Номер патенту: 11061

Опубліковано: 25.12.1996

Автори: Т'єррі Бюрнуф, Маріанна Бюрнуф

Завантажити PDF файл.

Текст

Способ разделения белков крови, включающий их хроматографическую очистку, о тл и ч а ю щ и й с я тем, что в качестве источника белков используют криопреципитат плазмы крови, который обрабатывают окисью алюминия, охлаждают до 14-16°С, центрифугируют, супернатант стерилизуют фильтрованием, затем обрабатывают детергентом для инактивации вирусов и наносят Изобретение относится к разделению белков в пробах плазмы крови человека и животных посредством анионо-обменной хроматографии с использованием методики, обеспечивающей высоко эффективную одностадийную очистку, особенно фактора VIII, фибриногена и фактора фон Виллебранда. Применение белков крови в терапевтических целях требует использования способов очистки, которые позволяют получать высоко очищенные продукты, не содержа на колонку со смолой, содержащей ДЭАЭгруппировки, фиксированные на винилполимерном геле, затем загружают колонку с раствором протеинов буферным раствором, содержащим 0,11 Мэ хлористого натрия, при этом фибриноген переводят в фильтрат, а другие протеины абсорбируют на колонке, затем проводят элюцию фибронектина и фактора фон Виллебранда путем увеличения концентрации хлорида натрия в буфере до 0,15 М, затем элюцию фактора VIII, увеличивая концентрацию хлорида натрия до 0,25 М, фибриноген дополнительно очищают хроматографией на гепарин-сефарозе, используя для элюции буферный раствор, содержащий 0,06 М хлористый натрий, фактор фон Виллебранда очищают хроматографией на винилполимерном геле, содержащем фиксированные ДЭАЭ-группировки, используя для элюции буфер, содержащий 0,15 М хлористый натрий, а фибронектин очищают дополнительной гельфильтрацией, при этом все используемые буферные растворы содержат 3 г/л лизина и 9 г/л глицина. щие никаких примесей, особенно других белков или таких инородных компонентов, как антитела. Так, например, при лечении гемофилии А важно иметь концентраты фактора VIII очень, высокой степени очистки. В этих случаях больные получают многократно повторные инъекции концентратов факторов VIII и, одновременно, большие количества фибриногена и иммуноглобулинов, которые могут вызывать нежелательные иммунные реакции. В связи с этим повторные инъекции С о ON о 11061 недостаточно очищенного фактора VIII можно производить только используя концентраты плазмы лишь одной группы крови , во избежание типичных при переливании крови осложнений, обусловленных различными 5 группами крови или присутствием иммуног лобулинов. Концентраты фактора VIII наиболее часто получают из плазмы человеческой крови методом криопреципитации. Степень очист- 10 ки концентратов фактора VIII, обычно получаемых в коммерческих масштабах центрами по переработке человеческой крови, часто лежит в пределах I международной единицы на мг и обычно не превышает 10-20 15 международных единиц/мг. Общепринятая технология получения использует процедуры осаждения, имеющие целью удаление, нередко очень некачественное, таких белковых примесей, как фибриноген, фибронек- 20 тин и иммуноглобулины. Для этой цели применяют преципитания при низкой температуре (10°) или ее комбинация с такими осаждающими белками агентами, как гидрофильные полимеры, например, ПЭГ (Br. J. 25 Haematol. 21, 1-2В, 1971, Jn, Methods of Plasma-Protein Fractionatron, Academic, Press 1980, 57-74), поливинилпирролидон (Br. J. Haematol., 50, 665-672, 1982), декстран, фикол, перкол, оксиэтилированный 30 крахмал или альбумин. Они были, в частности, предложены для осаждения фактора VII (Thronb, Haemostos, 51,338-342,1984). То же относится к глицину и хлористому натрию, применение которых предложено Торелл- 35 дом и Бембеком. Некоторые авторы (Thronbisis Res., 42, 625-834, 1986) получили хорошие результаты, применяя сочетание трех соединений, например, ПЭГ, глицина и хлористого натрия, что давало концентраты 40 фактора VIII со специфической активностью от 10 до 16 международных единиц мг. С целью получения фракции высокомо лекулярного материала, содержащей фактор VIII: С в комбинации с фактором фон Виллеб- 45 ранда (комплекс, частично