Поживне середовище для культивування штаму irpex lacteus (fr.) fr. a-021 – продуцента ферментів молокозсідальної дії

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Поживне середовище для культивування штаму А-021 ксилотрофа Іrрех lacteus (Fr.) Fr. - продуцента ферментів молокозсідальної дії, яке містить вуглевод, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і йод, яке відрізняється тим, що як вуглевод використовують фруктозу при наступному співвідношенні компонентів, г/л:

глюкоза

10

пептон

3

KН2РО4

0,6

K2НРО4

0,4

MgSO4×7H2O

0,5

СаСl2

0,05

ZnSO4´7H2O

0,001

дистильована вода

до 1 літра.

Текст

Реферат: Поживне середовище для культивування штаму А-021 ксилотрофа Іrрех lacteus (Fr.) Fr. продуцента ферментів молокозсідальної дії, яке містить вуглевод, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і йод. Як вуглевод використовують фруктозу, при наступному співвідношенні компонентів. UA 109986 U (54) ПОЖИВНЕ СЕРЕДОВИЩЕ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ШТАМУ IRPEX LACTEUS (FR.) FR. A-021 ПРОДУЦЕНТА ФЕРМЕНТІВ МОЛОКОЗСІДАЛЬНОЇ ДІЇ UA 109986 U UA 109986 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до біотехнології і може бути використана у науково-дослідних і промислових мікологічних лабораторіях для одержання ферментів молокозсідальної дії на основі культивування штамів-продуцентів. Величезний інтерес до пізнання різних аспектів біології та біосинтетичної активності вищих грибів відділу Basidiomycota, що спостерігається в останні роки, обумовлений, в першу чергу, розширенням сфери їх практичного використання. Цікавим в ньому відношенні є малодосліджений ксилотроф Irpex lacteus (Fr.) Fr., для якого встановлені певні перспективи біотехнологічного використання, в тому числі і як джерела молокозсідальних ферментів [6]. У результаті дії молокозсідальних ензимів зазнає глибоких перетворень казеїн, що є основним протеїном молока. Специфічність дії молокозсідальних ензимів полягає в їх здатності розщеплювати пептидний зв'язок між 105 (Фен) та 106 (Мет) амінокислотами первинної структури æ-казеїну. Дослідження з виявлення замінників сичужного ферменту серед вищих грибів проводяться в багатьох країнах світу. Вони показали, що ферментні препарати сичужної дії, отримані з базидіоміцетів, за своєю активністю ні в чому не поступаються ферментним препаратам, які використовуються у промисловості [7, 8]. Оптимізація умов культивування з метою отримання біологічно активних речовин базидіоміцетів є одним з важливих напрямків розвитку сучасних мікології і біотехнології [2-4]. Відоме агаризоване живильне середовище для виділення і пересівів чистих культур вищих базидіоміцетів - продуцентів біологічно активних речовин, що містить агар-агар, воду і відвар зерна ячменю від 500 до 250 мл, який отримують як побічний продукт при приготуванні зернового міцелію і містить цукристих речовин на рівні 3,6-3,8° за Баллінгом і водорозчинних білкових речовин - 48,0-62,0 мг/ мл. Не надаються данні про можливості використання цього живильного середовища для культивування штамів-продуцентів з мстою отримання біологічно активних речовин [4]. Відоме живильне середовище для вирощування штаму P-6v Pleurotus ostreatus - продуцента каталази, яке включає глюкозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, а також додатково містить лігносульфонат у такому співвідношенні компонентів, г/ л: глюкоза - 12; пептон - 1; KН2РО4 - 0,8; K2Н РО4 - 0,2; MgSO47Н2О - 0,5; СаСl2 - 0,05; ZnSO47H2O) - 0,001; лігносульфонат - 8-10; дистильована вода - до 1 літра. Не надаються дані про можливості використання цього живильного середовища для культивування штамів базидіоміцетів продуцентів молокозсідальних ферментів [3]. Найбільш близьким за технічною суттю поживне середовище для вирощування штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуцента молокозсідального ферменту, яке включає глюкозу, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, воду і цинк сірчанокислий, яке відрізняється тим, що додатково містить натрій хлористий при наступному співвідношенні компонентів г/ л: глюкоза 18-20, пептон - 8-10, KН2РО4 - 0,6; K2НРО4 - 0,4; MgSO4×7H2O - 0,9-1,1; СаСl2 - 0,11-0,13; NaCl 0,18-0,20; ZnSO47H2O - 0,001; дистильована вода - до 1 л. Не надаються данні щодо придатності цього середовища для культивування штамів продуцентів молокозсідальних ферментів роду Іrрех [2]. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалення глюкозо-пептонного поживного середовища для вирощування штаму Irpex lacteus A-021 - продуцента ферментів молокозсідальної дії, в якому шляхом оптимізації концентрацій компонентів досягають значного підвищення ферментативної активності, яка може бути використана в харчовій промисловості. Поставлена задача вирішується тим, що поживне середовище для вирощування штаму Irpex lacteus A-021 продуцента ферментів молокозсідальної дії, яке містить джерело карбону, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і воду, в якому, згідно з корисною моделлю, як джерело карбону використовують фруктозу при наступних співвідношеннях, г/ л: фруктоза - 12; пептон - 5; KН2РО4 - 0,4; K2НРО4 - 0,2; MgSO4×7H2O - 0,5; СаСl2 - 0,05; ZnSO47H2O - 0,001; дистильована вода - до 1 літра. Приклад конкретного виконання Етан 1. Дослідження росту і молокозсідальної дії Irpex lacteus A-021 на стандартному глюкозо-пептонному середовищі, готують вихідне поживне середовище наступного складу, г/л: глюкоза 10 пептон 3 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 MgSO4×7H2O 0,5 1 UA 109986 U 5 10 15 20 25 СаСl2 0,05 0,001 ZnSO47H2O дистильована вода до 1 літра. [1] Поживне середовище розливають по 50 мл в конічні колби Ерленмейєра на 250 мл, стерилізують в автоклаві при 121±2 °C протягом 40 хвилин. Кислотність середовища після стерилізації становить 6,0-6,5 рН. Середовище, після охолодження, інокулюють шматочком міцелію розміром 5×5 мм. Інокулюмом є чиста культура штаму А-021, яка росла 7-10 діб на 4° за Баллінгом агаризованому суслі (СА) або на картопляно-глюкозному агарі (КГА) [1]. Штам А-021 культивують протягом 20 днів при температурі 27,5 °C. Вивчення молокозсідальної активності (МЗА) у культуральному фільтраті (КФ) здійснювали за допомогою методу Каваі та Мукаі [2]. Метод заснований на визначенні часу, за який відбувається зсідання молока. Отримані значення переводили в умовні одиниці (у. о.) за формулою [6]: 40  100  К МЗАкф  од. / мл , n де: 40 - середній час зсідання молока, під час виробництва сиру (хв); К - коефіцієнт розведення культурального фільтрату або кристалічного препарату ферменту; n - час, за який з 100 мл молока при додаванні 1 мл культурального фільтрату або 1 мл 0,1 % розчину ферменту утвориться щільний згусток (хв). Питому молокозсідальну активність визначали за формулою [6]: МЗАзаг МЗAnum  од. / мл , С де, МЗАзаг - молокозсідальна активність культурального фільтрату (од./мл); С - концентрація білка в 1 мл культурального фільтрату (мг/мл). Субстратом служило свіже натуральне молоко з додаванням 1 мл 15 % розчину СаСl2×2Н2О на кожні 100 мл молока. Кислотність субстрату