Бета-галактозидаза з активністю альфа-галактозилтрансферази

1. Фермент β-галактозидаза з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2, що кодується ДНК з послідовністю SEQ ID NO: 1. 2. Фермент β-галактозидаза, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID NO: 2. 3. Рекомбінантний вектор, що містить ДНК з послідовністю SEQ ID NO: 1. 4.Вектор за п. 3, де вказаний вектор є вектором експресії. 5. Клітина-хазяїн, що містить послідовність ДНК за п. 1. 6. Клітина-хазяїн, що містить вектор за п. 3 або п. 4. 7. Клітина-хазяїн за будь-яким з п. 5 або п. 6, де вказана клітина є бактеріальною клітиною, дріжджовою або грибковою клітиною. 8. Клітина-хазяїн за п. 7, де вказана клітина вибрана з групи, що складається з Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Escherichia, Bacillus і Aspergillus. 9. Клітина-хазяїн за п. 8, де клітина вибрана з групи, що складається з Bifidobacterium bifidum, Bacillus subtilis, Bacillus circulans і Aspergillus niger. 10. Застосування ферменту β-галактозидази з амінокислотною послідовністю SEQ ID NO: 2 для одержання суміші олігосахаридів, що містить β 2 (19) 1 3 95944 4 експресію вказаного ферменту і виділення ферменту, що утворюється, з культури. 17. Спосіб одержання суміші олігосахаридів, що містить дисахариди Gal(β 1-3)Glc, Gal(β 1-3)Gal, Gal(β 1-6)Gal i Gal(α 1-6)Gal, трисахариди Gal(β 16)Gal(β 1-4)Glc, Gal(β 1-3)Gal(β 1-4)Glc, тетрасаха рид Gal(β 1-6)Gal(β 1-6)Gal(β 1-4)Glc і пентасахарид Gal(β l-6)Gal(β 1-6)Gal(β 1-6)Gal(β 1-4)Glc, що включає контактування ферменту за будь-яким з пп. 1 або 2 або клітини-хазяїна за будь-яким з пп. 5-9 з матеріалом, що містить лактозу. Даний винахід стосується -галактозидази з трансгалактозилуючою активністю, здатної перетворювати лактозу у суміш олігосахаридів, які з'єднані -зв'язком, і несподівано продукувати дисахарид 1-6-галактобіозу з -зв'язком. Зокрема, винахід стосується -галактозидази, виділеної з нещодавно відкритого штаму Bifidobacterium bifidum. Зокрема, винахід стосується послідовностей ДНК, що кодують виділений фермент галактозидазу, ферменту, що кодується послідовністю ДНК, і клітини-хазяїна, що містить послідовність ДНК або рекомбінантний вектор, який включає послідовність ДНК. Даний винахід також стосується застосування ферменту, що кодується послідовністю ДНК, або клітини-хазяїна, що містить послідовність ДНК або рекомбінантний вектор, для виробництва олігосахаридів. Біфідобактерії природним чином колонізують нижній відділ кишкового тракту, середовище якого містить незначну кількість моно- і дисахаридів, оскільки такі цукри переважно споживають хазяїн і мікроорганізми, які є присутніми у верхньому відділі кишкового тракту. Для того, щоб існувати у нижньому відділі кишкового тракту, біфідобактерії продукують різні поверхнево-зв'язані екзо- і ендоглікозидази і/або позаклітинні форми, за допомогою яких вони можуть утилізувати різні вуглеводи. Нарівні з гідролазною активністю деякі ферменти біфідобактерій володіють трансферазною активністю. Ця трансглікозилуюча активність глікозидаз широко використовується для ферментативного синтезу різних олігосахаридів, які виявилися здатними діяти як фактори, що стимулюють ріст біфідобактерій. Відомо, що представники біфідобактерій продукують ферменти -галактозидази, які беруть участь у бактеріальному метаболізмі лактози. Moller, P.L. et al у Appl & Environ. Microbial, (2001), 62, (5), 2276-2283 описують виділення і дають характеристики трьох -галактозидазних генів зі