Спосіб прогнозування плоїдності рослин у культурі in vitro

Реферат: Винахід належить до способу прогнозування плоїдності рослин у культурі in vitro, що включає: підбір батьківських форм гібриду, висаджування в умовах in vitro пиляків або насіннєвих зачатків гібридних рослин на штучне поживне середовище та регенерацію рослин із новоутворень, культивування рослин-регенерантів, проведення прогнозування плоїдності рослин-регенерантів, причому підбір батьківських форм гібриду здійснюють за морфологічною маркерною ознакою щонайменше одного з них, а визначення плоїдності проводять шляхом аналізу розщеплення рослин-регенерантів за цією маркерною ознакою, причому, визначають гаплоїдне походження рослин-регенерантів за умови розщеплення гібридів за маркерною ознакою і диплоїдне походження – за умови відсутності розщеплення. UA 99675 C2 (12) UA 99675 C2 UA 99675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спосіб належить до біології, а саме до біотехнології рослин, та дозволяє з високою ймовірністю прогнозувати походження рослин-регенерантів у культурі in vitro і проводити добір рослин, одержаних із гаплоїдних клітин, з метою створення гомозиготних ліній. Відомий спосіб створення форм сої зі зміненим жирно-кислотним складом, який базується на аналізі плоїдності рослин [Способ создания форм сои с измененным жирно-кислотным составом масла / Зеленцов СВ., Кочегура А.В., Шведов И.В., Шишков Г.З. - Патент RU 2215406 Опубл. 10.11.2003], який включає підбір вихідних диплоїдних сортів, їх переведення на тетраплоїдний рівень, добір у кількох поколіннях тетраплоїдів реверсивних диплоїдних рослин, їх розмноження в ряду поколінь та оцінку в кожному з них їх плоїдності за морфологічними ознаками та прямим підрахунком хромосом шляхом проведення цитологічного аналізу. Недоліками вказаного способу є те, що даний спосіб не придатний для визначення походження рослин у культурі in vitro, а також для визначення рослин гаплоїдного походження, плоїдність рослин необхідно оцінювати в ряду поколінь, поряд з аналізом морфологічних ознак необхідно використовувати і цитологічний аналіз для підрахунку кількості хромосом. Відомий спосіб прогнозування гаплоїдного походження рослин у культурі in vitro [Ницше В., Венцель Г. Гаплоиды в селекции растений. -М: Колос, 1980.-128 с, С. 104], який включає підбір батьківських компонентів гібриду, висаджування в умовах in vitro пиляків або насіннєвих зачатків гібридних рослин на штучне поживне середовище та регенерацію з новоутворень рослин, відбір проб тканин рослин-регенерантів та проведення цитологічного аналізу плоїдності клітин цих тканин. Недоліками цього способу є те, що доказ гаплоїдної природи рослин, одержаних через культуру in vitro пиляків та насіннєвих зачатків, з використанням цитологічного аналізу викликає значні труднощі. Він досить важкий за виконанням, та такий, що не завжди може бути здійснений через відсутність на цитологічних препаратах клітин у відповідній фазі мейозу, яка придатна для підрахунку кількості хромосом у досліджуваних рослинах. Цитологічний аналіз складно, але бажано застосовувати на найраніших етапах формування новоутворень. Пізніше на рівні сформованої рослини він не завжди прийнятний, оскільки, наприклад, рослини, джерелом походження яких були гаплоїдні мікроспори, на момент цитологічного аналізу можуть мати подвоєний набір хромосом лише за рахунок культивування in vitro і тому їх шляхом підрахунку кількості хромосом за допомогою цитологічного аналізу, вже неможливо відрізнити від рослин-регенерантів, ініційованих зі спорофітних тканин. Цей спосіб потребує значних витрат часу, реактивів і є трудомістким. Спільними ознаками, з рішенням, що заявляється, є: підбір батьківських компонентів гібриду, висаджування в умовах in vitro пиляків або насіннєвих зачатків гібридних рослин на штучне поживне середовище, регенерація з новоутворень рослин, культивування рослинрегенерантів, проведення аналізу плоїдності рослин-регенерантів. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб прогнозування плоїдності рослин у культурі in vitro шляхом аналізу генетичної структури популяції рослин-регенерантів за маркерною ознакою батьківської форми, що дозволяє розширити арсенал методів визначення плоїдності рослини та спростити процедуру визначення гаплоїдної або диплоїдної природи походження рослин в умовах in vitro. Суттєвими ознаками способу є: - підбір батьківських компонентів гібриду за маркерною ознакою щонайменше одного з них; - висаджування в умовах in vitro пиляків та/або насіннєвих зачатків гібридних рослин на штучне поживне середовище; - регенерація з новоутворень рослин; - культивування рослин-регенерантів до появи на них маркерної