Спосіб одержання амідів з використанням мікроорганізмів роду amycolatopsis, фермент, який має нітрилгідратазну активність і який одержують з мікроорганізмів роду amycolatopsis, штам мікроорганізму роду amycolatopsis (варіанти)

1. Спосіб одержання амідів, який відрізняється тим, що нітрил, який застосовують як субстрат, перетворюють на відповідний амід з використанням мікроорганізмів роду Amycolatopsis, а також їх функціонально еквівалентних мутантів, які мають здатність перетворювати нітрил на амід, або з використанням ферменту, який має нітрилгідратазну активність, який одержують з цих мікроорганізмів. 2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що як нітрил застосовують необов'язково заміщений аліфатичний нітрил, який містить від 1 до 10 атомів вуглецю. 3. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що як нітрил застосовують необов'язково заміщений 2 3 74768 4 Rhodococcus, а також нового способу одержання перетворювати використовувані як субстрат нітриамідів з використанням цих мікроорганізмів, відполи на відповідні аміди. Бажано, щоб ці мікроорганівідно з використанням екстракту ферментів цих зми мали здатність рости в середовищах, які місмікроорганізмів. тять нітрили або аміди як єдині джерела вуглецю Для одержання амідів, таких, як, наприклад, і/або азоту. амід нікотинової кислоти, який є важливим для Мікроорганізми за винаходом одержують шлятварин і людей вітаміном комплексу вітамінів В, хом відповідного відбору, наприклад, із зразків уже відомі численні біотехнологічні способи. Шиґрунту, мулу або стічних вод за допомогою звироко відомо, що мікроорганізми, які містять нітрилчайних мікробіологічних методів. Доцільно здійсгідратазу, перетворюють нітрили на відповідні амінювати відбір мікроорганізмів шляхом вирощуванди. Так, [в ЕР-А 0188316] описано спосіб ня в середовищі, яке в бажаному варіанті містить одержання аміду нікотинової кислоти з 3нітрили або аміди як єдині джерела вуглецю й азоціанпіридину з використанням мікроорганізмів роту, в присутності іонів кобальту. Придатні для здійдів Rhodococcus, Arthrobacter або мікобактерій. снення відбору нітрили й аміди являють собою Вадою цього способу є те, що дані мікроорганасамперед нітрили, які також застосовують як нізми мають лише незначну активність щодо пересубстрат для наступної біотрансформації, і відпотворення 3-ціанпіридину на аміднікотинову кисвідні одержувані з них аміди. Придатні для росту лоту. середовища також відомі спеціалістові в даній [В EP-Α 0307926] описано перетворення 3галузі; наприклад, може використовуватися сереціанпіридину на амід нікотинову кислоту за доподовище, подане в таблиці 1. могою мікроорганізмів виду Rhodococcus Як правило, мікроорганізми до здійснення rhodochrous J1. Для того щоб ці мікроорганізми власне біотрансформації культивують (вирощукаталізували потрібне перетворення, їх слід індують) у тих самих умовах, застосовуючи при цьому кувати. вищезазначені середовища. Ще однією вадою цього способу є те, що Як відомо спеціалістам, нітрилгідратаза утвоRhodococcus rhodochrous J1 має червоне забарвриться тільки тоді, коли середовище для росту лення і внаслідок цього відбувається фарбування містить іони кобальту як кофактор. Придатними продукту. Крім того, цей мікроорганізм має лише "кобальтовими сполуками, що утворюють іони конезначну теплостійкість і інгібується, наприклад, бальту", є солі, які містять Со2+ або Со3+. Прикласубстратом 3-ціанпіримідином. дами солей, які містять Со2+ або Со3+, є хлорид Ще один спосіб одержання аміду нікотинової кобальту, сульфат кобальту й ацетат кобальту. кислоти з 3-ціанпіридину за допомогою мікрооргаУ функції кобальтової сполуки доцільно засто2+ нізмів виду Rhodococcus rhodochrous J1 описано [в совувати сіль, яка містить Co , таку, як, наприЕР-А 0362829]. Щоб підвищити питому активність клад, СоСІ2. Вирощування можна також здійснюмікроорганізмів, які містять нітрилгідратазу, у севати в присутності вітаміну В12 разом із металевим редовище для культивування у функції індуктора кобальтом або іншими кобальтовими сполуками, додають сечовину або похідне сечовини. При виякі in situ дають іони кобальту. Доцільно застосокористанні цього способу, так само як і способу, вувати кобальтову сполуку в кількості від 1 до описаного вище, відбувається фарбування про10мг/л, бажано від 1 до 3мг/л. дукту. Як правило, вирощування здійснюють при теДалі [в WO 95/17505] описано спосіб одержанмпературі від 20 до 50°С і при значенні pH у діапаня ароматичних амідів з відповідних нітрилів за зоні від 5 до 8, бажано при температурі від 30 до допомогою мікроорганізмів виду Rhodococcus 45°С і значенні pH у діапазоні від 5,5 до 7,5. rhodochrous M33 Вадою цього способу є червоне Власне біотрансформацію можна здійснювати забарвлення Rhodococcus rhodochrous M33, а таза допомогою мікроорганізмів родів Actinomadura, кож високе значення Км для субстрату 3Amycolatopsis, з використанням екстракту фермеціанпіридину. нтів цих мікроорганізмів або з використанням очиЗавдання даного винаходу - усунути згадані щеної нітрилгідратази з цих мікроорганізмів. Доцівади і розробити такий спосіб одержання амідів, льно здійснювати біотрансформацію з який забезпечував би одержання відповідних амівикористанням мікроорганізмів виду Actinomadura дів з високим виходом і високим ступенем чистоти. spadix, наприклад, ізолятів Actinomadura spadix Зазначене завдання вирішується за допомоE3733, Actinomadura spadix E3736, Actinomadura гою нових мікроорганізмів за п.