Спосіб визначення хлорорганічних пестицидів в двостулкових молюсках (чорноморських мідіях)

Реферат: Спосіб визначення хлорорганічних пестицидів в двостулкових молюсках (чорноморських мідіях) включає підготовку проби для дослідження, екстрагування хлорорганічних пестицидів з наступним випаровуванням та очищенням отриманого екстракту. Пробу для дослідження готують шляхом гомогенізації з сульфатом натрію наважки із їстівної частини молюска у кількості 15 г до крихтоподібної маси. Екстрагування хлорорганічних пестицидів проводять гексаном протягом 30 хвилин на приладі для струшування двома послідовними порціями в 3 3 кількості 100см та 50 см відповідно. Випаровування отриманого екстракту проводять на 3 ротаційному випарнику при температурі 40 °С під низьким тиском до об'єму 5 см з додаванням декану у кількості 50 мкл. Для очищення гексанового екстракту проводять хроматографію на патроні для твердофазної екстракції з багатошаровим сорбентом, для чого в пустий патрон засипають безводневий сульфат натрію висотою 2 см, силікагель висотою 5 см і шар безводневого сульфату натрію висотою 3 см, на який наносять гексановий екстракт. При необхідності додаткового очищення гексанового екстракту повторно проводять його випаровування на ротаційному випарнику при температурі 40 °С під низьким тиском, де 3 повторне випаровування гексанового екстракту здійснюють до об'єму 2 см , отриманий після додаткового очищення екстракт використовують для хроматографічного аналізу. UA 120257 U (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ ХЛОРОРГАНІЧНИХ ПЕСТИЦИДІВ В ДВОСТУЛКОВИХ МОЛЮСКАХ (ЧОРНОМОРСЬКИХ МІДІЯХ) UA 120257 U UA 120257 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарно-санітарної експертизи харчових продуктів, зокрема до лабораторних методів визначення хлорорганічних пестицидів при хімікотоксикологічних дослідженнях харчових продуктів. Може бути використана у методиках щодо визначення хлорорганічних пестицидів в двостулкових молюсках(мідіях) живих та вареноморожених, з метою виявлення шляхів потрапляння цих небезпечних забруднюючих хімічних речовин до двостулкових молюсків (мідій). Корисна модель може бути використана в лабораторіях ветеринарної медицини для проведення хіміко-токсикологічних досліджень, для встановлення вимог токсикологічної безпечності та розробки відповідних коригуючих заходів на покращення вищезазначених показників. Корисна модель належить до способу визначення хлорорганічних пестицидів в двостулкових молюсках (мідіях) методом газової хроматографії. Особливу увагу приділяють визначенню таких хлорорганічних пестицидів як: гексахлорциклогексан та його ізомери (а,{3,у ГХЦГ); ДДТ та його метаболіти (ДДД, ДДЕ), альдрин, гептахлор, внаслідок того, що ці особливо токсичні пестициди широко використовувалися в минулому, на сьогоднішній день спостерігається їх надмірне накопичення у довкіллі, що веде до потрапляння їх у продукти харчування. Аналогом способу є спосіб, зазначений у ДСТУ EN 1528-1-2002, ДСТУ EN 1528-2:1996 , ДСТУ EN 1528-3:1996, ДСТУ EN 1528-4:1996 [1-4], принцип якого полягає в тому, що після відповідної екстракції пестицидів з проби сумішшю розчинників: гексан/ацетон, очистки екстракту за допомогою хроматографічної колонки заповненої Florisil та сульфатом натрію, елююючи пестициди сумішшю розчинників: гексан/діетиловий ефір, елюати концентрують для визначення методом газової хроматографії. Недоліком зазначеного способу є використання великого об'єму реактивів, серед яких є нафтовий бензин, який відносять до легкозаймистих речовин, а собівартість реактивів практично у два рази більше, ніж гексану. Крім того, метод не призначений для визначення хлорорганічних пестицидів в двостулкових молюсках; при відборі проб для дослідження необхідно набрати наважку в кількості 100 г для риби, не