очищенный от фибриногена), предлагалось использовать стерео-селективную хроматографию или гель-фильтрацию. Эти методики позволяют получать, хотя и с небольшим выходом, про- 50 дукт, специфическая активность которого не превышает 30 международных единиц (мг и для стабилизации которого требуется добав ление альбумина) что приводит к уменьшению специфической активности примерно 55 до 35 международных единиц/мг). При таком подходе возникают трудности , связанные с адаптацией методики к условиям крупномасштабного производства и необхо димостью поддержания высокой разрешаю щей способности промышленных гель-фильтрационных колонок на протяжении известного периода. Концентраты фактора VIII получают также посредством включения в технологическую схему стадии адсорбции на микрогранулах пористого силикон-диокон да с целью очистки от низкомолекулярных белковых примесей (Vox Sang, 341-348, 1984). Специфическая активность продукта при этом относительно невелика (1 международная единица/мг). Наиболее близким к предлагаемому изобретению является способ разделения белков крови, включающий их хроматографическую очистку (Thrombosis Res, Suppl. VIII, p. 60, 1987). В соответствии с этим методом фактор VIII очищают на антителах к фактору VIII: С или фактору фон Виллебранда, иммобилизованных на хроматографической среде. Этот способ дает хорошие результаты, но требует применения высоко активных растворителей на стадии десорбции фактора VIII со специфических антител или с антител к фактору фон Виллебранда. В связи с этим необходима дополнительная процедура ультрафильтрации, с помощью которой удаляются нежелательные химические агенты, что может отрицательно сказываться на биологической активности фактора VIII. Специфическая активность этого фактора в процессе производства может достигать 1000 международных единиц/мг и даже 3000 международных единиц/мг, однако его нестабильность заставляет применять стабилизаторы, например, альбумин, на стадии, предшествующей лиофильной сушке, что вызывает снижение специфической активности до 3-5 международных единиц/мг. Тем не менее, основным недостатком описанного способа является присутствие в препарате остаточных антител. Поскольку последние получают иммунизацией мышей, они могут вызывать у больных иммунные реакции, как при введении любых инородных для организма белков. В основу предлагаемого изобретения поставлена задача создания такого способа разделения белков крови, который можно было бы внедрить в промышленное производство с целью достижения высокого выхода продуктов путем их освобождения от посторонних белков, таких как антитела животного происхождения. Предлагаемый способ разделения белков крови, как и известный включает их хроматографическую очистку , а согласно изобретению в качестве источника белков используют криопреципитат плазмы крови, 11051 который обрабатывают окисью алюминия , В качестве исходной фракции можно исохлаждают до 14-16°С, центрифугируют, су- пользовать фракцию криопреципитата плазпернатант стерилизуют фильтрованием, затем мы, в том числе подвергавшуюся обрабатывают детергентом для предварительной обработке перед процедуинактивации вирусов и наносят на колонку 5 рой очистки. со смолой, содержащей ДЭАЭ-группировки, Такая обработка может заключаться, нафиксированные на винилполимерном геле , пример, в осаждении окисью алюминия или затем загружают колонку с раствором про - в низкотемпературной преципитации обычтеинов буферным раствором, содержащим 0,11 ными методами, применяемыми для обраМэ хлористого натрия, при этом фибри- 10 ноген ботки таких фракций. переводят в фильтрат, а другие проте-ины При тестировании различных смол на абсорбируют на колонке , затем проводят эффективность хроматографического раздеэлюцию фибронектина и фактора фон ления установлено, что наилучшие результаВиллебранда путем увеличения концентрации ты достигаются применением смол , в хлорида натрия в буфере до 0,15 М, 15 затем которых ДЭАЭ-группировки фиксированы элюцию фактора VIII, увеличивая концентрацию на винил-полимерном геле, например, фракхлорида натрия до 0,25 М, фибр и н о г е н тогеле ТСК. Смола такого типа поступает на дополнительно