доводили до 6,00-6,05 за допомогою 10 %-го розчину НСl [2]. Статистичну обробку експериментальних даних проводили за методом дисперсійного аналізу, порівняння середніх арифметичних - за методом Дункана [5]. Дані динаміки молокозсідальної активності штаму І. lacteus А-021 наведені в табл. 1. Дані досліду (табл. 1) свідчать про наступне. Досліджуваний штам І. lacteus A-021 накопичує біомасу протягом усього терміну ферментації. Уповільнення накопичення біомаси спостерігається в кінні терміну ферментації цього штаму, що скоріш за все пов'язане з вичерпаністю поживних речовин і накопиченням продуктів метаболізму. 30 Таблиця 1 Динаміка молокозсідальної активності культурального фільтрату штаму І. lacteus A-021 Час культивування, доба 2 4 6 8 10 35 40 Біомаса, мг/л 0,45±0,02 1,17±0,04 1,27±0,09 1,65±0,07 1,72±0,05 рH КФ 6,47 6,35 5,78 4,52 4,67 МЗA ум. од./л 35,82±1,17 63,19±0,96 81,34±3,05 129,72±4,89 90,48±2,35 рH культурального фільтрату змінюється в процесі росту штаму І. lacteus A-021 у бік підкислення до 4,52 од. (мінімальне значення) на 8-му добу з подальшим незначним підвищенням цього показника до 4,67 од., що також викликане вищезазначеними причинами. Динаміка молокозсідальної активності КФ має максимум на 8-му добу ферментації, який співпадає з мінімальним значенням рH і, ймовірно, вказує на кислу природу білків молокозсідальних ферментів [6]. Етап 2. Дослідження виливу джерел вуглецевого живлення на молокозсідальну активність штаму І. lacteus A-021. При вивченні впливу джерел вуглецевою живлення на молокозсідальну активність штаму І. lacteus A-021 беруть 20 вуглецьвмісних сполук: моносахариди: L-(+)-арабіноза, D-(+) ксилоза, DL-глюкоза, L-(+)-рамноза, D-(±)-фруктоза; олігосахариди: (±)-лактоза, D-(+)-мальтоза, DLсахароза; полісахариди: крохмаль, целюлоза; багатоатомні спирти: DL-дульцит, DL-i-інозит, D(±)-сорбіт, D-(-)-маніт, гліцерин; ди- і гідроксикарбонові кислоти: щавлева, бурштинова, винна, 2 UA 109986 U яблучна. Джерела вуглецевого живлення взяті в еквіваленті за вмістом вуглецю в перерахунку на його вміст в глюкозі. МЗЛ визначали на 8 добу росту культури. Результати дослідження наведені в таблиці 2. Таблиця 2 Вплив джерел вуглецю на ріст та молокозсідальну активність культурального фільтрату штаму І. lacteus A-021 № з/п Джерело карбону 1 2 L-(+)-арабіноза D-(+)-ксилоза 3 4 5 DL-глюкоза L-(+)-рамноза D-(+)-фруктоза 6 7 8 D-(+)-лактоза D-(+)-мальтоза DL-сахароза 9 МЗЛ, ум. од/ мл Моносахариди (пептози) 9,21±1,15 66,67±1,05 (гексози) 129,72±4,89 240,00±12,05 Олігосахариди (дисахариди) 9,60±0,21 106,67±7,38 81,36±2,50 (трисахариди) 10 11 Крохмаль Целюлоза 12 13 14 15 DL-дульцит DL-і-інозит D-(+)-сорбіт D-(-)-маніт 16 Гліцерин 17 18 Щавелева кислота Бурштинова кислота 19 20 Винна кислота Яблучна кислота (полісахариди) 85,07±3,19 32,00±1,20 Багатоатомні спирти (гексити) 24,54±1,38 11,37±1,03 7,81±0,12 (треозити) 112,10±6,64 Насичені дикарбонові кислоти 12,39±8,83 72,35±8,03 Гідроксикарбонові кислоти рН 1,08±0,11 1,63±0,07 4,67 4,50 1,65±0,07 0,77±0,06 1,72±0,03 4,54 5,07 4,65 1,59±0,12 1,67±0,11 1,80±0,04 4,33 4,53 4,41 0,91±0,04 DL-рафіноза Біомаса, мг/л 4,80 1,68±0,03 1,32±0,04 4,21 4,31 0,86±0,02 0,74±0,05 1,51±0,02 1,52±0,05 4,93 4,91 4,94 4,82 1,89±0,13 4,27 1,17±0,12 1,40±0,03 4,19 4,32 0,93±0,06 1,03±0,04 4,08 4,12 Примітка: " - " відсутність МЗА протягом - 40 хвилин 5 10 15 20 Джерела вуглецевого живлення вірогідно впливають на молокозсідальну активність штаму І. lacteus A-021. Максимальне значення МЗА КФ на 8-му добу культивування