ознаки; - прогнозування плоїдності рослин шляхом аналізу генетичної структури популяції рослинрегенерантів за цією маркерною ознакою. Відмінними від прототипу ознаками є: - підбір батьківських компонентів гібриду за маркерною ознакою щонайменше одного з них; - прогнозування плоїдності рослин шляхом аналізу генетичної структури популяції рослинрегенерантів за цією маркерною ознакою. Спосіб здійснюють таким чином: підбирають батьківські компоненти гібриду, як мінімум один з яких несе маркерну ознаку; висаджують в умовах in vitro пиляки та/або насіннєві зачатки на штучне поживне середовище; ініціюють регенерацію з новоутворень рослин; культивують рослини-регенеранти до появи на них маркерної ознаки; проводять аналіз генетичної структури популяції за маркерною ознакою батьківської форми та за його результатами визначають плоїдність клітин, з яких походять рослини-регенеранти. 1 UA 99675 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 За маркерну ознаку доцільно використовувати таку, що легко виявляється на певній стадії розвитку рослини. Вона може бути як рецесивною, так і домінантною. Якщо джерелом походження популяції рослин-регенерантів є гаплоїдні структури (мікроспори /мегаспори), то серед даних рослин спостерігається розщеплення за маркерною ознакою, а у випадку, якщо таким джерелом є спорофітні тканини, то розщеплення не спостерігається, тобто всі рослини мають однакові морфологічні ознаки. Для прогнозування джерела походження новоутворень (такими джерелами можуть бути мікроспори/мегаспори або спорофітні тканини пиляка чи насіннєвого зачатка), що утворюються при культивуванні in vitro пиляків чи насіннєвих зачатків гібриду F1, нами запропоновано використати аналіз генетичної структури популяції регенерованих із новоутворень рослин за маркерною ознакою, що притаманна, щонайменше, одному з батьківських компонентів гібриду. Як маркерну ознаку можна використовувати таку, що чітко ідентифікується на відповідній стадії розвитку рослини (наприклад, забарвлення листків або колір квітки). Однотипність за геномом диплоїдних клітин спорофітних тканин пиляка та насіннєвих зачатків гібриду, в разі утворення з них регенерантів, обумовлює однотипність за морфологічними ознаками і рослин-регенерантів. На відміну від диплоїдної клітини спорофітної тканини, мікроспора/мегаспора має гаплоїдний генотип й одержує в процесі мейозу лише по одній з кожної пари гомологічних хромосом. Це призводить до того, що з різних за генотипом мікроспор/мегаспор гібриду формуються різні за морфологічними ознаками рослини-регенеранти. Внаслідок цього серед рослин-регенерантів за маркерною ознакою відбувається розщеплення на декілька класів - два класи рослин виявляють у випадку контролювання досліджуваної ознаки, яка обумовлена однією парою генів, чотири класи - двома парами генів при їх незалежному успадкуванні і т. ін. Таким чином, якщо джерелом походження популяції рослин-регенерантів є гаплоїдні структури (мікроспори/мегаспори), то серед даних рослин спостерігається розщеплення за маркерною ознакою, а у випадку, якщо джерелом походження популяції рослин-регенерантів є спорофітні тканини, то розщеплення не спостерігається, тобто всі рослини мають однакові морфологічні ознаки. Це виявляють у результаті візуального спостереження, що не потребує особливих знань чи спеціального обладнання. Суттєвою перевагою даного способу є ще й те, що він працює на будь-якому виді квіткових рослин. На фіг. 1 зображено схему утворення рослин-регенерантів із гаплоїдних клітин при культивуванні пиляків гібриду МІ2 х М24. На фіг. 2. наведено схему утворення рослин-регенерантів із диплоїдних клітин при культивуванні пиляків гібриду МІ2 х М24. Приклад 1: На прикладі льону олійного проводилося прогнозування плоїдності рослин-регенерантів при культивуванні пиляків гібриду МР485 х Авангард, батьківські компоненти якого розрізнялися за проявом ознаки забарвлення квітки (табл.). Маркерна ознака - білий колір квітки була притаманна одній із ліній гібриду (Авангард), тоді як друга лінія (МР485) характеризувалася синім забарвленням квітки. Ознака білого кольору квітки, яка була притаманна лінії Авангард, була рецесивною та успадковувалася моногенно у схрещуваннях із синьоквітковими генотипами. У силу цього гібридні рослини МР485 х Авангард успадковували синє забарвлення квітки, але продукували гамети (мікро- та мегаспори) з геном як синього, так і білого забарвлення квітки. При культивуванні пиляків даного гібриду були отримані 24 рослини-регенеранти. Популяція цих рослин складалась із 13 синьоквіткових рослин та з 11 білоквіткових тобто спостерігалося розщеплення, близьке до 1:1 з високою вірогідністю. Оскільки таке розщеплення в гібриду відбувалось і на рівні гамет, це свідчило, що проаналізована популяція рослин-регенерантів з високою імовірністю була утворена саме з гаплоїдних мікроспор, а не з диплоїдних клітин спорофітних тканин пиляка. У прикладі 2 при культивуванні пиляків льону олійного проводилося встановлення плоїдності іншої популяції рослин-регенерантів гібриду МР485 х Авангард. Ця популяція рослинрегенерантів складалася лише з 17 синьоквіткових рослин, тоді як білоквіткові рослини були повністю відсутні (табл.). Відсутність розщеплення за ознакою забарвлення квітки свідчила про те, що дана популяція рослин-регенерантів з високою імовірністю була утворена з клітин, які мали спорофітну, тобто диплоїдну природу. 