п.1 і 3, а також за spadix 45A32, Actinomadura spadix 4501 або допомогою способу за п.6. Actinomadura spadix C15. Бажано біотрансформаСуть способу за винаходом полягає в тому, що цію здійснювати з використанням мікроорганізмів, використовуваний як субстрат нітрил перетворюякі належать до видів Amycolatopsis NE31 і ють на відповідний амід за допомогою мікроорганіAmycolatopsis NA40, або ix функціонально еквівазмів роду Actinomadura, Amycolatopsis або лентних варіантів і мутантів. Особливо бажано Rhodococcus, за допомогою екстракту ферментів застосовувати мікроорганізми, які належать до цих мікроорганізмів або за допомогою очищеної виду Amycolatopsis NA40. Мікроорганізми зазначенітрилгідратази з мікроорганізмів роду них видів, згідно з Будапештським договором, буAmycolatopsis або Actinomadura. ло депоновано 03.06.1997р. у Німецькій колекції Застосовувані для біотрансформації нітрили, мікроорганізмів і клітинних культур [Deutsche такі, як, наприклад, 3-ціанпіридин, являють собою Sammlung von Mikroorganismen und Zeilkulturen сполуки, наявні у продажу. Gmb, Mascheroderweg Ib, D-38124, Брауншвейг, Мікроорганізми за винаходом мають здатність Німеччина] під назвами Amycolatopsis ΝE31 і 5 74768 6 9/6 Amycolatopsis NA40, вони дістали реєстраційні 9/8 номери DSMZ 11616 і відповідно DSMZ 11617. Гомологія 16S-рДНК 96,9% Обидва ці мікроорганізми було точніше ідентифіФосфоліпіди, такі як ФЕ, ОН-ФЕ, лізо-ФЕ, не досліджуковано і зараховано до ще не описаних в літерамет-ФЕ, ФХ, ФГА, ФИ, ФИМ, ФГ, ДФГ, ГЛ вали турі видів роду Amycolatopsis. Жирні кислоти Таким чином, винахід також стосується мікроізо-16 +++ організмів роду Amycolatopsis або Actinomadura, ізо-15 + які мають здатність перетворювати амід на нітрил, ізо-17 (+) антеізо-15 (+) насамперед мікроорганізмів, які мають назву антеізо-17 (+) Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) і Amycolatopsis 10-Ме-16 NE31 (DSMZ 11616). 10-Ме-17 + При створенні винаходу далі було встановле2-ОН-15 + но, що деякі мікроорганізми роду Rhodococcus 2-ОН-16 + мають кращі характеристики щодо перетворення Тип 3f нітрилів на аміди в порівнянні з Rhodococcus МК rhodochrous J1, [описаним в ЕР-А 0362829]. Цими Ідентифікація Amvcolatopsis NE31 мікроорганізмами є Rhodococcus GF674, Колір повітряного міцелію білий Колір субстратного міцелію жовтогарячий Rhodococcus GF578, Rhodococcus GF473, Колір пігменту, який дифундував Rhodococcus GF270 (DSMZ 12211) і Rhodococcus Спектр цукрів GF376 (DSMZ 12175) або їх функціонально еквіваАРА + лентні варіанти і мутанти. Згідно з Будапештським ГАЛ + договором, в Німецьку колекцію мікроорганізмів і МАД клітинних культур 15.05.1998р. було поміщено мікКСИ роорганізм, який має реєстраційний номер DSMZ ГЛЮ сліди 12175, а 08.06.1998р. було поміщено мікрооргаРИБ + Тип А нізм, який має реєстраційний номер DSMZ 12211. ДАП DL Штами Rhodococcus GF270, GF376, GF473, Менахінон (у %) GF578 і GF674 після ідентифікації зараховано до 8/4 ще не описаних в науковій літературі видів роду 9/0 Rhodococcus. Таким чином, винахід також стосу9/2 + ється мікроорганізмів Rhodococcus GF270, 9/4 +++ Rhodococcus GF376, Rhodococcus GF473, 9/6 Rhodococcus GF578 і Rhodococcus GF674. 9/8 Гомологія 16S-рДНК 96,1% На відміну від мікроорганізмів роду Фосфоліпіди, такі, як ФЕ, ОН-ФЕ, лізо-ФЕ, не досліджуActinomadura, відповідно Amycolatopsis мікрооргамет-ФЕ, ФХ, ФГА, ФИ, ФИМ, ФГ, ДФГ, ГЛ вали нізми роду Rhodococcus доцільно індукувати пеЖирні кислоти ред їхнім використанням для власне біосинтезу. ізо-16 +++ Як індуктори придатні [описані в ЕР-А 0307926] ізо-15 + індуктори, такі, як, наприклад, ацетамід, амід масізо-17 (+) ляної кислоти, метакриламід, амід пропіонової антеізо-15 (+) кислоти, кротонамід і амід валеріанової кислоти. антеізо-17 (+) 10-Ме-1б Під "функціонально еквівалентними варіантаЮ-Ме-17 + ми і мутантами" розуміють мікроорганізми, які по2-ОН-15 + ходять із вищевказаних організмів-попередників і 2-ОН-16 + володіють в основному такими ж властивостями і Тип 3f функціями, що й останні. Такі варіанти і мутанти МК можуть виникати випадково, наприклад, у резульСкорочення і пояснення, які використовувалитаті опромінення ультрафіолетовим світлом, або ся при ідентифікації під дією хімічних речовин, які викликають мутації. (+) 1-5% Ідентифікація Amvcolatopsis NA40 + 5-15% Колір повітряного міцелію Колір субстратного міцелію Колір пігменту, який дифундував Спектр цукрів АРА ГАЛ МАД КСИ ГЛЮ РИБ Тип ДАП Менахінон (у %) 8/4 9/0 9/2 9/4 білий жовтогарячий ++ сліди + А DL + +++ ++ +++ ДАЛ АРА ГАЛ МАД КСИ ГЛЮ РИБ 15-30% >30% діамінопімедінова кислота арабіноза галактоза мадуроза ксилоза глюкоза рибоза Типи цукрів дані згідно з Lechevalier й ін., 1971 Типи жирних кислот дані згідно з Kroppenstedt, 1985 і 1992 9/4 МК-9 (Н4) 9/6 МК-9 (H6) 9/8 МК-9 (H8) МК міколові кислоти ФЕ фосфатидилетаноламін 7 74768 8 (98,4%). На основі хемотаксичних і молекулярнобіологічних даних можна зробити висновок про те, що GF270 і GF376, з одного боку, і GF473, GF578 і GF674, з іншого боку, являють собою штами двох нових видів Rhodococcus. За своїми послідовностями 168-рДНК штами GF270 і GF376 є спорідненими з Rhodococcus rhodochrous (99,1%), а штами GF473, GF578 і GF674 мають лише віддалену роізогексадеканові кислоти або 14динну подібність із Rhodococcus coprophilus метилпентадеканові кислоти (98,4%). 