Спосіб оцінки та прогнозування продуктивності рослин

Реферат: Винахід належить до біології, а саме до фізіології та біохімії рослин, та може бути використаний у генетиці та селекції рослин, наприклад, для оцінки потенційних можливостей селекційного матеріалу та для оперативного контролю фізіологічного стану рослин. Запропонований спосіб оцінки та прогнозування продуктивності рослин включає відбір проб (суцільне листя рослин) контрольних та досліджуваних рослин, фіксацію рослинного матеріалу у суміші Темпера, виготовлення парафінових мікротомних препаратів і їх фотографування, дослідження розміру хлоропластів, визначення форми хлоропластів, розрахунок площі їх перерізу та порівняння отриманих показників з контролем. При зменшенні площі перерізу, у порівнянні з контролем, більш ніж на 50 % та водночас зміні форми хлоропластів прогнозують зниження продуктивності досліджуваних генотипів. UA 111420 C2 (12) UA 111420 C2 UA 111420 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до біології, а саме до фізіології та біохімії рослин, та може бути використаний у генетиці та селекції рослин, наприклад, для оцінки потенційних можливостей селекційного матеріалу та для оперативного контролю фізіологічного стану рослин. Найбільш близьким до заявленого є спосіб виявлення оцінки стану рослин [Пат. 2339214 Российская Федерация, МПК A01G7/00. Способ оценки состояния растений / Терехова Н., Федотов Г.; заявитель патентообладатель Московский государственный университет леса - № 2007106652/12; заявл. 22.02.07; опубл. 27.11.08, Бюл. № 33], який включає вибір рослин, що знаходяться на одній стадії розвитку (частина з яких знаходяться у завідомо хорошому стані (контроль) та рослин, що досліджують); вимірювання електричного опору між рослиною та ґрунтом; визначення активності кореневої системи; порівняння з контролем; оцінку стану рослини за цим фізіологічним параметром. Стан рослини визначають за активністю кореневої системи, яка обумовлює поглинання води, що, у свою чергу, впливає на відкривання продихів. При відкритих продихах рослина здатна поглинати вуглекислий газ, який потрібен для фотосинтезу. Фізіологічним параметром, що характеризує стан рослин, є властивість кореневої системи рослини поглинати із ґрунту вологу, який оцінюють за величиною електричного опору між рослиною та ґрунтом. Це дозволяє визначити здатність рослин до фотосинтезу та транспірації вологи через відкриті продихи рослин і, як наслідок, їх стан. Недоліком цього способу є вимірювання непрямих компонентів фотосинтетичного апарату, наявність ряду проміжних етапів між оцінкою активності кореневої системи рослин та інтенсивністю фотосинтезу, а отже і станом рослин. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є вибір рослин, оцінка фізіологічного параметру рослини, порівняння його з контролем та визначення стану рослин. Найближчим до способу, що заявляється, є спосіб визначення стану рослин [М.М. Якубова, О.В. Усманова, X.Ю. Юлдашев, 3.М. Хамрабаева, Н.X. Хамидов, Ш.Ш. Сухробова Arabidopsis thaliana (L.) heynh. - объект для выявления физиолого-биохимических механизмов адаптации // Физиология и биохимия растений. - 2010. - № 2. -С. 60-66], у якому стан рослин визначають за механізмом адаптації та стійкості фотосинтетичного апарату хлорофільних мутантів до факторів зовнішнього середовища. Для цього відбирають проби, фіксують досліджувані зразки; проводять дослідження параметрів мезоструктури листка на тимчасових препаратах (висічки з листка закладають у серцевину бузини, виготовляють поперечні зрізи), визначають кількість та розмір (діаметр) хлоропластів у клітині шляхом інфільтрації зрізів у ізотонічному розчині сахарози; визначають концентрацію хлорофілу за Веттштейном та Верноном; порівнюють отримані показники з контролем, оцінюють фізіологічний стан рослин за вмістом хлорофілу, кількістю та розміром хлоропластів. Недоліком цього способу є використання тимчасових препаратів для дослідження параметрів мезоструктури листка, що не дозволяє зберігати досліджувані зразки; використання висічок листка не дозволяє досліджувати його анатомію. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: відбір проб рослин; фіксація рослинного матеріалу; дослідження параметру мезоструктури листка, а саме, розміру хлоропластів; порівняння розміру хлоропластів з контролем; оцінка фізіологічного стану рослин за розміром хлоропластів. