Спосіб визначення цито- та генотоксичності питної води

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб визначення цито- і генотоксичності питної води, що включає введення тест-організму, риби, в останню, витримування та виділення частини тест-організму, який відрізняється тим, що препарують нативні епітеліальні клітини зябер тест-об'єкта, визначають зміни морфологічної структури ядер епітеліальних клітин і за частотою клітин із мікроядрами і подвійними ядрами визначають генотоксичність, а за кількістю клітин у стані апоптозу визначають цитотоксичність питної води.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як тест-організм використовують: карась сріблястий Carassius auratus gibelio, золота рибка Carassius auratus auratus, даніо pepio Danio rerio.

Текст

Реферат: Винахід належить до методів визначення цито- та генотоксичності водних зразків на рівні клітини. Запропонований спосіб полягає у введенні тест-організму, риби, в зразок питної води, витримуванні та виділенні як частини тест-організму зябрової тканини, визначенні змін морфологічної структури епітеліальних клітин та їх ядер, за змінами яких оцінюють цито- та генотоксичність питної води. Реалізація запропонованого способу забезпечує одночасне визначення цито- та генотоксичності питної води з високою чутливістю, точністю, інформативністю, особливо при низьких концентраціях токсиканта. UA 104175 C2 (12) UA 104175 C2 UA 104175 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Винахід належить до області екології навколишнього середовища, а саме до методів біотестування водних середовищ і може бути використаний для визначення рівня токсичності питної води на клітинному рівні. Для оцінки цито- і генотоксичності питної води досліджують вплив токсикантів води на тесторганізми, у якості яких використовують риби. Поширеність тестів з рибами пов'язана з одного боку із зручністю їх утримання в лабораторних умовах та тим, що тест-організм перебуває безпосередньо в досліджуваному середовищі. З іншого боку, риби реагують на токсичний вплив, в більшості випадків, подібно до ссавців. Використання клітинних біомаркерів необхідно на сучасному етапі біотестування природних, в основному, питних вод. Для виявлення цитотоксичності проводять цитологічний аналіз клітин організму, визначаючи кількісні характеристики клітин, порушення в морфології та структури клітин, та на основі порівняльних узагальнених даних для дослідних і контрольних варіантів здійснюють оцінку цитотоксичності водного середовища [Цитологічна характеристика периферичної крові дев'яти видів риб // Вісник Запорізького національного університету. Біологічні науки. Запоріжжя. 2007.- № 1. - С. 10-15.] [1]. Генотоксичність - утворення ядерних порушень у клітинах тест-організмів, тобто збільшення рівня клітин з порушеннями мітозу мікроядер та подвійних ядер. Утворення мікроядер та подвійних ядер може бути обумовлено порушеннями різних клітинних механізмів. Підвищена частота клітин із мікроядрами та подвійними ядрами може виникнути унаслідок впливу токсичних речовин [Al-Sabti К. and Metcalfe CD. 1995. Fish micronuclei for assessing genotoxicity in water. Mutat Res. 343, 121-135) [2]. Таким чином, ядерні порушення являються біомаркером генотоксичних ефектів. Відомий спосіб визначення генотоксичності водних зразків із використанням клітинного біомаркера - мікроядерного тесту [Ильинских H.Н., Новицкий В.В., Варгунова Н.И., Ильинских И.Η. Микроядерный анализ и цитогенетическая нестабильность. - Томск: Изд-во Томск. Ун-та, 1991. - 272 с] [3]. Спосіб полягає в наступному. У способі [3] мікроядерний тест характеризує частоту хромосомних порушень у ході мітотичного процесу, тобто мікроядерний тест фіксує структурні порушення ядер клітини. Основний показник тесту - частота утворення клітин із мікроядрами та подвійними ядрами. Дослідження проводили на карасях, Carasius auratus gibelio, використовували клітини зябер. 