штаму Bifidobacterium bifidum. Вони знайшли, що всі три -галактозидази здатні каталізувати утворення бета-зв'язаних галактоолігосахаридів за допомогою трансгалактозилування. Dumortier et al у Carbohydrate Research, 201, (1990), 115-123 описали утворення бета-зв'язаних олігосахаридів за реакцією транслактозилування при гідролізі лактози Bifidobacterium bifidum DSM 20456. Їх аналіз структури суміші олігосахаридів, що продукуються, показав, що ці зв'язки були (13)-, - (16)- і - (14)-D-галактозильними зв'язками. Dumortier припустив, що сполуки, які продукуються Bifidobacterium bifidum, необхідні для адгезії бактерій у товстому кишечнику. Був виявлений штам Bifidobacterium bifidum, здатний продукувати активний фермент галактозидазу, що перетворює лактозу у нову суміш галактоолігосахаридів, яка, як несподівано було виявлено, містить до 35% дисахаридів, включаючи галабіозу (Ga1(1-6)-Gal). Відомо (див. Paton, J С and Paton, A W (1998), Clin. Microbiol. Revs., 11, 450-479; Carlsson, K А (1989), Ann. Reviews Biochem., 58, 309-350), що цей дисахарид є антиадгезивом, здатним запобігати адгезії токсинів, наприклад, токсину Shiga, і патогенів, таких як Е. соli, до стінок кишечнику. Цей штам В. bifidum 31 березня 2003 року був депонований у Національній колекції промислових і морських бактерій, Абердин, Великобританія (Eng). Він також описаний у патенті UK №2412380. Було виявлено, що штам В. bifidum продукує декілька -галактозидаз, одна з яких несподівано демонструє активність -галактозилтрансферази. Цей фермент продукує ряд різних олігосахаридів, які зв'язані -зв'язками, але також продукує і зв'язаний дисахарид галабіозу. Даний винахід стосується послідовності ДНК, що кодує білок з амінокислотною послідовністю, представленою у SEQ ID NO: 2, або у жорстких умовах гібридизується з послідовністю ДНК, що кодує цей білок. У SEQ ID NO: 1 наведена ця послідовність ДНК або її фрагмент або вироджене похідне. Термін «вироджене похідне» означає послідовність ДНК, яка гомологічна SEQ ID NO: 1 не менш ніж на 50%, переважно, на 50-98%, найбільш переважно, на 75-95%. Така послідовність ДНК може містити нуклеотидні заміни, вставки або делеції, які у результаті дають менше 60%, переважно менше 45%, більш переважно менше 25% змін в амінокислотній послідовності, показаній у SEQ ID NO: 2. Нуклеотидні заміни можуть у результаті давати консервативні заміни амінокислот. Відповідно до другого аспекту винахід стосується ферменту, що кодується послідовністю ДНК, визначеною вище. Такий фермент може містити амінокислотну послідовність, наведену у SEQ ID NO: 2, або її фрагмент. Відповідно до третього аспекту винахід стосується рекомбінантного вектора, переважно, вектора експресії, що містить послідовність ДНК, визначену вище. Такий вектор може бути частиною клітини-хазяїна, такої як бактеріальна, дріжджова або грибкова клітина. Альтернативно, послідовність ДНК може бути частиною такої клітинихазяїна. Відповідна клітина-хазяїн може бути виб 5 рана з Bifidobacterium, Lactococcus, Lactobacillus, Bacillus (наприклад, Bacillus subtilus або Bacillus circulans), Escherichia і Aspergillus (наприклад, Aspergillus niger). Використовуючи лактозу як субстрат, фермент, що кодується послідовністю ДНК, визначеною вище, продукує суміш дисахаридів, що включає Gal(1-3)Glc, GaI(1-3)Gal, Gal(1-6)Gal і Gal(1-6)Gal. У цій суміші олігосахаридів також присутні трисахариди Gal(1-6)Gal(1-4)Glc, Gal(1-3)Gal(1-4)Glc, тетрасахарид Gal(16)Gal(1-6)Gal(1-4)Glc і пентасахарид