Спосіб раннього виявлення дисфункції щитоподібної залози йододефіцитної етіології

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб раннього виявлення дисфункції щитоподібної залози йододефіцитної етіології, який включає діагностику йододефіцитного вузлового колоїдного зобу та прогноз небезпеки утворення вузлів, який відрізняється тим, що у тканині щитоподібної залози або сироватці крові людини визначають концентрацію металотіонеїнів за кількістю депонованого металу (металодепонувальна форма, МТ-Ме) та тіолових груп (апотіонеїн, МТ-SH), обраховують їх співвідношення як MT-SH/MT-Me та класифікують стадійність перебігу патологічного процесу у структурі паренхіми зобно-зміненої тканини щитоподібної залози як "компенсація", "субкомпенсація" та "декомпенсація", залежно від величини цього співвідношення і варіабельності абсолютного рівня його складових відносно запропонованих референтних значень.

Текст

Реферат: Спосіб раннього виявлення дисфункції щитоподібної залози йододефіцитної етіології включає діагностику йододефіцитного вузлового колоїдного зобу та прогноз небезпеки утворення вузлів. У тканині щитоподібної залози або сироватці крові людини визначають концентрацію металотіонеїнів за кількістю депонованого металу (металодепонувальна форма, МТ-Ме) та тіолових груп (апотіонеїн, МТ-SH), обраховують їх співвідношення як MT-SH/MT-Me та класифікують стадійність перебігу патологічного процесу у структурі паренхіми зобно-зміненої тканини щитоподібної залози як "компенсація", "субкомпенсація" та "декомпенсація", залежно від величини цього співвідношення і варіабельності абсолютного рівня його складових відносно запропонованих референтних значень. UA 100776 U (12) UA 100776 U UA 100776 U 5 Корисна модель належить до області медицини, а саме медичної біохімії, ендокринології та хірургії і може бути використана для діагностики вузлового колоїдного зобу, функціонального стану щитоподібної залози, прогнозу небезпеки патологічних станів у щитоподібній залозі людини та їх профілактики. Відомий спосіб ранньої діагностики порушення функції щитоподібної залози у дітей. Відповідно до опису моделі проводять збір анамнезу, ультразвукове дослідження щитоподібної залози, скринінгові неінвазивні методи, психологічне тестування та визначають функціональну активність щитоподібної залози. За сумою ознак обраховують ризик розвитку дисфункції (Qi  Ni ) , де Ni - відсутність інформативної ознаки; Ri Ni i1 Q i - наявність інформативної ознаки; R i - експертна оцінка довіри за і-ознакою, і при значенні Q більше 26,5 діагностують дисфункцію щитоподібної залози (патент РФ № 2230495). Відомий спосіб оцінки стану щитоподібної залози у дітей раннього віку (RU (11) 2269298 (13) С1), який полягає у проведенні ультразвукового дослідження і визначенні тиреоїдного об'єму. Для оцінки гіперплазії або гіпоплазії щитоподібної залози пропонується розрахувати масу залози і виміряти масу дитини. Визначають коефіцієнт відношення маси залози до маси дитини за яким і оцінюють стан щитоподібної залози. Відомий також подібний спосіб діагностики зобу і гіпоплазії щитоподібної залози у дітей (патент РФ № 2116752, автори: Касаткіна Е.П., Шилін Д.