зафіксували на рівні 240,00±12,05 ум. од. із культурах, що росли на поживному середовищі з фруктозою. Дещо нижча МЗЛ зафіксована в КФ культур, то росли на поживному середовищі з глюкозою і мальтозою. Максимальне накопичення біомаси не збігається і максимумами молокозсідальної активності. Етап 3. Оптимізація складу поживного середовища за молокозсідальною активністю штаму І. lacteus A-021. Удосконалення вихідного середовища, згідно з поставленою задачею, проводять за 4 методом повного факторного експерименту (ПФЕ-2 ) [5]. Варіювання () вмісту у поживних середовищах фруктози і пептону - факторів x1, x2 складає 2 г/ л, а KН2РО4 і K2НРО4 - факторів, x3, і x4 - 0,2 г/ л, інші компоненти мають постійну концентрацію (табл. 3.). Фруктоза, як компонент поживного середовища вибрана у зв'язку з тим, що на цьому середовищі спостерігається максимальна МЗЛ культурального фільтрату, який доцільно використовувати в біотехнології з метою отримання ферментного препарату. 3 UA 109986 U Таблиця 3 Склад поживних середовищ для підвищення молокозсідальної активності культурального фільтрату штаму І. lacteus A-021 Фактори № поживного середовища 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 5 x1 (фруктоза) 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 8 12 10 x2 (пептон) x3 (KН2РО4) x4 (K2НРО4) Вміст у поживному середовищі, г/л 1 0,4 0,2 1 0,4 0,2 0,4 0,2 5 0,4 0.2 1 0,8 0,2 1 0,8 0,2 0,8 0,2 5 0,8 0,2 1 0,4 0,6 1 0,4 0,6 5 0,4 0,6 5 0,4 0,6 1 0,8 0,6 1 0,8 0,6 0,8 0,6 5 0,8 0,6 3 0,6 0,4 Взаємодія факторів 1 x1 x2 x1x2 x3 x1x3 x2x3 x1x2x3 x4 x1x4 x2x4 x1x2x4 x3х4 x1x3х4 x2x3х4 x1x2x3х4 0 Всі операції по приготуванню поживних середовищ; культивуванню штаму А-021 та визначенню його МЗA і накопичення біомаси проводять за етапом 1. Штам А-021 культивують упродовж 8 діб при температурі 27,5 °C (табл. 4). Вплив складу поживного середовища молокозсідальну активність культурального фільтрату штаму І. lacteus А-021 Таблиця 4. Вплив складу поживного середовища молокозсідальну активність культурального фільтрату штаму І. Lacteus А-021 № поживного середовища 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 рН КФ Біомаса, г/л МЗА, ум. од/мл 4,30 4,32 4,60 4,37 4,97 4,02 4,10 4,27 4,76 4,73 4,80 4,94 4,67 4,58 4,77 4,66 4,65 0,28±0,20 0,42±0,05 1,36±0,13 1,88±0,01 0,52±0,04 0,49±0,17 1,08±0,20 1,71±0,05 0,90±0,08 1,29±0,13 0,94±0,06 1,98±0,09 1,08±0,16 1,25±0,07 1,25±0,09 2,51±0,04 1,72±0,03 101,92±1,30 95,95±2,20 121,67±0,03 296,25±2,04 95,68±0,16 80,95±0,04 127,24±0,08 254,46±0,07 113,92±1,09 121,27±0,06 81,89±0,02 254,19±1,03 90,80±0,91 130,83±2,11 159,19±1,09 246,71±1,05 240,58±0,24 4 UA 109986 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Найбільше накопичення біомаси штамом І. lacteus А-021 спостерігалося на поживних середовищах № 16, 12 та 4 в порядку убування. Названі середовища мали максимальний вміст фруктози та пептону, середовище № 16 також мало максимальний вміст KН2РО4 і та K2НРО4. Мінімальне накопичення біомаси зафіксовано при рості на середовищі № 1, де був найменший вміст факторів x2, x3 і x4, а вміст фруктози був на стандартному рівні. Максимальна молокозсідальна активність КФ відмічена у культурах, що росли на середовищах № 4, 8, 12 і 16, що відповідає пікам найвищого накопичення біомаси, за винятком середовища № 8. Також всі ці середовища були близькими за складом, та характеризувалися високим вмістом фруктози і пептону, вміст калію фосфорнокислого одно- і двозаміщеного варіює. рН культурального фільтрату з рН0=6,6 змінюється в межах від 