10-Ме-18 туберкулостеаринова кислота Екстракт ферментів можна отримати шляхом 2-ОН-16 2-гідроксипальмітинова кислота добре відомого фахівцям руйнування мікроорганіІдентифікація штамів GF270, GF376, GF473, змів, наприклад, за допомогою ультразвуку, за GF578 і GF674 допомогою преса типу Френч або з використанням Ідентифікацію цих штамів проводили на основі лізозиму. Очевидно, що для здійснення способу 5 незалежних один від одного характеристик цей екстракт ферментів, так само як і цілі клітини 1. Морфологія і колір колоній: Короткі розгалумікроорганізмів, можна імобілізувати на придатножені гіфи, що розпадаються на елементи, які нагаму носії, який являє собою полімер, або абсорбудують палички і спори. Колонії штамів GF270 і вати на придатному носії. GF376 мають рожево-червоний колір (RAL 3022), а Ферменти за винаходом, які мають нітрилгідколонії штамів GF578 і GF674 мають яскраворатазну активність, можна отримати із мікроорганічервоний колір (RAL 3012). змів роду Amycolatopsis, насамперед із штаму 2. Діамінокислоти пептидогліканів: МезодіаміAmycolatopsis NA40 (DSMZ 11617), і вони мають нопімелінова кислота. здатність перетворювати нітрил в амід. 3. Міколові кислоти: міколові кислоти Основними властивостями цих ферментів є Rhodococcus: Визначення міколової кислоти з довтакі: гим ланцюгом здійснювали за допомогою високоа) pH-оптимум становить 6,5±1,0; температурної газової хроматографії. Профілі б) температурний оптимум при pH7,0 має межі елюювання міколових кислот штамів GF270 і 35-40°С; GF376, а також штамів GF473, GF578 і GF674 був) значення KM для субстрату 3-ціанпіридину ли ідентичними. Ланцюги міколових кислот штамів становить 41,7±7,7м (20°С, 45мМ фосфатний буGF270 і GF376 містили 38-46 атомів вуглецю, а фер, pH7,0), ланцюги міколових кислот штамів GF473, GF578 і насамперед ферменти мають GF674 містили 40-48 атомів вуглецю. Характерисг) молекулярну масу 105кДа, що можна визнатики міколових кислот порівнювали із характерисчити, наприклад, за допомогою електрофорезу в тиками міколових кислот штамів Rhodococcus. ДСН-ПААГ. Штам GF270 було ідентифіковано з дуже низьким Як субстрат для біотрансформації можуть закоефіцієнтом кореляції (0,086) як належний до стосовуватися в принципі будь-які нітрили. Доцівиду Rhodococcus rhodochrous; GF376 не можна льно застосовувати або аліфатичні нітрили, які було ідентифікувати цим методом. Інші три ізоляти містять від 1 до 10 атомів вуглецю, у разі потреби GF473, GF578 і GF674 було ідентифіковано з дуже заміщені, наприклад, гідроксигрупою, аміногрупою, низьким коефіцієнтом кореляції як належні до виду галогеном або карбоксигрупою, або заміщені чи Rhodococcus ruber. незаміщені ароматичні нітрили, які містять від 4 до 4. Спектр жирних кислот: Нерозгалужені наси10 атомів вуглецю в ароматичній кільцевій системі. чені і ненасичені жирні кислоти, включаючи туберЯк аліфатичні нітрили, які містять від 1 до 10 атокулостеаринову кислоту. Спектр жирних кислот є мів вуглецю, можуть застосовуватися динітрили, діагностичною ознакою для представників усіх гідроксинітрили, амінонітрили, такі, як, наприклад, родів Rhodococcus і споріднених родів н-октаннітрил, ціаноцтова кислота, ізокапронітрил, Micobacterium, Nocardia, Dietzia, Tsukamurella і н-валеронітрил, адипонітрил, глутаронітрил, сукдеяких видів коринебактерій. Ідентифікацію на цинонітрил, себаконітрил, пропіонітрил, кротонітвидовому рівні здійснювали на основі кількісних і рил, акрилнітрил, метакрилнітрил, нітрил някісних розходжень характеристик жирних кислот масляної кислоти або азеланітрил. Як ароматичні штамів GF270, GF376, GF473, GF578 і GF674 і нітрили, які містять від 4 до 10 атомів вуглецю, жирних кислот видів Rhodococcus. можуть застосовуватися нітрили загальних фор5. Часткові послідовності 168-рДНК штамів мул GF270 і GF376 були ідентичними (100%), хоча порівняння їх з послідовностями штамів Rhodococcus виявило подібність тільки на 99,1% із або найбільш спорідненим видом Rhodococcus rhodochrous. (I) (II) Штами GF473 і GF578 мали ідентичні послідоде R1 і R2 позначають атом водню, атом галовності 168-рДНК (100%). Штам GF674 мав відмінгену або С1-С4алкіл. Атом галогену може являти ність від штаму GF578 тільки в одній парі основ із собою F, СІ, Вr або J. 500 (99,8%). Усі три ізоляти мали лише віддалену С1-С4алкіл може являти собою метил, етил, родинну подібність із Rhodococcus coprophilus пропіл, ізопропіл, трет-пропіл, бутил, ізобутил або ОН-ФЕ мет-ФЕ ФХ ФГА ФІ ФІМ ФГ ДФГ ГЛ Жирні кислоти