вказана кількість наважки для двостулкових молюсків; колонка з сорбентом промивається нафтовим бензином; випаровування екстракту досуха перед очисткою. Прототипом до заявленого способу є спосіб для визначення хлорорганічних пестицидів та поліхлорованих біфенілів методом газорідинної хроматографії в рибі, інших водних живих ресурсах та харчовій продукції з них[5]. Суть даного способу полягає в гомогенізації досліджуваної проби натрієм сірчанокислим з подальшим екстрагуванням гексаном, та очищення на колонці з силікагелем. Хлорорганічні пестициди елююють сумішами бензол/ петролейний ефір. Елюати концентрують для визначення методом газової хроматографії. Недоліком даного способу є те, що він охоплює не всі хлорорганічні пестициди (,, ГХЦГ, п.п ДДТ, п.п ДДЕ, п.п ДДД та гептахлор); довготривалість процедури - екстракт залишають на 12 год.; екстракт з проби, випарюють досуха, внаслідок чого виникають великі втрати залишкових кількостей пестицидів, що призводить до видачі хибних даних під час аналізу; очистка екстракту сірчаною кислотою, що може призвести до пошкодження капілярної колонки хроматографа; хлорорганічні пестициди елююють петролейним ефіром, який відносять до надзвичайно вогненебезпечних реактивів з сильним подразником, його пари і повітря може утворювати вибухонебезпечні суміші, є небезпека вибуху та бензол, який токсичний, канцерогенний. Задачею корисної моделі є розробка способу визначення хлорорганічних пестицидів в двостулкових молюсках, який буде малозатратним у часі проведення процедури та виключає (мінімізує) використання небезпечних речовин (кислота сірчана), включає екстрагування пестицидів із проби, очистку екстракту, концентрування та хроматографування. Крім того, постало питання вдосконалити пробопідготовку, очистку проби, зробити методику більш ефективною та простою, використовуючи невелику кількість наважки зразку, та максимально пристосувати метод з прототипу для використання при дослідженні двостулкових молюсків. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, що включає підготовку проби для дослідження, екстрагування хлорорганічних пестицидів з наступним випаровуванням та очищенням отриманого екстракту, згідно з корисною моделлю, пробу для дослідження готують шляхом гомогенізації з сульфатом натрію наважки із їстівної частини молюска у кількості 15 г до крихтоподібної маси, екстрагування хлорорганічних пестицидів проводять гексаном протягом 30 3 3 хвилин на приладі для струшування двома послідовними порціями в кількості 100см та 50 см відповідно, а випаровування отриманого екстракту проводять на ротаційному випарнику при 3 температурі 40 С під низьким тиском до об'єму 5 см з додаванням декану у кількості 50 мкл, і для очищення гексанового екстракту проводять хроматографію на патроні для твердофазної екстракції з багатошаровим сорбентом, для чого в пустий патрон засипають безводневий 1 UA 120257 U 5 сульфат натрію висотою 2 см, силікагель висотою 5 см і шар безводневого сульфату натрію висотою 3 см, на який наносять гексановий екстракт, причому при необхідності додаткового очищення гексанового екстракту повторно проводять його випаровування на ротаційному випарнику при температурі 40 °С під низьким тиском, де повторне випаровування гексанового 3 екстракту здійснюють до об'єму 2 см , отриманий після додаткового очищення екстракт використовують для хроматографічного аналізу. Відмінності корисної моделі від прототипу узагальнені в таблиці 1. Таблиця 1 Відмінності прототипу та запропонованого способу визначення хлорорганічних пестицидів у чорноморських мідій Базова модель Запропонована модель 1. Наважку 100 г розтираємо з 200 г сульфату Наважку 15 г розтираємо з сульфатом натрію до натрію до кришкоподібної маси кришкоподібної маси (до 90 г Na2SO4) 2. Екстрагування пестицидів Екстрагуємо