Моноклональне антитіло, яке специфічно зв’язується з avb6

Є ще 53 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Моноклональне антитіло, яке (a) специфічно зв'язується з αvβ6; і (b) інгібує зв'язування αvβ6 з асоційованим з латентністю пептидом (LAP) при значенні IC50 меншому, ніж таке в антитіла 10D5, причому вказане моноклональне антитіло містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга та легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою, вибраною з групи, що складається з гібридоми 6.1A8, ATCC PTA-3647, гібридоми 6.3G9, ATCC PTA-3649, гібридоми 6.8G6, ATCC PTA-3645, гібридоми 6.2B1, ATCC PTA-3646, гібридоми 7.1G10, ATCC PTA-3898, гібридоми 7.7G5, ATCC PTA-3899 і гібридоми 7.1С5, ATCC PTA-3900.

2. Моноклональне антитіло за п. 1, яке містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга і легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою 6.1A8, ATCC PTA-3647.

3. Моноклональне антитіло за п. 1, яке містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга і легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою 6.3G9, ATCC PTA-3649.

4. Моноклональне антитіло за п. 1, яке містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга і легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою 6.8G6, ATCC PTA-3645.

5. Моноклональне антитіло за п. 1, яке містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга і легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою 6.2B1, ATCC PTA-3646.

6. Моноклональне антитіло за п. 1, яке містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга і легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою 7.1G10, ATCC PTA-3898.

7. Моноклональне антитіло за п. 1, яке містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга і легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою 7.7G5, ATCC PTA-3899.

8. Моноклональне антитіло за п. 1, яке містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга і легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою 7.1С5, ATCC PTA-3900.

9. Антитіло за п. 1, де зв'язування між антитілом і αvβ6 залежить від двовалентного катіона.

10. Антитіло за п. 9, де двовалентний катіон являє собою Ca2+, Mg2+ або Mn2+.

11. Антитіло за п. 1, де його зв'язування з αvβ6 не залежить від двовалентного катіона.

12. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 1, 4 і 7, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 10, 13 і 15, відповідно.

13. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 3, 5 і 8, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 11, 14 і 17, відповідно.

14. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 3, 6 і 9, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 12, 14 і 18, відповідно.

15. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 2, 46 і 47, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 48, 13 і 16, відповідно.

16. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 49, 51 і 53, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 55, 57 і 59, відповідно.

17. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 50, 52 і 54, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 56, 58 і 60, відповідно.

18. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 19 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 37.

19. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 20 або 21 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 38.

20. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 22 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 43.

21. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 23 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 44.

22. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 24 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 45.

23. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 25 або 26 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 42.

24. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 27, 28 або 29 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 39.

25. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 34 або 35 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 40.

26. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 36 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 41.

27. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 61 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 63.

28. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 62 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 64.

29. Композиція для профілактики або лікування в ссавця захворювання, опосередкованого αvβ6, що містить антитіло за будь-яким з пп. 1-28 і фармацевтично прийнятний носій.

30. Композиція за п. 29, в якій антитіло кон’юговане з цитотоксичним засобом.

31. Композиція за п. 29, в якій антитіло являє собою катіонзалежне антитіло.

32. Спосіб лікування суб'єкта, що характеризується наявністю захворювання або ризиком наявності захворювання, опосередкованого αvβ6, що передбачає введення зазначеному суб'єктові композиції за п. 29, причому зазначений спосіб полегшує хід захворювання або відкладає його початок.

33. Спосіб за п. 32, де суб'єктом є людина.

34. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою фіброз.

35. Спосіб за п. 34, де фіброз являє собою склеродермію, рубці, фіброз печінки, фіброз нирок або фіброз легень.

36. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою псоріаз.

37. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою рак.

38. Спосіб за п. 37, де рак являє собою епітеліальний рак.

39. Спосіб за п. 37, де рак являє собою рак ротової порожнини, шкіри, шийки матки, яєчників, глотки, гортані, стравоходу, легень, молочної залози, нирок або колоректальний рак.

40. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою синдром Альпорта або атрезію жовчної протоки.

41. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою гостре ушкодження легені.

42. Спосіб детекції αvβ6 у зразку тканини ссавця, що передбачає забезпечення контакту зразка тканини з антитілом за п. 1, при цьому наявність αvβ6 у зразку детектується в тому випадку, якщо вказане антитіло зв'язується з зазначеним зразком тканини.