Є., Пиков M.I.) - Спосіб ґрунтується на проведенні ультразвукового дослідження, визначенні тиреоїдного об'єму і порівнянні параметрів зі значенням індивідуальної норми, яка обчислюється за антропометричними показниками з подальшою діагностикою зоба. Недоліками цих способів є їх базування на морфологічних (антропометричних) критеріях, зміна яких відбувається на пізніх стадіях розвитку патології, та обмежений набір методів для дослідження щитоподібної залози, який не може забезпечити адекватної інформації для ранньої діагностики функціональної здатності залози. Відомий спосіб біохімічної діагностики патологічних станів у щитоподібній залозі (зоб, анапластична тиреоїдна карцинома) на підставі імуноензимного аналізу (ELISA) рівня BAG 3 протеїну у сироватці крові людини (патент CШA US8673585 В2, 2010 p.). Збільшення його експресії вказує на потенційний розвиток анапластичної тиреоїдної карциноми, а зменшення на розвиток зобу. Недоліком пропонованого методу є низька його специфічність, позаяк BAG 3 протеїн експресується за низки онкологічних захворювань, зокрема колоректального раку, раку підшлункової залози та захворювань серцево-судинної системи. Відомий спосіб диференційної діагностики вузлового зобу, кіст і пухлин щитоподібної залози методом радіоізотопного сканування, який ґрунтується на селективному захопленні 131 радіоактивного ізотопу йоду І нормальною і пухлино-зміненою тканиною щитоподібної залози. У трансформованій тканині ("холодні" вузли) виникає "дефект" накопичення ізотопу. Недоліком методу є те, що феномен накопичення радіоактивного ізотопу не завжди дозволяє диференціювати вузловий зоб, кісту і пухлини щитоподібної залози, що було виявлено D. Honore зі співавт. (1975) при аналізі вибірки 300 хворих. Відомий спосіб визначення функціонального стану фетальної щитоподібної залози плоду людини. Для оцінки пропонується визначати рівень індикатора фетальних тиреоїдних гормонів (FTFI) у крові та сечі матері, а також сироватці плоду. Зниження рівня FTF1 у біологічних рідинах матері указує на зниження рівня ТЗ у плоду, а, відтак, на зниження гормонопродукуючої функції щитоподібної залози та гормональний дисбаланс дитини. Підвищений рівень FTFI указує на нормальний перебіг вагітності та гормоно-продукуючу функцію щитоподібної залози дитини (патент США № US5670380 А, 1997 р.). Нами був розроблений спосіб визначення субклітинного розподілу йоду у тканині щитоподібної залози (Спосіб визначення концентрації йоду в біосубстраті, №45332, 2009 p., автори: Шідловський О.В., Шідловський В.О., Столяр О.Б., Осадчук Д.В., Фальфушинська ГЛ.). Дані щодо субклітинного розподілу інтратиреоїдного йоду (збільшення вмісту та частки неорганічного йоду у структурі загального) у поєднанні з аналізом морфологічних змін у тиреоїдині паренхімі дозволяють оцінювати функціональний стан тиреоцитів та визначати стадійність розвитку вузлового колоїдного зобу. Найближчим до пропонованого способу вважаємо спосіб оцінки функціонального стану щитоподібної залози (див. патент РФ RU 2328746, заявники Коновалов В.О., Зубєєв П.С., Бавріна А.П., Жуков МО., Конторщикова К.М.), що включає визначення рівня окисних модифікацій білків за рівнем карбонільних похідних нейтрального та основного характеру, а також вмісту первинних продуктів перекисного окислення ліпідів, дієнових і трієнових кон'югатів і щитоподібної залози за формулою Q  10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 ik  1 UA 100776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 основ Шиффа у рідкій частині пунктату вузлів щитоподібної залози. Залежно від сукупності значень вузли щитоподібної залози класифікують як функціонально активні ("гарячі") або функціонально неактивні ("холодні"). Недоліками способу є неповнота аналізу функціональної активності залози лише за визначенням окремих прооксидантних проявів. На нашу думку, це не дозволяє зробити однозначні висновки про рівень активності