суміш гексан/ ацетон 3:1200 мл. Нагрівають на киплячій бані в оборотному Екстрагують пестициди гексаном протягом 30 потоці протягом 20 хв. Екстракцію хвилин на приладі для струшування двома 3 3 повторюють двічі з 150 мл суміші послідовними порціями 100 см та 50 см . гексан/ацетон. Вносимо в ділильну лійку на 1000 мл з 500 мл розчину сульфатом натрію. Екстракти очищуються в ділильній лійці та струшуються протягом 30 с. Нижню фазу відкидаємо. Після розділення фаз. Нижня, водна, відкидається. Органічна фаза ще раз промивається 500 мл розчином сульфату натрію. Об'єднані екстракти вносимо у ділильну лійку та 3. Фільтрація через паперовий фільтр з 15 г фільтруємо через паперовий фільтр з 15 г безводним сульфатом натрію безводним сульфатом натрію 4. Випаровування на ротаційному випарнику При температурі 40°С під низьким тиском до 5 3 см . При повільному обертанні і неглибокому зануренні колби для запобігання втрат При температурі 50 °С до 1 мл. Залишок пестициду. Перед випаровуванням для випаровується слабким потоком азоту зменшення втрати пестициду, рекомендується використовувати утримувач з додаванням декану 50 мкл. 5.Очищення гексанового екстракту Хроматографія на колонці з Florisil У хроматографічну трубку поміщається шар Хроматографія на патроні для твердофазної активного Florisil висотою 10 см, а також шар екстракції з багатошаровим сорбентом. В пустий сульфату натрію висотою 10 см і 40-50 мл патрон насипаємо шар безводного сульфату нафтового бензину. Під колоною натрію висотою 2 см, силікагелю висотою 5см, закріплюється Kuderna -Danish- випарник з шар безводного сульфату натрію висотою 3 см і градуйованими збірними трубками для 3 змочуємо його 25-30 см гексану. Наносимо уловлювання елюента. Екстракт додається в отриманий екстракт на підготовлену колонку. колонку і колонка елююється зі швидкістю не Елююємо патрон для твердофазної екстракції, більше 5 мл/хв. Kuderna - Danish-ємність який знаходиться в твердофазному екстракторі промивається двічі нафтовим бензином, почергово зі швидкістю не більше 5 мл/хв. об'ємом 5 мл, який додається в колонку, сумішами елюентів гексан / діетілєфір 94: 6. стінки колонки додатково промиваються 3 Елюат випаровуємо до об'єму 5 см . При незначною кількістю нафтового бензину. В необхідності додаткового очищення кінці 200 мл суміші елюента нафтовий бензин вищезазначене повторюють ще раз. / діетилефір 94: 6 елююються зі швидкістю 5 мл/хв. 10 2 UA 120257 U Продовження таблиці 1 Елюентом в Kuderna - Danish-випарнику окремо концентруються до певного обсягу. При досягненні обсягу менше 5 мл, використовується Mik.ro -Snyder - колонка з двома кульками або Mikro - Vigreux колонка. При необхідності додаткового очищення вона здійснюється на другій, знову виготовленій Florisil - колонці. 6.Випарювання очищеного екстракту Щоб мінімізувати втрати пестицидів, перед Елюент випаровують в Kuderna -Danish- випаровуванням додавати до екстракту випарнику до певного обсягу. При досягненні утримувач 50 мкл додекану. Елюат 3 обсягу менше 5 мл, використовується Mikro - випаровуємо до об'єму 2 см на ротаційному Snyder -колонка з двома кульками або Mikro - випарнику при температурі 40 °С під низьким Vigreux колонка. тиском та використовуємо для хроматографічного аналізу. 3 Сконцентрований елюат переносимо в віалки для проб об'ємом 2 см , які розміщуємо в треку автоінжектора для хроматографічного аналізу методом газової хроматографії з використанням детектора електронного захвату (ЕЗД). 