ізо-16 гідрокси-ФЕ фосфатидилметилетаноламін фосфатидилхолін фосфатидилглюкозамін фосфатидилінозитол фосфатидилінозитолманозид фосфатидилгліцерин дифосфатидилгліцерин гліколіпід 9 74768 10 трет-бутил. Придатними представниками аромаActinomadura spadix С15 як джерело вуглецю й тичних нітрилів загальної формули І або ll є 2-, 3азоту використовували ціаноцтову кислоту. або 4-ціанпіридин, бензонітрил, фтор-, хлор-, броб) Штам Amycolatopsis NA40 культивували в мбензонітрил, наприклад, орто-, мета-, парасередовищі, склад якого подано в таблиці 3. Кульхлорбензонітрил або 2-хлор-3-ціанпіридин. Бажативування здійснювали в субкультурах (у пробірно як ароматичний нітрил, який містить від 4 до 10 ках об'ємом 4мл) і в "основній культурі" (у колбах атомів вуглецю, застосовувати 3-ціанпіридин. об'ємом 500мл) в аеробних умовах при темпераБіотрансформацію із застосуванням одноратурі 37°С протягом 2, відповідно 3-4 днів. Ріст клізового або безперервного завантаження субстрату тин вимірювали турбідиметричним методом при доцільно проводити таким чином, щоб концентрадовжині хвилі 610нм і суху масу клітин обраховуція субстрату не перевищувала 40мас.%, бажано вали в такий спосіб маса сухих клітин (у мг/мл) 30мас.%. =ОГ610 нм 0,277. Спосіб доцільно здійснювати з використанням Таблиця 1 клітин-споживачів (які не ростуть). Як середовища для біотрансформації придатні Збагачувальне середовище звичайні в даній галузі техніки середовища, такі, як, наприклад, низькомолярний фосфатний буфер, нітрил 2,0г буфер HEPES (N-2-гідроксіетилпіперазин-N'-2KН2РО4 7,0г етансульфонова кислота), цитратний буфер, бо0,1г MgSO4 7H2O ратний буфер, середовища, склад яких поданий у суміш вітамінів 1,0мл таблицях 1-3, або їхні модифіковані форми, такі як, 2,0мг СoСІ2 6Н2О наприклад, середовище, описане в прикладі 8(1), 2,0мг FeSO4 7H2O або буфер трис-НСІ. додати воду до 1л (pH6,7-7,3) Біотрансформацію доцільно проводити при температурі від 0 до 50°С і при значенні pH у діаТаблиця 2 пазоні від 4,5 до 10, бажано при температурі від 20 Основне середовище до 40°С і при значенні pH у діапазоні від 4,5 до 10,0. мальтоза 2,0г В оптимальному варіанті здійснення біотранNaNO3 1,0г сформацію можна проводити в присутності С1K2НРО4 0,1г С4спиртів. Як С1-С4cпирти можуть застосовуватися 0,05г MgSO4 7H2O метанол, етанол, пропанол або бутанол. Бажано додати воду до 100мл (pH7,0) застосовувати метанол. На закінчення перетворення відповідні аміди Таблиця 3 можна виділити за допомогою звичайних методів перероблення, наприклад, за допомогою кристаліОптимізоване середовище зації. D-глюкоза 4,5г Приклади м’ясний екстракт 0,5г Приклад 1 K2НРО4 0,1г Культивування мікроорганізмів родів 0,05г MgSO4 7H2O Actinomadura і Amycolatopsis 1,0мг СoСІ2 6Н2О а) У різні зразки ґрунту, поміщені в збагачувадодати воду до 100мл (г 7,0) льне середовище, склад якого наведено у таблиці 1, вносили різноманітні нітрили або аміди як джеПриклад 2 рела вуглецю й азоту й інкубували протягом 7-10 Біотрансформація з використанням мікрооргаднів при 37°С або 45°С Після цього культури перенізмів родів Actinomadura і Amycolatopsis сівали в таке ж середовище і ще раз культивували (1) Для визначення нітрилгідратазної активнопротягом 7-10 днів при 37°С. Весь процес повтості реакційну суміш (2мл), яка містить 3рювали тричі. Після цього культури розріджували і ціанпіридин (1,0М, 1,0мл), калій-фосфатний буфер висівали на планшети для одержання окремих (pH7,0, 0,1М, 0,5мл) і 0,5мл суспензії клітин, інкуколоній. Планшети інкубували протягом 5 днів при бували при перемішуванні при 20°С протягом 37°С. Після цього різноманітні колонії піддавали 30хв. Реакцію припиняли шляхом додавання 0,2мл тестуванню на необхідну активність. 3н. НСl. Після короткочасного центрифугування Таким шляхом виділяли штами Amycolatopsis визначали вміст утвореного нікотинаміду за допоNA40 (DSMZ 11617) і Amycolatopsis NE31 (DSMZ могою ЖХВР (система типу Shimadzu SPD 6A з 11616) і потім вирощували їх в оптимізованому С18-колонкою (Develosil ODS-HG-5, 4,6 250см); середовищі (таблиця 3) при струшуванні протягом розчинник: 10мМ KН2РО4/Н3РО4 90-100год. при 37°С. (pH2,8)/ацетонітрил (в об'ємному співвідношенні Для Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616), 9:1); швидкість потоку: 1мл/хв; абсорбцію вимірюActinomadura spadix E3733 і Actinomadura spadix вали при 230нм). Питому активність виражали у E3736 як джерело вуглецю й азоту використовувигляді кількості (у мкмолях) утвореного нікотинавали адипонітрил, для Amycolatopsis NA40 (DSMZ міду/мл/хв./ОГ610 нм. 11617) і Actinomadura spadix 45A32 як джерело Швидкості перетворення аліфатичних нітрилів вуглецю й азоту використовували азеланітрил, у збагачувальному середовищі (таблиця 1) з викодля Actinomadura spadix 4501 як джерело вуглецю ристанням виділених бактерій подано в таблиці 5, й азоту використовували н-октанітрил, а для 11 74768 12 вплив індукторів і кофакторів, внесених в основне Таблиця 4 середовище (таблиця 2), подано в таблиці 4, а порівняння активності Amycolatopsis і Rhodococcus Вплив індукторів і кофакторів на питому активність в в основному