Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб біоіндикації токсичності водного середовища, який включає біологічну оцінку токсичності водного середовища, який відрізняється тим, що обчислюють співвідношення вмісту металотіонеїнів у печінці риби за рівнем тіолових груп у білку та вмістом металів та класифікують рівень токсичності середовища як малий (адекватна відповідь), середній (стан тривоги, залучення металотіонеїнів до антиоксидантного захисту) або високий (стан виснаження, втрата здатності зв'язувати метали у нетоксичні комплекси та реагувати на забруднення збільшенням вмісту білка) залежно від величини цього співвідношення і абсолютного рівня його складових у двох групах порівняння.

Текст

Реферат: Спосіб біоіндикації токсичності водного середовища включає біологічну оцінку токсичності водного середовища. Обчислюють співвідношення вмісту металотіонеїнів у печінці риби за рівнем тіолових груп у білку та вмістом металів та класифікують рівень токсичності середовища як малий (адекватна відповідь), середній (стан тривоги, залучення металотіонеїнів до антиоксидантного захисту) або високий (стан виснаження, втрата здатності зв'язувати метали у нетоксичні комплекси та реагувати на забруднення збільшенням вмісту білка) залежно від величини цього співвідношення і абсолютного рівня його складових у двох групах порівняння. UA 86249 U (54) СПОСІБ БІОІНДИКАЦІЇ ТОКСИЧНОСТІ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА UA 86249 U UA 86249 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до області збереження довкілля, а саме до біомоніторингу забруднення водойм і може бути використана для оцінки забруднення водних екосистем внаслідок їх експлуатації, аналізу фізико-хімічного забруднення річок та внесення екологічних оцінок у бізнес-плани інвестиційних проектів. Відомий спосіб визначення ступеня забруднення морської води за допомогою біоіндикації "Способ биоиндикации загрязнения морской воды тяжелыми металлами" (2003123682/13, 28.07.2003, заявники Корякова М.Д., Супоніна А.П., Звягінцев А.Ю., Росія), який полягає у визначенні та порівнянні вмісту металів у мінералізованому сухому залишку піонерних організмів акваторії (двостулкових молюски, ракоподібні, гідроїдні, черви (20 видів загалом)), відібраних у потенційно забрудненій та чистій місцевості. Недоліками цього способу є відсутність кількісних критеріїв, адаптація методу лише до забруднення морської води та недостатнє обґрунтування щодо варіабельності середнього значення вмісту металів залежно від видового набору піонерних організмів. Відомий також спосіб оперативної біоіндикації (2009112433/04, 03.04.2009, Росія), що передбачає проведення безперервної реєстрації поведінкових і/або фізіологічних реакцій водних організмів у природних умовах за допомогою вимірювальних приладів в режимі реального часу. Автор (Гудімов О.В.) пропонує використати для дослідження адукцію, амплітуду розкривання стулок мушлі, сумарний час закривання стулок мушлі двостулкових молюсків тощо. Недоліком цього способу є обмеження досліджень реакції організму на забруднення лише на організменному рівні, який не може забезпечити адекватної інформації для ранньої діагностики якості середовища. Відомий також спосіб (WO/2002/022859 "Визначення здоров'я екосистем шляхом оцінки множинних біомаркерів у живому організмі крім людини"), який полягає в узагальненні результатів визначення широкого спектру показників та у застосуванні множинних схем їх використання у лабораторних та природних умовах. Недоліками способу є висока собівартість та необхідність використання різних організмів, відсутність конкретних і універсальних рекомендацій та чітких критеріїв оцінки токсичності водного середовища. Відомий також спосіб біологічної очистки забрудненого середовища іонами кадмію за допомогою металотіонеїнів (див. патент США US 5824512 А, 08/754,431), що включає конструювання приладу для біосорбції шляхом нанесення на матрицю-носій рекомбінантних бактерій Е. соlі з попередньо індукованими металотіонеїнами, які проявляють селективну здатність зв'язувати кадмій у три- та тетрануклеарні тіолатні кластери. Недоліками способу є дороговартісність підготовчого етапу (експресія генів, полімеразна ланцюгова реакція в режимі реального часу тощо). В основу корисної моделі поставлено задачу створення способу експрес-діагностики біологічної відповіді на ступінь токсичності на підставі оцінки функціональної здатності стресреспонсивного і метал-депонувального протеїну у печінці риби. Поставлена