Gal(16)Gal(1-6)Gal(1-6)Gal(1-4)Glc. Фермент клітини-хазяїна, описаний вище, можна використовувати для продукування суміші дисахаридів, включаючи Gal(1-6)Gal (галабіозу), що може скласти частину продукту, призначеного для поліпшення стану здоров'я кишечнику. Такий продукт може бути вибраний з групи, що складається з молочних продуктів (наприклад, рідке молоко, сухий молочний порошок, такий як порошок незбираного молока, порошок знежиреного молока, молочні порошки, збагачені жиром, порошки молочної сироватки, молоко для дітей, дитячі молочні суміші, морозиво, дитячі харчові продукти, йогурт, сир, ферментовані молочні продукти), напоїв, таких як фруктовий сік, дитячого харчування, круп, хлібу, печива, кондитерських виробів, тортів, харчових добавок, дієтичних добавок, симбіотичних харчових продуктів, пребіотичних харчових продуктів, корму для тварин, корму для птахів або взагалі будь-яких інших харчових продуктів або напоїв. Альтернативно, олігосахариди, вироблені таким чином, можна використовувати для приготування медикаменту (наприклад, у формі таблетки або капсули) для запобігання адгезії патогенів або токсинів, що продукуються патогенами, до стінки кишечнику. Цей медикамент можна вводити пацієнту, наприклад, після курсу лікування антибіотиком, що часто змінює або навіть ушкоджує нормальну здорову кишкову флору. Відповідно до подальшого аспекту, винахід стосується способу виробництва ферменту, визначеного вище, що включає культивування клітини-хазяїна, визначеної вище, у відповідному культуральному середовищі в умовах, що дозволяють експресію цього ферменту, і виділення продукованого ферменту з цієї культури. Винахід також стосується способу одержання суміші олігосахаридів, включаючи дисахарид Gal(1-6)-Gal (галабіозу), що включає контактування ферменту, визначеного вище, або клітинихазяїна, визначеної вище, з матеріалом, що містить лактозу, в умовах, які ведуть до утворення цієї суміші олігосахаридів. Придатний матеріал, що містить лактозу, може бути вибраний з комерційно доступної лактози, незбираного молока, напівзнежиреного молока, знежиреного молока, молочної сироватки і молока, збагаченого жиром, фільтрату молочної сироватки. Такі молочні продукти можуть бути одержані від корів, буйволиць, овець або кіз. Молоко, збагачене жиром, визначають як незбиране молоко, з 95944 6 якого видалили молочний жир, який потім замінили додаванням рослинного жиру або олії. Короткий опис фігур На фігурі 1 показана нуклеотидна послідовність (SEQ ID NO: 1) -галактозидази Bifidobacterium bifidum за винаходом; і На фігурі 2 показана амінокислотна послідовність (SEQ ID NO: 2), що відповідає нуклеотидній послідовності фігури 1; На фігурі 3 представлений графік, що показує проходження у часі реакції при синтезі галактоолігосахариду з -галактозидазою і 40% за масою лактози як субстрату в 0,1 Μ фосфатному буфері при pH 6,0; і На фігурі 4 представлена високоефективна аніонобмінна хроматограма суміші галактоолігосахаридів, синтезованих -галактозидазою з В. bifidum NCIMB 41171 з використанням 40% за масою лактози як субстрату в 0,1 Μ фосфатному буфері при pH 6,0. (Glc = глюкоза, Gal = галактоза, Lac = лактоза, (1-6)галактобіоз, DP = ступінь полімеризації). Геномну ДНК виділяли зі штаму Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) з використанням способу Lawson et al. (1989) Fems Microbiol Letters, 65, (1-2), 41-45. ДНК обробляли ферментами рестрикції, і фрагменти з максимальним розміром 15 т.п.