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб оцінки та прогнозування фізіологічного стану рослин, який визначають шляхом дослідження параметрів мезоструктури їх пластидного апарату, що дозволяє проводити аналіз на ранніх етапах розвитку, прогнозувати продуктивність рослин без використання високовартісного обладнання. Суттєвими ознаками способу є: відбір проб листків рослин; фіксація рослинного матеріалу в суміші Темпера; виготовлення парафінових мікротомних препаратів; фотографування; дослідження параметрів мезоструктури листка шляхом: вимірювання розміру хлоропластів; визначення їх форми; розрахунку площі перерізу хлоропластів; порівняння отриманих даних з контролем; оцінка фізіологічного стану рослин; прогнозування продуктивності рослин. 1 UA 111420 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Відмінними від прототипу ознаками є: використання як проб цілих листків рослин; фіксація рослинного матеріалу в суміші Темпера; виготовлення парафінових мікротомних препаратів; фотографування; додаткове дослідження мезоструктури листка шляхом визначення форми хлоропластів та розрахунку їх площі перерізу; прогнозування продуктивності рослин. Як відомо, фотосинтез відіграє важливу роль у формуванні продуктивності рослин через його тісний зв'язок з процесами росту, розвитку, дихання, водного та мінерального живлення. Оцінка стану хлоропластів, як основних органел фотосинтетичного апарату, дозволяє оцінити та спрогнозувати фізіологічний стан рослин. Використання для дослідження мутантних зразків, які характеризуються різним типом хлорофільної недостатності та продуктивності рослин, дозволяє виявити взаємозв'язок між структурно-функціональною організацією фотосинтетичного апарату та продуктивністю рослин. Заявлений спосіб здійснюють так: Для аналізу пластидного апарату відбирають листя контрольних та досліджуваних рослин, що знаходяться на одній стадії розвитку, та фіксують їх у суміші Темпера. Готують парафінові мікротомні препарати, отримані поперечні зрізи листка поміщають у гліцерин та накривають покривними скельцями. Отримані препарати фотографують та аналізують. Вимірюють розміри хлоропластів (довжину та ширину) стандартними методами за допомогою окуляр-мікрометра. Визначають форму хлоропластів за співвідношенням довжини і ширини: при значенні співвідношення довжина:ширина більше 2,5 - форма циліндра, а менше - еліпса. На основі отриманих показників розраховують площу перерізу хлоропластів за формулами А.Т. Мокроносова [Определение мезоструктурных характеристик фотосинтетического аппарата растений: руководство к лабораторным занятиям большого спецпрактикума по физиологии и биохимии растений / [составители Р.А. Борзенкова, Е.В. Храмцова]. - Екатеринбург: Издательство Уральского университета, 2006.-27 с. - С. 18, 23]. За отриманими даними параметрів мезоструктури листка визначають фізіологічний стан та прогнозують продуктивність рослин. При зменшенні площі перерізу, у порівнянні з контролем, більш ніж на 50 % та водночас зміні форми хлоропластів прогнозують зниження продуктивності досліджуваних генотипів. Приклад конкретного виконання. Для дослідження були використані рослини, вирощені в польових умовах: сорт льону олійного Циан (контроль); мутантні лінії, отримані на його основі: М-80 (viridis); М-81 (xantha); колекційний зразок льону олійного К-7487 (контроль); мутантна лінія на його основі М-28 (viridis). Сорт льону олійного Циан - межеумок, рослина зелена, середньо облиствлена, лист широко ланцетний. Мутантна лінія М-80 (viridis) - отримана методом індукованого мутагенезу при опроміненні насіння сорту Циан дозою 400 Гр. Сіянець світло-зелений, згодом рослина стає більш зеленою, однак відрізняється від нормального зеленого забарвлення. Віднесена до хлорофільної недостатності типу viridis. Мутантна лінія М-81 (xantha) - отримана методом індукованого мутагенезу при опроміненні насіння сорту Циан дозою 400 Гр. Сіянець яскраво-жовто-зелений. Жовто-зелені рослини, зберігаючи ознаки сильної пригніченості, доживають до кінця вегетації й дають насіння. Віднесена до хлорофільної недостатності типу xantha. Колекційний зразок льону олійного К-7487 (із Чехії) - межеумок, рослина зелена, середньо облиствлена. Мутантна лінія М-28 - отримана при опроміненні насіння сорту К-7487 дозою 700 Гр. Уся рослина жовто-зелена, хлорофільна недостатність зберігається протягом усієї вегетації. Занесена до Реєстру сортів рослин України як сорт Золотистий. Віднесена до хлорофільної недостатності типу viridis. Для дослідження у всіх зразків, вирощених у польових умовах, на стадії бутонізації відбирали листя та фіксували у 10 кратному об'ємі суміші Темпера, що дозволяло зберегти забарвлення хлоропластів [Барыкина Р.