення пари послідовностей праймерів для ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, містить пару праймерів, що містить або складається з пари праймерів, які дозволяють ампліфікувати нуклеїнову кислоту, що містить послідовність за винаходом або її фрагменти або підпослідовності. Один або обидва члени пари послідовностей праймерів для ампліфікації можуть містити олігонуклеотид, який містить щонайменше приблизно від 10 до 50 послідовних основ з послідовності. В одному з варіантів здійснення способи ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, включають ампліфікацію матричної нуклеїнової кислоти з використанням пари послідовностей праймерів для ампліфікації, що дозволяють ампліфікувати послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом або її фрагменти або підпослідовності. В одному з варіантів здійснення експресуючі касети містять нуклеїнову кислоту за винаходом або її підпослідовність. В одному з аспектів експресуюча касета може містити нуклеїнову кислоту, яка функціонально зв'язана з промоторами. Промотори можуть являти собою промотори вірусів, бактерій, ссавців або рослин. В одному з аспектів промотори рослин можуть являти собою промотори картоплі, рису, кукурудзи, пшениці, тютюну або ячменю. Промотори можуть являти собою конститутивний промотор. Конститутивний промотор може містити CaMV35S. В іншому аспекті промотори можуть являти собою індуковані промотори. В одному з аспектів промотори можуть являти собою тканиноспецифічні промотори або промотори, регульовані навколишнім середовищем або регульовані розвитком. Таким чином, промотори можуть являти собою специфічні промотори, наприклад, насіння, листів, коренів, стебла, або промотори, індуковані скиданням. В одному з аспектів експресуюча касета може додатково містити експресуючий вектор рослини або вірусу рослини. 60 5 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів здійснення переносники для клонування містять експресуючу касету (наприклад, вектор) за винаходом або нуклеїнову кислоту за винаходом. Переносник для клонування може являти собою вірусний вектор, плазміду, фаг, фагеміду, косміду, фосміду, бактеріофаг або штучну хромосому. Вірусний вектор може містити аденовірусний вектор, ретровірусний вектор або аденоасоційований вірусний вектор. Переносник для клонування може містити бактеріальну штучну хромосому (BAC), плазміду, вектор, одержаний з бактеріофага P1 (РАС), штучну хромосому дріжджів (YAC) або штучну хромосому ссавця (MAC). В одному з варіантів здійснення трансформовані клітини містять нуклеїнову кислоту за винаходом або експресуючу касету (наприклад, вектор) за винаходом, або переносник для клонування за винаходом. В одному з аспектів трансформована клітина може являти собою бактеріальну клітину, клітину ссавця, клітину гриба, клітину дріжджів, клітину комахи або клітину рослини. В одному з аспектів клітина рослини може являти собою клітину картоплі, пшениці, рису, кукурудзи, тютюну або ячменю. Трансформована клітина може являти собою будь-яку клітину-хазяїна, відому фахівцям у даній галузі, включаючи прокаріотичні клітини, еукаріотичні клітини, такі як бактеріальні клітини, клітини грибів, клітини дріжджів, клітини ссавців, клітини комах або клітини рослин. Зразкові бактеріальні клітини включають будь-які види в межах родів Escherichia, Bacillus, Streptomyces, Salmonella, Pseudomonas і Staphylococcus, включаючи, наприклад, Escherichia coli, Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Salmonella typhimurium, Pseudomonas fluorescens. Зразкові клітини грибів включають будь-які види Aspergillus. Зразкові клітини дріжджів включають будь-які види Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces або Schwanniomyces, включаючи Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae або Schizosaccharomyces pombe. Зразкові клітини комах включають будь-які види Spodoptera або Drosophila, включаючи Drosophila S2 і Spodoptera Sf9. Зразкові клітини тварин включають лінії клітин CHO, COS або меланоми Боуеса або будь-які лінії клітин миші або людини. В одному з варіантів здійснення трансгенні рослини містять нуклеїнову кислоту за винаходом або експресуючу касету (наприклад, вектор) за винаходом. Трансгенною рослиною може бути рослина кукурудзи, рослина картоплі, рослина помідора, рослина пшениці, рослина олійної культури, рослина рапсу, рослина сої, рослина рису, рослина ячменю або рослина тютюну. В одному з варіантів здійснення трансгенне насіння містить нуклеїнову кислоту за винаходом або експресуючу касету (наприклад, вектор) за винаходом. Трансгенне насіння може являти собою рис, насіння кукурудзи, зерна пшениці, насіння олійних культур, насіння рапсу, насіння сої, ядра кокосових горіхів, насіння соняшника, насіння кунжуту, насіння рослин арахісу або тютюну. В одному з варіантів здійснення виділені, синтетичні або рекомбінантні поліпептиди, що мають гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, або поліпептиди, що дозволяють одержати специфічну імунну відповідь до гідролази, наприклад, до ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази (наприклад, епітоп); і в альтернативних аспектах пептиди і поліпептиди за винаходом містять послідовність: (a) яка має щонайменше приблизно 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або більше або має 100% (повну) ідентичність послідовностей з: (і) амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:2 або її ферментативно активними фрагментами і містить заміни щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти, одинадцяти, дванадцяти, тринадцяти, чотирнадцяти, п'ятнадцяти, шістнадцяти, сімнадцяти, вісімнадцяти, дев'ятнадцяти, двадцяти, двадцяти одного, двадцяти двох, двадцяти трьох, двадцяти чотирьох або більше, або всіх амінокислотних залишків (або їх еквіваленти), як зазначено в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23, або (ii) амінокислотною послідовністю SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:18 або SEQ ID NO:20, де поліпептид або пептид за п. (і) або (ii) має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, або поліпептид або пептид дозволяє одержати специфічне антитіло до гідролази (наприклад, до ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) (поліпептид або пептид, який виконує функцію епітопа або імуногена), (b) поліпептиду або пептиду за п. (a), де ідентичність послідовностей визначають: (a) за допомогою аналізу з використанням алгоритму порівняння послідовностей або за допомогою візуального дослідження, або (b) на ділянці довжиною щонайменше приблизно 20, 25, 30, 35, 6 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 40, 45, 50, 55, 60, 75, 100, 150, 200, 250, 300 або більше амінокислотних залишків або по всій довжині поліпептиду або пептиду, або ферменту і/або їх ферментативно активних підпослідовностей (фрагментів), (c) поліпептиду або пептиду за п. (b), де алгоритмом порівняння послідовностей є алгоритм BLAST версії 2.2.2, де встановлені наступні настроювання фільтрації blastall -p blastp -d "nr pataa" -F F, а всі інші опції мають значення за замовчуванням; (d) амінокислотну послідовність, кодовану нуклеїновою кислотою, наданою в даному документі, де поліпептид має (і) гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, або (ii) має таку імуногенну активність, що вона дозволяє одержати антитіло, яке специфічно зв'язується з поліпептидом, що містить послідовність за п. (a), і/або з його ферментативно активними підпослідовностями (фрагментами); (e) амінокислотну послідовність за будь-яким з пп. з (a) до (d), що включає щонайменше одну заміну консервативного амінокислотного залишку, але поліпептид або пептид зберігає гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність; (f) амінокислотну послідовність за п. (e), де консервативна заміна включає заміну аліфатичної амінокислоти на іншу аліфатичну амінокислоту; заміну серину на треонін або навпаки; заміну кислотного залишку на інший кислотний залишок; заміну залишку, що несе аміногрупу, на інший залишок, що несе аміногрупу; заміну основного залишку іншим основним залишком; або заміну ароматичного залишку іншим ароматичним залишком або їх сполучення, (g) амінокислотну послідовність за п. (f), де аліфатичний залишок включає аланін, валін, лейцин, ізолейцин або їх синтетичний еквівалент; кислий залишок включає аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту або їх синтетичний еквівалент; залишок, що містить амідну групу, включає аспарагін, глутамін або їх синтетичний еквівалент; основний залишок містить лізин, аргінін, гістидин або їх синтетичний еквівалент; або ароматичний залишок містить фенілаланін, тирозин, триптофан або їх синтетичний еквівалент; (h) поліпептиду за будь-яким з пп. з (a) до (f), який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, але не містить сигнальну послідовність, (і) поліпептиду за будь-яким з пп. з (a) до (h), який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, який додатково містить гетерологічну послідовність; (j) поліпептиду за п. (і), де гетерологічна послідовність містить або складається з: (a) гетерологічної сигнальної послідовності, (b) послідовності за п. (a), де гетерологічну сигнальну послідовність одержують з гетерологічного ферменту, і/або (c) мітки, епітопа, таргетинг-пептиду, розщеплюваної послідовності, фрагмента або ділянки, що піддається виявленню; або (m) містять амінокислотну послідовність, кодовану будь-якою послідовністю нуклеїнової кислоти за винаходом. Зразкові поліпептидні або пептидні послідовності за винаходом включають SEQ ID NO:2 і її підпослідовності і варіанти, наприклад, довжиною щонайменше приблизно 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500 або більше залишків або повнорозмірний фермент, усі містять заміни одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти, одинадцяти або дванадцяти або більше, або всіх амінокислотних залишків (модифікації амінокислотної послідовності SEQ ID NO:2), що зазначені в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23. Зразкові поліпептидні або пептидні послідовності за винаходом містять послідовність, кодовану нуклеїновою кислотою за винаходом. Зразкові поліпептидні або пептидні послідовності за винаходом включають поліпептиди або пептиди, з якими специфічно зв'язується антитіло за винаходом. В одному з аспектів, поліпептид за винаходом має щонайменше один вид гідролазної активності, наприклад, ліпазної, сатуразної, пальмітазної і/або стеаратазної активності. В одному з аспектів активність являє собою регіоселективну і/або хемоселективну активність. В одному з аспектів виділений, синтетичний або рекомбінантний поліпептид може містити поліпептид за винаходом, що не містить сигнальну (пептидну) послідовність, наприклад, не містить гомологічну сигнальну послідовність, і в одному з аспектів містить гетерологічну сигнальну (пептидну) послідовність. В одному з аспектів виділений, синтетичний або рекомбінантний поліпептид може містити поліпептид за винаходом, що містить гетерологічну сигнальну послідовність, таку як гетерологічна сигнальна послідовність гідролази або негідролази (наприклад, неліпази, несатурази або непальмітази). В одному з аспектів химерні білки містять перший домен, що містить сигнальну послідовність за винаходом, і щонайменше другий домен. Білок може являти собою злитий білок. Другий домен може містити фермент. 7 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Фермент може являти собою гідролазу (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом або іншу гідролазу. В одному з аспектів гідролазна (наприклад, ліпазна, сатуразна, пальмітазна і/або стеаратазна) активність включає конкретну активність приблизно при 37 °C у діапазоні приблизно від 100 приблизно до 1000 одиниць на міліграм білка. В іншому аспекті гідролазна (наприклад, ліпазна, сатуразна, пальмітазна і/або стеаратазна) активність включає конкретну активність приблизно від 500 приблизно до 750 одиниць на міліграм білка. Альтернативно, гідролазна активність включає конкретну активність при 37 °C у діапазоні приблизно від 500 приблизно до 1200 одиниць на міліграм білка. В одному з аспектів гідролазна активність включає конкретну активність при 37 °C у діапазоні приблизно від 750 приблизно до 1000 одиниць на міліграм білка. В іншому аспекті термостабільність включає зберігання щонайменше половини конкретної активності гідролази при 37 °C після нагрівання до підвищеної температури. Альтернативно, термостабільність може включати зберігання конкретної активності при 37 °C у діапазоні приблизно від 500 приблизно до 1200 одиниць на міліграм білка після нагрівання до підвищеної температури. В одному з варіантів здійснення виділені, синтетичні або рекомбінантні поліпептиди за винаходом містять щонайменше один сайт глікозилування. В одному з аспектів глікозилування може являти собою N-глікозилування. В одному з аспектів поліпептид можна глікозилувати після експресії в P. pastoris або S. pombe або в рослинах, таких як олійні рослини, наприклад, соя, канола, рис, соняшник або генетично модифіковані (ГМО) варіанти цих рослин. В одному з аспектів поліпептид може зберігати гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність в умовах, що включають приблизно pН 6,5, pН 6, pН 5,5, pН 5, pН 4,5 або pН 4,0, або нижче. В іншому аспекті поліпептид може зберігати гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність в умовах, що включають приблизно pН 7, pН 7,5, pН 8,0, pН 8,5, pН 9, pН 9,5, pН 10, pН 10,5, pН 11, pН 11,5, pН 12,0 або