середовищі (таблиця 2) подано в основному середовищі таблиці 6. Дані з таблиці 4 свідчать про те, що нітрилгідратаза з Amycolatopsis NA40 експресується Загальна акПитома активРіст конститутивним чином, проте для виявлення актиІндуктор тивність ність (мкмо(ОГ610нм) вності у функції кофактора потрібен кобальт. (мкмолі/мл/хв.) лі/мл/хв./ОГ) (2) Вплив температури на ріст штаму NA40 1,26 20,9 16,6 Субкультури (2мл) інкубували в середовищі, ε-капролактам 0,66 9,52 14,5 кротонамід 3,41 22,9 6,72 поданому в таблиці 3, протягом 2 днів при 37°С, метакриламід 3,33 2,46 0,74 потім їх пересівали в 20мл середовища, поданого бутирамід 2,19 0,19 0,88 в таблиці 3, яке міститься в струшувальних колпропіонамід 1,91 0,92 0,48 бах. Культивування проводили при 37, 40, 45, 50 і сечовина 1,72 2,97 1,73 55°С протягом 3-4 днів при струшуванні. ВимірюЗагальна акПитома активвали ріст клітин і оцінювали нітрилгідратазну актиРіст Кофактор тивність ність (мкмовність при 20°С. У таблиці 7 подано дані про вплив (ОГ610нм) (мкмолі/мл/хв.) лі/мл/хв./ОГ) температури на нітрилгідратазну активність і ріст 7,97 0,10 0,01 клітин. 8,32 3,36 0,40 FeSO 7H O 4 2 СоСІ2 6Н2О 8,41 47,8 5,68 Таблиця 5 Швидкості перетворення аліфатичних нітрилів при використанні виділених бактерій Штам Субстрат Amycolatopsis NE31 (DSMZ 11616) Actinomadura spadix E3733 Actinomadura spadix E3736 Actinomadura spadix 45A32 Actinomadura spadix 4501 Actinomadura spadix С 15 Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) Ріст (ОГ610нм) адипонітрил адипонітрил адипонітрил азеланітрил н-октаннітрил ціаноцтова кислота азеланітрил 2,68 1,62 1,36 5,81 7,24 2,04 5,92 Загальна активність (мкмолі/мл/хв.) 0,377 0,347 3,00 18,8 32,2 7,01 33,0 Питома активність (мкмолі/мл/хв./ОГ) 0,141 0,214 2,21 3,23 4,45 3,43 5,57 Таблиця 6 Порівняння активностей Amycolatopsis і Rhodococcus rhodochrous J1 Активність щодо 3-ціанпіридину Активність щодо 3-ціанпіридину Мікроорганізм Amycolatopsis NA40 (DSMZ 11617) (мкмолі/мл/хв.) 303 Очищений фермент із штаму NA40 (мкмолі/хв./мг протеїну) 1110 (3) Для визначення активності штаму NA40 щодо інших субстратів клітини із сухою масою 0,0388мг інкубували в описаному вище буфері. Реакцію починали шляхом додавання відповідного субстрату і суміш інкубували при струшуванні протягом 10хв. при 20°С. Реакцію припиняли, додаючи 0,2мл 2н. НСl, і реакційну суміш центрифугували протягом короткого проміжку часу. Мікроорганізм Rhodococcus rhodochrous J1 314 Очищений фермент із штаму J1 (мкмолі/хв./мг протеїну) 371 Надосадову рідину аналізували за допомогою ЖХВР або газової хроматографії. У таблиці 8 наведено умови дослідів із визначення специфічності щодо субстрату, а в таблиці 9 подано дані щодо специфічності спочиваючих клітин штаму NA40 стосовно різних субстратів. Відповідні умови дослідів узагальнено в таблиці 8, а результати - у таблиці 9. Таблиця 7 Вплив температури вирощування на нітрилгідратазну активність і на ріст клітин Температура Ріст (мг/мл) 37°С 40°С 45°С 50°С 6,16 5,79 6,56 5,96 Загальна активність (мкмолі/мл/хв.) 4,69 9,89 4,83 1,16 Питома активність (мкмолі/мл/хв./мг) 0,761 1,71 0,736 0,195 Відносна активність (%) 100 225 97 26 13 74768 14 Таблиця 8 Умови дослідів для визначення специфічності щодо субстрату Субстрат 3-ціанпіридин 2-ціанпіридин 4-ціанпіридин кротонітрил бензонітрил акрилнітрил орто-хлорбензонітрил мета-хлорбензонітрил пара-хлорбензонітрил 2-хлор-3-ціанпіридин ацетонітрил пропіонітрил метакрилнітрил н-бутиронітрил Субстрат (мМ) 1,0 0,25 0,25 0,4 0,03 0,4 0,15 0,15 0,15 0,15 0,4 0,4 0,4 0,4 Метод аналізу ЖХВР ЖХВР ЖХВР ЖХВР ЖХВР ЖХВР ЖХВР ЖХВР ЖХВР ЖХВР ГХ ГХ ГХ ГХ Утворений амід нікотинамід 2-піколінамід піридин-4-карбоксамід кротонамід бензамід акриламід орто-хлорбензамід мета-хлорбензамід пара-хлорбензамід 2-хлорнікотинамід ацетамід пропіонамід метакриламід н-бутирамід Примітка: орто-, мета-, пара-хлорбензонітрил і 2-хлор-3-ціанпіридин додали в реакційну суміш у вигляді розчину в метанолі. Таблиця 9 Специфічність нітрилгідратази штаму NA40 щодо субстрату Субстрат 3-ціанпіридин 4-ціанпіридин 2-ціанпіридин бензонітрил кротонітрил акрилнітрил орто-хлорбензонітрил Відносна активність (%) 100 168 128 51 52 115 96 (4) Температурний оптимум клітин у спокої та їхня теплостійкість Реакцію проводили протягом 10хв. у стандартній реакційній суміші. Температурний оптимум був у діапазоні від 35 до 40°С (мал.5). Після цього клітини інкубували протягом 30хв. при різноманітних температурах і оцінювали активність у стандартних реакційних умовах. Як видно з мал.4, теплостійкість зберігалася приблизно до 40°С. (5) pH-оптимум і pH-стабільність клітин у спокої Для визначення цих характеристик проводили реакцію протягом 10хв. у стандартній реакційній суміші, в якій калій-фосфатний буфер заміняли різноманітними 0,1М буферами. Як видно з мал.6, оптимальне значення pH має діапазон від 4,5 до 10. Після інкубації клітинної суспензії протягом 30хв. при 20°С при різноманітних значеннях pH клітини центрифугували. Потім клітини промивали і ресуспендували в 0,1М калій-фосфатному буфері з pH7,0. Реакцію проводили протягом 