3 2+ Досліджували розчин солі міді CuSO4·5Н2О наприклад, в концентрації 2,5 мг/дм по іону Сu . Відбір проб тканини зябер проводили через 7 та 14 діб після початку експерименту. Тканини зябер (зяброві дуги) фіксували в оцтово-гліцеринової суміші, яка одночасно є мацеріруючим розчином. Потім готували цитологічні препарати і забарвлення проводили в протягом 5 хв розчином азур-еозину. Проводили порівняльний аналіз кількості утворених мікроядер та подвійних ядер. Частота утворення мікроядер (МЯ) та подвійних ядер (2Я), а саме величина відхилення від контролю була використана для оцінки генотоксичності води. Дані представлені в табл. 1. Таблиця 1 Досліджувані проби Контроль 2+ 3 Сu 2,5 мг/дм 45 50 Тип клітин Клітини зябер Клітини зябер Клітини з мікроядрами, Двоядерні клітини, ‰ 2Я ‰ МЯ 234 1,67 11,67 1334 До недоліків відомого способу відноситься тривалий час проведення експерименту, що призводить організм до стресовому стану, яка викликає утворення аномальних ядер, про це свідчить наявність у контрольному середовищі МЯ та 2Я, що вказує на недостатню точність отриманих даних способу. Відомий також спосіб визначення цитотоксичності водних зразків із використанням ядерцевого біомаркера [Ю. А. Стойка, В. В. Архипчук Использование ядрышкового биомаркера в плавниках рыб для оценки токсичності водных проб // Міжнародна науково-практична конференція «Проблема і перспективи очищення та повторного використання води». - К.: Знання, 2000. - С. 41-42] [4]. Сутність способу полягає в тому, що у способі [4] для визначення токсичності водного середовища використовують ядерцевий біомаркер, який оцінює ядерцеву активність ядер клітин. 1 UA 104175 C2 5 10 15 Для визначення цитотоксичності водного середовища за допомогою ядерцевих характеристик клітин тест-об'єктів риб, карась сріблястий (Carassius auratus gibelio), як біомаркер використовували ядерце клітин хвостового плавця риб. Риб утримували у досліджуваному зразках воді від 3 до 5 діб. Цитологічні препарати з клітин риб готували наступним чином. Відібраний матеріал, шматок хвостового плавця, фіксували в двох змінах свіжо приготованого фіксатора Кларка (суміш етилового спирту та оцтової кислоти 3:1). Фіксовану тканину піддавали спочатку хімічній мацерації в 45% оцтовій кислоті протягом 30-45 хвилин, а потім - механічній за допомогою електричного гомогенізатора. З одержаної суспензії клітин готували повітряно-сухі цитологічні препарати. Потім їх забарвлювали за методикою Ховела і Блека, суттєвим моментом якої є короткочасова (3-5 хв) обробка препаратів 50%-вим розчином азотнокислого срібла з додаванням 2%-вого розчину желатину в термостаті чи на нагрівальному столику при температурі 50-60 °C. Після висушування препарати дофарбовували 2%-ним розчином азур-еозину за Романовським впродовж 1 хвилини. Проби тканини хвостового плавця фіксували двічі, через 30 і 90 хв експозиції. Для мікроскопічного аналізу готували цитологічні препарати, пофарбовані 50% водним розчином азотнокислого срібла. Інформативними показниками, що застосовуються для оцінки впливу токсичності водних проб на ядерце клітин плавників риб, являються розмір поодиноких ядерець (ОЯ) та відсоток гетероморфних парних ядерець (ГПЯ). Дані представлені в таблиці 2. Таблиця 2 Досліджувані проби Контроль 2+ 3 Сu 2,5 мг/дм Тип ядерцевих порушень ОЯ % 30 хв 90 хв 12,0 09,9 7,7 5,2 Тип клітин Клітини плавця Клітини плавня Тип ядерцевих порушень ГПЯ % 30 хв 90 хв 26,6 24,1 29,4 33,6 20 25 30 35 40 Як недолік відомого способу [4] можна відмітити тривалий час підготовки цитологічних препаратів для аналізу, недостатня точність отриманих даних до виявлення негативного впливу на організм саме токсичних речовин при визначенні цитотоксичності водного середовища. Це можна пояснити наступним. Ядерця являють собою комплекс функціонуючих рибосомних генів і їх продуктів, що обумовлює їх високу сприйнятливість до різноманітних зовнішніх впливів, наприклад світла, кисень у воді, підвищення або зниження температури, зміна pH води та ін. Найбільш близьким аналогом до винаходу за технічною суттю та результатом, що досягається, є спосіб оцінки генотоксичності водного середовища [Спосіб оцінки генотоксичності водного середовища / Архипчук В.