н. лігували з вектором pSP72, який піддався дії тих ферментів рестрикції. Клітини Е. соlі трансформували вектором, що містить вставки, які складаються з хромосомної ДНК В. bifidum, обробленої (рестриктазами) PstI, Eco RI, Ваm НІ, Kpnl, Smal або Hindlll. Клони з -галактозидазною активністю відібрали на агарових середовищах Лурія-Бертані, що містять п-нітрофенол, X--Gal (5-бром-4-хлор-3-індоліл--D-галактозид) та ізопропіл--D-тіогалактозид (IPTG). Лігуючі суміші з хромосомної ДНК, перевареної Ваm НІ, дали сім клонів, позитивних на -галактозидазу, один з яких був ідентифікований як рВ1. Секвенування вставленого фрагмента ДНК В1 проводили з використанням дидезоксинуклеотидного методу термінації ланцюга за Сенгером (Russel P., 2002 iGenetics, Pearson Education, Inc., San Francisco, 187-189) з використанням набору для циклічного секвенування BigDye Terminator V.3.0 (Applied Biosystems, USA). Послідовність ДНК B1 показана на фігурі 1 (SEQ ID NO: 1). Відкриту рамку зчитування (ORF) ідентифікували за допомогою програми ORF Finder з NCBI (National Center of Biotechnology Information). Нуклеотидна послідовність Фігури 1 була трансльована у всіх шести можливих рамках зчитування і була ідентифікована одна відкрита рамка зчитування (1052 амінокислот), що кодує передбачувану галактозидазу. Трансляція показана на Фігурі 2 (SEQ ID NO:2). Нижче даний винахід описаний з посиланнями на наведені далі приклади. Приклад 1 Матеріали і методи Усі хімічні реагенти і препарати середовищ, використані у цій роботі, були одержані від Sigma (Dorset, UK), Invitrogen (Paisley, UK), Oxoid 7 (Basingstoke, UK), Qiagen (West Sussex, UK) і Promega (Southampton, UK). Бактеріальні штами Штам Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) зберігали на кріогенних гранулах у пробірках Microbank при -70°С. Для подальших експериментів штам оживляли на агарі Wilkinson Chalgren (WC) (Oxoid, UK) і середовищі TPY (середовище Триптиказа з фітоном і дріжджовим екстрактом) і вирощували анаеробно (склад СО2 і N2 - 80% і 20% відповідно) при 37°С протягом 48 годин. Морфологію колоній і відсутність забруднень перевіряли забарвлюванням за Грамом. Штами Е. соlі Штам Escherichia coli DH5a, використаний у цій роботі, звичайно інкубували в аеробних умовах при 37°С на агаровому середовищі Лурія-Бертані (LB) або бульйоні (Sambrook J. and Russell W. D. (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) і за необхідності додавали антибіотики (100 мкг/мл ампіциліну і/або 15 мкг/мл хлорамфеніколу) і 40 мкл 2% X--Gal, 7 мкл 20% ізопропіл--Dтіогалактозиди (IPTG), що наносили на поверхні заздалегідь приготованих 90-мм агарових чашок. Штам Е. coli DH5a (Invitrogen, Paisley, UK) (генотип: F 80lacZAM A(lacZYA-argF)U169 recA1 endA1 hsdR17(rk , mk ) phoA supE44 thi-1 gyrA96 relA1 ) є штамом, позитивним за галактозидазою, і його використовували в експериментах з експресії і для інших генетичних маніпуляцій. Екстракція геномної ДНК з Bifidobacterium bifidum Геномну ДНК виділяли зі штаму Bifidobacterium bifidum (NCIMB 41171) з використанням наведеного нижче способу, в якому хромосомну ДНК готували з клітинного осаду, зібраного зі 100 мл анаеробного бульйону WC. Клітини ресуспендували у 10 мл TES-буфера (10 мМ Tris-HCl, 10 мМ EDTA, 10 мМ NaCl, pH 8) і обробляли 200 мкл суміші лізоциму з мутанолізином (4:1, лізоцим 10 мг/мл, мутанолізин 1 мг/мл) протягом 30 хвилин при 37°С. Потім клітини обробляли 200 мкл протеїнази К (при 20 мг/мл) і 200 мкл РНКази (обидві 10 мг/мл), перемішували та інкубували 1 