10хв. у стандартних умовах, додаючи 3-ціанпіридину. Фермент залишався стабільним при значеннях pH у діапазоні від 4,5 до 10,0 (мал.7). (6) Накопичення нікотинаміду. одержуваного з 3-ціанпіридину з використанням штаму NA40 Реакцію проводили в реакційній суміші (30мл), яка містить 500мМ 3-ціанпіридин, 40м калійфосфатний буфер (pH7,0) і клітини у спокої (суха маса 2,3мг). У ході реакції 7 раз додали 3ціанпіридин (500м) відповідно до витрати попере Субстрат мета-хлорбензонітрил пара-хлорбензонітрил 2-хлор-3-ціанпіридин ацетонітрил пропіонітрил метакрилнітрил н-бутиронітрил Відносна активність (%) 75 16 126 105 130 194 дньої порції. Таким чином, протягом 15год. було внесено 4,0 молі 3-ціанпіридину, у результаті утворилося 3,89 молів (475г/л) нікотинаміду, який відповідає виходові 97,3%. Нікотинова кислота не утворювалася. Приклад 3 Ідентифікація мікроорганізмів роду Amycolatopsis Ідентифікація ґрунтувалася на використанні таких 5 хемотаксономічних маркерів: 1. Діагностична амінокислота пептидоглікану: мезо-діамінопімелінова кислота. 2. Діагностичні цукри: арабіноза і галактоза. 3. Міколові кислоти: міколових кислот немає. 4. Менахінон: МК-9 (Н4). 5. Спектр жирних кислот: ізо/антеізорозгалужені і 2-гідроксижирні кислоти, крім того, виявлено незначні кількості 10-метилрозгалужених жирних кислот. Такий спектр жирних кислот виявлено у всіх представників роду Amycolatopsis (спектр жирних кислот 3f). Комбінація цих хімічних ознак достатня для виявлення всіх видів роду Amycolatopsis. Характеристики жирних кислот обох культур порівнювали з інформацією, наявною в банку даних жирних кислот, з використанням аналізу основних компонентів. За допомогою цього методу виявилося можливим зарахувати як штам NE31, так і штам NA40 до роду Amycolatopsis, проте здійснити видову ідентифікацію виявилося неможливим, тому що коефіцієнт кореляції був надто 15 74768 16 9/0 (+) низьким. Проте на основі порівняння спектра жир9/2 + них кислот обох штамів було встановлено, що во9/4 +++ ни являють собою два штами, які належать до 9/6 різноманітних видів. 9/8 Цей факт було підтверджено результатами Гомологія 168-рДНК >99,5% аналізу послідовності 16S-рДНК. У цьому випадку Фосфоліпіди також було встановлено належність до роду ФЕ + Amycolatopsis, однак належність до жодного з опиОН-ФЕ + лізо-ФЕ саних видів роду Amycolatopsis не було встановмет-ФЕ лено. За допомогою цього методу шляхом прямого ФХ секвенування було визначено послідовність 16SФГА рДНК, отримана в результаті ампліфікації з викоФІ + ристанням ПЦР гена 16S-рДНК. Діагностичну часФІМ v тину послідовності 16S-рДНК порівнювали з посліФГ + довностями типових представників видів роду ДФГ + Amycolatopsis і родинних таксонів. Результати поГЛ * Тип П+ОН-ФЕ казали, що штам належить до роду Amycolatopsis. Жирні кислоти Було виявлено найбільшу подібність з ізо-16 +++ Amycolatopsis methanolica, що становить для штаізо-15 + му NA40 96,9% і для штаму NE31 96,1%. Подібізо-17 (+) ність послідовностей обох штамів між собою стаантеізо-15 + новила 99,0%. Дослідження заявників, проведені антеізо-17 (+) на представниках роду Amycolatopsis, свідчать про 10-Ме-16 (+) те, що для надійної ідентифікації видів коефіцієнт 10-Ме-17 + 2-ОН-15 + кореляції повинен бути вищим ніж 99,5%. Оскільки 2-ОН-16 + розмір 96,9% істотно менший ніж 99,5%, то можна Тип 3f припустити, що обидва ізоляти не належать до МК представників відомих видів Amycolatopsis. Приклад 4 На основі поданих результатів ізоляти не моОчищення нітрилгідратази з мікроорганізму жна зарахувати до будь-якого з відомих видів штаму NA40 Amycolatopsis. Заявники виходили з того, що NA40 Штам культивували при 37°С протягом 3 днів у і NE31 являють собою штами двох нових, дотепер середовищі, склад якого наведено у таблиці 3. не описаних видів роду Amycolatopsis. Клітини 2-літрової культури збирали центрифугуІдентифікаційні характеристики мікроорганізванням і потім ресуспендували в 0,85%-ому розмів соду Amvcolatoosis чині NaCl. Після цього клітини переносили в 0,1Μ Колір повітряного міцелію калій-фосфатний буфер (pH7,0), який містить Колір субстратного міцелію 44мМ н-масляну кислоту, і обробляли ультразвуКолір пігменту, який дифундував ком. Екстракт клітин центрифугували і відокремСпектр цукрів + АРА лювали клітинний дебрис. Цей екстракт застосоГАЛ + вували для очищення ферменту. МАД Протягом усього очищення застосовували каКСИ лій-фосфатний буфер (pH7,0), який містить 44мМ ГЛЮ v н-масляну кислоту. Як видно з таблиці 10, ферРИБ + мент після трьох стадій очищення досягав гомоТип А генного стану. ДАП DL Менахінон (у %) 8/4 Таблиця 10 Очищення нітрилгідратази зі штаму ΝΑ40 екстракт без клітин ДЕАЕ-Sephacel феніл-TOYOPEARL Загальна активність (одиниці) 73300 68000 64800 Загальний протеїн (мг) Питома активність (од./мг) 1020 71,9 110 620 61,4 1105 Збагачення 1 8,62 15,4 Примітка: 1 одиниця відповідає кількості ферменту, що каталізує утворення нікотинаміду зі швидкістю 1мкмоль/хв. при 20°С. Приклад 5 Вивчення властивостей нітрилгідратази (1) Визначення молекулярної маси, структури субодиниць і вмісту іонів кобальту За допомогою