очищают хроматографией рынок под названием фрактогель ТСК на гепарин-сефарозе, используя для элюции ДЭАЭ 650/М/ (фирма Мерк). Основанная на буферный раствор, со- 20 держащий 0,06 М ней хроматографическая система дает нахлористый натрий, фактор фон Виллебранда много лучшие результаты чем системы на очищают хроматографией на основе других типов гелей, таких как ДЭАЭ винилполимерном геле, содержащем - сефароза ЦЛ-6Б, ДЭАЭ-сефароза ЦЛ-6Б фиксированные ДЭАЭ-группировки , ис- (Fast-Flow) фирмы Фармация, ДЭАЭ-сефапользуя для элюции буфер, содержащий 25 роза 4Б или ДЭАЭ-трисакрил /1С фирмы 0,15 М хлористый натрий, а фибронектин ИБФ. очищают дополнительной гельфильтрацией, при Применение геля, подобного фрактогеэтом все используемые буферные растворы лю ТСК-ДЭАЭ (М), описано Като с соавторасодержат 3 г/л лизина и 9 г/л глицина. ми (J.Chromatos, 245, 1982, 193-211), Заявитель предлагает процесс очистки 30 которые рекомендуют его в качестве систена основе анионообменной хроматографии, мы со средней эффективностью для коммеркоторый позволяет, благодаря правильному ческого разделения белков очень крупного подбору смолы, отделять искомый белок на размера. Особенности задержки и элюции одной хроматографической колонне при материала на таком геле определяются его условиях, устраняющих необходимость по- 35 крупнопористой структурой и пониженной следующей обработки, например, ультраионообменной способностью. фильтрация. Это предотвращает Заявитель установил, что такой тип геля усложнение процесса и снижение специфиобеспечивает возможность преимущественческой активности очищенного белка. ной адсорбции крупноразмерных комплекТаким образом, изобретение относится 40 сов, образующихся при взаимодействии к процессу очистки белков плазмы крови, фактора VIII и фактора фон Виллебранда. конкретно-фактора VIII, фибриногена, фибКроме того, посредством подбора соответронентина и фактора фон Виллебранда, отствующих уравновешивающих и элюируюличающегося тем, что солюбилизированная щих буферных растворов, заявитель показал фракция криопреципитата плазмы человека 45 возможность использования слабо гидроподвергается хроматографии на анионо-обфобных связей, образующихся в результате менной смоле относительно умеренной ионной длительной задержки крупноразмерных силы, обеспечивающей гидрофобные комплексов на поливинильном геле. Эти взаимодействия, но не адсорбирующей оппреимущества описываемого геля ранее не ределенные белки, фиксированные на смоле 50 отмечались. белки специфически элюируются при увелиИспользуя такую смолу для работы с чении ионной силы буферного раствора. фракцией плазмы, содержащей фактор VIII, например, предварительно очищенный расЭтот процесс пригоден также для работы с твор криопреципитата, а также соответствуплазмой крови животных, например, 55 свиней, ющие буферные растворы , получают что необходимо в некоторых случаях гемофилии концентрат фактора VIII очень высокой стеу больных, сыворотки которых обладают пени очистки с характеристиками, свойстингибирующими свойствами и для лечения венными концентрату плазмы одной группы которых нельзя использовать человеческий крови. Содержание фактора VIII в таких префактор VIII. паратах составляет 50 международных еди 11061 ниц/мл при специфической активности свы ше 200 международных единиц/мг, они не требуют ультрафильтрации, характеризуют ся высокой стабильностью и позволяют от казаться от добавления стабилизаторов белковой природы. С помощью той же хроматографической системы можно также пол учать фракции, обогащенные фибриногеном, фибронектином или факто ром фон Виллебранда, с физико-химически ми свойствами , удовлетворяющими требованиям клинического применения или использования в качестве реагентов. Кроме того, фибриноген может быть подвергнут дальнейшему концентрированию для ис пользования в качестве биологического клея, в соответствии с заявкой на Европей ский патент Ns 88401961. Способ осуществляется следующим образом. Предварительно очищенную фракцию плазмы крови, содержащую основные белки криопреципитата, т.