43. Клітина гібридоми, що продукує антитіло, яке (а) специфічно зв'язується з αvβ6; і (b) інгібує зв'язані αvβ6 з асоційованим з латентністю пептидом (LAP) при значенні ІС50 меньшому, ніж таке у антитіла 10D5, яка вибрана з групи, що складається з гібридоми 6.1A8, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3647; гібридоми 6.3G9, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3649; гібридоми 6.8G6, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3645; гібридоми 6.2B1, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3646; гібридоми 7.1G10, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3898; гібридоми 7.7G5, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3899; гібридоми 7.1C5, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3900.

44. Застосування композиції за п. 29 для одержання лікарського засобу для лікування захворювання, опосередкованого αvβ6, де вказаний засіб полегшує перебіг захворювання або відкладає його початок.

45. Застосування за п. 44, де вказаний лікарський засіб призначений для суб’єкта-ссавця, котрий є людиною.

46. Застосування за п. 45, де захворювання являє собою фіброз.

47. Застосування за п. 46, де фіброз являє собою склеродермію, рубці, фіброз печінки, фіброз нирок або фіброз легень.

48. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою псоріаз.

49. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою рак.

50. Застосування за п. 49, де рак являє собою рак ротової порожнини, шкіри, шийки матки, яєчників, глотки, гортані, стравоходу, легень, молочної залози, нирок або колоректальний рак.

51. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою синдром Альпорта або атрезію жовчної протоки.

52. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою гостре ушкодження легені.

53. Моноклональне антитіло, яке є блокуючим αvβ6 антитілом або його антигензв’язувальним фрагментом, який (a) специфічно зв'язується з αvβ6, але не зв'язується з іншими αv-інтегринами або неспецифічними інтегринами; і (b) інгібує зв'язування αvβ6 з асоційованим з латентністю пептидом (LAP) при значенні IC50 меншому, ніж таке у антитіла 10D5, і (с) зв'язується з αvβ6 або катіоннезалежним, або катіонзалежним чином, причому при катіонзалежному зв'язуванні ніяких відмінностей між використанням Ca2+/Mg2+ і Mn2+ не виявляється,

яке містить області (CDR), що визначають комплементарність, 1, 2 і 3 важкого ланцюга і області (CDR), що визначають комплементарність, 1, 2 і 3 легкого ланцюга, де області (CDR), що визначають комплементарність, 1, 2 і 3 важкого ланцюга містять послідовності SEQ ID NO: 3, 6 і 9, відповідно, і де області (CDR), що визначають комплементарність, легкого ланцюга містять послідовності SEQ ID NO: 12, 14 і 18, відповідно.

54. Моноклональне антитіло за п. 53, яке зв'язується з розчинним αvβ6, але не зв'язується з субодиницею β6.

55. Моноклональне антитіло за п. 53, яке перешкоджає активації TGF-β.