більше. В одному з варіантів здійснення препарати білка містять поліпептид за винаходом, де препарат білка містить рідину, тверду речовину або гель. В одному з аспектів гетеродимери за винаходом містять поліпептид і другий домен. В одному з аспектів другий домен може являти собою поліпептид і гетеродимер може являти собою злитий білок. В одному з аспектів другий домен може являти собою епітоп або мітку. В одному з аспектів гомодимери за винаходом містять поліпептид за винаходом. В одному з варіантів здійснення іммобілізовані поліпептиди за винаходом мають гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність, де поліпептид містить поліпептид за винаходом, поліпептид, кодований нуклеїновою кислотою за винаходом, або поліпептид, що містить поліпептид за винаходом, і другий домен. В одному з аспектів поліпептид за винаходом можна іммобілізувати на клітині, везикулі, ліпосомі, плівці, мембрані, металі, смолі, полімері, кераміці, склі, мікроелектроді, графітовій частинці, бусині, гелі, планшеті, кристалі, таблетці, драже, капсулі, порошку, агломераті, поверхні, пористій структурі, блоці або капілярній трубці або на матеріалах, таких як зерна, шкірка, кора, шкіра, волосся, емаль, кістка, і матеріалах, одержуваних з них. Полінуклеотиди, поліпептиди і ферменти за винаходом можна ввести до складу у твердій формі, такій як порошок, ліофілізований препарат, гранули, таблетка, пластинка, кристал, капсула, драже, пелет, або в рідкій формі, такій як водний розчин, аерозоль, гель, паста, суспензія, водно-масляна емульсія, крем, капсула або суспензія везикул або міцел. В одному з варіантів здійснення харчові добавки для тварин містять поліпептид за винаходом, наприклад, поліпептид, кодований нуклеїновою кислотою за винаходом. В одному з аспектів поліпептид у харчовій добавці може бути глікозилованим. В одному з варіантів здійснення їстівні матриці для доставки ферменту містять поліпептид за винаходом, наприклад, поліпептид, кодований нуклеїновою кислотою за винаходом. В одному з аспектів матриця для доставки містить пелет. В одному з аспектів поліпептид може бути глікозилований. В одному з аспектів гідролазна активність є термостійкою. В іншому аспекті гідролазна активність є термостабільною. В одному з варіантів здійснення способи виділення або ідентифікації поліпептиду, що має гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність, включають стадії: (a) одержання антитіла за винаходом; (b) одержання зразка, що містить поліпептиди; і (c) контакт зразка зі стадії (b) з антитілом зі стадії (a) в умовах, у яких антитіло може специфічно зв'язуватися з поліпептидом, за допомогою чого здійснюють виділення або ідентифікацію поліпептиду, що має гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність. 8 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з варіантів здійснення способи одержання антитіла проти гідролази включають введення тварині, що не належить до людини, нуклеїнової кислоти за винаходом або поліпептиду за винаходом, або їх підпослідовності в кількості, достатній для створення гуморальної імунної відповіді, за допомогою чого одержують антитіло проти гідролази. Винахід стосується способів одержання антитіла до гідролази, які включають введення тварині, що не є людиною, нуклеїнової кислоти за винаходом або поліпептиду за винаходом, або їх підпослідовності в кількості, достатній для одержання імунної відповіді. В одному з варіантів здійснення способи одержання рекомбінантного поліпептиду включають стадії: (a) одержання нуклеїнової кислоти за винаходом, функціонально зв'язаної з промоторами; і (b) експресія нуклеїнової кислоти зі стадії (a) в умовах, що допускають експресію поліпептиду, за допомогою чого одержують рекомбінантний поліпептид. В одному з аспектів спосіб може додатково включати трансформацію клітини-хазяїна нуклеїновою кислотою зі стадії (a) з наступною експресією нуклеїнової кислоти зі стадії (a), за допомогою чого одержують рекомбінантний поліпептид у трансформованій клітині. В одному з варіантів здійснення способи ідентифікації поліпептиду, який має гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність, включають наступні стадії: (a) одержання поліпептиду за винаходом або поліпептиду, кодованого нуклеїновою кислотою за винаходом; (b) одержання субстрату гідролази; і (c) контакт поліпептиду або його фрагмента або варіанта зі стадії (a) із субстратом зі стадії (b) і виявлення зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції, де зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції виявляє поліпептид, який має гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність. В одному з варіантів здійснення способи ідентифікації субстрату гідролази включають наступні стадії: (a) одержання поліпептиду за винаходом або поліпептиду, кодованого нуклеїновою кислотою за винаходом; (b) одержання тестованого субстрату; і (c) контакт поліпептиду зі стадії (a) з тестованим субстратом зі стадії (b) і виявлення зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції, де зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції ідентифікує тестований субстрат як субстрат гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази). В одному з варіантів здійснення способи визначення специфічного зв'язування тестованої сполуки з поліпептидом включають наступні стадії: (a) експресія нуклеїнової кислоти або вектора, що містить нуклеїнову кислоту, в умовах, які допускають трансляцію нуклеїнової кислоти в поліпептид, де нуклеїнова кислота містить нуклеїнову кислоту за винаходом, або надання поліпептиду за винаходом; (b) одержання тестованої сполуки; (c) контакт поліпептиду з тестованою сполукою; і (d) визначення специфічного зв'язування тестованої сполуки зі стадії (b) з поліпептидом. В одному з варіантів здійснення способи ідентифікації модулятора гідролазної (наприклад, ліпазної, сатуразної, пальмітазної і/або стеаратазної) активності включають наступні стадії: (a) одержання поліпептиду за винаходом або поліпептиду, кодованого нуклеїновою кислотою за винаходом; (b) одержання тестованої сполуки; (c) контакт поліпептиду зі стадії (a) з тестованою сполукою зі стадії (b) і вимірювання активності гідролази, де зміну гідролазної активності вимірюють у присутності тестованої сполуки в порівнянні з активністю за відсутності тестованої сполуки, що дозволяє визначити, що тестована сполука модулює гідролазну активність. В одному з аспектів гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність можна виміряти шляхом одержання субстрату гідролази і виявлення зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції або виявлення збільшення кількості субстрату або зниження кількості продукту реакції. Зниження кількості субстрату або збільшення кількості продукту реакції при використанні тестованої сполуки в порівнянні з кількістю субстрату або продукту реакції без використання тестованої сполуки ідентифікує тестовану сполуку як активатор гідролазної активності. Збільшення кількості субстрату або зниження кількості продукту реакції при використанні тестованої сполуки в порівнянні з кількістю субстрату або продукту реакції без використання тестованої сполуки ідентифікує тестовану сполуку як інгібітор гідролазної активності. В одному з варіантів здійснення комп'ютерні системи містять процесор і пристрої зберігання даних, де на зазначеному пристрої зберігання даних зберігають послідовність поліпептиду або послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом (наприклад, поліпептид, кодований нуклеїновою кислотою за винаходом). В одному з аспектів комп'ютерна система додатково може включати алгоритм порівняння послідовностей і пристрій зберігання даних, що містить збережувану на ньому щонайменше одну еталонну послідовність. В іншому аспекті алгоритм порівняння послідовностей включає комп'ютерну програму, яка визначає поліморфізм. В 9 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 одному з аспектів комп'ютерна система додатково може включати ідентифікатор, що ідентифікує одну або декілька ознак у зазначеній послідовності. В одному з варіантів здійснення машиночитаний носій містить збережувану на ньому послідовність поліпептиду або послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом. В одному з варіантів здійснення способи ідентифікації ознаки в послідовності включають стадії: (a) зчитування послідовності, використовуючи комп'ютерну програму, що ідентифікує одну або декілька ознак у послідовності, де послідовність містить послідовність поліпептиду або послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом; і (b) ідентифікація однієї або декількох ознак у послідовності з використанням комп'ютерної програми. В іншому варіанті здійснення винахід стосується способів порівняння першої послідовності з другою послідовністю, які включають стадії: (a) зчитування першої послідовності і другої послідовності за допомогою комп'ютерної програми, що порівнює послідовності, де перша послідовність містить послідовність поліпептиду або послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом; і (b) визначення відмінностей між першою послідовністю і другою послідовністю з використанням комп'ютерної програми. Стадія визначення відмінностей між першою послідовністю і другою послідовністю додатково може включати стадію ідентифікації поліморфізму. В одному з аспектів спосіб додатково може включати ідентифікатор, що ідентифікує одну або декілька ознак у послідовності. В іншому аспекті спосіб може включати зчитування першої послідовності з використанням комп'ютерної програми й ідентифікацію однієї або декількох ознак у послідовності. В одному з варіантів здійснення способи виділення або збирання нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має гідролазну (наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну) активність, зі зразка включають стадії: (a) одержання пари послідовностей праймерів для ампліфікації нуклеїнової кислоти, що кодує поліпептид, який має гідролазну активність, де пара праймерів дозволяє ампліфікувати нуклеїнову кислоту за винаходом; (b) виділення нуклеїнової кислоти зі зразка або обробка зразка таким чином, що нуклеїнову кислоту в зразку роблять доступною для гібридизації з парою праймерів для ампліфікації; і (c) об'єднання нуклеїнової кислоти зі стадії (b) з парою праймерів для ампліфікації зі стадії (a) і ампліфікація нуклеїнової кислоти зі зразка, за допомогою чого зі зразка виділяють або збирають нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид, який має гідролазну активність. В одному з варіантів здійснення зразок являє собою зразок навколишнього середовища, наприклад, зразок води, зразок рідини, зразок ґрунту, зразок повітря або біологічний зразок, наприклад, клітину бактерії, клітину найпростішого, клітину комахи, клітину дріжджів, клітину рослини, клітину гриба або клітину ссавця. Один або обидва члени пари послідовностей праймерів для ампліфікації можуть містити олігонуклеотид, що містить щонайменше приблизно від 10 до 50 або більше послідовних основ з послідовності за винаходом. В одному з варіантів здійснення способи збільшення термостійкості або термостабільності поліпептиду гідролази включають глікозилування поліпептиду гідролази, де поліпептид містить щонайменше тридцять суміжних амінокислот з поліпептиду за винаходом або з поліпептиду, кодованого послідовністю нуклеїнової кислоти за винаходом, за допомогою чого збільшують термостійкість або термостабільність поліпептиду гідролази. В одному з аспектів конкретна активність гідролази може бути термостабільною або термостійкою при температурі в діапазоні приблизно від більше ніж 37 °C приблизно до 95 °C. В одному з варіантів здійснення способи підвищеної експресії поліпептиду рекомбінантної гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) у клітині включають експресію вектора, що містить нуклеїнову кислоту за винаходом або послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом, де ідентичність послідовностей визначають за допомогою аналізу з використанням алгоритму порівняння послідовностей або за допомогою візуального дослідження, де підвищену експресію забезпечують за допомогою використання промоторів з високою активністю, дицистронного вектора або за допомогою ампліфікації гена вектора. В одному з варіантів здійснення мийні склади, що містять поліпептид за винаходом або поліпептид, кодований нуклеїновою кислотою за винаходом, мають гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність. В одному з аспектів гідролаза може являти собою неповерхнево-активну гідролазу. В іншому аспекті гідролаза може являти собою поверхнево-активну гідролазу. В одному з варіантів здійснення способи миття об'єкта включають наступні стадії: (a) одержання композиції, що містить поліпептид, який має гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, де поліпептид містить: поліпептид за винаходом або поліпептид, кодований нуклеїновою кислотою за винаходом; (b) одержання 10 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 об'єкта; і (c) контакт поліпептиду зі стадії (a) з об'єктом зі стадії (b) в умовах, у яких композиція може мити об'єкт. В одному з варіантів здійснення способи одержання трансгенної рослини включають наступні стадії: (a) введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітину рослини, де гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти містить послідовність нуклеїнової кислоти за винаходом, за допомогою чого одержують трансформовану клітину рослини; і (b) одержання трансгенної рослини