системи антиоксидантного захисту (компенсована активація, або пригнічення) та, відповідно, оцінити ступінь прогресування патологічного процесу. Відтак, проведений патентний пошук свідчить про обмежені можливості у диференціації і прогнозі функціонального стану щитоподібної залози, що ґрунтуються, здебільшого, на аналізі морфологічних, антропометричних промірів та ультразвукової діагностики, та окремих, мало специфічних молекулярних критеріях. Йододефіцитні захворювання відносяться до числа найбільш поширених неінфекційних захворювань людини. Нестача йоду призводить до розладів репродуктивної системи, кретинізму, ендемічного зобу, причому останній займає чільне місце з-поміж йододефіцитної патології. За даними ВООЗ на ендемічний зоб страждає близько 7 % населення планети. У зв'язку з цим питання диференційної діагностики, прогнозу та вибору клініко-морфологічних критеріїв функціональної автономії і прогресування зростання вузлів являють собою актуальну проблему сучасної медичної біохімії, клінічної ендокринології, хірургії та онкології. Присутність у середовищі "неспецифічних" струмогенів, зокрема, іонів міді, може модулювати ендогенний рівень йоду. Одним з механізмів пошкоджувальної дії міді, як потенційного струмогену, може бути окисне ушкодження біомолекул. Доведемо, що прооксидантній дії міді сприяє дисбалансування метаболічно активних форм міді та цинку у тканині. У свою чергу, цей розподіл залежить від рівня їх депонування металотіонеїнами (МТ) специфічними цинк-мідь-кадмій депонувальними протеїнами у відповідності до редокс-статусу їх тіолових груп та концентрації у тканині. Відповідно, функціональний стан МТ визначається рівнем експресії генів МТ та стабільністю функціонально активної форми (Outten and O'Halloran, 2001; Krezel and Maret, 2007). В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу прогнозування утворення вузлів у зобно-зміненій щитоподібній залозі людини за умов йододефіциту на підставі оцінки функціональної здатності стресочутливого і метало-депонувального протеїну металотіонеїну в однойменній тканині та/або крові. Поставлена задача вирішується тим, що на основі визначення концентрації МТ у щитоподібній залозі або сироватці крові людини за кількістю депонованого металу (металодепонувальна форма, МТ-Ме) та тіолових груп (загальний вміст, MT-SH) обраховується співвідношення МТ-SH/MT-Me. Стадійність перебігу патологічного процесу у залозі класифікуємо як "компенсація", "субкомпенсація" та "декомпенсація", остання з яких відповідає глибоким депресивним змінам за тривалості захворювання більше ніж 25 років. МТ - це низькомолекулярні термостабільні, сульфур-вмісні протеїни цитозолю з плейотропними функціями. З одного боку, вони з високою ефективністю акумулюють практично весь кадмій у метаболічно-активних тканинах, беруть участь у гомеостазі цинку та міді, а з іншого - можуть функціонувати як стресочутливі протеїни, оскільки їх синтез індукується численними стресорними чинниками та прооксидантами, та є потенційними антиоксидантами, оскільки, як встановлено в умовах in vitro, пригнічують перекисно-радикальні процеси. Також МТ залучаються до регуляції проліферації та диференціації клітин, розвитку пухлин, вироблення резистентності до радіо-та хіміотерапії тощо. Нами було доведено, що МТ щитоподібної залози у зобно-зміненій тканині активно залучаються до зменшення наслідків окисного ушкодження, виконуючи роль пастки радикалів за рахунок резерву тіолових груп та хелатуючи метали у нетоксичні для тиреоцитів комплекси (Фальфушинська та ін., 