годину при 65°С. Остаточно клітини обробляли 2 мл 10% ДДС та інкубували 15 хв. при 65°С. Додавали 12 мл фенолу з хлороформом і екстракцію повторювали доти, доки водна фаза не починала легко відділятися від проміжної фази. Геномну ДНК осаджували ізопропанолом і ресуспендували у 10 мМ Tris-HCl 1 мМ EDTA (pH 8). Потім геномну ДНК переварювали з ферментами рестрикції, проводили лігування в pSP72, перевареній тими ж ферментами, і обробляли лужною фосфатазою. Переварювання геномної ДНК В. bifidum проводили, використовуючи EcoRI, PstI, BamHI, Smal і Kpnl. Лігуючі суміші використовували для трансформування Е. coli DH5a; клони, позитивні за -галактозидазою, ідентифікували як сині колонії на пластинах, що містять X-Gal. Приготування векторної ДНК У цій роботі як вектор для клонування та експресії використовували pSP72 (Promega, UK) 95944 8 (Krieg, P.A. and Melton, D. A. (1987). In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase. Methods in Enzymology. 155: 397-415). Цей вектор вибрали внаслідок відсутності комплементарної активності -фрагмента галактозидази, який не кодований у pSP72. Цей вектор не несе короткий сегмент ДНК Ε. coli, що містить регуляторну послідовність і кодує інформацію для перших 146 амінокислот галактозидази, що, у комбінації зі штамами Е. coli (тобто DH5a), які експресують С-кінцеву частину цієї -галактозидази, дає активну -галактозидазу (-комплементація). Вектор переварювали наступними рестрикційними ферментами: PstI, BamHI, Hindlll, Smal, Kpnl та EcoRI відповідно до інструкцій виробника, з використанням десятикратного надлишку ферменту стосовно ДНК (одиниці ферменту: мікрограм ДНК дорівнює 10 одиницям ферменту на один мкг плазмідної ДНК або 10 одиницям ферменту на 0,5 пмоль плазмідної ДНК). Після термоінактивації ферментів (20 хв. при 65 °С) рестрикційну картину аналізували за допомогою електрофорезу у горизонтальному гелі. Присутність єдиного фрагмента у гелі означало повне переварювання вектора і його єдиний сайт рестрикційного переварювання. Достатність переварювання вектора перевіряли також трансформацією нелігованих молекул у компетентні клітини Е. coli DH5a. Кількість утворених колоній на пластинах LB-агару з доданим ампіциліном (100 мкг/мл) служила показником непереварених молекул і очікуваного фону при подальших експериментах. Вектори додатково дефосфорилували телячою кишковою лужною фосфатазою СІАР (Promega, Southampton, UK) відповідно до інструкцій виробника. Ефективність цієї обробки перевіряли за самолігуванням (з ДНК-лігазою бактеріофагу Т4 відповідно до інструкції виробника) після трансформації у клітини DH5a. Кількість утворених колоній показувала кількість молекул, повторно замкнутих у кільця (неклонований вектор), а віднімання від неї числа утворених колоній без обробки вектора СІАР давало кількість недефосфорилованого вектора. Побудова бібліотеки геномної ДНК Геномну ДНК частково переварювали шістьма ферментами рестрикції, які пізнають гексануклеотидні послідовності, що часто зустрічаються, у прокаріотичній ДНК. EcoRI, BamHI, PstI, Kpnl, Smal і Hindlll є рестрикційними ендонуклеазами типу II, що специфічно пізнають послідовності 5'G/AATTC3', 5'G/САТСС3', 5'CTGCA/G3', 5'GGTAC/G3', 5'CCC/GGG3' і 5'A/AGCTT3' відповідно і роблять двохниткові розриви у цих послідовностях, утворюючи 5'-оверхенги з чотирьох нуклеотидів, ААТТ, GATC, AGCT для EcoRI, BamHI і Hindlll відповідно, і 3'-оверхенги, ACGT, GTAC для PstI і КрnІ відповідно і тупі кінці для Smal. Усі ці ферменти були