е. фибриноген, фактор VUI, фибронектин и фактор фон Виллебранда, пропускают через вышеописанную анионо-обменную смолу. Фактор VIII, фактор фон Виллебранда и фибронектин (первые два фактора полностью или большая их часть, в зависимости от количества исходного материала) адсорбируются на смоле, тогда как фибриноген обнаруживают в фильтрате неадсорбируемых белков. При первом повышении ионной силы буферного раствора элюируются фибронектин и значительная часть фактора фон Виллебранда. Дополнительное увеличение ионной силы буфера приводит к элюции фактора VIII вместе с небольшими количествами фактора фон Виллебранда. Эту фракцию можно сразу подвергать лиофильной сушке, не добавляя в нее стабилизаторы и не подвергая ультрафильтрации. Наилучшие результаты дает использование буферного раствора, содержащего лизин в концентрациях от 2 до 4 г/л или глицин в концентрациях от 8 до 11 г/л. Применение других аминокислот или только одной из двух указанных аминокислот дает значи тельно менее эффективные результаты. Ионную силу буфера повышают добавлением хлористого натрия. Применение вышеуказанной смолы, характеризующейся умеренной ионной силой и слабой гидрофобностью, дает возможность использовать эту соль для десорбции фактора фон Виллебранда раньше фактора VIII и позволяет отказаться от хлористого кальция , который приходится впоследствии удалять ультра 8 фильтрацией для диссоциации факторов VIII и фон Виллебранда. Обработка с целью инактивации вирусов одним из существующих методов может, 5 разумеется, производиться на любой стадии процессов. При использовании химического антивирусного средства инактивацию лучше всего проводить до нанесения проб плазмы на смолу. В этом случае хроматогра10 фический процесс обеспечивает эффективное удаление инактивирующих соединений. Хорошие результаты получены при использовании растворов детергентов для инактивации вирусов, как описано в Евро15 пейской патентной заявке № 0131740. Фактор VIII может быть получен посредством хроматографии любой содержащей его белковой фракции, например, из предварительно очищенного криопреципитата 20 плазмы, наносившейся на окись алюминия с последующим осаждением при низкой температуре, в соответствии с общепринятыми способами изготовления концентра тов факторов VIII, как описано в 25 Европейской патентной заявке № 861042976. Специфическая активность фактора VIII: С в исходной фракции может быть очень низкой (порядка 0,1 международной едини30 цы/мг). Одностадийная анионо-обменная хроматография согласно данному способу обеспечивает его 400-700-кратную очистку. При этом выход составляет 75-90%. Полученный таким образом концентрат 35 фактора VIII характеризуется очень высокой степенью очистки при специфической ак-' тивности более 100 международных единиц/мг белка. Препарат не содержит фибриноген или иммуноглобулин Г и в зна40 чительной степени свободен от фибронектина. В нем отсутствуют также антитела к факторам группы крови или их содержание незначительно, В связи с этим его можно классифицировать, в соответствии с реко45 мендациями Европейской Фармакопеи, как концентрат плазмы крови одной группы даже в случае использования в качестве исходного материала плазмы, отбиравшейся без учета группы крови. Благодаря этому, прела50 рат может с успехом применяться в клинике, особенно для лечения гемофилии А, когда требуются многократные инъекции. Его можно использовать также в качестве реактива при любых тестах и анализах, требую55 щих высокой степени очистки фактора VIII. Получаемые с той же хроматографиче-ской колонны другие фракции также пред ставляют интерес с точки зрения своего белкового состава. С одной стороны, они содержат фибриноген, который выделяют из 11061 первого фильтрата, а с другой стороны, фибронектин и фактор фон Виллебранда, которые злюируются после первого повышения ионной силы буферного раствора. Способ иллюстрируется следующими 5 примерами, которые не исчерпывают возможности его применения. Пример 1. А. Предварительная очистка и инективация вирусов. 