з трансформованої клітини. В одному з аспектів стадія (a) додатково може включати введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти за допомогою електропорації або мікроін'єкції протопластів клітин рослини. В іншому аспекті стадія (a) додатково може включати введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти безпосередньо в тканину рослини за допомогою бомбардування частинками ДНК. Альтернативно, стадія (a) додатково може включати введення гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітину рослини ДНК, використовуючи хазяїна Agrobacterium tumefaciens. В одному з аспектів клітиною рослини може бути клітина картоплі, кукурудзи, рису, пшениці, тютюну або ячменю. В одному з варіантів здійснення способи експресії гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітині рослини включають наступні стадії: (a) трансформація клітини рослини гетерологічною послідовністю нуклеїнової кислоти, функціонально зв'язаною з промоторами, де гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти містить нуклеїнову кислоту за винаходом; (b) вирощування рослини в умовах, у яких відбувається експресія гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітинах рослини. В одному з варіантів здійснення перший спосіб біокаталітичного синтезу структурованого ліпіду включає наступні стадії: (a) одержання поліпептиду (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом; (b) одержання композиції, що містить триацилгліцерид (ТАГ); (c) контакт поліпептиду зі стадії (a) з композицією зі стадії (b) в умовах, у яких поліпептид здійснює гідролітичне відщеплення залишку карбонової кислоти в положенні Sn2 триацилгліцериду (ТАГ), за допомогою чого одержують 1,3-діацилгліцерид (ДАГ); (d) надання R1-складного ефіру; (e) одержання R1-специфічної гідролази, і (f) контакт 1,3-ДАГ зі стадії (c) зі R1-складним ефіром зі стадії (d) і R1-специфічною гідролазою зі стадії (e) в умовах, у яких R1-специфічна гідролаза каталізує етерифікацію в положенні Sn2, за допомогою чого одержують структурований ліпід. Гідролаза за винаходом може являти собою Sn2-специфічну ліпазу. Структурований ліпід може містити альтернативу масла какао (CBA), синтетичне масло какао, натуральне масло какао, 1,3-дипальмітоїл-2-олеоїлгліцерин (POP), 1,3-дистеароїл-2олеоїлгліцерин (SOS), 1-пальмітоїл-2-олеоїл-3-стеароїлгліцерин (POS) або 1-олеоїл-2,3диміристоїлгліцерин (OMM). В одному з варіантів здійснення другий спосіб біокаталітичного синтезу структурованого ліпіду включає наступні стадії: (a) одержання гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом; (b) одержання композиції, що містить триацилгліцерид (ТАГ); (c) контакт поліпептиду зі стадії (a) з композицією зі стадії (b) в умовах, у яких поліпептид здійснює гідроліз залишку карбонової кислоти в положенні Sn1 або Sn3 триацилгліцериду (ТАГ), за допомогою чого одержують 1,2-ДАГ або 2,3-ДАГ; і (d) сприяння перегрупуванню залишку карбонової кислоти в 1,2-ДАГ або 2,3-ДАГ зі стадії (c) у кінетично контрольованих умовах, за допомогою чого одержують композицію, що містить 1,3-ДАГ. Цей другий спосіб додатково може включати надання R1-складного ефіру і R1-специфічної ліпази і контакт 1,3-ДАГ зі стадії (d) зі R1-складним ефіром і R1-специфічною ліпазою в умовах, у яких R1-специфічна ліпаза каталізує етерифікацію в положенні Sn2, за допомогою чого одержують структурований ліпід. Гідролаза, наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза за винаходом, може являти собою Sn1- або Sn3-специфічний фермент. Структурований ліпід може містити будь-яку рослинну олію, наприклад, соєву олію, олію каноли, альтернативу масла какао (CBA), синтетичне масло какао, натуральне масло какао, 1,3дипальмітоїл-2-олеоїлгліцерин (POP), 1,3-дистеароїл-2-олеоїлгліцерин (SOS), 1-пальмітоїл-2олеоїл-3-стеароїлгліцерин (POS) або 1-олеоїл-2,3-диміристоїлгліцерин (OMM). R1-складний ефір може містити менш насичений фрагмент, ніж гідролізований залишок карбонової кислоти, і в цьому випадку одержаний таким чином структурований ліпід являє собою менш насичений жир або олію, ніж вихідний ТАГ. R1-складний ефір може містити одну або декілька речовин з омега-3 жирної кислоти, омега-6 жирної кислоти, мононенасиченої жирної кислоти, поліненасиченої жирної кислоти, фосфогрупи, складного ефіру фітостерину й оризанолу. Більш конкретно R1-складний ефір може містити фрагмент, вибраний із групи, що складається з α-ліноленової кислоти, ейкозапентаєнової кислоти, докозагексаєнової кислоти, γліноленової кислоти, дигомо-γ-ліноленової кислоти, арахідонової кислоти, олеїнової кислоти, 11 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пальмолеїнової кислоти, холіну, серину, β-ситостерину, куместролу, діетилстильбестролу й оризанолу. В одному з аспектів цього другого способу стадія (d) додатково включає використання іонообмінних смол. Кінетично контрольовані умови можуть включати нерівноважні умови, що ведуть до одержання кінцевого продукту, що має відношення 1,3-ДАГ до 2,3-ДАГ більше 2:1. Композиція зі стадії (b) може містити флуорогенну жирну кислоту (ЖК). Композиція зі стадії (b) може містити умбеліфериловий ефір ЖК. Кінцевий продукт може бути енантіомерно чистим. В одному з варіантів здійснення спосіб одержання менш насиченого жиру або олії включає наступні стадії: (a) одержання поліпептиду (гідролази, наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом; (b) одержання олії або жиру, і (c) контакт поліпептиду зі стадії (a) з олією або жиром зі стадії (b) в умовах, у яких гідролаза може модифікувати олію або жир, наприклад, видалити щонайменше одну насичену жирну кислоту, наприклад, пальмітинову, стеаринову, лауринову, каприлову кислоту (октанову кислоту) і т. п. Модифікація може включати каталізований гідролазою гідроліз жиру або олії. Гідроліз може являти собою повний або частковий гідроліз жиру або олії. Гідролізована олія може містити гліцериновий ефір поліненасиченої жирної кислоти, який може замістити видалену насичену жирну кислоту, або риб'ячий жир, тваринний жир або рослинну олію. Рослинна олія може містити маслинову, пальмову, соєву олію, олію каноли, соняшника або лауринову олію, або рисову олію, або їх сполучення. В одному з варіантів здійснення спосіб одержання менш насиченого жиру або олії, що може містити незамінні жирні кислоти, включає наступні стадії: (a) одержання поліпептиду (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом; (b) одержання композиції, що містить триацилгліцерид (ТАГ); (c) контакт поліпептиду зі стадії (a) з композицією зі стадії (b) в умовах, у яких поліпептид гідролізує залишок карбонової кислоти в положенні Sn1 або Sn3 триацилгліцериду (ТАГ), за допомогою чого одержують 1,2-ДАГ або 2,3-ДАГ; і (d) сприяння перегрупуванню залишку карбонової кислоти в 1,2-ДАГ або 2,3-ДАГ зі стадії (c) при кінетично контрольованих умовах, за допомогою чого одержують 1,3-ДАГ. Спосіб додатково може включати надання R1-складного ефіру і R1-специфічної ліпази і контакт 1,3-ДАГ зі стадії (d) з R1-складним ефіром і R1-специфічною ліпазою в умовах, у яких R1-специфічна ліпаза каталізує етерифікацію в положенні Sn2, за допомогою чого одержують структурований ліпід. R1-складний ефір може містити менш насичений фрагмент, ніж гідролізований залишок карбонової кислоти, і в цьому випадку одержаний таким чином структурований ліпід являє собою менш насичений жир або олію, ніж вихідний ТАГ. R1складний ефір може містити омега-3 жирну кислоту (α-ліноленову, ейкозапентаєнову (ЕПК), докозагексаєнову (ДГК)), омега-6 жирну кислоту (γ-ліноленову, дигомо-γ-ліноленову (ДГЛК) або арахідонову), мононенасичену жирну кислоту (олеїнову, пальмолеїнову і т. п.), фосфогрупи (холін і серин), складні ефіри фітостерину (β-ситостерин, куместрол і діетилстильбестрол) і оризанол. Гідролаза, наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза за винаходом, може бути Sn1- або Sn3-специфічним ферментом. Жир або олію зі зниженим вмістом насичених жирних кислот можна одержати за допомогою описаного вище гідролізу будь-якої олії водоростей, рослинної олії або тваринного жиру, наприклад, олії Neochloris oleoabundans, олії Scenedesmus dimorphus, олії Euglena gracilis, олії Phaeodactylum tricornmutum, олії Pleurochrysis carterae, олії Prymnesium parvum, олії Tetraselmis chui,олії Tetraselmis suecica, олії Isochrysis galbana, олії Nаnnосhlоrорsіs salina, олії Botryococcus braunii, олії Dunaliella tertiolecta, олії видів Nannochloris, олії видів Spirulina, олії Chlorophycease (зелені водорості) і олії Bacilliarophy, олії каноли, рицинової олії, кокосової олії, коріандрової олії, кукурудзяної олії, бавовняної олії, олії лісового горіха, конопельної олії, лляної олії, олії пінника лугового, маслинової олії, пальмової олії, кісточкової пальмової олії, арахісової олії, рапсової олії, рисової олії, сафлорової олії, олії сасанкви, соєвої олії, олії соняшника, талової олії, олії цубаки, різноманітних "натуральних" олій, що мають змінений склад жирних кислот за рахунок генетично модифікованих організмів (ГМО) або традиційної "селекції", таких як олії з високим вмістом олеїнової кислоти, з низьким вмістом ліноленової кислоти або з низьким вмістом насичених жирних кислот (олія каноли з високим вмістом олеїнової кислоти, соєва олія з низьким вмістом ліноленової кислоти або олія соняшника з високим вмістом стеаринової кислоти); тваринних жирів (сала, лярду, жиру коров'ячої олії і курячого жиру), риб'ячого жиру (жиру тихоокеанського талеїхта, жиру печінки тріски, жиру хоплостета, жиру сардини, жиру оселедця і жиру менхадена) або сумішей будьяких зазначених вище компонентів. Одержані таким чином жир або олія зі зниженим вмістом насичених жирних кислот можна використовувати в продуктах харчування або в печених, смажених або термічно оброблених продуктах, що містять олії або жири з низьким вмістом деяких жирних кислот, включаючи олії з низьким вмістом пальмітинової кислоти, олеїнової 12 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 кислоти, лауринової кислоти, стеаринової кислоти, каприлової кислоти (октанової кислоти) і т. д., що оброблені з використанням композиції або способу за винаходом. В одному з варіантів здійснення спосіб очищення лубриканту включає наступні стадії: (a) одержання композиції, що містить гідролазу (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом; (b) одержання лубриканту; і (c) обробка лубриканту гідролазою в умовах, у яких гідролаза (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) за винаходом може здійснювати вибірковий гідроліз олій у мастильному засобі, таким чином очищуючи його. Лубрикант може являти собою гідравлічну олію. В одному з варіантів здійснення спосіб обробки матерії включає наступні стадії: (a) одержання композиції, що містить гідролазу (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом, де гідролаза може вибірково гідролізувати складні ефіри карбонових кислот; (b) одержання матерії; і (c) обробка матерії гідролазою при умовах, у яких гідролаза може здійснювати вибірковий гідроліз складних ефірів карбонових кислот, таким чином обробляючи матерію. Обробка матерії може включати поліпшення тактильних і драпірувальних властивостей кінцевої матерії, фарбування, одержання уповільнення горіння, одержання водовідштовхувальних властивостей, одержання оптичного відбілювання або одержання обробки смолою. Матерія може містити бавовну, віскозу, віскозне волокно, ліоцел, льон, полотно, рами, будь-які їх суміші або їх суміші з поліестерами, вовною, поліаміди, акрили або поліакрили. В одному з варіантів здійснення матерія, нитка або пряжа містить гідролазу за винаходом, яку можна адсорбувати, абсорбувати або іммобілізувати на поверхні матерії, пряжі або волокна. В одному з варіантів здійснення спосіб видалення або зниження кількості плям від харчових продуктів або олії включає конакт гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом із плямою від продукту харчування або олії в умовах, у яких гідролаза може здійснювати гідроліз олії або жиру в плямі. Гідролаза (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) за винаходом може мати збільшену стійкість до денатурації поверхнево-активними речовинами і до теплової деактивації. Гідролаза (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) за винаходом може мати детергент або розчин для прання. В одному з варіантів здійснення дієтична композиція містить гідролазу (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом. Дієтична композиція додатково може містити поживну основу, що містить жир. Гідролазу можна активувати сіллю жовчної кислоти. Дієтична композиція додатково може містити склад для немовлят на основі коров'ячого молока. Гідролаза може здійснювати гідроліз жирних кислот з довгим ланцюгом. В одному з варіантів здійснення спосіб зниження вмісту жиру в молоці або дієтичних композиціях на основі овочів включає наступні стадії: (a) одержання композиції, що містить гідролазу (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом; (b) одержання композиції, що містить молоко або рослинну олію, і (c) обробка композиції зі стадії (b) гідролазою в умовах, у яких гідролаза може здійснювати гідроліз олії або жиру в композиції. В одному з варіантів здійснення дієтична композиція для людини або тварин з однокамерним шлунком містить поживну основу, де основа містить жир і не містить гідролазу або містить невелику кількість гідролази, і ефективну кількість гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом для збільшення усмоктування жиру і росту людини або тварини