4,10 (середовище № 7) до 4,97 (середовище № 5). Отже, поживне середовище № 12 є найбільш придатним для росту - накопичення біомаси штамом І. lacteus А-021, а поживне середовище № 4 - для синтезу позаклітинних молокозсідальних ферментів (перевищує контроль (середовище № 17) у 1,23 разу. Оптимізація глюкозо-пептонного середовища з метою підвищення ферментативної активності штаму А-021 ксилотрофа Irpex lacteus (Fr.) Fr. дозволяє вести його культивування, направлене на отримання як міцеліальної біомаси, так і молокозсідальних ферментів, що спрощує і здешевлює їх виробництво. Джерела інформації:, які використані при складанні заявки: 1. Ломберг M.Л. Лікарські макроміцети у поверхневій та глибинній культурі: дис… канд. біол. наук: 03.00.21 / НАН України; Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного. - К., 2005. - 20 с. 2. Патент 22915 України. Живильне середовище для вирощування штаму М-81 Hirschioporus laricinus - продуцента молокозгортаючого ферменту / Бойко М.І., Негруцький С.Ф., Федотов С.И., Борисенко О.О. Заявка № 96031179 від 27.03.1996, кл. C12N1/38, Бюл. № 3, від 30.06.1998 (найближчий аналог) 3. Патент 39760 України. Живильне середовище для вирощування штаму P-6v Pleurotus osireatus (Jacq.: Fr.) Kumm. - продуцента каталази / Федотов О.В., Брусніцина О.М. Заявка № u200812035, від 10.10.2008, МПК (2009), кл. C12N9/52, А23С19/00 Бюл. № 5, від 10.03.2009. 4. Патент 63177 України. Живильне середовище для виділення і пересівання чистих культур вищих базидіоміцетів/ Федотов О.В., Бугрім Є.Ю., Крюков О.Л. Заявка № 2003021394, від 17.02.2003, кл. 7C12N9/54, А23С19/032, Бюл. № 1. від 15.01.2001. 5. Приседський Ю.Г. Статистична обробка результатів біологічних експериментів/ Ю.Г. Приседський. - Донецьк: Кассиопея, 1999. 210 с. 6. Федотов О.В., Бойко М.І., Негруцький С.Ф. Зв'язані амінокислоти і білок ферментних препаратів молокозсідальної дії у афілофорових грибів // Укр. ботан. журн. - 2002. - Т. 59, № 1. С. 45-48. 7. Fedotov O.V. Wood-destroying fungi as bio-sources of ferments for medicinal and nutritional purposes / O.V. Fedotov Plant and Mierobial linzymes: isolation, characterization and biotechnology applications - Tbilisi: Myza, - 2007. - P. 125-126. 8. Wasser S.P. Medicinal mushroom Science: History, Current Status, Future Trends, and Unsolved problems / S.P. Wasser // Int. J. Med. Mush. - 2010. - 12 (1). - P. 1-16. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 45 50 Поживне середовище для культивування штаму А-021 ксилотрофа Іrрех lacteus (Fr.) Fr. продуцента ферментів молокозсідальної дії, яке містить вуглевод, пептон, калій фосфорнокислий однозаміщений, калій фосфорнокислий двозаміщений, магній сірчанокислий, кальцій хлористий, цинк сірчанокислий і йод, яке відрізняється тим, що як вуглевод використовують фруктозу, при наступному співвідношенні компонентів, г/л: глюкоза 10 пептон 3 KН2РО4 0,6 K2НРО4 0,4 MgSO4×7H2O 0,5 СаСl2 0,05 0,001 ZnSO47H2O дистильована вода до 1 літра. 5 UA 109986 U Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/00

Мітки: молокозсідальної, середовище, irpex, дії, fr, поживне, lacteus, a-021, ферментів, продуцента, культивування, штаму

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/8-109986-pozhivne-seredovishhe-dlya-kultivuvannya-shtamu-irpex-lacteus-fr-fr-a-021-producenta-fermentiv-molokozsidalno-di.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Поживне середовище для культивування штаму irpex lacteus (fr.) fr. a-021 – продуцента ферментів молокозсідальної дії</a>

Подібні патенти