В., Гаранько Н.М., Гончарук В.В. // Патент 67315] [5]. У способі [5] для визначення генотоксичності водного середовища за допомогою мікроядерного тесту, як біомаркер використовували клітини зябер риб - карась сріблястий (Carassius auratus gibelio). Риб залишали в експериментальному розчині на 5 діб для аналізу генотоксичності у досліджуваному та контрольній воді. Як токсичні речовини використовували розчин хлоралгідрату (С13ССН(ОН)2) в концентрацій 0,04%. Після експозиції, на п'ятий день, проводили відбір проб тканини зябер у досліджуваних риб та проводили фіксацію в оцтово-гліцериновому фіксаторі (10%-ний розчин льодової оцтової кислоти на 10%-ному водному розчині гліцерину). У цьому розчині тканину залишають не менш ніж на добу, після чого тканину поміщають на предметне скло й акуратно, препарувальною голкою перетворюють її в суспензію. З краплі отриманої суспензії кліток готують мазок, що сушать протягом 30 і більше хвилин. Мазки докрашують розчином азур-еозина за Романовським 5 хвилин. Потім проводили порівняльний аналіз кількості утворених мікроядер та подвійних ядер. Частота утворення мікроядер (МЯ) та подвійних ядер (2Я), а саме величина відхилення від контролю була використана для оцінки генотоксичності води. Отримані дані представлені в таблиці 3. 45 Таблиця 3 Досліджувані проби Контроль Хлоралгідрат Тип клітин Клітини зябер Клітини зябер Клітини з мікроядрами, ‰ 6,00 9,33 Двоядерні клітини, ‰ 0,67 5,00 Як видно із таблиці, реалізація відомого способу [5] не забезпечує високу точність виявлення клітин з аномальними ядрами (МЯ, 2Я). Про це свідчить наявність у контрольній воді 2 UA 104175 C2 5 мікроядер та подвійних ядер, що вказує на реакцію тест-організму не тільки на токсичні речовини у воді, а й на інші подразники. Для визначення ефективності відомого способу, нами були проведені досліди по 3 3 визначенню генотоксичності питної води, що містила мідь в кількості 0,01 мг/дм і 2,5 мг/дм . Отримані дані представлені в таблиці 4. Таблиця 4 Досліджувані проби Тип клітин Контроль Клітини зябер 2+ 3 Сu 0,01 мг/дм Клітини зябер 2+ 3 Сu 2,5 мг/дм Клітини зябер 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Клітини з мікроядрами, ‰ МЯ Двоядерні клітини, ‰ 2Я 0,3 0,85 3,0 0,90 9,8 53 Отримані нами дані підтверджують результати, надані в способі [5], тобто при визначенні генотоксичності водного середовища створюються умови, які приводять тест-організми до стресового стану, що в свою чергу призводить до утворення аномальних ядер у контрольному 3 середовищі. Так, наприклад, при низькій концентрації токсиканта 0,01 мг/дм , що відповідає ГДК [ДСанПиН «Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання»] [6], отриманий майже одинаків результат за кількістю мікроядер та подвійних ядер контрольному і дослідному питної води. Кращий результат одержані при підвищені 2+ 3 концентрації Сu 2,5 мг/дм . Таким чином, як недолік способу [5] можна відмітити, що при визначенні аномалій ядер (МЯ, 2Я), які характеризуються лише частотами утворення мікроядер та подвійних ядер, не забезпечуються висока точність та інформативність щодо оцінки генотоксичності водного середовища. Слід відмітити, що згідно з способом [5] можна одержати дані тільки з генотоксичності водного середовища, і його реалізації не передбачає визначення показників цитотоксичності питної води. Винахід направлено на розробку способу визначення цитогенетичних показників питної води за допомогою біотестування, в якому використання як біомаркера нативних препаратів епітеліальних клітин зябер, забезпечило б