з однокамерним шлунком. В одному з варіантів здійснення спосіб каталізу реакції переетерифікації для одержання нових триацилгліцеридів включає наступні стадії: (a) одержання композиції, що містить поліпептид (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом, де поліпептид може каталізувати реакцію переетерифікації; (b) одержання суміші триацилгліцеридів і вільних жирних кислот; (c) обробка суміші зі стадії (b) поліпептидом в умовах, у яких поліпептид може каталізувати обмін вільної жирної кислоти й ацильних груп триацилгліцеридів, за допомогою чого одержують нові триацилгліцериди, збагачені приєднаними жирними кислотами. Поліпептид може являти собою Sn1,3-специфічну ліпазу. В одному з варіантів здійснення спосіб переетерифікації для одержання олії з низьким вмістом транс-ізомерів жирних кислот і низьким вмістом жирних кислот із середньою довжиною ланцюга включає наступні стадії: (a) одержання реакційної суміші для переетерифікації, яка містить речовину джерела стеаринової кислоти, вибрану з групи, що складається зі стеаринової кислоти, складних моноефірів стеаринової кислоти й одноатомних спиртів з низькою молекулярною масою і їх сумішей, (b) одержання рідкої рослинної олії; (c) одержання поліпептиду (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом, де поліпептид має 1,3-специфічну ліпазну активність; (d) переетерифікація речовини джерела 13 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стеаринової кислоти і триацилгліцериду рослинної олії, (e) відділення компонентів переетерифікованих вільних жирних кислот від гліцеридних компонентів суміші переетерифікації, щоб надати продукт переетерифікації жиру маргарину і суміш жирних кислот, що містить жирні кислоти, складні моноефіри жирних кислот або їх суміші, звільнені від рослинної олії, і (f) гідрогенізація суміші жирних кислот. В одному з варіантів здійснення способу переетерифікації реакцію переетерифікації продовжують доти, поки в реакційній суміші присутнє значне співвідношення складноефірних груп у положеннях 1, 3 гліцеридного компонента і компонентів негліцеридних жирних кислот. В одному з варіантів здійснення спосіб одержання композиції, що містить 1-пальмітоїл-3стеароїл-2-монолеїн (POSt) і 1,3-дистеароїл-2-монолеїн (StOSt), включає одержання поліпептиду (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом, де поліпептид дозволяє здійснювати каталізовану 1,3-специфічною ліпазою переетерифікацію 1,3дипальмітоїл-2-монолеїну (POP) і стеаринової кислоти або тристеарину, і контакт зазначеного поліпептиду з композицією, що містить зазначений POP, у присутності джерела стеарину, такого як стеаринова кислота або тристеарин, для одержання продукту, збагаченого 1-пальмітоїл-3стеароїл-2-монолеїном (POSt) або 1,3-дистеароїл-2-монолеїном (StOSt). В одному з варіантів здійснення спосіб поліпшення або запобігання опосередкованій ліпополісахаридами (ЛПС) токсичності включає введення пацієнту фармацевтичної композиції, що містить гідролазу (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом. В одному з варіантів здійснення спосіб детоксифікації ендотоксину включає контакт ендотоксину з гідролазою (наприклад, ліпазою, сатуразою, пальмітазою і/або стеаратазою) за винаходом. В одному з варіантів здійснення спосіб відщеплення 2'- або 3'-ланцюга жирної кислоти деацилюванням від ліпіду A включає контакт ліпіду A з поліпептидом за винаходом. В одному з варіантів здійснення способи зміни субстратної специфічності або субстратної переваги вихідного ферменту ліпази (гідролази жирної кислоти), що містить амінокислотну послідовність, яка відповідає амінокислотній послідовності в SEQ ID NO:2, включають стадію створення (введення) щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12, або більше мутацій амінокислотних залишків у SEQ ID NO:2, як показано в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23, за допомогою чого створюють новий фермент гідролазу, що має модифіковану амінокислотну послідовність і змінену субстратну специфічність або субстратні переваги в порівнянні з вихідною SEQ ID NO:2 ферменту ліпази (гідролази жирної кислоти). В одному з аспектів субстратна специфічність або субстратні переваги нового ферменту ліпази (гідролази жирної кислоти) включають переважне або підвищене гідролітичне відщеплення пальмітинової кислоти від олії, або субстратна специфічність або субстратні переваги нового ферменту ліпази (гідролази жирної кислоти) включають переважне або підвищене гідролітичне відщеплення стеаринової кислоти від олії. В одному з аспектів модифікована амінокислотна послідовність (у порівнянні з "вихідною" SEQ ID NO:2) містить щонайменше одну модифікацію амінокислоти A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L або A225S, або їх еквіваленти, або їх сполучення і/або щонайменше одну модифікацію кодону (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT); (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG) або їх еквіваленти, або їх сполучення, а субстратна специфічність або субстратні переваги нового ферменту ліпази (гідролази жирної кислоти) включають переважне або підвищене гідролітичне відщеплення пальмітинової кислоти від олії. В одному з аспектів модифікована амінокислотна послідовність (у порівнянні з "вихідною" SEQ ID NO:2) містить I20L; V62S; G77P; V83C; D88H; Y113G; E116T; E116G; H140K; K146S; I167S; L180E; E194M; A211Q; S212Y; G215C; G215V; G215W; A218H; A218S; V223A; A225M; A225Q або їх сполучення, а субстратна специфічність або субстратні переваги нового ферменту ліпази (гідролази жирної кислоти) включають переважне або підвищене гідролітичне відщеплення стеаринової кислоти від олії. В одному з варіантів здійснення способи одержання ферменту, що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважне або підвищене гідролітичне відщеплення пальмітинової кислоти від олії, включають стадії: (a) одержання вихідного ферменту гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази), що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включає переважне гідролітичне відщеплення пальмітинової кислоти від олії, де вихідний фермент гідролаза (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) містить послідовність за винаходом; і (b) створення щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12, або більше модифікацій амінокислотних 14 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 залишків у вихідному ферменті гідролазі (наприклад, ліпазі, сатуразі, пальмітазі і/або стеаратазі), де модифікації амінокислотних залишків відповідають мутаціям амінокислотної послідовності в SEQ ID NO:2, як показано в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23, за допомогою чого створюють фермент, що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважне або підвищене гідролітичне відщеплення пальмітинової кислоти від олії. В одному з варіантів здійснення способи одержання ферменту, що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважне або підвищене гідролітичне відщеплення стеаринової кислоти від олії, включають стадії: (a) одержання вихідного ферменту гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази), що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважне гідролітичне відщеплення стеаринової кислоти від олії, де вихідний фермент гідролаза (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) містить послідовність за винаходом; і (b) створення щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12, або більше модифікацій амінокислотних залишків у вихідному ферменті гідролазі (наприклад, ліпазі, сатуразі, пальмітазі і/або стеаратазі), де модифікації амінокислотних залишків відповідають мутаціям амінокислотної послідовності в SEQ ID NO:2, як показано у таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23, за допомогою чого створюють фермент, що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважне або підвищене гідролітичне відщеплення стеаринової кислоти від олії. В одному з варіантів здійснення способи одержання ферменту гідролази жирної кислоти (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази), що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважний гідроліз конкретної жирної кислоти, включають стадії (a) одержання послідовності ферменту гідролази жирної кислоти (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом; (b) створення (введення) щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12, або більше мутацій залишків основ в нуклеїновій кислоті, де мутації відповідають тим змінам послідовності, що зазначені в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23; і (c) тестування активності знову створеного ферменту на субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважне гідролітичне відщеплення конкретної жирної кислоти, за допомогою чого одержують новий фермент гідролазу жирної кислоти (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу), що має субстратну специфічністю або субстратні переваги, включаючи переважний гідроліз конкретної жирної кислоти. В одному з аспектів фермент гідролаза жирної кислоти (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) містить послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:2. В одному з аспектів жирна кислота являє собою ліноленову кислоту, лінолеву кислоту, олеїнову кислоту, пальмітинову кислоту або стеаринову кислоту. В одному з варіантів здійснення способи одержання ферменту гідролази жирної кислоти (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази), що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважний гідроліз конкретної жирної кислоти, включають стадії (a) одержання послідовності нуклеїнової кислоти, що кодує фермент гідролазу жирної кислоти (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу) за винаходом; (b) створення (введення) щонайменше 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 або 12, або більше мутацій залишків основ у нуклеїнову кислоту, де мутації відповідають тим змінам послідовності, що зазначені в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23; і, (c) експресія створеної нуклеїнової кислоти для одержання нового ферменту гідролази жирної кислоти (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази), за допомогою чого створюють фермент гідролазу жирної кислоти (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу), що має субстратну специфічність або субстратні переваги, включаючи переважний гідроліз конкретної жирної кислоти. В одному з аспектів послідовність, кодуюча фермент гідролазу жирної кислоти (наприклад, ліпазу, сатуразу, пальмітазу і/або стеаратазу), містить послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:1. В одному з аспектів жирною кислотою є ліноленова кислота, лінолева кислота, олеїнова кислота, пальмітинова кислота або стеаринова кислота. В одному з аспектів новий фермент гідролаза жирної кислоти (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) має субстратну специфічність або субстратні переваги до пальмітинової кислоти в порівнянні із субстратною специфічністю або субстратними перевагами вихідного ферменту гідролази жирної кислоти (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) до стеаринової кислоти, або новий фермент гідролаза жирної кислоти (наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) має субстратну специфічність або субстратні переваги до стеаринової кислоти в порівнянні із субстратною специфічністю або субстратними перевагами вихідного ферменту 15 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 гідролази жирної кислоти (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) до пальмітинової кислоти. В одному з варіантів здійснення ліпази містять амінокислотну послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:2, але також містять щонайменше модифікацію амінокислотного залишку A48C; D49R; D61A; D61E; R72E; R72K; V83M; R85Y; E95K; E116A; E116I; E116L; E116N; E116Q; E116R; E116T; E116V; S133A; A144I; E149H; A150I; I151G; I151A; P162G; P162K; V163R; D164R; R172H; R172L або A225S, або їх еквіваленти, або їх сполучення, і/або щонайменше одну модифікацію кодону (GCG)35(GCT); (GGC)45(GGA); (GCG)92(GCT), (GTG)102(GTT); (AGC)108(AGT); (CTG)117(CTT); (CTG)124(TTG); (CGG)126(AGG); (GTC)128(GTG); (AGT)133(TCT); (TTC)135(TTT); (GTG)183(GTT); (ACC)188(ACG) або їх еквіваленти, або їх сполучення. В одному з аспектів субстратна специфічність або субстратні переваги нової ліпази включають переважне або підвищене гідролітичне відщеплення жирної кислоти від олії в порівнянні з "вихідною" SEQ ID NO:2. В одному з аспектів жирною кислотою є ліноленова кислота, лінолева кислота, олеїнова кислота, пальмітинова кислота або стеаринова кислота. Деталі одного або декількох варіантів здійснення винаходу зазначені на прикладених кресленнях і в нижченаведеному описі. Інші ознаки, цілі і переваги винаходу стануть ясні з опису і креслень, а також з формули винаходу. Усі публікації, патенти, патентні заявки, послідовності GenBank і депозити ATCC, цитовані в даному документі, таким чином, у явній формі включені посиланням для всіх цілей. Опис креслень Наступні фігури тільки ілюструють варіанти здійснення винаходу, але не обмежують обсяг формули винаходу. Файл патенту або заявки містить щонайменше одну фігуру, виконану в кольорі. Копії публікації цього патенту або патентної заявки з кольоровою фігурою(ами) надасть Бюро по запиту і після сплати необхідного мита. На фіг. 1 представлена блокова діаграма комп'ютерної системи. На фіг. 2 представлена блок-схема, що ілюструє один з аспектів процесу