2011, Фальфушинська та ін., 2014). Аналіз МТ слугує важливим діагностичним критерієм прогнозу у розвитку захворювання, зокрема утворення метастазів, а також у застосуванні хіміотерапії. Проте при цьому не враховують плейотропність їх функцій, визначаючи лише єдину їх характеристику. За такого спрощеного підходу поза увагою залишається встановлене нами явище невідповідності загального вмісту МТ та вмісту метало-депонувальної форми МТ (Falfushynska et al., 2011, 2012). За збільшення співвідношення MT-SH/MT-Me у тканині зростає частка апотіонеїнів, які за участю вільних тіолових груп можуть залучатися до знешкодження активних форм кисню, а, відтак, забезпечити частковий компенсаторний вплив на прооксидантні процеси у залозі. Запропонований спосіб здійснюється наступним чином: у пацієнта відбирають 1 мл крові або, інтраопераційно, частки тканини щитоподібної залози масою 220-250 мг, які 2 UA 100776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використовують в подальшому для біохімічного аналізу. У досліджуваних зразках визначають вміст MT-SН та МТ-Ме та обраховують співвідношення показників за формулою MT-SH/MT-Me. Матеріалом для досліджень були зразки сироватки крові осіб, які в анамнезі не мали патології щитоподібної залози, зразки сироватки крові та післяопераційні препарати часток щитоподібної залози 25 хворих, оперованих з приводу однобічного йододефіцитного вузлового колоїдного зоба на базі хірургічного відділення міської клінічної лікарні швидкої допомоги м. Тернополя. Відбирали тканину вузла, паранодулярної (навколовузлової макроскопічно не зміненої тканини) та контрлатеральної (не ураженої вузлом тканини) частки щитоподібної залози. Всі обстежені пацієнти були мешканцями регіону дефіциту йоду середнього ступеню важкості. Всі дослідження проводились у відповідності до ухвали Першого національного конгрес) з біоетики (Київ, 2000) та рішення комісії з біоетики Тернопільського державного медичного університету ім. І.Я. Горбачевского. Всі процедури по обробці тканин проводили на холоді. Всі реактиви, крім нижче зазначених, були фірми "Синбіас" кваліфікації "хч". Для визначення МТ-Ме одержують розчин термостабільних сполук з 10 %-ного гомогенату тканини щитоподібної залози або сироватки крові в 10 мМ трис-НСІ буфері, рН 8,0 з додаванням 10 мМ 2-меркаптоетанолу («Sigma») для запобігання окиснення SH-груп та інгібітора протеаз фенілметилсульфонілфториду (0,1 мМ, "Sigma"). Гомогенат виготовляють з наважки тканини загальною масою 350 мг та центрифугують протягом 45 хв. при 16 000g. Отриманий надосад інкубують 5 хв при 85 °C і знову центрифугують за тих самих умов. Надосад, що містить розчинні термостабільні сполуки, піддають гель-розподільчій хроматографії, яку здійснюють 0,01 М трис-НСІ буфером, рН 8,0 на колонці, заповненій сефадексом G-75 ("Sigma") або сефадексом G-50 ("Sigma"), з охолоджувальним кожухом розміром 501,5 см із швидкісно 0,33 мл/хв. Для запобігання втрат металів, зв'язаних з білками, в елюент не додають ЕДТА. Вимірюють світлопоглинання проб при довжині хвилі 280 і 254 нм (D280 і D254). Калібровку колонки здійснюють за допомогою білків з відомою молекулярною масою - сироваткового альбуміну (67,0 кДа), хімотрипсиногену (25,8 кДа), міоглобіну (17,0 к Да), цитохрому с (12,3 кДа), убіквітину (8,4 кДа) та окисненого β-ланцюга інсуліну (3,4 кДа), (всі маркери фірми "Sigma", США). МТ ідентифікують як низькомолекулярні термостабільні білки із високим показником співвідношення світлопоглинання D254/D280. Після об'єднання проб піку МТвмісної фракції (10 