10 В качестве исходного материала используют криопреципитат плазмы человеческой крови ресуспендированный в водном растворе натронного гепарина (2 ед/мл) и содержащий фактор VIII со специфической 15 активностью от 0,6 до 1,1 международных единиц/кг. рН суспензии доводят до 7,0-7,1 добавлением 0,1 М уксусной кислоты. Полученную таким образом суспензию 20 криопреципитата подвергают очистке на геле из окиси алюминия и осаждением при низкой температуре. Окись алюминия добавляют в суспензию из расчета 108 г 2%-ной АІ(ОН)з на кг криопреципитата при 25 комнатной температуре и непрерывном помешивании в течение 5 мин. рН доводят 0,1 м уксусной кислотой до 6,5-6,6. Затем суспензию охлаждают до 14-16°С, продолжают перемешивание. По достижении указанной 30 температуры производят центрифугирование, надосадочную фракцию собирают и подвергают стерилизации посредством фильтрования. Такой предварительно очищенный рас- 35 твор обрабатывают детергентом с целью инактивации вирусов, в присутствии твинаТНБП, в соответствии с описанием, приве денным в Европейской заявке на патент № 0131740. 40 Б - Хроматографическое разделение на фрактогеле ДЭАЭ-ТСК Из фрактогеля ТСК - ДЭАЭ 650 (М) фирмы Мерк готовят хроматографическую колонку из расчета 0,5 л фрактогеля на кг 45 криопреципитата. Колонку промывают 5 объемами 0,1 М раствора хлористого натрия и уравновешивают буферным раствором следующего состава: лимоннокислый натрий (2,94 г/л), хлори- 50 стый кальций (1 мМ), хлористый натрий (0,11 мМ), глицин (9 г/л), лизин (3 г/л). На колонку наносят предварительно очищенный, как описано в примере А, рас твор криопреципитата. 55 Получаемые фильтраты и элюаты анализируются на содержание белка по поглощению при 280 нм, которые в дальнейшем изложении выражается в единицах оптической плотности (О.П.). 10 Первый фильтрат показывает пик белкового материала не адсорбируется на колонке и состоящий в основном из фибриногена (см.пример 3). После прохождения этого пика, когда О.П. уменьшается до базальной величины, элюцию продолжают, используя тот же буфер, но более высокой ионной силы, которая достигается добавлением хлористого натрия до конечной концентрации 0,15 М. Этот буфер вызывает десорбцию белкового пика, содержащего основное количество фактора фон Виллебранда и фибронектина (см.пример 4). После снятия этого типа и снижения О.П. до базального уровня повторно увеличивают ионную силу буферного раствора, добавляя хлористый натрий до конечной концентрации 0,25 М. При этих условиях фактор VIII элюирует-ся в концентрации порядка 30-40 международных единиц/мл. Пример 2. Получение концентрата фактора VIII. Раствор фактора VIII, полученный с помощью хроматографической процедуры, описанный в примере 1, характеризуется достаточно высокими степенью очистки и конце нт рацией, что поз воля ет сра зу реализовать его по флаконам без дополнительной ультрафильтрации При необходимости можно получать растворы различной концентрации, используя для разведения тот же буфер, который использовали для элюции. Таким образом можно получать упаковки препарата со специфической активностью, соответствующей действующим стандартам. Усредненный состав получаемых растворов представлен ниже. белки (г/л) 0,16-0,25 фактор VIII: С (международ ные единицы/мл 30-45 специфическая активность фактора VII!: С (международ ные единицы/мг 120-250 фибриноген (г/л) менее 0,1 фактор фон Виллебранда (Ад.ед. мл) 11-23 фактор фон Виллебранда (ИСО.ед./мл) 10-20 фактор VIII (Ад. ед/мл 35-60 иммуноглобулины Г, мг/мл (нефелометрия) менее 0,011 природные и индуцирован ные анти-А-антитела 0-2 фибронектин (кг/л) 15-40 После лиофилизации получают чистый, быстрорастворимый продукт. Содержание 11 11061 12 Пример 4. Получение концентрата фактора фон Виллебранда. Элюат, получаемый при хроматографии на фрактогеле ДЭАЭ в присутствии 0,15 М хлористого натрия, как описано в примере 1, содержит большие количества фактора фон Виллебранда и фибронектина. В нем присутствуют также твин и ТНБФ. Эту фракцию разводят до получения осмотического давления 386-390 мосМ, используя для этой цели хроматографический буферный раствор (лимоннокислый натрий, хлористый кальций, лизин, глицин, рН 7,0, осмотическое давление 18 мосМ). После этого ее наносят на вторую колонку иа фрактогеля ДЭАЭ, уравновешивают тем же буфером, содержащим хлористый натрий в концентрации 0,11 М при рН 7,0 и осмотическом давлении 387 мосМ. При