хроматографії на колонках типу G3000 SW (0,75 60см) із TSK-гелем з використан ням 0,1М калій-фосфатного буфера (pH7,0) із додаванням 0,2М KСl і 44мМ н-масляної кислоти було встановлено, що молекулярна маса дорівнює 106кДа. Було виявлено, що фермент складається з 2 різних субодиниць α і β, молекулярні маси яких відповідно дорівнюють 30000 і 26000 Да. На мал.1 показано діаграму визначення моле 17 74768 18 кулярної маси за допомогою хроматографії на колинання при 300-400нм. лонці G3000 SW із TSK-гелем. (2) Специфічність очищеного ферменту щодо На мал.2 показано діаграму визначення молесубстрату кулярної маси за допомогою електрофорезу в Визначення специфічності щодо субстрату ДСН-ПААГ. проводили аналогічно до прикладу 2(1). РезультаНа мал.3 показано спектр поглинання очищети подано в таблиці 11. ного ферменту. Було виявлено широку смугу погТаблиця 11 Специфічність очищеної нітрилгідратази щодо субстрату Субстрат 3-ціанпіридин 2-ціанпіридин 4-ціанпіридин кротонітрил бензонітрил акрилнітрил орто-хлорбензонітрил мета-хлорбензонітрил пара-хлорбензонітрил 2-хлор-З-ціанпіридин ацетонітрил пропіонітрил метакрилнітрил н-бутиронітрил (М) Загальна активність (мкмолі/мл/хв) 1,0 0,25 0,25 0,4 0,03 0,4 0,15 0,15 0,15 0,15 0,4 0,4 0,4 0,4 17,7 39.1 31,6 11,9 11,3 16,6 22,4 15,9 2,30 16,0 39,3 22,1 17,9 У реакційну суміш (2,0мл) додали 1,7 одиниці ферменту. Реакційна суміш містила відповідний субстрат в 45мМ фосфатному буфері (pH7,0). (3) Визначення значення KM Значення KM, яке визначали на основі діаграми Lineweaver-Burk, для 3-ціанпіридину становить 41,7мМ, а для акрилнітрилу 3,7мМ. Порівняння зі штамом Rhodococcus rhodochrous J1, в якого значення KM для 3-ціанпіридину становить 200мМ, показує, що даний параметр у штаму NA40 має істотно меншу величину. Це одна з основних переваг штаму NA40. (4) Теплостійкість і температурний оптимум Очищений фермент інкубували при різних температурах протягом 30хв. при pH7,0 і потім протягом 1хв. при 20°С оцінювали перетворення 3ціанпіридину на амід нікотинової кислоти. При температурі вище ніж 40°С фермент втрачав активність. Теплостійкість, як і у випадку клітин у спокої, зберігалася приблизно до 40°С, температурний Відносна активність (%) ферментативна реак- реакція з використанням ція клітин у спокої 100 100 221 128 179 168 67 52 64 51 94 115 127 96 90 75 13 16 90 126 222 105 125 130 101 194 оптимум був у діапазоні від 35 до 40°С (мал.5). (5) pH-оптимум і pH-стабільність Для визначення цих характеристик проводили реакцію перетворення 3-ціанпіридину на амід нікотинову кислоту при 20°С в реакційній суміші (2,0мл), яка містить різні буфери (42,5мМ), 1,71 одиниці очищеного ферменту і 500мМ 3ціанпіридин. pH-Оптимум становив приблизно 6,5±1,0 (мал.8). Щоб оцінити pH-стабільність, інкубували 4,2 одиниці очищеного ферменту протягом 1год. при 20°С в різних буферах (45мМ). Частина інкубованого розчину (1,71 одиниці) додали в стандартну реакційну суміш (порівн. приклад 2(1)). Оцінювали збережену активність. Фермент зберігав стабільність при значеннях pH у діапазоні від 5 до 9. Результати подано на мал.9. (6) Інгібітори Оцінювали вплив різноманітних інгібіторів. Результати узагальнено в таблиці 12. Таблиця 12 Вплив різноманітних інгібіторів на активність очищеного ферменту Інгібітор N-етилмалеїнімід йодоцтова кислота 4-хлорртутьбензойна кислота азид натрію гідроксиламін фенілгідразин семікарбазин тирон (двонатрієва сіль 4,5-дигідрокси-1,3-бензолдисульфонової кислоти) орто-фенантролін α-, α'-дипіридил 8-гідроксихінолін ЕДТК (етилендіамінтетраоцтова кислота) діетилдитіокарбамат мМ 1 1 0,1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Відносна активність (%) 100 97 39 69 59 37 8 82 110 89 100 110 115 89 19 74768 Приклад 6 Вплив метанолу на клітини ν спокої штаму ΝΑ40 Реакцію проводили протягом 10хв. при різно 20 манітних концентраціях (0-20об.%) метанолу в реакційних сумішах, склад яких наведено в таблиці 13. Як видно з таблиці 14, активність підвищується при додаванні 5-15% метанолу. Таблиця 13 Реакція з використанням клітин у спокої 1,ОМ 3-ціанпіридин 0,1М КФБ*(рН7,0) метанол суспензія клітин (0,388мг/мл) Загальний об'єм 1 1,0мл 0,9мл 0,1мл 2,0мл 2 1,0мл 0,8мл 0,1мл 0,1мл 2,0мл Методи 3 1,0мл 0,7мл 0,2мл 0,1мл 2,0мл 4 1,0мл 0,6мл 0,3мл 0,1мл 2,0мл 5 1,0мл 0,5мл 0,4мл 0,1мл 2,0мл Примітка: * КФБ позначає калій-фосфатний буфер. Таблиця 14 Вплив метанолу на активність штаму Amycolatopsis NA40 Методи 1 2 3 4 5 Метанол [об. %] 0 5 10 15 20 Приклад 7 Накопичення мікроорганізмів роду Rhodococcus Різні зразки ґрунту вносили в збагачувальне середовище, склад якого наведено в таблиці 1 і яке містило як джерело вуглецю й азоту ціаноцтову кислоту, і згідно з методом, описаним в прикладі 1, виділяли мікроорганізми Rhodococcus GF270, GF57S, GF473 і GF376. Приклад 8 Біотрансформація з використанням мікроорганізмів роду Rhodococcus (1) Теплостійкість мікроорганізмів Rhodococcus GF674. Rhodococcus GF578. Rhodococcus GF270 і Rhodococcus GF376 порівняно з Rhodococcus rhodochrous J1. Для визначення теплостійкості, перераховані вище мікроорганізми культивували в нижчеописаних