активними і здатними розщеплювати ДНК тільки у присутності іонів магнію. Ці іони були єдиним необхідним кофактором. Рестрикційне переварювання ДНК Переварювання зразків ДНК усіма рестриктазами проводили при інкубації протягом 2 годин при 9 37°С з кінцевою термоінактивацією при 65°С протягом 20 хвилин. Реакційні суміші потім охолоджували до кімнатної температури і додавали відповідну кількість робочого буфера з подальшим обережним перемішуванням запаяним скляним капіляром. Потім розчини завантажували в ямки 0,8% агарозного гелю (при напрузі 4-5 вольт/см протягом 14-16 годин) і розмір перевареної ДНК оцінювали за допомогою 1-тпо стандартів ДНК (Promega, UK) (Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2002)). Очищення фрагментів, утворених після переварювання рестриктазами 95944 10 З реакційних сумішей і агарозних гелів фрагменти очищали за допомогою набору для екстракції з гелів QIAEX від Qiagen (West Sussex, UK). Протоколи докладно описані в інструкції виробника. Лігування ДНК і трансформація Після очищення фрагментів ДНК за допомогою набору для екстракції з гелів Qiaex їх лігували з вектором pSP72, обробленим СІАР. Для лігування відповідні кількості ДНК переносили у стерильні мікроцентрифугові пробірки, як показано у Таблиці 1. Таблиця 1 Пробірка А В С Днк Вектор (15 фмоль [29,7 нг]) Вектор (15 фмоль [29,7 нг]) плюс вставка (сторонні 15 фмоль 69,3 нг) pUC контроль (0,056 фмоль [100 пг]) Молярне співвідношення плазмідного ДНКвектора до фрагмента ДНК, що вставляється, у реакції лігування повинне бути 1:1. Кінцева концентрація ДНК повинна бути 10 нг/мкл. Таблиця 1. Суміші лігування. Пробірка А показує кількість самолігованої векторної ДНК, яку слід відняти від загальної кількості трансформантів після трансформації. Пробірка В показує лігування вектора з фрагментами ДНК, а пробірка С показує контроль для розрахунку ефективності трансформації. Перед кожним лігуванням фрагменти ДНК нагрівали при 45°С протягом 5 хвилин для розплавлювання будь-яких липких кінців, що були піддані повторному відпалу при приготуванні фрагмента. Молярне співвідношення вектор:вставка ДНК було вибране на рівні 1:1 для всіх реакцій лігування, які проводили за інструкціями Promega. У пробірки А і В додавали по 1,0 мкл 10кратного буфера лігування і 0,5 одиниць Вейса ДНК-лігази Т4 (Promega, UK) і об'єм доводили до 10 мкл водою молекулярно-біологічної категорії чистоти. У пробірку С додавали 1,0 мкл 10кратного буфера лігування і об'єм лігування доводили до 10 мкл водою молекулярно-біологічної категорії чистоти. У пробірки додавали фрагменти ДНК з водою і нагрівали до 45°С протягом 5 хвилин для розплавлювання всіх липких кінців, що були піддані повторному відпалу при приготуванні. Перед додаванням інших реагентів лігування ДНК охолоджували до 0°С і реакційні суміші інкубували протягом ночі при 16°С (Sambrook and Russell, 2001). Після осадження етанолом і очищення лігованих фрагметів (для видалення лігуючої суміші, що знижує ефективність трансформації) прово дили трансформацію за інструкціями Hanahan. 