мл) проводять визначення в ній вмісту міді, цинку та кадмію. Вміст металів у фракціях МТ вимірюють після озолення зразків за 105 °C у перегнаній нітратній кислоті в співвідношенні 1:5 (маса:об'єм). Вміст цинку, міді та кадмію визначають на атомно-абсорбційному спектрофотометрі за загальноприйнятими методиками і виражають в мкмоль на г вологої маси тканини. Вміст МТ-Ме в розрахунку на 1 г тканини обчислюють за модифікованим рівнянням Гамільтона, враховуючи стехіометричний характер зв'язування цих металів: m(MTMe)=0,5(((Zn)M(MT)+(Cd)M(MT))/7+(Cu)M(MT)/12) (мкг), де  - кількість металу в МТ, мкмоль/г тканини; М(МТ) середня молярна маса МТ (7000 г/моль), 7 і 12 кількість іонів цинку, кадмію і міді (1) відповідно, що зв'язуються молекулою МТ за повного насичення. Для людини референтне значення вмісту МТ-Ме для тканини щитоподібної залози становить 5,6±0,6 мкг/г тканини, а для крові - 11,5±1,3 мкг/мл крові. Вміст MT-SH у 30 % гомогенаті тканини щитоподібної залози або в сироватці крові в 20 мМ тріс-сахарозному буфері визначають за методом A. Viarengo та співавт. (1997) за взаємодією із 5,5'-дитіо-біс-2-нітробензойною кислотою (ДТНБ) після хлороформ-етанольної екстракції МТ. Для цього приготований гомогенат центрифугують протягом 45 хв при 12000g, 4 °C. Екстракцію супернатанту проводять сумішшю 0,5 мл охолодженого етанолу (до -20 °C) та 0,04 мл хлороформу з наступним центрифугуванням при 6000g протягом 10 хв. До супернатанту додають 3 мл охолодженого етанолу, змішують протягом 15 с і переносять пробу на 1 год. в морозильну камеру. Після цього до суміші додають 1 мл 0,2 М фосфатного буферу рН 8,0 і пробу центрифугують протягом 12 хв при 6000g. Супернатант декантують, а осад промивають 2 мл 20 мМ тріс буферного розчину в етанолі, що містить 1 % хлороформу та 0,5 мМ сахарози та знову центрифугують протягом 20 хв при 3000g, 4 °С. Після цього супернатант знову декантують, а осад ресуспендують в 0,3 мл 5 мМ тріс-ЕДТА буферу, після чого додають 4,2 мл 0,43 мМ розчину ДТНБ в 0,2 М фосфатному буфері рН 8,0 і центрифугують 10 хв при 3000g, 4 °C. Вимірюють світлопоглинання проби при 412 нм. Вміст MT-SH в пробі визначають за калібрувальною кривою, побудованою на глутатіоні та обчислюють, вважаючи, що в 1 молі МТ міститься така ж кількість SH-груп, як і в 20 молях глутатіону і виражають в мкг/г вологої тканини або мкг/мл крові. 3 UA 100776 U 5 10 15 Для щитоподібної залози людини вміст MT-SH в нормі становить 5,5±0,6 мкг/г тканини, а у крові - 13,2±1,3 мкг/мл крові. Стадійність перебігу патологічного процесу кваліфікують як: "компенсація" - значення MT-SH та МТ-Ме перевищують на 20-50 % референтні значення показників. При цьому, незважаючи на наявність патологічного процесу, зміни в структурах ураженого органа забезпечують його подальше адекватне функціонування; "субкомпенсація" MT-SH/MT-Me становить більше 2,5 (стан тривоги, посилена експресія МТ із зростанням антиоксидантного потенціалу). Субкомпенсаторна стадія структурного гомеостазу супроводжується поглибленням патоморфологічних змін; '"декомпенсація" - значення MT-SH та МТ-Ме менші на 20-50 % референтних значень (пригнічення стрес-індукованої відповіді в результаті виснаження стресочутливих систем, втрата здатності зв'язувати метали у нетоксичні комплекси та реагувати на прогресування патологічного стану збільшенням вмісту білка). Реалізація корисної моделі проілюстрована на прикладах оцінки) ункціонального стану щитоподібної залози на підставі визначення співвідношення MT-SH/MT-Me у зразках біологічного матеріалу тканини