5 10 15 20 25 30 Використання усіх суттєвих ознак способу, включаючи відміни, дозволяє за рахунок особливостей проведення операцій способу значно скоротити час для проведення дослідження із виключенням небезпечних речовин, таких як сірчана кислота. Окрім цього запропонований спосіб у разі використання незначної кількості наважки зразку є більш ефективним та простим при його використанні, а досягнуті при цьому результати дослідження двостулкових молюсків на вміст хлорорганічних пестицидів підтверджують їх достовірність і точність. Спосіб здійснюють наступним чином: для визначення хлорорганічних пестицидів в мідіях живих (двостулкових молюсках) проводили відбір мідій на місці їх росту та розмноження. Для розкриття раковини скальпель вводять між стулками та розрізають мускул-замикач. Зливають міжстулкову рідину, у чорноморських мідій для аналізу беруть їстівну частину молюска - всю масу укладеного в раковині тіла, відкидуючи бісус. Подрібнену наважку 15 г розтирали з сульфатом натрію (до 90 г) до кришкоподібної маси та поміщали у конічну колбу. Екстрагували пестициди гексаном протягом 30 хвилин на приладі для 3 3 струшування двома послідовними порціями у кількості 100 см та 50 см . Екстракт фільтрували через паперовий фільтр у круглодонну колбу зі шліфом. Колбу, в якій проводили екстрагування 3 та фільтрацію, промивали 5 см гексану, який об'єднуємо з екстрактом. Отриманий екстракт 3 випаровували на ротаційному випарнику при температурі 40 °С під низьким тиском до 5 см з додаванням декану 50 мкл, які далі для очистки зразка наносили в патрон для твердофазної екстракції з багатошаровим сорбентом. Підготовка патрона для твердофазної екстракції. В пустий патрон насипали шар безводного сульфату натрію 2 см, шар силікагелю висотою 5 см, шар безводного сульфату натрію висотою 3 3 см і змочували його 30 см гексану. Пройдений через колонку гексан відкидали. Наносили отриманий екстракт у підготовлений патрон. Елюювали патрон для твердофазної екстракції, який знаходиться в твердофазному екстракторі, гексаном/ефіром 94:6 зі швидкістю не більше 5 мл/хв. 3 Елюат випаровували до об'єму см та використовували для хроматографічного аналізу. Хроматографічне розділення і кількісне визначення залишків пестицидів проводилося на газовому хроматографі "Bruker SCION 456-GC" з наступним режимом роботи, який зазначений в таблиці 2. 3 UA 120257 U Таблиця 2 Режимом роботи на газовому хроматограф і Параметри приладів Температура інжектора (випарника) Колонка Температура колонки Модуль Температура детектора Газ-носій через детектор/колонку) Об'єм введення Split Програмне управління Автоінжектор 5 10 15 20 "Bruker SCION 456-GC" 260 °С Капілярна BR-C1 Pesticides FS (довжина 30 m* внутрішній діаметр 0,25 mm ID* товщина нерухомої фази 0,25 um) 80 °С -1 хв.; 20 °С/хв. до 270 °С -10 хв. ЕЗД, ТІД 320 °С Азот ос.ч. (60 мл/хв./ 1,4 мл/хв.) 1 мкл 1:20/1:50 забезпечено наявний Сконцентрований елюат переносили в віалки для проб об'ємом 2 см, які розміщували в треку автоінжектора. Об'єм введення - 1 мкл. Ідентифікація пестицидів здійснювалась за часом утримання, а кількісне визначення методом зовнішніх стандартів за площею піків. Межа кількісного визначення методу для хлорорганічних пестицидів становила 0,001 мг/кг. Для градуювання системи газового хроматографа використовували стандартні розчини пестицидів з чистотою не менше 95 % імпортного виробництва (Sigma-Aldrich, Fluka) у 3 наступних концентраціях: 0,001; 0,01, 0,02; 0,03; 0,05 мкг/см . Як розчинник для приготування стандартних зразків використовували гексан. Для підтвердження достовірності результатів випробувань, при проведенні досліджень готували пробу з добавкою. Розрахунок результатів випробувань проводили за формулою C  V  V2 X , V1  m де 3 С - концентрація по калібрувальному графіку, мкг/см ; 3 V - об'єм отриманого екстракту, см . 