50 нг лігованої ДНК у 5 мкл розчину додавали до 100 мкл компетентних клітин Е. coli DH5a. Після термообробки та експресії гена резистентності до ампіциліну клітини розподіляли по поверхні чашок середовища LB, що містить ампіцилін (100 мкг/мл), X--Gal (40 мкл 2% X--Gal) та IPTG (7 мкл 20% IPTG). Визначали кількість трансформантів з кожної реакції лігування. Звичайна кількість трансформантів, одержуваних з пробірки С, складала 5 6 210 -110 КУО/мкг, тоді як з пробірки А одержували 500-600 КУО/мкг. Кількість трансформантів у пробірці А була показником ефективності векторної ДНК. Кількість трансформантів у пробірці 6 В була у діапазоні 2-410 КУО/мкг. Кількість трансформантів Лігуючі суміші з хромосомної ДНК, перевареної PstI, дали 13 клонів, позитивних на галактозидазу з 2500 проскринованих трансформантів, тоді як після переварювання ВаmНІ одержано 7 позитивних клонів (1500 проскринованих трансформантів), обробка EcoRI дала 3 позитивних клони (1300 проскринованих трансформантів), КрnІ - 7 позитивних клонів (2000 проскринованих трансформантів), Smal - 3 позитивних клони (1600 проскринованих трансформантів) і Hindill - 2 позитивних клони (1200 проскринованих трансформантів). Переварювання позитивних клонів Для ідентифікації різних генів галактозидази плазміди, виділені з позитивних клонів, піддавали переварюванню відповідно до наведеної нижче таблиці. 11 95944 12 Таблиця 1-е переварювання 2-е переварювання 3-є переварювання 4-е переварювання 5-е переварювання 6-е переварювання 7-е переварювання 8-е переварювання 9-е переварювання Зразки рВ1, рВ2, рВ3, рВ4, рВ5, рВ6, рВ7 рР1, рР2, рР3, рР4, рР5, рР6, рР7, рР8, рР9, рР10, рР11 рР12, рР13, рР14 рЕ1, рЕ2, рЕ3 рР1, рР12, рВ1, рР2, рЕ1, рЕ2, рЕ3......... pS1, pS2, pS3 рР1, рР12, рВ1, рР2, pSl, pS2, pS3 Рk1, pK2, рk3, рK4, рK5, рK6, рK7 Рр1, рР12, рВ1, рР2, Рk1, рK2, рK3, рK4, рK5, рK6, рK7 Перша буква (p) позначає плазміду і вставний ген, а друга буква (Р, В, Е, S, K) позначає фермент рестрикції, який використовували для виділення відповідного клону з геномної ДНК. Гель-електрофоретичний аналіз фрагментів, утворених після переварювання, показав, що кожна плазміда Рв1, рР1, рР2 і рР11 має вставку, що кодує іншу β-галактозидазу. Для подальшого аналізу використовували клони, що містять рВ1. Секвенування ДНК ДНК секвенували, застосовуючи дидезоксинуклеотидну термінацію за Сенгером, використовуючи набір для циклічного секвенування BigDye Terminator v.3.0 (Applied Biosystems, USA), і аналізували за допомогою флуоресцентної системи аналізу ДНК ABI Prism 3100, що включає капілярний електрофорез. 5'- і 3'-кінці вставлених фрагментів ДНК секвенували з праймерами, специфічними для векторів. Для подальшого секвенування вставок використовували Genome Priming System (GPS-I) (New England Biolabs, UK). GPS-I є системою, що діє in vitro, яка базується на транспозоні TN7 і використовує транспозазу TnsABC для того, щоб випадковим чином вставляти транспозон у ДНКмішень. Відповідно до інструкції виробника, використовували співвідношення мас донор:ДНКмішень, що дорівнює 1:4. Кількість плазмід, виділених для секвенування після вставок транспраймера у плазміду-мішень, складало 25. Ця кількість була розрахована відповідно до інструкцій виробника і припускала 5-кратну глибину покриття. Для плазміди рВ1 вставка транспозону, який приблизно дорівнює 1699 тпо, у позиції біля 973-ї пари основ нижче множинно клонованого сайта використаного вектора, цілком елімінувала активність -галактозидази, тим самим демонструючи, що стартовий кодон знаходився між вектором MCS (multiple cloning site) і сайтом транспозону, тоді як введення вставки у позиції 841 нижче MCS вело до утворення активної галактозидази, тим самим вказуючи, що стартовий кодон існує між парами основ у позиціях 841 і 973 нижче MCS. Ферментативна активність повністю усувалася введенням вставки у позиції 3586 пар основ нижче MCS, тим самим вказуючи, що термінуючий кодон