задача вирішується тим, що на основі визначення концентрації металотіонеїнів печінки карася за кількістю депонованого металу (метал-депонувальна форма, МТ-Ме) та тіолових груп (загальний вміст, МТ-SH) у тканині обраховується їх співвідношення MT-SH/MTMe. Відповідь організму класифікується як норма, стан тривоги або стан виснаження, і, відповідно, токсичність середовища - як мала, середня або висока. Металотіонеїни (МТ) - це низькомолекулярні термостабільні протеїни цитозолю. У молюсків їх головною функцією є депонування металів. Вони з високою ефективністю акумулюють практично весь кадмій у метаболічно-активних тканинах, беруть участь у гомеостазі цинку та міді. У риб вони є передусім стрес-респонсивними протеїнами, оскільки індукуються численними стресорними чинниками та прооксидантами та є потенційними антиоксидантами, оскільки, як встановлено в умовах in vitro, пригнічують перекисно-радикальні процеси. МТ молюсків широко використовують у системах раннього виявлення небезпеки забруднювачів для біоти, про що свідчить їх включення до рекомендованого набору біомаркерів для оцінки якості морських акваторій у європейських (MED POL, Biomar, "Mussel Watch" programme, BEEP тощо) програмах біомоніторингу. При цьому перевагу надають визначенню їх вмісту за кількістю тіолових груп у білку спектрофотометричним або полярографічним методами. У риб за такого спрощеного підходу поза увагою залишається встановлене нами явище невідповідності загального вмісту МТ та вмісту метал-депонувальної форми МТ (Falfushynska et al., 2011, 2012). Поєднане визначення вмісту МТ у тканинах риби за двома характеристиками, загальним рівнем тіолових груп у білку та металодепонувальною здатністю, та обчислення їх співвідношення як МТ-SH/MT-Me становить важливий діагностичний інструмент для оцінки неспецифічного пошкоджуючого впливу довкілля. Значення показника співвідношення MT 1 UA 86249 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 SH/MT-Me >> 1 відповідає стану компенсаторної реакції (середня токсичність середовища). Порівнюючи співвідношення характеристик МТ у екземплярів риби з двох місцевостей, одна з яких є референційною, за абсолютним значенням MT-SH та МТ-Ме, встановлюється ознака глибоких депресивних змін (висока токсичність середовища) як низькі значення обох характеристик або високі значення цих характеристик (мала токсичність середовища). Для використання способу виловлюють 5 екземплярів риби родини Cyprinidae карася Carrasius auratus, який є широко розповсюдженим видом риб, з подібними морфологічними показниками (розмір, вік, маса) з досліджуваної водойми та визначають вміст MT-SH та МТ-Ме у тканині печінки. Для визначення МТ-Ме одержують розчин термостабільних сполук з 10 %-ного гомогенату тканини в 10 мМ трис-НСl буфері, рН 8,0 з додаванням 10 мМ 2-меркаптоетанолу ("Sigma") для запобігання окиснення SH-груп та інгібітора протеаз фенілметилсульфонілфториду (0,1 мМ, "Sigma"). Гомогенат виготовляють з об'єднаних рівних наважок тканини з п'яти тварин дослідної групи (загальною масою 350 мг) та центрифугують протягом 45 хв. при 16 000g. Отриманий надосад інкубують 5 хв при 85 °C і знову центрифугують за тих самих умов. Надосад, що містить розчинні термостабільні сполуки, піддають гель-розподільчій хроматографії, яку здійснюють 0,01 М трис-НСl буфером, рН 8,0 на колонці, заповненій сефадексом G-75 ("Sigma") або сефадексом G-50 ("Sigma"), з охолоджувальним кожухом розміром 50×1,5 см із швидкістю 0,33 мл/хв. Для запобігання втрати металів, зв'язаних з білками, в елюент не додають ЕДТА. Вимірюють світлопоглинання проб при довжині хвилі 280 і 254 нм (D280 і D254). Калібровку колонки здійснюють за допомогою білків з відомою молекулярною масою - сироваткового альбуміну (67,0 кДа), хімотрипсиногену (25,8 кДа), міоглобіну (17,0 кДа), цитохрому с (12,3 кДа), убіквітину (8,4 кДа) та окиснений β-ланцюг інсуліну (3,4 кДа), (всі маркери фірми "Sigma", США). МТ ідентифікують як низькомолекулярні термостабільні білки із високим показником співвідношення світлопоглинання D254/D280. Після об'єднання проб піку МТ-вмісної фракції (10 мл) проводять визначення в ній вмісту міді, цинку та кадмію. Вміст металів у фракціях МТ вимірюють після озолення зразків за 105 °C у перегнаній нітратній кислоті в співвідношенні 1:5 (маса:oб'єм). Вміст цинку, міді та кадмію визначають на атомно-абсорбційному спектрофотометрі за загальноприйнятими методиками і виражають в мкмоль на г вологої маси тканини. Вміст МТ-Ме в розрахунку на 1 г тканини обчислюють