порівняння нової нуклеотидної або білкової послідовності з базою даних послідовностей для того, щоб визначити рівні гомології між новою послідовністю і послідовностями в базі даних. На фіг. 3 представлена блок-схема, що ілюструє один з аспектів процесу в комп'ютері для визначення гомології двох послідовностей. На фіг. 4 представлена блок-схема, що ілюструє один з аспектів процесу ідентифікації 300 для визначення присутності ознаки в послідовності. На фіг. 5 представлений зразковий спосіб за винаходом, що включає використання ліпаз за винаходом, для обробки ліпіду, наприклад, ліпіду із соєвої олії, для вибіркового гідролітичного відщеплення пальмітинової кислоти для одержання "соєвої олії зі зниженим вмістом пальмітинової кислоти". SM На фіг. 6a показаний вплив зразкових мутацій GSSM пальмітази на гідроліз пальмітату і стеарату стосовно вихідної SEQ ID NO:2, що докладно розглянуті далі в прикладі 4. На фіг. 6b SM показаний вплив зразкових мутацій GSSM стеаратази на гідроліз пальмітату і стеарату стосовно вихідної SEQ ID NO:2, що докладно розглянуті далі в прикладі 4. На фіг. 7 показана SEQ ID NO:2 з конкретними положеннями мутацій, що впливають на гідроліз пальмітату і стеарату , які позначені жирним накресленням збільшеного шрифту. Підкреслені мутації (наприклад, 61A, E) являють собою положення альтернативних амінокислотних залишків (альтернативні послідовності для альтернативних варіантів здійснення) для поліпшення гідролізу пальмітату. Мутації, позначені курсивом (наприклад, 20L), являють собою положення альтернативних амінокислотних залишків (альтернативні послідовності для альтернативних варіантів здійснення) для поліпшення гідролізу стеарату. Положення 116 являє собою положення мутації альтернативного амінокислотного залишку (альтернативна послідовність для альтернативного варіанта здійснення) для поліпшення гідролізу пальмітату і стеарату. На фіг. 8 показані дані підтверджувального аналізу соєвої олії для відібраних клонів з бібліотеки пальмітаз. Однакові позначення на різних кресленнях позначають однакові елементи. Докладний опис Альтернативні варіанти здійснення включають поліпептиди, включаючи ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази, кодуючі їх полінуклеотиди і способи одержання і використання цих полінуклеотидів і поліпептидів. Альтернативні варіанти здійснення включають поліпептиди, наприклад, ферменти, що мають гідролазну активність, наприклад, ліпазну, сатуразну, 16 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 пальмітазну і/або стеаратазну активність, включаючи термостабільну і термостабільну гідролазну активність, і полінуклеотиди, що кодують ці ферменти, а також одержання і використання цих полінуклеотидів і поліпептидів. Гідролазні активності поліпептидів і пептидів за винаходом включають ліпазну активність (гідроліз ліпідів), реакції переетерифікації, синтез складних ефірів, активність ацилгідролаз ліпідів (АГЛ) і пов'язану ферментативну активність. Для цілей цієї патентної заявки реакції переетерифікації можуть включати реакції ацидолізу (включаючи реакцію жирної кислоти і триацилгліцериду), алкоголіз (включаючи реакцію спирту і триацилгліцериду), алкоголіз (включаючи реакцію гліцерину і триацилгліцериду) і реакції трансетерифікації (включаючи реакцію складного ефіру і триацилгліцериду). Поліпептиди за винаходом можна використовувати в різних фармацевтичних, сільськогосподарських і промислових застосуваннях, включаючи виробництво косметичних засобів і нутрицевтиків. В іншому аспекті поліпептиди за винаходом використовують для синтезу енантіомерно чистих хіральних продуктів. У визначених варіантах здійснення ферменти за винаходом можуть являти собою високоселективні каталізатори. Вони можуть мати здатність до каталізу реакцій зі стерео-, регіоі хемоселективністю, яка неможлива в стандартному хімічному синтезі. В одному з варіантів здійснення ферменти за винаходом можуть бути універсальними. У різних аспектах вони можуть функціонувати в органічних розчинниках, діяти при граничних pН (наприклад, при високих pН і низьких pН), граничних температурах (наприклад, високих температурах або низьких температурах), граничних мірах засоленості (наприклад, при високій засоленості або низькій засоленості) і каталізувати реакції зі сполуками, що структурно не зв'язані з їх природними, фізіологічними субстратами. В одному з аспектів поліпептиди за винаходом включають гідролази, які мають ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, і їх можна використовувати, наприклад, у біокаталітичному синтезі структурованих ліпідів (ліпідів, що містять визначений набір жирних кислот, розподілених певним чином на гліцериновому кістяку), включаючи будь-яку рослинну олію, наприклад, олію каноли, соєву олію, альтернативи соєвої олії, альтернативи масла какао, 1,3-діацилгліцериди (ДАГ), 2-моноацилгліцериди (МАГ) і триацилгліцериди (ТАГ), такі як 1,3дипальмітоїл-2-олеоїлгліцерин (POP), 1,3-дистеароїл-2-олеоїлгліцерин (StOSt), 1-пальмітоїл-2олеоїл-3-стеароїлгліцерин (POSt) або 1-олеоїл-2,3-диміристоїлгліцерин (OMM), поліненасичені жирні кислоти (ПНЖК), поліненасичені жирні кислоти з довгим ланцюгом, такі як арахідонова кислота, докозагексаєнова кислота (ДГК) і ейкозапентаєнова кислота (ЕПК). У визначеному варіанті здійснення ферменти і способи за винаходом можна використовувати для видалення, додавання або заміни будь-якої жирної кислоти в композиції, наприклад, для одержання олії зі зниженим вмістом насичених жирних кислот (наприклад, олії "з низьким вмістом насичених жирних кислот") або вмістом різних жирних кислот (наприклад, перетворення олії, що містить "насичені" жирні кислоти, в олію, що містить альтернативні "ненасичені" жирні кислоти). Приклади насичених жирних кислот, які можна видаляти, додавати або "перегруповувати" у ліпіді, наприклад, в олії, використовуючи фермент або здійснюючи на практиці спосіб за винаходом, включають: оцтова кислота: CH3COOH; масляна кислота: CH3(CH2)2COOH; капронова кислота: CH3(CH2)4СООН; каприлова кислота: CH3(CH2)6COOH; капринова кислота: CH3(CH2)8СООН; ундеканова кислота: CH3(CH2)9COOH; лауринова кислота (додеканова кислота): CH3(CH2)10СООН; міристинова кислота (тетрадеканова кислота): CH3(CH2)12COOH; пентадеканова кислота: CH3(CH2)13COOH; пальмітинова кислота (гексадеканова кислота): CH3(CH2)14COOH; маргаринова кислота: CH3(CH2)15COOH; стеаринова кислота (октадеканова кислота): CH3(CH2)16COOH; арахінова кислота (ейкозанова кислота): CH3(CH2)18COOH; бегенова кислота: CH3(CH2)20COOH. Приклади омега-3 ненасичених жирних кислот, які можна видаляти, додавати або "перегруповувати" у ліпіді, наприклад, в олії, використовуючи фермент або здійснюючи на практиці спосіб за винаходом, включають: α-ліноленова кислота (ALA): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH; 17 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 стеаридонова кислота (октадекатетраєнова кислота): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)4COOH; ейкозапентаєнова кислота (ЕПК): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)3COOH; докозагексаєнова кислота (ДГК): CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)2COOH. Приклади омега-6 ненасичених жирних кислот, які можна видаляти, додавати або "перегруповувати" у ліпіді, наприклад, в олії, використовуючи фермент або здійснюючи на практиці спосіб за винаходом, включають: ліноленова кислота (9,12-октадекадієнова кислота): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7COOH; γ-ліноленова кислота (6,9,12-октадекатриєнова кислота): СН3(CH2)4СН=СНС2СН=СНС2СН=СН(CH2)4СООН; ейкозандієнова кислота (11,14-ейкозадієнова кислота): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)9COOH; дигомо-γ-ліноленова кислота (8,11,14-ейкозатриєнова кислота): CH3(CH2)4СН=СНС2СН=СНС2СН=СН(CH2)6СООН; арахідонова кислота (5,8,11,14-ейкозатетраєнова кислота): CH3(CH2)4СН=СНС2СН=СНС2СН-СНС2СН=СН(CH2)3СООН; докозадієнова кислота (13,16-докозадієнова кислота): CH3(CH2)4СН=СНС2СН=СН(CH2)11СOОН; адренова кислота (7,10,13,16-докозатетраєнова кислота): CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)5COOH; докозапентаєнова (4,7,10,13,16-докозапентаєнова кислота): CH3(CH2)4СН=СНС2СН=СНС2СН=СНС2СН=СНС2СН=СН(CH2)2СООН. Приклади омега-9 жирних кислот, які можна видаляти, додавати або "перегруповувати" у ліпіді, наприклад, в олії, використовуючи фермент або здійснюючи на практиці спосіб за винаходом, включають: олеїнова кислота (9-октадеценова кислота): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7СООН; ейкозеноєва кислота (11-ейкозеноєва кислота): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)9COOH; (5Z,8Z,11Z)-ейкоза-5,8,11-триєнова кислота (5,8,11-ейкозатриєнова кислота): CH3(CH2)7СН=СНС2СН=СНС2СН=СН(CH2)3СООН; ерукова кислота (13-докозенова кислота): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)11COOH; нервонова кислота (15-тетракозенова кислота): CH3(CH2)7CH=CH(CH2)13COOH; пальмітолеїнова кислота: СН3(CH2)7СН=СН(CH2)5СООН. В одному з аспектів у даному документі надані нові класи ліпаз, названі "сатуразами", наприклад, "пальмітази" і "стеаратази". Раніше в літературі термін "сатураза" використовували для позначення ферменту, що здійснює насичення конкретних зв'язків у метаболічному шляху, наприклад, гідрогенізацію подвійного зв'язку (Moise et. al., J Biol Chem, 2005, 280(30):2781527825). Однак у даному документі надані нові і раніше не описані "сатурази", де сатурази, описувані в даному документі, гідролізують складні ефіри насичених жирних кислот, де гідролізовані складні ефіри можуть являти собою складні ефіри насичених жирних кислот і гліцерину, умбеліферолу або інших спиртів. Також у даному документі надані раніше не описані "пальмітази" і "стеаратази", де пальмітази і стеаратази гідролітично відщеплюють пальмітинову кислоту і стеаринову кислоту, відповідно, наприклад, від гліцеринового кістяка. "Сатурази", описані в даному документі, також можна позначити як "гідролази насичених жирних кислот". Подібним чином, "пальмітази", описані в даному документі, також можна позначити як "гідролази пальмітату", а "стеаратази", описані в даному документі, також можна позначити як "гідролази стеарату". В іншому аспекті сатурази, описані в даному документі, вибірково гідролізують щонайменше 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або 100% насичених жирних кислот. В іншому аспекті пальмітази, описані в даному документі, вибірково гідролізують жирні кислоти так, що щонайменше 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 18 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або 100% гідролітично відщеплених жирних кислот являють собою пальмітинову кислоту. В іншому аспекті стеаратази, описані в даному документі, вибірково гідролізують жирні кислоти так, що щонайменше 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% або 100% гідролітично відщеплених жирних кислот являють собою стеаринову кислоту. В одному з аспектів, як показано на фіг. 5, способи використання ферменту за винаходом дозволяють обробляти ліпід, наприклад, ліпід із соєвої або іншої рослинної олії, для вибіркового гідролітичного відщеплення насиченої жирної кислоти, наприклад, пальмітинової або стеаринової кислоти (наприклад, від олії, що містить ці насичені жирні кислоти), для одержання "олії з низьким (або зниженим) вмістом насичених жирних кислот", наприклад, "олії зі зниженим вмістом пальмітинової кислоти", такої як "рослинна олія зі зниженим вмістом пальмітинової кислоти", наприклад, "соєва олія зі зниженим вмістом пальмітинової кислоти". Ферменти за винаходом також можна використовувати для вибіркового гідролітичного відщеплення будь-якої жирної кислоти, конкретно насичених жирних кислот, від гліцеринового кістяка для одержання "олії з низьким (або зниженим) вмістом насичених жирних кислот", включаючи вибіркове гідролітичне відщеплення насиченої жирної кислоти, наприклад, пальмітинової кислоти або стеаринової кислоти, від гліцеринового кістяка в положенні Sn1 або Sn2, на доповнення до гідролітичного відщеплення в положенні Sn3 (наприклад, гідролітичного відщеплення пальмітинової кислоти в положенні Sn3, зображеному на фіг. 5). В одному з аспектів наданий зразковий синтез тригліцеридів, олій або жирів з низьким вмістом насичених жирних кислот. У цьому зразковому синтезі можна використовувати вільні жирні кислоти або складні ефіри жирних кислот, залежно від використовуваного ферменту. В одному з аспектів гідролази, наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази за винаходом, використовують для видалення або гідролітичного відщеплення насичених жирних кислот, таких як оцтова кислота, масляна кислота, капронова кислота, каприлова кислота, капринова кислота, ундеканова кислота, лауринова кислота, міристинова кислота, пентадеканова кислота, пальмітинова кислота, маргаринова кислота, стеаринова кислота, арахінова кислота або бегенова кислота, від тригліцериду, олії або жиру. В одному з аспектів видалені або гідролізовані жирні кислоти заміщають жирними кислотами з удосконаленою користю для здоров'я (наприклад, зі зниженою кореляцією із серцево-судинними захворюваннями) або з удосконаленими хімічними властивостями (такими як окисна стабільність або реакційна здатність), або удосконаленими фізичними властивостями (такими як температура плавлення або тактильні відчуття в ротовій порожнині). В одному з аспектів приєднані жирні кислоти являють собою омега-3 ненасичені жирні кислоти, такі як α-ліноленова кислота, стеаридонова