2 UA 99675 C2 Таблиця Генетичний аналіз популяцій рослин-регенерантів льону олійного, одержаних через культуру пиляків гібридів F1 Фенотип батьків Комбінація схрещування Співвідношення за Фенотип забарвленням квітки гібридів Fi, з рослин яких беруть Р1 Р2 пиляки синя квітка біла квітка При утворенні рослин-регенерантів з гаплоїдних клітин МР485 х Синя квітка Біла квітка Синя квітка 13 11 Авангард М12х М24 Біла квітка Біла квітка Синя квітка 11 27 При утворенні рослин-регенерантів з диплоїдних клітин МР485 х Синя квітка Біла квітка Синя квітка 17 0 Авангард М12х М24 Біла квітка Біла квітка Синя квітка 14 0 Модель розщеплення 1:1* 1*3** 1:0 1:0 2 Прим. * - відмінності від розщеплення 1:1 не суттєві (х =0,17); ** - відмінності від 2 розщеплення 1:3 не суттєві (х =0,32). 5 10 15 20 25 30 Приклад 3: У прикладі 3 для одержання рослин-регенерантів льону олійного використано пиляки гібриду М12 х М24 від схрещування ліній із білим забарвленням квітки. У даному випадку забарвлення квітки контролювали дві пари неалельних генів (позначених як ген А та ген В) з комплементарним типом взаємодії [Лях В.А., Сорока А.И. Ботанические и цитогенетические особенности видов рода Linum L. и биотехнологические пути работы с ними. - Запорожье: ЗНУ, 2008.-182 с, С. 43]. У силу цього гібридні рослини комбінації схрещування M12 х М24 (AAbb x aaBB) мали синє забарвлення квітки, але продукували чотири класи гамет (мікро- та мегаспор) у співвідношенні 1 частина АВ (синя квітка), 1 частина АЬ (біла квітка), 1 частина AВ (біла квітка) та 1 частина aB (біла квітка). Після культивування пиляків даного гібриду було отримано 38 рослин-регенерантів, серед яких було 11 рослин із забарвленою квіткою та 27-з білою, тобто у співвідношенні, близькому до 1 синя: 3 біла. Таке співвідношення збігалося із теоретичним розщепленням на рівні гамет (фіг. 1). Наявність двох класів фенотипів за забарвленням квітки рослин у популяції з високою імовірністю свідчило про те, що джерелом походження рослин-регенерантів були саме гаплоїдні мікроспори, а не диплоїдні клітини спорофітної тканини. У приладі 4 для одержання іншої популяції рослин-регенерантів льону олійного використовували також пиляки гібриду МІ2 х М24. У цьому випадку були одержані лише рослини з синьою квіткою, як це видно з таблиці та фіг. 2. Це з високою імовірністю свідчило про те, що джерелом походження рослин-регенерантів були диплоїдні клітини пиляків. Варто зазначити, що частка рослин-регенерантів у прикладах 1 та З мала синє забарвлення квітки, тобто фенотипово була схожою з рослинами-регенерантами, описаними в прикладах 2 та 4. Це може свідчити, що ці рослини утворилися з диплоїдних, а не гаплоїдних клітин гібриду. У разі виникнення сумнівів щодо походження клітин, з яких утворилися ці рослини-регенеранти, пропонується використати цитологічний або інші методи визначення плоїдності. Таким чином, запропонований спосіб дозволяє з високою ймовірністю прогнозувати походження рослин-регенерантів у культурі in vitro та проводити добір рослин, одержаних із гаплоїдних клітин, з метою створення гомозиготних ліній. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 35 40 Спосіб прогнозування плоїдності рослин у культурі in vitro, що включає: підбір батьківських форм гібриду, висаджування в умовах in vitro пиляків або насіннєвих зачатків гібридних рослин на штучне поживне середовище та регенерацію рослин із новоутворень, культивування рослинрегенерантів, проведення прогнозування плоїдності рослин-регенерантів, який відрізняється тим, що підбір батьківських форм гібриду здійснюють за морфологічною маркерною ознакою щонайменше одного з них, а визначення плоїдності проводять шляхом аналізу розщеплення 3 UA 99675 C2 рослин-регенерантів за цією маркерною ознакою, причому, визначають гаплоїдне походження рослин-регенерантів за умови розщеплення гібридів за маркерною ознакою і диплоїдне походження – за умови відсутності розщеплення. UA 99675 C2 Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 5