3 V1 - об'єм градуювального розчину, введеного у хроматограф, мкл (мм ); 3 V2 - об'єм екстракту проби, введеного у хроматограф, мкл (мм ): m - маса зразка, г. Діапазон вимірювань і границя відносної похибки визначення масової концентрації пестицидів 5,% при довірчій ймовірності Р = 0,95 у вказаних діапазонах вимірювання при застосуванні детектора по захвату електронів наведені у таблиці 3. Таблиця 3 Діапазон вимірювань і границя відносної похибки визначення масової концентрації пестицидів Допустима Границя сумарної розбіжність між відносної похибки Діапазон вимірювань масової двома при довірчій № Назва компонента частки пестицидів, мг/кг паралельними ймовірності Р=0,95, результатами, ,% ,% 1. Альфа - ГХЦГ від 0,001 до 0,5 включно 20 30 2. Бета - ГХЦГ від 0,001 до 0,5 включно 20 30 3. Гамма - ГХЦГ від 0,001 до 0,5 включно 20 30 4. Гептахлор від 0,001 до 0,5 включно 20 30 5. Альдрін від 0,001 до 0,5 включно 20 30 6. 4,4-ДДЕ від 0,001 до 0,5 включно 20 30 7. 4,4-ДДД від 0,001 до 0,5 включно 20 30 8. 4,4-ДДТ від 0,001 до 0,5 включно 20 30 4 UA 120257 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Для реалізації заявленого способу використовували наступне обладнання, лабораторний посуд, реактиви: - подрібнювач (м'ясорубка, блендер) - вакуумний ротаційний випарник "Heidolph" з круглодонною колбою місткістю 500 мл та водяною банею, з регульованою температурою 20 °С - 50 °С; - перемішуючий пристрій "Екрос ПЄ 6410м"; - ваги лабораторні "AXIS ANG 200" 2-го класу точності з межею зважування до 200 г; - газовий хроматограф "Bruker SCION 456-GC" з ЕЗД та автосамплером; - прилад для твердофазної екстракції "Supelco"; - патрони для твердофазної екстракції порожні; - лабораторний посуд: - годинникове скло 60-100 мм; 3 - колби конічні з притертими пробками об'ємом 100, 200, 500 см ; 3 - колби круглодонні об'ємом 250, 500 см ; 3 - лійки ділильні на 250 см ; - лійки лабораторні d=56-80 мм ГОСТ 8613 - 64; - ступки фарфорові з пестиком № 6 D-180; - фарфорові чашки для випаровування №3 ГОСТ 9147 - 69; 3 - циліндри мірні об'ємом 50, 100 см ГОСТ 1770 - 71; 3 - шприц "Hamilton" на 1 см ; - мікрошприц "Hamilton" на 10 мкл; 3 - віалки місткістю 2 см для зберігання зразків з гумовою мембраною, покритою тефлоном, що забезпечує герметичність, з пластмасовим ковпачком; - мірний посуд І класу точності ГОСТ 29228-91 (або мірні колби "Simax" з притертими 3 пробками об'ємом 10, 25, 50, 100 см ). Всі засоби вимірювальної техніки мають бути повірені або атестовані у встановленому порядку. Реактиви, розчини та витратні матеріали: - гексан для хроматографії / хч; - діетиловий ефір, вільний від перекису, дистильований і з 2,0 об'ємними процентами етанолу (абсолютно) стабілізований, "медичний"/фарм; - сульфат натрію, безводний, х.ч.; - силікагель марки для хроматографії з розміром частинок 60-100 меш (Sigma-Aldrich) - додекан, 99,8 %; - стандартні зразки пестицидів з чистотою не менше 95 % імпортного виробництва (SigmaAldrich, Fluka); - суміш елюентів : гексан і діетилефір , об'ємне співвідношення (V/V) 94:6; - вата знежирена. Знежирення проводиться за допомогою розчинників: в хімічну склянку поміщаємо гігроскопічну вату і заливаємо гексаном приблизно на 10 хв. Процедуру виконуємо двічі. Потім вату висушуємо і зберігаємо в закритому посуді. Корисна модель ілюструється наступними прикладами. Приклад 1. Було відібрано 5 проб мідій живих. Проводили дослідження методом прототипу та заявленим методом. Приклад 2. Було відібрано 5 проб мідій варено-морожених (виробник Китай). Приклад 3. Було відібрано 5 проб мідій варено-морожених (виробник Чилі). Проводили дослідження методом прототипу та заявленим методом. Порівняльна характеристика прототипу та запропонованого способу наведена в таблиці 4. 5 UA 120257 U Таблиця 4 Порівняльна характеристика прототипу та запропонованого способу визначення хлорорганічних пестицидів в двостулкових молюсках(мідіях) ДвостулГХЦГ (,, При№ кові ізомери) мг/кг клапромолюски Корисна ди би Прототип (мідії) модель 1 0,0183 0,00579 2 0,0100 0,00268 Приклад Живі 3 0,0139 0,00276 1 4 0,016 0,0028 5 0,006