одночасно використання двох критеріїв оцінки токсичності цито- та генотоксичності водного середовища з високою інформативністю і точністю при виявленні дії токсичних речовин в значно менших кількостях. Для вирішення поставленої задачі запропоновано спосіб визначення цито- і генотоксичності питної води, що включає введення тест-організму, риби, в останню, витримування та виділення частини тест-організму, в якому згідно з винаходом, як частину тест-організму виділяють зяброву тканину, препарують нативні епітеліальні клітини зябер тест-об'єкта визначають зміни морфологічної структури епітеліальних клітин та їх ядер і за їх змінами оцінюють цито- і генотоксичність питної води, при цьому як тест-організм використовують: карась сріблястий Carassius auratus gibelio, золота рибка Carassius auratus auratus, даніо pepio Danio rerio. Однією з інтегральних систем, що дозволяють простежити порушення на різних рівнях функціонування риб, є зяброва система. Зябра виконують кілька життєвих функцій (а саме, респіраторну, осморегуляторну й екскреторну), мають велику поверхню безпосередньо контактуючу із зовнішнім середовищем і являються тим органом у риб, який одним з перших зазнає впливу хімічних і фізичних змін водного середовища. Клітини зябер визнані чутливим індикатором якості та токсичності води [Wendelaar Bonga S. E. The stress response in fish // Physiology Reviews. - 1997. - Vol. 77. - P. 591-625] [7]. Для визначення цитогенотоксичних показників водного середовища, нами вперше запропоновано як біомаркера нативні епітеліальні клітини зябрової тканини тест-об'єкта. Під дією токсикантів відбувається зміни морфологічної структури епітеліальних клітин з утворенням клітин з конденсованим або фрагментованим хроматином, тобто клітини в стані апоптозу. Це дає можливість визначити цитотоксичність питної води. Одночасно відбувається зміни морфологічної структури ядер епітеліальних клітин, що дає можливість за мікроядерним аналізом визначати генотоксичність. Визначення зміни морфологічної структури епітеліальних клітин та їх ядер у досліджуваних риб, які перебували у контрольних та токсичних водних зразках, дозволяє одержати більш повну картину впливу токсичних речовин на тест-організм, на клітинному рівні. При цьому досягається неочікуваний ефект - отримання даних, які характеризують одночасно цито- і генотоксичність водного середовища з високою точністю, повною і достовірною інформативністю, що особливо важливо при дослідженні впливу токсикантів у малих концентраціях у питній воді. Це в свою чергу, підвищує чутливість, 3 UA 104175 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інформативність та повної і достовірно точної оцінки способу, щодо оцінки цито- та генотоксичність питної води. Відомо, що навіть при низьких концентраціях токсикантів (мідь) у питній воді останні накопичуються в організмі і після всмоктування в кров пошкоджують центральну нервову систему, печінку і нирки, порушують фосфорно-кальцієвий обмін, а хронічне отруєння призводить до анемії і руйнування кісток, відзначається підвищений ризик раку легенів. Дослідження на тваринах свідчать про тератогенний, канцерогенний ефект токсикантів. Ряд досліджень свідчить про мутагенну активність сполук міді таких як пригнічення РНК-полімерази, хромосомні аберації й аномальний клітинний поділ у тварин [Zhou X. Chemical and biological evidence for base propenals as the major source of the endogenous MldG adduct in cellular DNA / X. Zhou, K. Taghizadeh, P. C. Dedon // J. Biol. Chem. - 2005. - Vol. 280. - P. 253-258] [8]. Таким чином сукупність суттєвих ознак запропонованого способу визначення цито- та генотоксичності питної води для оцінки токсичності водного середовища, є необхідною і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату - значного покращення результатів щодо отримання об'єктивної, повної та достовірно точної оцінки токсичності питної