Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові людини, що включає забір периферійної крові, руйнування клітинних оболонок, позбавлення від білкової фази протеолітичними ферментами, висолювання ДНК хлоридом натрію та осадження етанолом, який відрізняється тим, що після забору крові, клітини 2-3 рази промивають 1-кратним ретикулюючим розчином, а після лізису клітин, очистки від білків, висолювання ДНК, її осаджують холодним 96 % етанолом, промивають охолодженим 70 % етанолом і розчиняють у ТЕ-буферному розчині.

Текст

Корисна модель відноситься до галузі медицини, зокрема - медичної генетики, а саме до молекулярної генетики, і може бути використана для виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові людини. Відомі способи виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові людини, які грунтуються на тому, що клітини крові, забрані у флакони з антикоагулянтом, руйнують лізуючим розчином, лізат позбавляють білків за допомогою протеолітичних ферментів, ДНК очищають за допомогою фенолу, фенол - хлороформу, хлороформу ізоамілового спирту і осаджують етанолом [1,2]. Основним недоліком цього способу є висока токсичність реагентів, зокрема, фенолу, хлороформу і меркаптоетанолу. Найближчим аналогом є спосіб виділення ДНК з лейкоцитів периферійної крові, який включає традиційний забір крові, руйнування клітинних оболонок лізуючим розчином, позбавлення білкової фази за допомогою протеолітичних ферментів, висолювання ДНК хлоридом натрію з наступною концентрацією абсолютним етанолом кімнатної температури [3]. Недоліком аналогу є недостатнє очищення ДНК. Задачею корисної моделі є розробка такого способу виділення ДНК, який би за допомогою нетоксичних реактивів дозволяв отримати достатню кількість чистої ДНК. Поставлена задача вирішується тим, що у способі виділення ДНК, який включає забір периферійної крові, руйнування клітинних оболонок, позбавлення від білкової фази протеолітичними ферментами, висолювання ДНК хлоридом натрію та осадження етанолом, згідно з корисною моделлю, після забору крові, клітини 2-3 рази промивають 1-кратним ретикулюючим розчином, а після лізису клітин, очистки від білків, висолювання ДНК, її осаджують холодним 96% етанолом, промивають охолодженим 70% етанолом і розчиняють у ТЕ-буферному розчині. Спосіб забезпечує отримання достатньої кількості високомолекулярної очищеної ДНК при застосуванні нетоксичних реагентів. Спосіб використовують наступним чином: забирають 3-10мл периферійної крові у пластикові флакони з ЕДТА в якості антикоагулянта, промивають клітини крові 2-3 рази 1-кратним ретикулюючим розчином (140mM NaCl, 5mМ КС1, 7mМ MgC12 x 6H2O), суміш центрифугують при 2,5тис.об/хв впродовж 10хв., перемішують осад 5-10хв із свіжоприготовленим лізуючим розчином (131mМ NH4C1, 0,9mМ NH4CO3), центрифугують та відбирають надосадову рідину (процедуру повторюють 2-а рази), а осад ресуспендують у 3-5мл STE-розчину (100mМ NaCl, 50mM Tris-HCl, pH 7,4, 1mМ EDTA), додають 100-200мкл 10% розчину SDS та 30-50мкл протеїнази К (10мкл/мл), інкубують при 37°С впродовж ночі, додають 1,5мл 6М NaCl, перемішують та центрифугують 10хв. при 4000об/хв., відбирають у скляну пробірку верхню в'язку ДНК-вмісну фазу, додають для осадження ДНК 2,5 об'єми охолодженого до -20°С 96% етанолу, 2-разово промивають осад ДНК охолодженим при +10°С 70%-им етанолом, підсушують та розчиняють у 200-800мкл ТЕ-буферного розчину (10mМ Tris-HCl, pH 7.5, 1mМ EDTA). Кількісні та якісні показники отриманої ДНК оцінювали у 10 пацієнтів. Дані зведено в таблиці Таблиця Пацієнти В.М. В.Н. В.Л. В.І. Р.Л. Д.М. Д.Л. Д.Р. Г.М. Г.І. Концентрація ДНК(мкг/мл) 176* 460 344 310 360 200 400 230 334 216 Чистота ДНК 2.38** 1.78 1.85 2.06 1.89 2.0 2.0 2.30 1.92 1.81 Примітки: Для визначення кількості та чистоти ДНК проводили спектрофотометричне вимірювання оптичної щільності розчину в області довжини хвилі 260нм та 280нм. * - показники кількості ДНК в мкг/мл, вирахувані з розрахунку того, що оптична щільність D=1 при 260нм відповідає 50мкг/мл ДНК; ** - показники чистоти ДНК вирахувані співвідношенням показів спектрофотометра при оптичній щільності D, виміряній в області 260нм до величини D, отриманій в області 280нм. Якщо препарати ДНК є чистими, то цей показник складає 1,8 - 2, якщо препарат ДНК має домішки білку, чи фенолу, то цей показник є значно нижчим. Приклад 1. Сім'я В. (В.