этом условии достигается весьма эффективное удаление твина и ТНБФ. Поскольку исходный раствор уже содержит фактор фон Виллебранда в очень высокой концентрации, последний в значительно большей степени задерживается на колонке чем во время хроматографирования на первой колонке. Адсорбирующая способность этой колонки составляет по крайней мере 160 ед Ад/мл (антигенных единиц фактора фон Виллебранда) или 100 RCO мл (в единицах кофактора ристоцетина). Фракция, содержащая фактор фон Виллебранда, элюируется буфером, содержащ и м х л о р ис т ы й н а т р и й в к о н е чн о й концентрации 0,15 М. Получаемый элюат характеризуется достаточно высокой концентрацией фактора фон Виллебранда, в связи с чем его можно разливать по флаконам и лиофилизировать без дополнительной ультрафильтрации. Концентрат имеет очень высокую степень очистки при специфической активности более 100 единиц RCO мг. Он содержит некоторое количество фибронектина, однако это не сказывается на его активности. Пример 5. Получение концентрата фибронектина. Фактор фон Виллебранда и фибронекПолученный таким образом концентрат 50 тин можно разделять благодаря разнице их молекулярных масс. Методом гель - фильтфибриногена удовлетворяет требованиям рации на колонке из сефакрила S-400 (R) стандарта качества, установленного Еврофирмы Фармация получают первую фракпейской Фармакопеей. цию, содержащую фактор фон Виллебранда. Кроме того, он может использоваться в качестве субстрата для приготовления био- 55 Следующая фракция содержит фибронекклея в соответствии с Европейской заявкой на тин, который можно сразу разливать по флаконам и лиофилизировать. патент № 884019613. фактора VIII: С остается постоянным на протяжении суток при комнатной температуре. При инъекции людям обнаруженные фактора VIII: С сопоставимо с таковыми при использовании менее очищенных продук- 5 тов. Сходным образом, период полужизни высоко очищенного фактора VIII сравним с тем же показателем у других препаратов. Показана высокая терапевтическая эффективность концентрата, особенно в слу- 10 ч а е п ов т о рн ых и нъ е кц и й п р и л еч ен и и больных с гемофилией А. Пример 3. Очистка концентрата фибриногена. Первый фильтрат, получаемый при хро- 15 матографии на колонке из фрактогеля ДЭАЭ, как описано в примере 1, содержит фибриноген, а также альбумин, иммуногло булины и антивирусные средства (твин и ТНБФ). 20 Очистку содержащегося в этом материале фибриногена производят дополнительной х ромат огр аф ией на кол онк е и з гепарин-сефарозы. Хроматографирование проводится в том 25 же буферном растворе, который использовался на предшествующей стадии, после доведения концентрации в нем хлористого натрия до 0,06 М, что предотвращает диализ между двумя хроматографическими стадия- 30 ми. Фильтрат, полученный на первой стадии разводят для получения осмотического давления 280 моем при рН 6,5. Затем его наносят на вторую колонку и получают но- 35 вый фильтрат, содержащий альбумин, иммуноглобулины, твин и ТНБФ. Фибриноген адсорбируется на колонке. После уменьшения О.П. фильтрата до базальной величины, колонку элюируют тем 40 же буфером, ионную сипу которого предварительно повышают добавлением хлористого натрия до конечной концентрации 0,16 М. Собранную фракцию фибриногена концентрируют и подвергают диализу в кассет- 45 ной системе. Концентрированный продукт разливают по флаконам и подвергают лиофильной сушке. 11061 Упорядник Замовлення 4045 Техред М.Моргентал Коректор О.Обручар Тираж Підписне Державне патентне відомство України, 254655, ГСП, Київ-53, Львівська пл., 8 Відкрите акціонерне товариство "Патент", м. Ужгород, вул.ГагарІна, 101

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for separating proteins of blood

Автори англійською

Thierry Burnouf, Marianna Burnouf

Назва патенту російською

Способ разделения белков крови

Автори російською

Тьерри Бюрнуф, Марианна Бюрнуф

МПК / Мітки

МПК: A61K 35/16

Мітки: білків, спосіб, крові, розділення

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/8-11061-sposib-rozdilennya-bilkiv-krovi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб розділення білків крові</a>

Подібні патенти