кислота, ейкозапентаєнова кислота (ЕПК) або докозагексаєнова кислота (ДГК), або ПНЖК, або жирні кислоти риб'ячого жиру. В одному з аспектів приєднані жирні кислоти являють собою омега-6 ненасичені жирні кислоти, такі як лінолева кислота, γ-лінолева кислота, ейкозадієнова кислота, дигомо-γ-лінолева кислота, арахідонова кислота, докозадієнова кислота, адренова кислота або докозапентаєнова кислота. В одному з аспектів приєднані жирні кислоти являють собою омега-9 ненасичені жирні кислоти, такі як олеїнова кислота, ейкозаєнова кислота, (5Z,8Z,11Z)-ейкоза-5,8,11-триєнова кислота, ерукова кислота, невронова кислота або пальмітолеїнова кислота. В одному з аспектів приєднані жирні кислоти (наприклад, омега-3, омега-6 або омега-9) приєднані за допомогою реакції жирних кислот із тригліцеридами, оліями або жиром після видалення або гідролітичного відщеплення насичених жирних кислот за допомогою гідролаз, наприклад, ліпаз, сатураз, пальмітаз і/або стеаратаз за винаходом. В одному з аспектів приєднані жирні кислоти (наприклад, омега-3, омега-6 або омега-9) приєднані за допомогою реакції складних ефірів жирних кислот, включаючи гліцеринові ефіри, або складних етилових або метилових ефірів із тригліцеридами, олією або жиром після видалення або гідролітичного відщеплення насичених жирних кислот за допомогою гідролаз, наприклад, ліпаз, сатураз, пальмітаз і/або стеаратаз за винаходом. В одному з аспектів реакцію приєднання жирних кислот (наприклад, омега-3, омега-6 або омега-9) каталізують гідролази або ліпази, такі як неспецифічна ліпаза (включаючи ліпазу, яка нерегіоспецифічна і не має специфічність до жирної кислоти) або Sn1,3-специфічна ліпаза, або Sn1-специфічна ліпаза, або Sn3-специфічна ліпаза, або Sn2-специфічна ліпаза, або ліпаза зі специфічністю до жирної кислоти. Способи і композиції (гідролази, наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом, можна використовувати для одержання нутрицевтиків (наприклад, поліненасичених жирних кислот і олій), різних продуктів харчування і харчових добавок 19 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 (наприклад, емульгаторів, замінників жиру, маргаринів і пастоподібних сумішей), косметичних засобів (наприклад, емульгаторів, кремів), засобів доставки фармацевтичних і лікарських засобів (наприклад, ліпосом, таблеток, складів) і добавок до тваринних кормів (наприклад, поліненасичених жирних кислот, таких як лінолева кислота). В одному з аспектів, ліпази за винаходом можуть впливати на флуорогенні складні ефіри жирних кислот (ЖК), наприклад, на умбеліферилові ефіри ЖК. В одному з аспектів можна одержати профілі специфічностей до жирних кислот ліпаз, одержаних або модифікованих способами за винаходом, вимірюючи їх відносні активності на ряді умбеліферилових ефірів ЖК, таких як складний пальмітиновий, стеариновий, олеїновий, лауриновий, ПНЖК або масляний ефір. В одному з аспектів поліпептид (наприклад, антитіло або фермент, наприклад, ліпаза, сатураза, пальмітаза і/або стеаратаза) за винаходом для цих реакцій іммобілізують, наприклад, як описано нижче. В альтернативних аспектах способи за винаходом, для здійснення яких не потрібний органічний розчинник, можна здійснювати при відносно високих швидкостях реакцій. Див., наприклад, патенти США №№ 5552317; 5834259. У визначених варіантах здійснення способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати для гідролізу (включаючи вибірковий гідроліз) олій і жирів, таких як риб'ячий жир, тваринні жири і рослинні олії, і ліпідів, таких як поліненасичені жирні кислоти. В одному з аспектів поліпептиди за винаходом використовують для одержання олій з низьким вмістом насичених жирних кислот, наприклад, шляхом видалення (гідролітичного відщеплення) щонайменше однієї жирної кислоти від олії; і гідроліз може являти собою вибірковий гідроліз, наприклад, видалення тільки конкретної жирної кислоти, такої як пальмітинова, стеаринова або інші насичені жирні кислоти, або видалення жирної кислоти тільки з одного положення, наприклад, з Sn1, Sn2 або Sn3. В одному з аспектів поліпептиди за винаходом використовують для обробки жирних кислот (таких як поліненасичені жирні кислоти), наприклад, жирних кислот риб'ячого жиру, наприклад, для використання в продуктах харчування або як харчової або кормової добавки, або кулінарної олії, олії для смаження або випічки або харчової олії. В іншому варіанті здійснення способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати для вибіркового гідролізу насичених складних ефірів стосовно ненасичених складних ефірів з одержанням кислот або спиртів. В іншому варіанті здійснення способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати для обробки латексів для множини різних цілей, наприклад, для обробки лактексів, використовуваних у композиціях фіксаторів для волосся для видалення неприємних запахів. В іншому варіанті здійснення способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати для лікування дефіциту ліпази у тварини, наприклад, у ссавця, такого як людина. В іншому варіанті здійснення способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати для одержання мастильних засобів, таких як гідравлічна олія. В іншому варіанті здійснення способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати в одержанні і використанні детергентів. В іншому варіанті здійснення способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати в процесі хімічної обробки матерії, волокон або пряжі. В одному з аспектів способи і композиції (ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можна використовувати для одержання уповільнення горіння матерії, використовуючи, наприклад, галогенозаміщені карбонові кислоти або їх складні ефіри, тобто, фторовмісні, хлоровмісні або бромовмісні карбонові кислоти або їх складний ефір. В одному з аспектів надані способи створення ліпаз із природних бібліотек. В одному з варіантів здійснення "гідролази" за винаходом включають поліпептиди (наприклад, антитіла, ферменти) і пептиди (наприклад, "активні центри"), що мають будь-яку гідролазну активність, тобто, поліпептиди за винаходом можуть мати будь-яку гідролазну активність, включаючи, наприклад, ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність. В іншому варіанті здійснення "гідролази" за винаходом включають усі поліпептиди, що мають будь-яку ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність, включаючи ліпосинтетичну або ліпогідролітичну активність, тобто, поліпептиди за винаходом можуть мати будь-який ліпазну, сатуразну, пальмітазну і/або стеаратазну активність. В іншому варіанті здійснення ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази за винаходом включають ферменти, що беруть участь у біоконверсії ліпідів через каталіз реакцій гідролізу, алкоголізу, ацидолізу, етерифікації й амінолізу. В одному з аспектів гідролази (наприклад, ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази) за винаходом можуть гідролізувати емульсії ліпідів. В одному з аспектів ферменти за винаходом можуть діяти переважно на зв'язку Sn1, Sn2 і/або Sn3 20 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 триацилгліцеридів для вивільнення однієї або декількох жирних кислот із гліцеринового кістяка. Наприклад, гідролазна, ліпазна, сатуразна, пальмітазна і/або стеаратазна активність наданих у даному документі поліпептидів включає синтез масла какао, поліненасичених жирних кислот (ПНЖК), 1,3-діацилгліцеридів (ДАГ), 2-моноацилгліцеридів (МАГ) і триацилгліцеридів (ТАГ). В іншому варіанті здійснення ліпазна, сатуразна, пальмітазна і/або стеаратазна активність наданих у даному документі поліпептидів також включає одержання олій з низьким вмістом насичених жирних кислот, наприклад, соєвої олії або олії каноли, за допомогою видалення жирної кислоти, наприклад, пальмітинової, олеїнової, лауринової або стеаринової кислоти. В альтернативних аспектах ферменти за винаходом також можуть гідролізувати і/або ізомеризувати зв'язки при високих температурах, низьких температурах, лужних pН і кислих pН. В одному з аспектів гідролази, наприклад, ліпази за винаходом, являють собою сатурази, що каталізують реакції гідролізу, алкоголізу, ацидолізу, етерифікації й амінолізу, де карбонова або жирна кислота в молекулі, що утворилася або вступила в реакцію, являє собою насичену жирну кислоту, таку як оцтова кислота, масляна кислота, лауринова кислота, міристинова кислота, пальмітинова кислота, стеаринова кислота або арахінова кислота. В одному з аспектів гідролаза, наприклад, ліпаза або сатураза за винаходом, являє собою пальмітазу, що каталізує реакції гідролізу, алкоголізу, ацидолізу, етерифікації й амінолізу, де карбонова або жирна кислота в молекулі, що утворилася або вступила в реакцію, являє собою пальмітинову кислоту. В одному з аспектів гідролаза, наприклад, ліпаза або сатураза за винаходом, являє собою стеаратазу, що каталізує реакції гідролізу, алкоголізу, ацидолізу, етерифікації й амінолізу, де карбонова або жирна кислота в молекулі, що утворилася або вступила в реакцію, являє собою стеаринову кислоту. У визначених варіантах здійснення в даному документі надані ферменти, включаючи варіанти ферментів гідролаз (наприклад, "варіант ліпази", "варіант сатурази", "варіант пальмітази" або "варіант стеаратази") за винаходом; ці ферменти можуть містити амінокислотну послідовність, що одержана з амінокислотної послідовності "попередника". Попередник може містити гідролазу, що зустрічається в природі, і/або рекомбінантну гідролазу. Амінокислотна послідовність варіанта гідролази "одержана" з амінокислотної послідовності попередника гідролази за допомогою заміни, делеції або вставки, або інсерції однієї або декількох амінокислот в амінокислотній послідовності попередника. Таку модифікацію виконують у "послідовності ДНК попередника", яка кодує амінокислотну послідовність попередника ліпази, а не маніпулюють попередником ферменту гідролази per se. Придатні способи для таких маніпуляцій послідовністю ДНК попередника включають способи, описані в даному документі, а також способи, відомі фахівцям у даній галузі. Створення і маніпуляції з нуклеїновими кислотами В одному з аспектів у даному документі надані нуклеїнові кислоти, включаючи експресуючі касети, такі як експресуючі вектори, що кодують поліпептиди (наприклад, гідролази, такі як ліпази, сатурази, пальмітази і/або стеаратази, і антитіла). В іншому аспекті в даному документі надані нуклеїнові кислоти, що мають послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:1, і містять заміни щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти, одинадцяти або дванадцяти або більше, або усіх залишків основ, описані в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23 (або їх еквіваленти). В одному з варіантів здійснення в даному документі надані нуклеїнові кислоти, що кодують поліпептиди, які мають послідовність, як зазначено в SEQ ID NO:2, і містять зміни щонайменше одного, двох, трьох, чотирьох, п'яти, шести, семи, восьми, дев'яти, десяти, одинадцяти або дванадцяти або більше, або всіх амінокислотних залишків, описані в таблиці 3, таблиці 4, таблиці 9, таблиці 10, таблиці 11, таблиці 16 або таблиці 23 (або їх еквіваленти). SEQ ID NO:1: ATGCTGAAACCGCCTCCCTACGGACGCCTGCTGCGCGAACTGGCCGATATC, CCGGCCATCGTGACGGCACCGTTCCGGGGCGCTGCGAAAATGGGCAAACTG, GCGGATGGCGAGCCGGTACTGGTGCTGCCCGGCTTCCTGGCCGACGACAAC, GCCACCTCGGTGCTGCGCAAGACCTTCGATGTCGCGGGCTTTGCCTGTTCG, GGCTGGGAACGCGGCTTCAACCTCGGCATTCGTGGCGACCTCGTGGACCGG, CTGGTCGACCGGCTGCGGGCGGTGTCGGAGGCGGCCGGTGGTCAGAAGGT, GATCGTGGTCGGCTGGAGCCTCGGCGGCCTCTATGCGCGCGAGCTGGGCCA, CAAGGCGCCCGAACTGATCCGGATGGTCGTCACGCTCGGCAGTCCGTTCGC, GGGCGACCTCCACGCCAACCATGCGTGGAAGATCTACGAGGCGATCAACAG, CCACACGGTCGACAACCTGCCGATCCCGGTCGATTTCCAGATTAAGCCGCC, GGTGCGCACCATCGCGGTGTGGTCGCCGCTCGACGGGGTGGTGGCGCCGG, AGACCTCGGAAGGCTCGCCCGAGCAGTCGGACGAGCGGCTAGAGCTGGCG, 21 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GTGACCCACATGGGCTTTGCCGCATCGAAGACCGGGGCCGAGGCTGTGGTC, CGGCTGGTCGCGGCGCGGCTCTAG; SEQ ID NO:2 (кодується за допомогою SEQ ID NO:1): 1-буквений код: MLKPPPYGRLLRELADIPAIVTAPFRGAAKMGKLADGEPVLVLPGFLADDNATSVLR, KTFDVAGFACSGWERGFNLGIRGDLVDRLVDRLRAVSEAAGGQKVIVVGWSLGGL, YARELGHKAPELIRMVVTLGSPFAGDLHANHAWKIYEAINSHTVDNLPIPVDFQIKPP, VRTIAVWSPLDGVVAPETSEGSPEQSDERLELAVTHMGFAASKTGAEAVVRLVAAR, L3-буквений код: Met Leu Lys Pro Pro Pro Tyr Gly Arg Leu Leu Arg Glu Leu Ala Asp, Ile Pro Ala Ile Val Thr Ala Pro Phe Arg Gly Ala Ala Lys Met Gly, Lys Leu Ala Asp Gly Glu Pro Val Leu Val Leu Pro Gly Phe Leu Ala, Asp Asp Asn Ala Thr Ser Val Leu Arg Lys Thr Phe Asp Val Ala Gly, Phe Ala Cys Ser Gly Trp Glu Arg Gly Phe Asn Leu Gly Ile Arg Gly, Asp Leu Val Asp Arg Leu Val Asp Arg Leu Arg Ala Val Ser Glu Ala, Ala Gly Gly Gln Lys Val Ile Val Val Gly Trp Ser Leu Gly Gly Leu, Tyr Ala Arg Glu Leu Gly His Lys Ala Pro Glu Leu Ile Arg Met Val, Val Thr Leu Gly Ser Pro Phe Ala Gly Asp Leu His Ala Asn His Ala, Trp Lys Ile Tyr Glu Ala Ile Asn Ser His Thr Val Asp Asn Leu Pro, Ile Pro Val Asp Phe Gln Ile Lys Pro Pro Val Arg Thr Ile Ala Val, Trp Ser Pro Leu Asp Gly Val Val Ala Pro Glu Thr Ser Glu Gly Ser, Pro Glu Gln Ser Asp Glu Arg Leu Glu Leu Ala Val Thr His Met Gly, Phe Ala Ala Ser Lys Thr Gly Ala Glu Ala Val Val Arg Leu Val Ala, Ala Arg Leu; SEQ ID NO:3: ATGGCCGGCCACCAGGGCGCGCGGGGCCCCAAAGACGGTCCGCCGGCGATGGTG, ATCCCGGGCTTCCTCGCCCACGACAGGCACACGACACGATTGCGCCGGGAACTC, GCCGAGGCGGGGTTCAGGGTTCACCCCTGGCGGCAGGGCTGGAACATGGGAGCG, CGTGCCGACACGCTCGAGAAATTGAAGCGGGCAGTGGACCAGTGCGGTCATGAC, GAGCCGATCCTGCTGGTCGGCTGGAGTCTGGGCGGGCTCTACGCGAGGGAGGTC, GCGCGCGCCGAGCCGGATCAGGTGCGGGCGGTGGTCACTCTTGGTTCCCCGGTGT, CGGGCGACCGGCGCCGCTACACCAACGTGTGGAAGCTGTACGAATGGGTGGCGG, GTCACCCGGTGGACGACCCGCCGATCCCCGACAAGGAGGAAAAGCCGCCGGTGC, CGACCCTGGCTTTGTGGTCGGCGGATGACGGGATCGTCGGCGCCCCGTCGGCGCG, CGGGACTCAGTTATCTCACGACAAGGCGGTCGAGATGCGAACGAGCCACATGGG, CTTTGCCATGTCGGCGAAGAGCGCACGCTTTGTTGTCGCCGAGATCGTGAAGTTC, CTGAAGAAAACCGAAGGTTCCGAGTCGCACGATTGA; SEQ ID NO:4 (кодується за допомогою SEQ ID NO:3): MAGHQGARGPKDGPPAMVIPGFLAHDRHTTRLRRELAEAGFRVHPWRQGWNMGA, RADTLEKLKRAVDQCGHDEPILLVGWSLGGLYAREVARAEPDQVRAVVTLGSPVSG, DRRRYTNVWKLYEWVAGHPVDDPPIPDKEEKPPVPTLALWSADDGIVGAPSARGTQ, LSHDKAVEMRTSHMGFAMSAKSARFVVAEIVKFLKKTEGSESHD; SEQ ID NO:5: GTGAGCGAGAAAGGCGCACCCAAGGGAAGGCAGCGGCTGAAGGAGATCGGCGC, GCTTCTGTTCCACGCGCCTCGCAGCTTGGGCCATCTGGGCGCGCGCGGCCCCAAG, GACGGTCCTCCGGTGATGGTCATCCCGGGATTCCTCGCGCACGACTTGCATACGA, CGCAGTTGCGCCGGGCGCTCGCGAAGGCAGGCTTCCGAGTGCATCCGTGGCGGC, AGGGGATGAACCTTGGAGCGCGCGCCGATACGCTCGAAATTCTGAAGCGCGCGG, TGGATTCCTGCGGCTCGAGCGAGCCGATGCTGCTCGTCGGCTGGAGCCTGGGCGG, TCTCTATGCCCGGGAGATCGCGCGTGCGGAGCCGGACCGGGTGCGGGCGGTGGT, GACGATGGGATCGCCGGTGTGGGGCGACCGCAGGCGCTACACCAACGTGTGGAA, GCTGTACGAACGGATTGCCGGCCATCCGGTCGACAAGCCGCCGATCCCGGACAA, GAGCCAGAAGCCGCCGGTGCCGACTCTGGCTTTGTGGTCGCAGCATGATGGCATC, GTCGGCGCGCCCTCGGCGAGAGGGACGAAGAAGACCCGCGACAAGGCGGTCGC, CATCGACACGACTCACATGGGGTTTGCCATGTCGCCCAAGACGACGCGCGCGGC, AGTGCGTGAGATCGTGGGCTTTTTGAATGAAGTCGAAGGCGGTTCGTCACCCCGG, GCGTGA; SEQ ID NO:6 (кодується за допомогою SEQ ID NO:5): MSEKGAPKGRQRLKEIGALLFHAPRSLGHLGARGPKDGPPVMVIPGFLAHDLHTTQL, 22 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 RRALAKAGFRVHPWRQGMNLGARADTLEILKRAVDSCGSSEPMLLVGWSLGGLYA, REIARAEPDRVRAVVTMGSPVWGDRRRYTNVWKLYERIAGHPVDKPPIPDKSQKPP, VPTLALWSQHDGIVGAPSARGTKKTRDKAVAIDTTHMGFAMSPKTTRAAVREIVGF, LNEVEGGSSPRA; SEQ ID NO:7: ATGAGGCTGCGCGAGGGGGGCGCGCTCGTATCGCGGGCCTATCGCGCCTTCGGG, CGCCTCGGCGAGCGCGGCCCGGCGGACGGGCCGCCGCTGATGGTGATCCCGGGC, TTCCTCGCCACCGATCGCACCACTTTGGGGCTGCAGCGGGCGCTGGCCAAGGGCG, GCTACAAGGTGACCGGATGGGGCATGGGCCTCAACAGCGGCGTCACCGAAGACA, TAGTCGACCGCATCGCCGCTCGGGTCGAAAGGTTTGGAGCCGGCCGCAAAGTGA, TCCTCGTCGGCTGGAGCCTCGGCGGACTCTACGCGCGCGTGGTCGCGCAGGAGC, GGCCGGATCTCGTCGACAAGGTGGTCACGCTCGGCTCGCCCTTTTCGGGCGACAG, GCGCCGCAACAACAATGTCTGGCGGCTCTACGAGTTCGTC, GCCGGCCATCCGGTCAACAGCCCGCCGATCGACAAGGACCCCGAGGTGAAGCCG, CCGGTGCCGACGCTCGCTATCTGGTCGCGGCGCGACGGCATCGTCTCTCCGGCGG, GCGCGCGCGGGCGGGAGGGAGAGCGCGACGCCGAGCTCGAGCTCGACTGCAGC, CACATGGGCTTTGCGGTCAGCGCCAGGGCTTATCCCAAGATCGTGGAGGCGGTG, CGGGCGTTTCCGGAAAACATCCGTTCGCGCTGA; SEQ ID NO:8 (кодується за допомогою SEQ ID NO:7): MRLREGGALVSRAYRAFGRLGERGPADGPPLMVIPGFLATDRTTLGLQRALAKGGY, KVTGWGMGLNSGVTEDIVDRIAARVERFGAGRKVILVGWSLGGLYARVVAQERPD, LVDKVVTLGSPFSGDRRRNNNVWRLYEFVAGHPVNSPPIDKDPEVKPPVPTLAIWSR, RDGIVSPAGARGREGERDAELELDCSHMGFAVSARAYPKIVEAVRAFPENIRSR; SEQ ID NO:9: ATGAAGCCGCCGCCCGGATGGATGAAGATCCGGGAGGCGGGCTCGCTCCTCGCG, CGCTTCTACCGCGCGTTCGGCAAGCTCGAGCCGCGCGGGCCGGCGGACGGGCCG, AAGCTGATGGTGATCCCGGGTTTCCTCGCGGGCGACAGGACGACGCTCGGGCTG, CAGCGAGCGCTGGCCGGCGGCGGCTACCGGGTCGCCGGCTGGGGGCTGGGGGTG, AACCGCGGCGTTTCGGAGGACGTGGTCGACCGGATCGGCCAGCAAGTCGCGCGG, TTCGGGGCGGGCGAGAAGGTGATCCTGGTCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT, GCGCGCGTGGTGGCGCAGGAGCGGCCCGACCTCGTCGAGAAGGTGGTGACCTTG, GGCTCGCCGTTTTCGGGCGACCGGCGGCGCAACAACAATGTGTGGCGGCTCTATG, AGTGGGTGGCTGGGCATCCGGTGAACGATCCGCCGATCGACAAGGACCCGGCGA, AGAAGCCCCCGGTGCCGACGCTCGCGATCTGGTCGCGGCGTGATGGGATCGTGG, CGGTCGAAGGCGCGCGGGGGCGGCCGGAGGAGCGGGATGCCGAGCTGGAGATC, GATTGCAGCCACATGGGGTTTGGGGTCAGCGGCAAGGCGTTTCCCCGAATCGTA, GAGGCGGTGAAGGGGTTCTAA; SEQ ID NO:10 (кодується за допомогою SEQ ID NO:9): MKPPPGWMKIREAGSLLARFYRAFGKLEPRGPADGPKLMVIPGFLAGDRTTLGLQR, ALAGGGYRVAGWGLGVNRGVSEDVVDRIGQQVARFGAGEKVILVGWSLGGLYAR, VVAQERPDLVEKVVTLGSPFSGDRRRNNNVWRLYEWVAGHPVNDPPIDKDPAKKPP, VPTLAIWSRRDGIVAVEGARGRPEERDAELEIDCSHMGFGVSGKAFPRIVEAVKGF; SEQ ID NO:11: GTGTTGGTGCTGCCGGCGTTCCTCGCCAACGACCTTCCCACTTCGCTTCTCCGCAG, GACGCTGAAGGCGAACGGGTTTCGCCCGTTCGGCTGGGCGAACGGTTTCAACTTA, GGTGCACGGCCGGACACGCTCCAGCGCCTGAGCGCACGGCTCGATGCGGTGGTT, CAGGAAGCGGGCAGGCCGGTTGCATTGATCGGCTGGAGCCTTGGCGGGCTTTAT, GCCCGAGAGCTGGCGAAACGCAGGTCGGCTGAGGTGTCGGCAGTGATCACGCTC, GGCACGCCCTTCTCGGTTGACCTCAGACGCAACAACGCCTGGAAGCTGTACGAG, CTCATCAACGATCATCCTGTCGATGCCCCTCCCTTGGATGTTCAGGTCGACGCGA, AGCCACCCGTCCGAACCTTCGCTTTGTGGTCGCGTCGCGACGGGATCGTAGCGCC, CGCGAGCGCGCACGGCATGGAGGGCGAGTTCGACCAGGCGATCGAGCTGCAGTG, CACGCACAACGAGATGGTCAGTGATCCGGAGGCCCTCTCCACGATCGTTACCTTG, CTGCGGGAAAATGTTGGCTCCTGA; SEQ ID NO:12 (кодується за допомогою SEQ ID NO:11): MLVLPAFLANDLPTSLLRRTLKANGFRPFGWANGFNLGARPDTLQRLSARLDAVVQ, EAGRPVALIGWSLGGLYARELAKRRSAEVSAVITLGTPFSVDLRRNNAWKLYELIND, HPVDAPPLDVQVDAKPPVRTFALWSRRDGIVAPASAHGMEGEFDQAIELQCTHNEM, VSDPEALSTIVTLLRENVGS; SEQ ID NO:13: 23 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 GTGAATACAGCCGACCTATTGAAGCCACCACCCGCAAGCATGACAGTTCTCGAG, GCGAGAGCGCTGCTGGACATATGCAAGATGAGCGCCCCATTGGCGCGCTTGCTA, TTCAAAAAGAACTCGCCCTGGCGCAAACAACGGGTTCTCGTAATACCTGGCTTTG, GCGCTGATGATCGCTACACCTGGCCGTTGCGCAATTTCGTCCAGGCACAGGGCTA, TGCCACGACTGGCTGGGGCCTGGGCACCAACAAGGCAGGTCTCAATATGCCGCA, TCAACTATCCGACGTCCACCCCAGATGGAAGCTAAAACCCAAGACGCCGTACCG, TGGTGAGGCGGGCGTACCTTACGTGATTGACCGCTTGATCGAACGGTTTGACGAA, TTGGCATCGACGGATCCGCAACCCATCGCACTTATAGGTTGGAGTCTGGGTGGTT, TCATGGCCCGTGAAGTTGCCCGAGAGCGCCCAAACCAGGTGAGTCAGGTTATTA, CCCTCGGTTCTCCTGTCATCGGAGGCCCAAAATACACCCTCGCTGCATCGGCTTT, CATCCGGCGCAAATACGATTTGGACTGGGTGGAGCAAGTGATCGCGGAGCGGGA, AGATCGCCCCATTACTGTTCCTATTACAGCAATAGTCAGCCAGTCTGATGGCATC, GTCGGATATTCAGCGGCAATCGATCACCACAGTCCCGCTGTGCAGCATTTACATA, TGGATGTTGCCCATTTGGGCTTTCCTTACAACACGAGGGTTTGGTCAGAAATCGC, CAATGCGCTCAACTCTTTAGAGGTGGAGAAGGAGCGTGTTTAG; SEQ ID NO:14 (кодується за допомогою SEQ ID NO:13): MNTADLLKPPPASMTVLEARALLDICKMSAPLARLLFKKNSPWRKQRVLVIPGFGA, DDRYTWPLRNFVQAQGYATTGWGLGTNKAGLNMPHQLSDVHPRWKLKPKTPYRG, EAGVPYVIDRLIERFDELASTDPQPIALIGWSLGGFMAREVARERPNQVSQVITLGSPV, IGGPKYTLAASAFIRRKYDLDWVEQVIAEREDRPITVPITAIVSQSDGIVGYSAAIDHH, SPAVQHLHMDVAHLGFPYNTRVWSEIANALNSLEVEKERV; SEQ ID NO:15: ATGGAGCTCGCCAAGGTCACCGCCCTGATGAAGGCCACCGCCCTCGAGATCGCG, ATCCTCACCGGCCACCTCGTCCTCTACCCCTCCGGGATCGTGGCCGAGCGCCTCG, CGGCCGCCCCCTCTTCACCGTCCTCCCCGTCCGCGGGCCCGACGGGCCGACGTCC, GGTCGTCCTGCTGCACGGTTTCGTGGACAACCGCTCGGTCTTCGTCCTGCTGCGC, CGTGCCCTCACCCGGAGCGGCCGTGACTGCGTCGAGTCGCTCAACTACTCGCCGC, TCACCTGCGACCTGCGGGCCGCCGCCGAACTGCTGGGGCGCCGGGTGGACGAGA, TCCGCGCCCGGACCGGACACGCCGAGGTCGACATCGTCGGCCACAGCCTGGGCG, GGCTCATCGCCCGTTATTACGTACAGCGTCTCGGCGGTGACAGCCGGGTGCGCAC, CCTGGTCATGCTCGGCACCCCGCACTCCGGCACCACCGTGGCCCGGCTCGCCGAC, GCGCATCCGCTGGTGCGGCAGATGCGGCCGGGTTCGGAGGTGCTGCGGGAGCTC, GCCGCGCCCTCGCCCGGCTGCCGTACCCGGTTCGTGAGCTTCTGGAGCGACCTC, GACCAGGTGATGGTGCCGGTGGACACGGCCTGCCTGGACCACCCCGACCTGCTG, GTGCACAACGTCCGGGTCAGCGGGATCGGTCATCTCGCGCTGCCGGTCCATCCCA, CGGTGGCGGCCGGGGTCCGGGAGGCCCTCGACGCGAGCGGCGCGGGGGTCCCGG, GGGTGCGGGAGGAGGGGCCCGGCGCCGGCGCCGTGGCGTGA; SEQ ID NO:16 (кодується за допомогою SEQ ID NO:15): MELAKVTALMKATALEIAILTGHLVLYPSGIVAERLAAAPSSPSSPSAGPTGRRPVVL, LHGFVDNRSVFVLLRRALTRSGRDCVESLNYSPLTCDLRAAAELLGRRVDEIRARTG, HAEVDIVGHSLGGLIARYYVQRLGGDSRVRTLVMLGTPHSGTTVARLADAHPLVRQ, MRPGSEVLRELAAPSPGCRTRFVSFWSDLDQVMVPVDTACLDHPDLLVHNVRVSGI, GHLALPVHPTVAAGVREALDASGAGVPGVREEGPGAGAVA; SEQ ID NO:17: GTGGCCGCCGCGGACAGCGGGACGGCGGAAGGGCAAAGGCTTCGGCCGCCGAG, CCTGTTCCTGATGCTGGCCGAGGCGAGGGGCTTGCTCGAACTGAACTCGAGCCTG, TTGTTGTCGCCGCTGTTGTTGCGGGCGCCGAAGGGCGACGGACATCCGGTGCTGG, CGCTGCCGGGCTTTCTCGCCAGCGATCTGTCGATGGCGCCGATGCGGCGCTATCT, GAAAGAACTCGGCTACGATGCCCATGCGTGGAACATGGGCCGCAATCTCGGCGG, CGTCGCGTCCAAGCGCGAAGCCTTGCGCGACCTGTTGCGGCGCATTTACAGCCAG, ACGGGCCGCAAGGTCAGCCTGGTCGGCTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGC, GATCTCGCTTTGCAGGCGCCCGACATGGTGCGTTCCGTGATCACGCTCGGCAGTC, CGTTTGCCAGCGACATCAGGGCGACCAACGCCACGCGGCTCTACGAGGCGCTGT, CGGGAGAAAGGGTCGACGACAATCCGGAGTTAACAGCGGCGATCGCCGGCGACC, TGCCGGTGCCGGCGACCTCGATCTATTCCCGTACCGACGGTATCGTGAACTGGCA, CACCAGCCTGCTGCGTCCTTCCGCAACGGCTGAAAACATCGAGGTTTACTTCGCC, AGCCATATCGGGCTCGGCGTCAACCCGGCAGCGCTGTGGGCGGTGGCCGACCGC, CTGGCGCAGCCCGAGGGGGAATTTAAGCATTTTGACCGGTCGGGTCCCTTTGCCA, TTGCCTATGGCCCCCCTGAAAATGCACAATCCTGA; SEQ ID NO:18 (кодується за допомогою SEQ ID NO:17): 24 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 MAAADSGTAEGQRLRPPSLFLMLAEARGLLELNSSLLLSPLLLRAPKGDGHPVLALP, GFLASDLSMAPMRRYLKELGYDAHAWNMGRNLGGVASKREALRDLLRRIYSQTGR, KVSLVGWSLGGVYARDLALQAPDMVRSVITLGSPFASDIRATNATRLYEALSGERV, DDNPELTAAIAGDLPVPATSIYSRTDGIVNWHTSLLRPSATAENIEVYFASHIGLGVNP, AALWAVADRLAQPEGEFKHFDRSGPFAIAYGPPENAQS; SEQ ID NO:19: ATGCCGGAGCGAAACGAAGCGCAGGCCCCGCCGCGTCTTCGTCCGCCGGGGCTC, GGGCTGTTCCTCGCCGAAGCGCGGGGCATTTTCGAGCTCAACGCGAGCCTGTTGC, TGTCGCCGCTTCTGTTGCGCGCGCCGCGCGGCGACGGCCATCCGGTGCTGGCGTT, GCCGGGCTTTCTTGCCAGTGATCTATCGATGGCGCCGTTGCGCCGCTACCTCACC, GAGCTCGGCTACGACACCCACGCCTGGCGCATGGGCCGCAATGTCGGCGGCATC, GCGAAGATGCGGATCGCGCTGCTCGAGCGGCTCACGCAGATCCATGCCGAGTGC, GGCCGCAAGGTCTCGATTGTCGGCTGGAGTCTCGGCGGCGTCTATGCGCGCGACC, TCGCGTTGCAGGCGCCCGAGATGGTGCGCTACGTCGTCACCCTCGGCAGCCCCTT, CGCCAGCGACGTCCGCGCCACCAATGCGACGCGGCTCTATGAGGCGATGTCGGG, CGAAACGGTCGGCGACAATGTCGACCTCGTGCAGGCGATTGCCGGCGACCTGCC, GGTTCCCGTGACCTCGATCTATTCGAAGAGCGACGGCATCGTGAACTGGCGGACC, TGCCTGCTGCGCCCGTCCGCGACCGCCGAGAATATCGAGGTCTATTTCGCGAGCC, ATGTCGGCATCGGCGTCAATCCGGCCGCGCTGTGGGCGATCGCGGACCGGCTGG, CCCAGCGGGAAGGCGAATTCCGCCCCTTCGACCGGTCCGGTCCTTTTGCCATTGC, CTACGCGCCCCCGGAACAGGCACAATCGATCTGA; SEQ ID NO:20 (кодується за допомогою SEQ ID NO:19): MPERNEAQAPPRLRPPGLGLFLAEARGIFELNASLLLSPLLLRAPRGDGHPVLALPGF, LASDLSMAPLRRYLTELGYDTHAWRMGRNVGGIAKMRIALLERLTQIHAECGRKVS, IVGWSLGGVYARDLALQAPEMVRYVVTLGSPFASDVRATNATRLYEAMSGETVGD, NVDLVQAIAGDLPVPVTSIYSKSDGIVNWRTCLLRPSATAENIEVYFASHVGIGVNPA, ALWAIADRLAQREGEFRPFDRSGPFAIAYAPPEQAQSI. У даному документі надані способи виявлення нових послідовностей гідролаз, використовуючи нуклеїнові кислоти за винаходом. Також надані способи модифікації SM нуклеїнових кислот за винаходом, наприклад, за допомогою технологій GSSM і SM GeneReassembly . Нуклеїнові кислоти за винаходом можна одержати, виділити і/або маніпулювати ними за допомогою, наприклад, клонування й експресії бібліотек кДНК, ампліфікації транскрипту або геномної ДНК за допомогою ПЛР і т. п. Вихідне джерело вибраних зразкових поліпептидів і нуклеїнових кислот: 35 SEQ ID NO: 1, 2 3, 4 5, 6 7, 8 9, 10 11, 12 13, 14 15, 16 17, 18 19, 20 40 45 Джерело Одержана зі зразка навколишнього середовища Одержана зі зразка навколишнього середовища Одержана зі зразка навколишнього середовища Одержана зі зразка навколишнього середовища Одержана зі зразка навколишнього середовища Одержана зі зразка навколишнього середовища Одержана зі зразка навколишнього середовища Бактерії Одержана зі зразка навколишнього середовища Одержана зі зразка навколишнього середовища При практичному здійсненні способів за винаходом гомологічні гени можна модифікувати за допомогою маніпуляції матричної нуклеїнової кислоти, як описано в даному документі. Заявлений об'єкт винаходу можна здійснювати на практиці в сполученні з будь-яким способом або протоколом, або пристроєм, відомими в даній галузі, що добре описані в науковій і патентній літературі. Основні способи У визначених варіантах здійснення в даному документі надані нуклеїнові кислоти, включаючи РНК, інтерферуючу РНК (наприклад, міРНК, мкРНК), антисмислову нуклеїнову кислоту, кДНК, геномну ДНК, вектори, віруси або їх гібриди, нуклеїнові кислоти, виділені з різних джерел, створені способами генної інженерії, ампліфіковані і/або експресовані/створені рекомбінантними способами. Рекомбінантні поліпептиди, створені з цих нуклеїнових кислот, можна індивідуально виділяти або клонувати і тестувати на бажану активність (наприклад, гідролазну, таку як, наприклад, ліпазна, сатуразна, пальмітазна і/або стеаратазна активність). 25 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Можна використовувати будь-яку систему експресії рекомбінантних генів, включаючи системи експресії в клітинах бактерій, ссавців, дріжджів, грибів, комах або рослин. Альтернативно, ці нуклеїнові кислоти можна синтезувати in vitro за допомогою добре відомих способів хімічного синтезу, наприклад, як описано в Adams (1983) J. Am. Chem. Soc. 105:661; Belousov (1997) Nucleic Acids Res. 25:3440-3444; Frenkel (1995) Free Radic. Biol. Med. 19:373-380; Blommers (1994) Biochemistry 33:7886-7896; Narang (1979) Meth. Enzymol. 68:90; Brown (1979) Meth. Enzymol. 68:109; Beaucage (1981) Tetrа. Lett. 22:1859; патенті США № 4458066. Способи маніпулювання нуклеїновими кислотами, такі як, наприклад, субклонування, мічення зондами (наприклад, мічення з випадковими праймерами з використанням полімерази Кленова, нік-трансляція, ампліфікація), секвенування, гібридизація і т. п., докладно описані в науковій і патентній літературі, див., наприклад, Sambrook, ed., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (2ND ED.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989); CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York (1997); LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N.Y. (1993). Іншими ефективними засобами одержання і маніпулювання нуклеїновими кислотами, використовуваними при практичному здійсненні способів за винаходом, є клонування з геномних зразків і, при бажанні, скринінг і повторне клонування вставлених фрагментів, виділених або ампліфікованих, наприклад, з геномних клонів або клонів кДНК. Джерела нуклеїнових кислот, використовувані в способах за винаходом, включають геномні бібліотеки або бібліотеки кДНК, що містяться, наприклад, у штучних хромосомах ссавців (MAC), див., наприклад, патенти США №№ 5721118; 6025155; штучних хромосомах людини, див., наприклад, Rosenfeld (1997) Nat. Genet. 