води одночасно за двома показниками: цитотоксичність та генотоксичність. Спосіб реалізується наступнім чином. В способі визначення цито- та генотоксичності питної води використовували наступний набір тест-організмів - риби: - карась сріблястий, Carassius auratus gibelio; - золота рибка, Carassius auratus auratus; - даніо pepio, Danio rerio; та їх епітеліальні клітини зяберної тканини і визначали наступні аномалії ядер: • мікроядра (МЯ); • подвійні ядра (2Я); • клітини в стані апоптозу; Дослідження проводили за наступною схемою: Відбирали по 10 особин для контрольної та дослідної групи. Як об'єкт дослідження брали водні зразки питної води, які містили соль міді 3 3 2+ CuSO4·5Н2О в концентрації 0,01 мг/дм та 2,5 мг/дм по іону Сu . Після експозиції у воді, через 4 доби, від кожної особини отримували зразки зябер. Для дослідження клітин зябер використовували техніку приготування нативних препаратів згідно з [Бокуняева Н.И., Золотницкая Р.П. В кн.: Справочник по клиническим лабораторным методам исследования. Под ред. Е.А. Кост. М, 1968. - Р. 29-295] [9]. Відбитки зяброві тканини фіксували метанолом на 1-3 хвилин й фарбували флуоресцентним ядерним барвником Hoechst 33258 в протягом 10-15 хвилин. На отриманих препаратах підраховували епітеліальні клітини з конденсованим або фрагментованим хроматином, що є характерною ознакою клітин у стані апоптозу, за одержаними даними визначали цитотоксичність водного зразка. Визначали також частоту епітеліальних клітин зябер з мікроядрами та подвійними ядрами, що характеризувала генотоксичність. Препарати аналізували при загальному збільшенні х1000 під люмінесцентним мікроскопом, з додатковим використанням ефекту змішаного висвітлення. Кількість клітин, проаналізованих для кожної риби становила 3000 клітин. Статистична обробка проводилася стандартними методами, токсичний ефект вважається дійсним при статистично достовірній різниці із контролем [Лакин Г. Φ. Биометрия. - Μ.: Высш. шк. 1980. - 293 с] [10]. Приклади реалізації за винаходом. Приклад 1. 3 Брали зразок питної води, що містив іони міді в концентрації 0,01 мг/дм . Як тест-організм використовували - карась сріблястий, Carassius auratus gibelio. Відбирали по 10 особин; контрольну групу (10 особин) вміщували у стандартну лабораторну воду та інкубували протягом чотирьох діб. Як контрольний зразок використовували підготовлену лабораторну воду (відстояна водопровідна вода), яка відповідала стандартним рівням гідрохімічних показників: 3 3 вміст O2 у воді акваріумів становив 7,52+0,19 мг/дм , СО2 - 2,34+0,13 мг/дм , а значення pH 7,64+0,13, температура складала +20 °C Методические руководство по биотестированию воды РД 118-02-90. - Μ., 1991. - 29 c.] [11]. Дослідну групу (10 особин) вміщували у зразок питної води. Після закінчення інкубації у всіх риб відбирали шматочок зябрової тканини. Готували нативні препарати та проводили цитологічні дослідження за методикою [9]. У підготовленому цитологічному препараті визначали епітеліальні клітини у стані апоптозу в тканинах зябер і одночасно визначали частоту епітеліальних клітин з мікроядрами та подвійними ядрами. Препарати аналізували при загальному збільшенні x1000 під люмінесцентним мікроскопом, кількість клітин, проаналізованих для кожної риби становила 3000 клітин. Зміни морфологічної 4 UA 104175 C2 структури епітеліальних клітин та їх ядер представлені на Фіг. 1, де а - епітеліальні клітини у контрольному зразку, б - клітини в стані апоптозу (вказано стрілкою), в - клітини з мікроядрами (вказано стрілкою). Дані представлені в таблиці 5, (приклад 2). Таблиця 5 Досліджувані проби № п/п 1 Контроль 2 Сu 3 Сu 2+ 0,01 мг/дм 2+ 2,5 мг/дм 3 3 Клітини зябер Клітини зябер Клітини зябер Клітини у стані апоптозу, ‰ Клітини з мікроядрами, ‰ МЯ Двоядерні клітини, ‰ 2Я 0 0 0 17,63 2,67 6,33 22,99 Тип клітин 14,67 18,33 5 10 15 20 Приклад 2. Дослідження проводили аналогічно прикладу 