П., Веселова Т.Д., Девятов А.Г., Джалилова Х.Х., ИльинаГ.М., Чубатова Н.В. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы. - М.: 2 UA 111420 C2 5 10 15 20 25 30 МГУ, 2004-312 с. - С. 28]. Фіксацію здійснювали протягом 10 днів у темряві, після чого листя промивали великою кількістю води. Потім проводили рослинний матеріал через спирти зі зростаючою концентрацією. Використовували 12 змін спирту: по дві зміни 20 %, 40 %, 60 %, 70 %, 96 % та 100 % спирту. Далі для просвітлення просочували проби розчинником парафіну хлороформом. Проводили заливку в парафін шляхом заміщення хлороформу парафіном. Зразки поміщали в термостат при температурі 55-57 °C та залишали там до повного випаровування хлороформу. Потім виготовляли "парафінові пряники", після цього готували парафінові блоки (5 × 55 см) та вплавляли в них готові "парафінові пряники". З готових парафінових блоків виготовляли серії зрізів товщиною 10 мкм, поміщали їх у воду з температурою 40 °C для розправлення та наклейки на предметні скельця. Після цього предметні скельця поміщали у термостат при 40 °C на декілька годин для випаровування зайвої води. Проводили депарафінування зрізів. Для цього скельця з наклеєними зрізами промивали у трьох змінах ксилолу, двох змінах 100 % спирту, одній зміні 75 % спирту та одній 50 % спирту та трьох змінах дистильованої води. Потім поміщали зрізи у гліцерин та накривали покривними скельцями [Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. - М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с. - С. 56-58]. Отримані препарати фотографували за допомогою тринокулярного мікроскопа MS3330 і окулярної камери МА88-500 при збільшенні х640 і х 1600 разів. Розміри хлоропластів (довжину й ширину) вимірювали стандартними методами за допомогою окуляр-мікрометра. Додатково визначали параметри мезоструктури хлоропластів: форму та площу перерізу, використовуючи методику Мокроносова А.Т. [Определение мезоструктурных характеристик фотосинтетического аппарата растений: руководство к лабораторным занятиям большого спецпрактикума по физиологии и биохимии растений / [составители Р.А. Борзенкова, Е.В. Храмцова]. - Екатеринбург: Издательство Уральского университета, 2006. - 27 с. - С. 18, 23]. Форму хлоропластів визначали за показником співвідношення довжини/ширини. При співвідношенні довжини/ширини більше 2,5 - форма циліндра, менше - еліпса. На основі отриманих показників розраховували площу перерізу хлоропластів за формулою А.Т. Мокроносова. Для циліндра: S  157d * (2L  d) , , (1) де S - площа перерізу хлоропластів, мкм; L - довжина хлоропласта, мкм; d - ширина хлоропласта, мкм. Для еліпса за формулою еліпсоїда обертання: 35 (2) S  42 (ab 2 )2 , де S - площа перерізу хлоропластів, мкм2; a L ; 2 L - довжина хлоропласта, мкм; d ; 2 d - ширина хлоропласта, мкм. При вимірюванні хлоропластів на п'яти зрізах у тридцятикратному повторенні в кожному зразку стандартними методами було виявлено, що хлоропласти мутантних зразків за лінійними параметрами значно відрізнялися від хлоропластів контрольних рослин (таблиця 1). Отримані дані вказують, що морфологічні характеристики хлоропластів змінюються залежно від типу хлорофільних змін рослини. Так, у хлорофілдефіцитних мутантів типу viridis (М-80 та М28) хлоропласти за формою не відрізнялися від контрольних зразків, але вони були коротші та вужчі, а у мутанта типу xantha (М-81) хлоропласти були дуже вузькі та видовжені, мали циліндроподібну форму. b 40 45 3 UA 111420 C2 Таблиця 1 Показники морфології пластид Генотип льону Форма хлоропластів олійного Циан хлоропласти еліпсоподібної форми (контроль) М-80 (viridis) М-81 (xantha) К-7487 (контроль) М-28 (viridis) Площа перерізу, Прогноз продуктивності 2 мкм рослин продуктивність 29,34±0,60 характерна для зразка зниження показників хлоропласти еліпсоподібної форми, 12,32±0,38* продуктивності на 20коротші та вужчі, ніж у контролі (-58 %) 30 % хлоропласти циліндроподібної форми, зниження показників 11,56±0,26* дуже вузькі та видовжені у порівнянні з продуктивності на 30(-60 %) контролем 50 % продуктивність хлоропласти еліпсоподібної форми 46,30±1,22 характерна для зразка суттєвого зниження хлоропласти еліпсоподібної форми, 24,42±0,40* показників коротші та вужчі, ніж у контролю (-47 %) продуктивності не прогнозується Примітка: * - відмінності від контролю суттєві при Р