знаходиться нижче цієї позиції. Більш того, вставки у позиціях 1239 по, 1549 по, 1683 по, 1832 по, 2108 по, 2189 по, 2270 Ферменти ВаmНІ PstI PstI EcoRI PstI i EcoRI Smal PstI і Smal Kpnl PstI і Kpnl по, 2340 по, 2414 по, 2574 по, 2648 по, 2734 по, 2807 по і 3410 по повністю усували ферментативну активність. Реакційна суміш секвенування містила приблизно 400-600 нг плазмідної ДНК, 3,2 пмоль розчину праймера і 4 мкл розчину BigDye Terminator. Ідентифікація відкритої рамки зчитування Відкрита рамка зчитування (ВРЗ) була виявлена з використанням ВРЗ-шукача від NCBI Довжина рамки, визначена з використанням бактеріального генетичного коду, складала 100 пар основ. Нуклеотидна послідовність була трансльована у шість можливих рамок, що дозволило ідентифікувати відкриту рамку зчитування 1052 амінокислот, що кодує передбачувану галактозидазу (ця трансляція показана на Фігурі 2). Приклад 2 Синтез за допомогою клонованого ферменту -галактозидази, виділеної з Bifidobacterium bifidum NCIMB 41171 в Ε. coli як хазяїна (штам РН5а) Синтез, описаний нижче, проводили, якщо не зазначено інакше, з цілими клітинами Е. coli DH5a як хазяїна після обробки біомаси Е. coli (зібраної центрифугуванням при 10000 g) толуолом у концентрації 2000 чнм, для збільшення проникності клітини, щоб зробити її нежиттєздатною, зруйнувавши її цитоплазматичну мембрану. Біомасу Е. coli готували, як описано у п. «Штами Е. coli» Прикладу 1. Синтез за допомогою клонованого ферменту Синтез з -галактозидазою проводили при початковій концентрації лактози, яка дорівнює 40 мас. %, прийнятій як концентрація субстрату. Розчин для цього синтезу готували в 0,1 Μ фосфатному буфері при pH 6,8 (або 0,1 Μ цитратному буфері pH 6,2 або калій-фосфатному буфері pH 6,8). Синтез проводили при 40°С на водяній бані при струшуванні при 150 об./хв. Оптимум pH для цього специфічного ферменту вибрали, базуючись на вимірюваннях активності (з використанням о-нітрофеніл--D-галактопіранозиду як субстрату) препарату специфічного ферменту при різних значеннях pH. Для синтезу галактоолігосахариду 5 мл суспензії клітин Е. coli DH5a (з активністю 2,2 од./мл) центрифугували (при 10000 g) для збирання біомаси, відкинувши супернатант. Щоб 13 провести синтез, цю біомасу ресуспендували з 10 г 40% за масою розчину субстрату. Концентрації різних цукрів, які є присутніми у суміші при синтезі, показані на фігурі 3. На Фігурі 4 показані хроматограми, одержані при високоефективній аніонообмінній хроматографії, поєдна 95944 14 ній з пульсуючим амперометричним детектуванням (HPAEC-PAD), для сумішей галактоолігосахаридів, синтезованих клонованою галактозидазою з В. bifidum NCIMB 41171. Концентрації цукрів у цій суміші галактоолігосахаридів в оптимальний час синтезу показані у Таблиці 1. Таблиця 1 Вуглеводний склад синтезу галактоолігосахаридів при початковій концентрації лактози, яка дорівнює 40% за масою, у момент часу, коли спостерігалася максимальна концентрація олігосахаридів Початкова концентрація субстрату при синтезі % за масою 40 GOS DP>3 GOS DP=2 Lac Glc Gal Концентрація (% від загальних цукрів) 20,45 27,64 12,73 25,90 13,28 Позначення: Lac - лактоза, Glc -глюкоза, Gal - галактоза, DP - ступінь полімеризації (degree of polymerisation). 15 95944 16 17 95944 18 19 95944 20 21 95944 22 23 95944 24 25 95944 26 27 95944 28 29 95944 30 31 95944 32 33 95944 34 35 95944 36 37 Комп’ютерна верстка Литвиненко Л. 95944 Підписне 38 Тираж 23 прим. Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601