1, але визначення цитогенетичних показників 3 здійснювали у зразку питної води, що вмістив іони міді в концентрації 2,5 мг/дм . Дані представлені в таблиці 5 (приклад 3) та на Фіг. 2, де г - епітеліальні клітини у контрольному зразку, д - клітини в стані апоптозу (вказано стрілкою), е - клітини з мікроядрами (вказано стрілкою). Дані представлені на Фіг. 1 і 2 та таблиці 5 показують що заявлюваний спосіб дає можливість визначити одразу два критерії, цито- та генотоксичність водного середовища з високою точністю (відсутність аномальних явищ в контролі), що досягається при значно малих концентраціях токсиканта. Слід відмітити, що відомим способом [5], згідно нашими даними було виявлено тільки генотоксичний вплив вказаних водних зразків, причому у контрольної групи також були виявлені аномалії ядер, що негативно впливає на точність одержаних даних (таблиця 4). Приклад 3. Об'єктом водного середовища був зразок питної води, що містив іони міді в концентрації 2,5 3 мг/дм . Як тест-організм брали - золота рибка, Carassius auratus auratus. Готували нативні препарати та проводили дослід, як описано у прикладі 1, реалізація за винаходом, які свідчать про високу точність визначенні цитогенетичних показників. Дані представлені в таблиці 6. Таблиця 6 Досліджувані проби Контроль 2+ 3 Сu 2,5 мг/дм Тип клітин Клітини у стані апоптозу, ‰ Клітини зябер Клітини зябер 0 26,33 Клітини з мікроядрами, ‰ МЯ 0 13,59 Двоядерні клітини, ‰ 2Я 0 15,34 25 30 35 Реалізація способу визначення цито- та генотоксичності питної води, що заявляється, з виявленням нативних препаратів епітеліальних клітин зябрової тканини тест-об'єкта забезпечує: - одночасно визначити двох показників токсичності водного зразка, а саме цито- та генотоксичності, що не досягається жодним відомим способом; - підвищення точності і чутливості цитогенотичних показників, що досягається відсутності аномальних явищ у контрольному зразку. Це особливо важливо при визначенні впливу низьких концентрації токсиканта (на рівні ГДК). Таким чином, реалізація способу, що заявляється, забезпечує одержання більш широкої інформації про токсичну дію різних токсикантів на клітинному рівні, а саме, морфофункціональної структури клітин та їх ядер на рівні генетичного апарата організму. Це є необхідною і достатньою для досягнення забезпечуваного винаходом технічного результату значного покращення результатів щодо отримання об'єктивної, повної та достовірно точної оцінки цитотоксичності та генотоксичності питної води. 40 5 UA 104175 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 1. Спосіб визначення цито- і генотоксичності питної води, що включає введення тест-організму, риби, в останню, витримування та виділення частини тест-організму, який відрізняється тим, що препарують нативні епітеліальні клітини зябер тест-об'єкта, визначають зміни морфологічної структури ядер епітеліальних клітин і за частотою клітин із мікроядрами і подвійними ядрами визначають генотоксичність, а за кількістю клітин у стані апоптозу визначають цитотоксичність питної води. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що як тест-організм використовують: карась сріблястий Carassius auratus gibelio, золота рибка Carassius auratus auratus, даніо pepio Danio rerio. Комп’ютерна верстка А. Крулевський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 6

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Honcharuk Vladyslav Volodymyrovych, Verholias Maia Rozmetivna

Автори російською

Гончарук Владислав Владимирович, Верголяс Майя Розметовна

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/18

Мітки: визначення, води, генотоксичності, питної, спосіб, цито

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/8-104175-sposib-viznachennya-cito-ta-genotoksichnosti-pitno-vodi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення цито- та генотоксичності питної води</a>

Подібні патенти