залози та крові людини. Приклад 1. Порівнювали співвідношення показників MT-SH/MT-Me у тканині щитоподібної залози осіб, які в анамнезі не містили патології щитоподібної залози (К-група) та хворих на йододефіцитний вузловий колоїдний зоб. Одержані результати представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Оцінка функціонального стану щитоподібної залози людини на підставі визначення співвідношення концентрації металотіонеїн-асоційованих тіолів (MT-SH) до концентрації металів у металотіонеїнах (МТ-Ме) у біоматеріалі щитоподібної залози людини, M±SD, n=25 Показник К MT-SH, мкг/г тканини МТ-Ме, мкг/г тканини Співвідношення MTSH/MT-Me 5,5±0,6 5,6±0,6 1,0±0,1 Групи обстежуваних Вузловий йододефіцитний колоїдний зоб Контрлатеральна Паранодулярна Вузол частка тканина а a,b a,b,c 11,3±1,8 25,4±3,7 38,4±3,2 а,b a,b,c 7,8±1,1 12,3±1,7 18,4±2,3 1,5±0,1 а 2,1±0,1 a,b 2,1±0,1 a,b Примітка. Тут і в таблиці 2: а - відмінності показників вірогідні порівняно з контролем, b відмінності показників вірогідні порівняно з тканиною контрлатеральної частки щитоподібної залози; с - відмінності показників вірогідні порівняно з паранодулярною тканиною щитоподібної залози 20 Приклад 2. Порівнювали співвідношення показників MT-SH/MT-Me у тканині щитоподібної залози осіб, які в анамнезі не містили патології щитоподібної залози (К-група) та хворих на йододефіцитний вузловий колоїдний зоб (ВКЗ-група). Одержані результати представлені в таблиці 2. 25 Таблиця 2 Оцінка функціонального стану щитоподібної залози людини на підставі визначення співвідношення концентрації металотіонеїн-асоційованих тіолів (MT-SH) до концентрації металів уметалотіонеїнах (МТ-Ме) у сироватці крові людини, M±SD, n=18 Групи обстежуваних К ВКЗ а 13,2±1,3 25,1±2,9 11,5±1,3 10,0±1,4 а 1,15±0,2 2,5±0,4 Показник MT-SH, мкг/г тканини МТ-Ме, мкг/г тканини Співвідношення MT-SH/MT-Me 30 Як відомо, МТ, низькомолекулярні внутрішньоклітинні, високоаффінні до іонів d-металів білки, у амінокислотному складі яких близько 30 % припадає на цистеїн, забезпечують депонування металів у метаболічно активних тканинах. У печінні вони зв'язують переважно цинк та, меншою мірою, мідь (Maret, 2011; Raudenslai еt аl., 2014). Дані щодо властивостей та 4 UA 100776 U 5 10 15 20 25 30 35 40 функцій МТ щитоподібної залози поодинокі та стосуються, здебільшого, участі МТ в канцерогенезі. Згідно одержаних нами результатів за йододефіцитного вузлового колоїдного зобу збільшується у них вміст МТ та рівень в них металів. Проте їх метало-депонувальна здатність зростає менше, ніж загальний вміст, в зв'язку з чим збільшується співвідношення MTSH/MT-Me, тобто зростає частка апотіонеїну. Відтак, посилюється антиоксидантний потенціал МТ у знешкодженні активних форм кисню та підтриманні редокс-потенціалу у тканині за участю вільних тіолових груп. Наведені міркування підтверджуються результатами множинного регресійного аналізу, оскільки детермінантами змін вмісту МТ у тканині щитоподібної залози є вміст міді та рівень утворення оксирадикалів (ОР): МТ=0,37+2,44·Сu(МТ)*-1,17Zn(MT)+7,51OP*, 2 R =0,77; p

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/48, G09B 23/28

Мітки: йододефіцитної, залози, дисфункції, щитоподібної, раннього, спосіб, виявлення, етіології

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/8-100776-sposib-rannogo-viyavlennya-disfunkci-shhitopodibno-zalozi-jjododeficitno-etiologi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб раннього виявлення дисфункції щитоподібної залози йододефіцитної етіології</a>

Подібні патенти