середовищах. Штам Rhodococcus rhodochrous J1 культивували протягом 72год. у середовищі, описаному в ЕР-А 0307926. Мікроорганізми Rhodococcus GF674, GF578, GF270 і GF376 культивували протягом проміжку часу до 96год. при pH7,0 у таких середовищах. Штам Rhodococcus GF674 культивували в середовищі, що містить 1,0г/л екстракту дріжджів, 5,0г/л фруктози, 10,0г/л солодового екстракту, 5,0г/л ацетаміду, 2,0г/л KН2РО4, 0,5г/л MgSO4 7H2O і 10,0мг СоСl2 6Н2О. Штам Rhodococcus GF578 культивували в середовищі, що містить 1,0г/л екстракту дріжджів, 15,0г/л фруктози, 10,0г/л солодового екстракту, 25,0г/л ацетаміду, 2,0 /л KН2РО4, 0,5г/л MgSO4 7H2O і 5,0мг СоСІ2 6Н2О. Штам Rhodococcus GF270 культивували в середовищі, що містить 12,5г/л екстракту дріж Відносна активність [%] 100 123 128 130 105 джів, 5,0г/л цитрату натрію, 7,5г/л метакриламіду, 2,0г/л KН2РО4, 0,5г/л MgSO4 7H2O і 30,0мг СоСІ2 6Н2О. Штам Rhodococcus GF376 культивували в середовищі, що містить 1,0г/л екстракту дріжджів, 10,0г/л цитрату натрію, 15,0г/л солодового екстракту, 7,5г/л бутираміду, 2,0г/л KН2РО4, 0,5г/л MgSO4 7H2O і 15,0мг СоСІ2 6Н2О. Потім клітини у спокої інкубували протягом 15хв. при різноманітних температурах, після чого визначали збережену активність у стандартних реакційних умовах згідно з прикладом 2(1). При цьому було встановлено, що штам Rhodococcus GF674 при температурі 50°С має відносну активність, близьку до 100%, а при 60°С ще зберігає приблизно 10% активності. Штам Rhodococcus GF578 при температурі 50°С також має відносну активність, що становить 100%, і має відносну активність, що становить 20% при 60°С. Штам Rhodococcus GF376 має 100%-у відносну активність при температурі до 50°С, 70%-у активність при 60°С і при 70°С зберігає ще приблизно 5%-у відносну активність. Rhodococcus GF270 має майже 100%-у відносну активність при температурі до 60°С і також ще зберігає при 70°С 5%-у відносну активність. Порівняно з цим штам Rhodococcus rhodochrous J1 зберігає до 50°С 100%-у відносну активність, при 60°С має 80%-у активність і при 70°С повністю втрачає активність. Таким чином, можна стверджувати, що штами Rhodococcus GF270 і GF376 мають кращу теплостійкість порівняно зі штамом J1, при цьому штам GF270 має найвищу теплостійкість. (2) Оптимальне значення pH для штамів Rhodococcus Вплив значення pH на нітрилгідратазну активність штамів Rhodococcus GF674, GF578, GF270 і 21 74768 22 GF376 визначали аналогічно до прикладу 2(5). ціанпіридину клітини у спокої інкубували протягом Оптимальне значення pH для штаму 15хв. при 20°С при концентраціях 3-ціанпіридину в Rhodococcus GF674 становить 7,5-9,5, для GF578 діапазоні від 1 до 10% (мас/об.), після чого клітини становить 8-8,5, для GF270 становить 6-7,0 і для центрифугували. Після промивання клітин 0,85%GF376 становить 6-8. им NaCI вимірювали збережену активність. (3) Специфічність штамів Rhodococcus щодо Толерантність щодо 3-ціанпіридину як субсубстрату страт вивчали при різноманітних концентраціях Дані про специфічність щодо субстрату у висубстрату. Було встановлено, що при концентрації гляді значень відносної активності узагальнено в субстрату 2% (мас/об.) нітрилгідратазна активність таблиці 15. штаму Rhodococcus rhodochrous J1 знижується в (4) Накопичення нікотинаміду штамами 1,4 рази, нітрилгідратазна активність штаму Rhodococcus Rhodococcus GF674 знижується в 1,4 рази при Штами Rhodococcus GF674, GF578, GF270 і концентрації субстрату 4% (мас/об.), нітрилгідраGF376 культивували аналогічно до прикладу 2(6) з тазна активність штаму Rhodococcus GF578 заливикористанням як субстрат 3-ціанпіридину (прибшається практично сталою аж до концентрації лизно 500м). При цьому штам Rhodococcus GF674 субстрату 8%, нітрилгідратазна активність штаму продукував протягом 25год. 6М нікотинаміду, штам Rhodococcus GF270 знижується в 1,7 рази при GF578 продукував протягом 10год. 5,5М нікотинаконцентрації субстрату 4% (мас/об.) і нітрилгідраміду, штам GF270 продукував протягом 20год. тазна активність штаму Rhodococcus GF376 зниприблизно 8,5М нікотинаміду і штам GF376 продужується в 1,25 рази при концентрації субстрату кував протягом 20год. 7,5М нікотинаміду. 10% (мас./об.). (5) Толерантність активності штамів Штами Rhodococcus rhodochrous J1 мають Rhodococcus щодо 3-ціанпіридину найгіршу толерантність щодо 3-ціанпіридину поріДля вивчення толерантності щодо 3вняно з іншими штамами Rhodococcus. Таблиця 15 3-ціанпіридин 2-ціанпіридин 4-ціанпіридин бензонітрил 2-хлорбензонітрил 3-хлорбензонітрил 4-хлорбензонітрил ацетонітрил пропіонітрил н-бутиронітрил акрилнітрил кротонітрил метакрилнітрил Rhodococcus rhodochrous J1 100 (%) 45 70 27 2,8 43 13 608 434 352 478 78,2 86,9 Rhodococcus GF674 100 (%) 308 231 138 64,8 27,8 0 1,49 274 491 147 98,0 176 Rhodococcus GF578 100 (%) 200 167 85,1 49,0 28,9 0 347 132 368 101 124 122 Rhodococcus GF270 100 (%) 15,7 55,6 13,4 0 8,41 0 659 37,3 181 192 37,1 0 Rhodococcus GF376 100 (%) 54,3 79,8 57,2 0 8,63 0 806 245 195 257 110 0 23 74768 24 25 Комп’ютерна верстка Т. Чепелева 74768 Підписне 26 Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601