за модифікованим рівнянням Гамільтона, враховуючи стехіометричний характер зв'язування цих металів: m(MTMe)=0,5((ν(Zn)M(MT)+ν(Cd)M(MT))/7+ν(Cu)M(MT)/12) (мкг), де ν - кількість металу в МТ, мкмоль/г тканини; М(МТ) молярна маса МТ (7000 г/моль), 7 і 12 - кількість іонів цинку, кадмію і міді (І) відповідно, що зв'язуються молекулою МТ за повного насичення. Для карася вміст МТМе в нормі становить 51±8 мкг/г тканини. Вміст MT-SH у 30 % гомогенаті тканини в 20 мМ тріс-сахарозному буфері визначають за методом A. Viarengo та співавт. (1997) за взаємодією із 5,5'-дитіо-біс-2-нітробензойною кислотою (ДТНБ) після хлороформ-етанольної екстракції МТ. Для цього приготований гомогенат центрифугують протягом 45 хв при 12000 g, 4 °C. Екстракцію супернатанту проводять сумішшю 0,5 мл охолодженого етанолу (до -20 °C) та 0,04 мл хлороформу з наступним центрифугуванням при 6000 g протягом 10 хв. До супернатанту додають 3 мл охолодженого етанолу, змішують протягом 15 с і переносять пробу на 1 год. в морозильну камеру. Після цього до суміші додають 1 мл 0,2 М фосфатного буферу рН 8,0 і пробу центрифугують протягом 12 хв при 6000 g. Супернатант декантують, а осад промивають 2 мл 20 мМ тріс буферного розчину в етанолі, що містить 1 % хлороформу та 0,5 мМ сахарози та знову центрифугують протягом 20 хв при 3000 g, 4 °C. Після цього супернатант знову декантують, а осад ресуспендують в 0,3 мл 5 мМ тріс-ЕДТА буферу, після чого додають 4,2 мл 0,43 мМ розчину ДТНБ в 0,2 М фосфатному буфері рН 8,0 і центрифугують 10 хв при 3000 g, 4 °C. Вимірюють світлопоглинання проби при 412 нм. Вміст MT-SH в пробі визначають за калібрувальною кривою, побудованою на глутатіоні та обчислюють, вважаючи, що в 1 молі МТ міститься така ж кількість SH-груп, як і в 20 молях глутатіону і виражають в мкг/г вологої тканини. Для карася вміст MT-SH в нормі становить 165±30 мкг/г тканини. Кваліфікують біологічну відповідь і, відповідно, загальну токсичність водного середовища як: - "мала токсичність" - значення MT-SH та МТ-Ме перевищують на 20-50 % значення показників у референційній місцевості (адекватна відповідь на стрес); - "середня токсичність" - MT-SH/MT-Me становить більше 4,5 (стан тривоги, посилена експресія МТ із зростанням антиоксидантного потенціалу); 2 UA 86249 U 5 10 15 - "висока токсичність" - значення MT-SH та МТ-Ме менші на 20-50 % значення показників у референційній місцевості (пригнічення стрес-індукованої відповіді в результаті виснаження стрес-залежних систем, втрата здатності зв'язувати метали у нетоксичні комплекси та реагувати на дію пошкоджуючих чинників збільшенням вмісту білка). - з двох груп з подібним значенням MT-SH/MT-Me група з вищими значеннями вмісту MT-SH та МТ-Ме має переваги у адаптації до умов існування. Реалізація корисної моделі проілюстрована на прикладах оцінки токсичності водного середовища за допомогою визначення MT-SH/MT-Me у печінці риби Carassius auratus (Cyprinidae). Приклад 1. Порівнювали співвідношення показників MT-SH/MT-Me у печінці риби Carassius auratus (Cyprinidae) з природних популяцій у ставах з верхньої течії р. Серет (3-група, референційна місцевість) та на р. Нічлава у зоні інтенсивного аграрного виробництва (Б-група, аграрнонавантажена місцевість) у травні, липні та вересні. Одержані результати представлені в таблиці 1. Таблиця 1 Оцінка токсичності водного середовища на підставі визначення співвідношення MT-SH/MT-Me у печінці карася (Cyprinidae) з природних водойм Параметр Вміст МТ-Ме, мкг/г тканини Вміст MT-SH, мкг/г тканини MT-SH/MT-Me Токсичність середовища Група З Б З Б З Б З Б Весна 69,9±6,4 71,3±6,9 23,4±2,1 b 43,1±13,1 0,33 0,60 Висока Висока а Літо 64,4±5,9 a, b 74,0±0,8 а 384,2±52,6 a, b 485,4±18,3 5,97 6,57 Середня Середня Осінь а 51,3±4,8 a 48,2±4,1 а 138,7±17,0 a, b 204,2±11,5 2,70 4,24 Мала Мала b Примітка. - відмінності в групі порівняно з весною вірогідні, - відмінності між групами вірогідні, р

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Stoliar Oksana Borysivna, Falfushynska Halyna Ivanivna, Hnatyshyna Lesia Liubomyrivna

Автори російською

Столяр Оксана Борисовна, Фальфушинская Галина Ивановна, Гнатишина Леся Любомировна

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/00

Мітки: водного, біоіндикації, спосіб, токсичності, середовища

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/7-86249-sposib-bioindikaci-toksichnosti-vodnogo-seredovishha.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб біоіндикації токсичності водного середовища</a>

Подібні патенти