15:333-335; штучних хромосомах дріжджів (YAC); штучних хромосомах бактерій (BAC); штучних хромосомах P1, див., наприклад, Woon (1998) Genomics 50:306-316; векторах, одержаних з P1 (PAC), див., наприклад, Kern (1997) Biotechniques 23:120-124; космідах, рекомбінантних вірусах, фагах або плазмідах. Фрази "нуклеїнова кислота" або "послідовність нуклеїнової кислоти" можуть включати олігонуклеотид, нуклеотид, полінуклеотид або будь-який їх фрагмент, ДНК або РНК (наприклад, мРНК, рРНК, тРНК, інтерферуючу РНК) геномного або синтетичного походження, що можуть бути одноланцюжковими або дволанцюжковими і можуть представляти смисловий або антисмисловий ланцюг, пептидну нуклеїнову кислоту (ПНК), або будь-яку ДНК-подібну або РНКподобну речовину, природного або синтетичного походження, включаючи, наприклад, інтерферуючу РНК (дволанцюжкову "інтерферуючу" РНК), рибонуклеопротеїди (наприклад, iRNP). Термін охоплює нуклеїнові кислоти, тобто, олігонуклеотиди, що містять відомі аналоги природних нуклеотидів. Термін також охоплює структури із синтетичними кістяками, схожі на нуклеїнові кислоти, див., наприклад, Mata (1997) Toxicol. Appl. Pharmacol. 144:189-197; StraussSoukup (1997) Biochemistry 36:8692-8698; Samstag (1996) Antisense Nucleic Acid Drug Dev 6:153156. Як застосовують у даному документі, термін "промотори" включає всі послідовності, здатні керувати транскрипцією кодуючої послідовності у клітині, наприклад, клітині рослини. Таким чином, промотори, використовувані в конструкціях за винаходом, включають транскрипційні керуючі елементи, що діють у цис-положенні, і регуляторні послідовності, що беруть участь у регуляції або модуляції регулювання за часом і/або швидкості транскрипції гена. Наприклад, промотори можуть являти собою транскрипційний керуючий елемент, що діє в цис-положенні, включаючи енхансер, промотори, термінатор транскрипції, ділянку початку реплікації, послідовність інтеграції в хромосому, 5'- і 3'-нетрансльовані області або інтронні послідовності, що беруть участь у регуляції транскрипції. Ці послідовності, що діють у цис-положенні, як правило, взаємодіють з білками або іншими біологічними молекулами для здійснення (включення/виключення, регуляції, модуляції і т. д.) транскрипції. "Конститутивні" промотори являють собою промотори, що безупинно керують експресією в більшості станів навколишнього середовища і станів розвитку або диференціації клітин. "Індуцибельні" або "регульовані" промотори керують експресією нуклеїнової кислоти за винаходом, під впливом умов навколишнього середовища або умов розвитку. Приклади умов навколишнього середовища, що можуть впливати на транскрипцію за допомогою індукованих промоторів, включають анаеробні умови, підвищену температуру, низький вміст вологи або присутність світла. "Тканиноспецифічні" промотори являють собою транскрипційні керуючі елементи, які активні тільки в частині клітин або тканин, або органів, наприклад, у рослинах або тваринах. Тканиноспецифічну регуляцію можна здійснювати за допомогою визначених внутрішніх 26 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 факторів, що забезпечують експресію генів, кодуючих білки, специфічні для даної тканини. Відомо, що, для того, щоб конкретній тканини надати можливість розвитку, у ссавців і рослин існують такі фактори. Термін "рослина" включає цілі рослини, частини рослин (наприклад, листи, стебла, квітки, корені і т. д.), протопласти рослин, насіння і клітини рослин і їх потомство. Клас рослин, які можна використовувати в способі за винаходом, як правило, відповідає класу вищих рослин, сприйнятливих до способів трансформації, включаючи покритонасінні рослини (односім'ядольні і двосім'ядольні рослини), а також голонасінні рослини. Він включає рослини різної міри плоїдності, включаючи поліплоїдні, диплоїдні, гаплоїдні і гемізиготні стани. Як застосовують у даному документі, термін "трансгенна рослина" включає рослини або клітини рослини, у які введена гетерологічна послідовність нуклеїнової кислоти, наприклад, нуклеїнові кислоти і різні рекомбінантні конструкції (наприклад, експресуючі касети) за винаходом. В одному з аспектів збирають нуклеїнову кислоту, що кодує поліпептид за винаходом, у відповідній фазі і лідерну послідовність, що може керувати секрецією трансльованого поліпептиду або його фрагмента. В одному з варіантів здійснення в даному документі надані злиті білки і кодуючі їх нуклеїнові кислоти. Поліпептид за винаходом можна злити з гетерологічним пептидом або поліпептидом, таким як N-кінцеві сигнальні пептиди, які надають бажані характеристики, такі як збільшена стабільність або спрощене очищення. Пептиди і поліпептиди за винаходом також можна синтезувати і експресувати у вигляді злитих білків із приєднаним до них одним або декількома додатковими доменами, наприклад, для одержання більш імуногенного пептиду, для більш легкого виділення пептиду, синтезованого рекомбінантними способами, для ідентифікації і виділення антитіла і В-клітин, експресуючих антитіла, і т. п. Домени, що сприяють визначенню й очищенню, включають, наприклад, пептиди, хелатуючі метали, такі як полігістидинові тракти і гістидин-триптофанові модулі, що надають можливість очищення на іммобілізованих металах, домени білка A, що надають можливість очищення на іммобілізованому імуноглобуліні, і домени, що використовують у системі експресії/афінного очищення з FLAGS (Immunex Corp, Seattle WA). Включення послідовностей розщеплюваного лінкера, таких як розщеплювані послідовності фактора Xa або ентерокінази (Invitrogen, San Diego CA), між доменом очищення і мотив-вмісним пептидом або поліпептидом, може сприяти очищенню. Наприклад, експресуючий вектор може містити послідовність нуклеїнової кислоти, що кодує епітоп, яка з'єднана із шістьма залишками гістидину, за яких іде тіоредоксин і сайт розщеплення ентерокінази (див., наприклад, Williams (1995) Biochemistry 34:1787-1797; Dobeli (1998) Protein Expr. Purif. 12:404-414). Залишки гістидину полегшують визначення й очищення, тоді як сайт розщеплення ентерокінази забезпечує засіб очищення епітопа від іншої частини злитого білка. Способи, що стосуються векторів, які кодують злиті білки, і застосування злитих білків добре описані в науковій і патентній літературі, див., наприклад, Kroll (1993) DNA Cell. Biol., 12:441-53. Послідовності, що керують транскрипцією і трансляцією В іншому варіанті здійснення в даному документі надані послідовності нуклеїнових кислот (наприклад, ДНК, іРНК), функціонально зв'язані послідовністю(ями), що керує експресією (наприклад, транскрипцією або трансляцією), наприклад, промотори або енхансери, для керування або модуляції синтезу РНК/експресії. Послідовність, що керує експресією, може являти собою експресуючий вектор. Зразкові бактеріальні промотори включають lacІ, lacZ, Т3, Т7, gpt, lambda PR, PL і trp. Зразкові еукаріотичні промотори включають передранній промотор CMV, тимідинкіназу HSV, ранній і пізній SV40, LTR з ретровірусів і металотіонеїн миші. Промотори, придатні для експресії поліпептиду в бактеріях, включають промотори E. coli lac або trp, lac промотор, промотор lacZ, промотор T3, промотор T7, промотор gpt, промотор lambda PR, промотор lambda PL, промотори з оперонів, кодуючі гліколітичні ферменти, такі як 3фосфогліцераткіназа (PGK) і промотор кислої фосфатази. Еукаріотичні промотори включать передранній промотор CMV, промотор тимідинкінази HSV, промотори білків теплового шоку, ранні і пізні промотори SV40, LTR з ретровірусів і промотор металотіонеїну-I миші. Також можна використовувати інші промотори, про які відомо, що вони керують експресією генів у прокаріотичних або еукаріотичних клітинах або їх вірусах. Тканиноспецифічні промотори рослин В одному з варіантів здійснення в даному документі надані експресуючі касети, які можна експресувати тканиноспецифічним чином, наприклад, які дозволяють експресувати гідролазу за винаходом, тканиноспецифічним чином. В іншому варіанті здійснення в даному документі надані рослини або насіння, що експресують гідролазу за винаходом, тканиноспецифічним чином. Тканиноспецифічність може являти собою специфічну дію в насінні, стеблах, листах, коренях, фруктах і т. п. 27 UA 101214 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному з аспектів можна використовувати конститутивний промотор, такий як промотор CaMV 35S, для експресії в конкретних частинах або насінні або у всій рослині. Наприклад, для підвищеної експресії гідролази за винаходом можна використовувати фрагмент промотору рослини, який буде керувати експресією нуклеїнової кислоти в деяких або у всіх тканинах рослини, наприклад, регенеруючої рослини. Такі "конститутивні" промотори активні в більшості умов навколишнього середовища і станах розвитку або диференціації клітин. Приклади конститутивних промоторів включають ділянку ініціації транскрипції вірусу мозаїки цвітної капусти (CaMV) 35S, 1'- або 2'-промотори, одержані з T-ДНК Agrobacterium tumefaciens, і інші відомі фахівцям ділянки ініціації транскрипції з різних генів рослин. Такі гени включають, наприклад, ACT11 з Arabidopsis (Huang (1996) Plant Mol. Biol. 33:125-139); Cat3 з Arabidopsis (GenBankNo. U43147, Zhong (1996) Mol. Gen. Genet. 251:196-203); ген, що кодує десатуразу білка-переносника стеароїл-ацилу з Brassica napus (Genbank No. X74782, Solocombe (1994) Plant Physiol 104:1167-1176); Gpc1 з маїсу (GenBank No. XI5596; Martinez (1989) J. Mol. Biol 208:551-565); Gpc2 з маїсу (GenBank No. U45855, Manjunath (1997) Plant Mol. Biol. 33:97-112); промотори рослин, описані в у патентах США №№ 4962028; 5633440. В одному з варіантів здійснення в даному документі надані тканиноспецифічні або конститутивні промотори, одержані з вірусів, що можуть включати, наприклад, субгеномні промотори тобамовірусів (Kumagai (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:1679-1683); паличкоподібний вірус рису тунгро (RTBV), що реплікується тільки в клітинах флоеми інфікованих рослин рису, промотори якого керують вираженою специфічною для флоеми експресією репортерного гена; промотор вірусу мозаїки жилок маніоки (CVMV), з найвищою активністю в елементах жилкування, у мезофільних клітинах листів і в кінчиках коренів (Verdaguer (1996) Plant Mol. Biol. 31:1129-1139). Альтернативно, промотор рослини може керувати експресією експресуючої гідролазу нуклеїнової кислоти в конкретній тканині, органі або типі клітин (тобто, тканиноспецифічні промотори) або може іншим способом знаходитися під більш точним керуванням з боку навколишнього середовища або стану розвитку або знаходитися під керуванням індукованого промотору. Приклади умов навколишнього середовища, що можуть впливати на транскрипцію, включають анаеробні умови, підвищену температуру, присутність світла або обприскування хімічними речовинами/гормонами. В одному з варіантів здійснення в даному документі надані індуковані низьким вмістом вологи промотори маїсу (Busk (1997), вище); індуковані холодом, низьким вмістом вологи і високою солоністю промотори картоплі (Kirch (1997) Plant Mol. Biol. 33:897 909). Тканиноспецифічні промотори можуть сприяти транскрипції тільки в рамках визначеного часового інтервалу стадії розвитку в межах цієї тканини. Див., наприклад, Blazquez (1998) Plant Cells 10:791-800, характеристику промотору гена LEAFY з Arabidopsis. Також див. Cardon (1997) Plant J 12:367-77, опис фактора транскрипції SPL3, що розпізнає послідовність консервативного мотиву в ділянці промотору ідентифікуючого гена AP1 меристеми квіток A. thaliana; і Mandel (1995) Plant Molecular Biology, том 29, стор. 995-1004, опис промотору меристеми eIF4. Можна використовувати тканиноспецифічні промотори, які активні протягом всього життєвого циклу конкретної тканини. В одному з аспектів нуклеїнові кислоти за винаходом функціонально зв'язані з промотором, який активний, головним чином, тільки в клітинах бавовняного волокна. В одному з аспектів нуклеїнові кислоти за винаходом функціонально зв'язані з промотором, який активний, головним чином, у ході стадій подовження клітин бавовняного волокна, наприклад, як описано автором Rinehart (1996) вище. Нуклеїнові кислоти можуть бути функціонально зв'язані з промотором гена Fb12A, щоб експресувати переважно в клітинах бавовняного волокна (Ibid). Також див. John (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5769-5773; John, et al., патенти США №№ 5608148 і 5602321, опис специфічних промоторів бавовняного волокна і способів конструювання трансгенних рослин бавовни. Для експресії нуклеїнових кислот за винаходом також можна використовувати специфічні промотори коренів. Приклади специфічних промоторів коренів включають промотор з гена алкогольдегідрогенази (DeLisle (1990) Int. Rev. Cytol. 123:39-60). Інші промотори, які можна використовувати для експресії нуклеїнових кислот за винаходом, включають, наприклад, специфічні промотори насінного зачатка, зародка, ендосперму, інтегументу, насінної оболонки або будь-яке їх сполучення; специфічний промотор листів (див., наприклад, Busk (1997) Plant J. 11:1285 1295, опис специфічного промотору листів у маїсі); промотор ORF13 з Agrobacterium rhizogenes (який виявляє високу активність у коренях, див., наприклад, Hansen (1997) вище); специфічний промотор пилка маїсу (див., наприклад, Guerrero (1990) Mol. Gen. Genet. 224:161 168); промотор томата, активний у процесі дозрівання плодів, зів'янення й опадання листів і, у меншій мірі, квіток, можна використовувати (див., наприклад, Blume (1997) Plant J. 12:731 746); специфічний промотор маточки з гена SK2 28