М., В.Н. батьки, В.Л. - мати, В.І. - батько), яка проживає у Тернопільській обл., Теребовлянському р-ні, с.м.т. Дружба, звернулася у Львівський міжобласний медико-генетичний центр з приводу верифікації діагнозу муковісцидоз. У дітей В.М. (1992 р.н.) та В.Н. (1998 р.н.) зафіксовано часті бронхолегеневі та шлунково-кишкові розлади та підвищений рівень хлоридів у поті. Усім членам сім'ї проведені молекулярно-генетичні дослідження. З цією метою виділено ДНК вище описаним методом. Взірці ДНК отримали наступну нумерацію: № 779 (В.М.), №780 (В.Н.), №781 (В.Л.), № 782 (В.І.). Концентрацію ДНК вимірювали оптичним методом: кінцева концентрація складала 176- (№779), 460- (№780), 344(№781), 310мкг/мл (№782), при коефіцієнті чистоти 2.38, 1.78, 1.85 та 2.06, відповідно. Проби ДНК піддавали ампліфікації методом ПЛР та подальшому аналізу у поліакриламідному гелі (ПААГ). Отримані результати засвідчили: 1. Наявність мутації F508del у гомозиготному стані у дітей В.М.,1992р.н. та В.Н., 1998р.н.(генотип F508del/F508del); 2. Наявність гетерозиготного носійства мутації F508del у матері В.Л., 1969 р.н. та у батька В.І., 1964р.н. (генотипи F508del/-). Приклад 2. Сім'я Д. Звернулася у Львівський міжобласний медико-генетичний центр з приводу підозри фенілкетонурії у дитини (Д.М., 1998р.н.). Сім'я проживає за адресою: Волинська обл., Турійський р-н, с.Волиця. Усім членам родини проведено виділення ДНК вище описаним методом. Препарати ДНК отримали нумерацію: № Ф68 Д.М.,1998 р.н. - дитина, Ф69 - Д.Л., 1977 р.н. - мати, Ф70 - Д.Р., 1977 р.н. - батько, концентрація ДНК в цих пробах становила 200-, 400- та 230 мкг/мл, відповідно, при коефіцієнтах чистоти 2.0-, 2.0-, 2.30, відповідно. Молекулярно-генетичні дослідження гена фенілаланінгідроксилази засвідчили наявність мутації R408W у пробанда Д.М.,1998 р.н. та у батьків Д.Л., 1977 р.н. та Д.Р., 1977 р.н. Отримані результати показали: 1. Наявність мутації R408W у дитини Д.М. в гомозиготному стані (генотип R408W/ R408W); 2. Наявність гетерозиготного носійства мутації R408W у батьків (генотипи R408W/-). Отже, пропонований метод виділення ДНК дозволяє отримувати ДНК в такій кількості і такої якості, які задовольняють подальші молекулярно-генетичні дослідження порушень геному на рівні мутацій окремих генів. Джерела інформації: 1. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. / Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование. 1984.- Москва «Мир».-С. 403-410. 2. Efremov G.D., Dimovski A.J., Plaseska-Karanfilska D., Simjanovska L., Sukarova E., Koceva S. PCR based methods in the detection and characterization of inherited, infectious and malignant diseases / FEBS Advanced Theoretical/Practical Course 99/16 - 1999 - Skopje. 3. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acids Research. - 1988. - Vol.16. - No 3. -P.1215.

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for separation of dna from leucocytes of peripheral blood

Автори англійською

Makukh Halyna Vasylivna, Zastavna Danuta Volodymyrivna, Tyrkus Marta Yaroslavivna, Tretiak Bohdan Ireniiovych, Chorna Lilia Bohdanivna

Назва патенту російською

Способ выделения днк из лейкоцитов периферической крови

Автори російською

Макух Галина Васильевна, Заставна Данута Владимировна, Тиркус Марта Ярославовна, Третяк Богдан Иреньевич, Черная Лиля Богдановна

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/49

Мітки: периферійної, лейкоцитів, крові, виділення, спосіб, днк

Код посилання

<a href="https://uapatents.com/2-32044-sposib-vidilennya-dnk-z-lejjkocitiv-periferijjno-krovi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виділення днк з лейкоцитів периферійної крові</a>

Подібні патенти