Текст

1. Моноклональне антитіло, яке (a) специфічно зв'язується з αvβ6; і (b) інгібує зв'язування αvβ6 з асоційованим з латентністю пептидом (LAP) при значенні IC50 меншому, ніж таке в антитіла 10D5, причому вказане моноклональне антитіло містить ті ж самі області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга та легкого ланцюга, що і антитіло, яке продукується гібридомою, виб 2 (19) 1 3 11. Антитіло за п. 1, де його зв'язування з αvβ6 не залежить від двовалентного катіона. 12. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 1, 4 і 7, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 10, 13 і 15, відповідно. 13. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 3, 5 і 8, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 11, 14 і 17, відповідно. 14. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 3, 6 і 9, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 12, 14 і 18, відповідно. 15. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 2, 46 і 47, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 48, 13 і 16, відповідно. 16. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 49, 51 і 53, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 55, 57 і 59, відповідно. 17. Антитіло за п. 1, в якому області (CDR), що визначають комплементарність, важкого ланцюга включають амінокислотні послідовності SEQ ID NO: 50, 52 і 54, відповідно, а CDR 1, 2 і 3 легкого ланцюга включають послідовності SEQ ID NO: 56, 58 і 60, відповідно. 18. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 19 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 37. 19. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 20 або 21 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 38. 20. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 22 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 43. 21. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 23 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 44. 22. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 24 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 45. 23. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 25 або 26 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 42. 24. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 90242 4 27, 28 або 29 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 39. 25. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 34 або 35 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 40. 26. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 36 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 41. 27. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 61 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 63. 28. Антитіло за п. 1, що містить послідовність варіабельного домену важкого ланцюга SEQ ID NO: 62 і послідовність варіабельного домену легкого ланцюга SEQ ID NO: 64. 29. Композиція для профілактики або лікування в ссавця захворювання, опосередкованого αvβ6, що містить антитіло за будь-яким з пп. 1-28 і фармацевтично прийнятний носій. 30. Композиція за п. 29, в якій антитіло кон'юговане з цитотоксичним засобом. 31. Композиція за п. 29, в якій антитіло являє собою катіонзалежне антитіло. 32. Спосіб лікування суб'єкта, що характеризується наявністю захворювання або ризиком наявності захворювання, опосередкованого αvβ6, що передбачає введення зазначеному суб'єктові композиції за п. 29, причому зазначений спосіб полегшує хід захворювання або відкладає його початок. 33. Спосіб за п. 32, де суб'єктом є людина. 34. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою фіброз. 35. Спосіб за п. 34, де фіброз являє собою склеродермію, рубці, фіброз печінки, фіброз нирок або фіброз легень. 36. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою псоріаз. 37. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою рак. 38. Спосіб за п. 37, де рак являє собою епітеліальний рак. 39. Спосіб за п. 37, де рак являє собою рак ротової порожнини, шкіри, шийки матки, яєчників, глотки, гортані, стравоходу, легень, молочної залози, нирок або колоректальний рак. 40. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою синдром Альпорта або атрезію жовчної протоки. 41. Спосіб за п. 32, де захворювання являє собою гостре ушкодження легені. 42. Спосіб детекції αvβ6 у зразку тканини ссавця, що передбачає забезпечення контакту зразка тканини з антитілом за п. 1, при цьому наявність αvβ6 у зразку детектується в тому випадку, якщо вказане антитіло зв'язується з зазначеним зразком тканини. 43. Клітина гібридоми, що продукує антитіло, яке (а) специфічно зв'язується з αvβ6; і (b) інгібує зв'язані αvβ6 з асоційованим з латентністю пептидом (LAP) при значенні ІС50 меньшому, ніж таке у антитіла 10D5, яка вибрана з групи, що складається з гібридоми 6.1A8, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером до 5 90242 6 ступу PTA-3647; гібридоми 6.3G9, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3649; гібридоми 6.8G6, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3645; гібридоми 6.2B1, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3646; гібридоми 7.1G10, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3898; гібридоми 7.7G5, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3899; гібридоми 7.1C5, депонованої в Американській Колекції Типових Культур (ATCC) під номером доступу PTA-3900. 44. Застосування композиції за п. 29 для одержання лікарського засобу для лікування захворювання, опосередкованого αvβ6, де вказаний засіб полегшує перебіг захворювання або відкладає його початок. 45. Застосування за п. 44, де вказаний лікарський засіб призначений для суб'єкта-ссавця, котрий є людиною. 46. Застосування за п. 45, де захворювання являє собою фіброз. 47. Застосування за п. 46, де фіброз являє собою склеродермію, рубці, фіброз печінки, фіброз нирок або фіброз легень. 48. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою псоріаз. 49. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою рак. 50. Застосування за п. 49, де рак являє собою рак ротової порожнини, шкіри, шийки матки, яєчників, глотки, гортані, стравоходу, легень, молочної залози, нирок або колоректальний рак. 51. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою синдром Альпорта або атрезію жовчної протоки. 52. Застосування за п. 44, де захворювання являє собою гостре ушкодження легені. 53. Моноклональне антитіло, яке є блокуючим αvβ6 антитілом або його антигензв'язувальним фрагментом, який (a) специфічно зв'язується з αvβ6, але не зв'язується з іншими αv-інтегринами або неспецифічними інтегринами; і (b) інгібує зв'язування αvβ6 з асоційованим з латентністю пептидом (LAP) при значенні IC50 меншому, ніж таке у антитіла 10D5, і (с) зв'язується з αvβ6 або катіоннезалежним, або катіонзалежним чином, причому при катіонзалежному зв'язуванні ніяких відмінностей між використанням Ca2+/Mg2+ і Mn2+ не виявляється, яке містить області (CDR), що визначають комплементарність, 1, 2 і 3 важкого ланцюга і області (CDR), що визначають комплементарність, 1, 2 і 3 легкого ланцюга, де області (CDR), що визначають комплементарність, 1, 2 і 3 важкого ланцюга містять послідовності SEQ ID NO: 3, 6 і 9, відповідно, і де області (CDR), що визначають комплементарність, легкого ланцюга містять послідовності SEQ ID NO: 12, 14 і 18, відповідно. 54. Моноклональне антитіло за п. 53, яке зв'язується з розчинним αvβ6, але не зв'язується з субодиницею β6. 55. Моноклональне антитіло за п. 53, яке перешкоджає активації TGF-β. Винахід відноситься, загалом, до галузі молекулярної біології і конкретно до антитіл проти v6інтегринів. Інтегрини являють собою надсімейство рецепторів клітинної поверхні, які опосередковують адгезію клітина-клітина і клітина-матрикс. Дані білки, як відомо, забезпечують заякорювання, а також сигнали клітинного росту, міграції та диференціювання під час розвитку і відновлення тканини. Інтегрини також залучені до зворотного диференціювання та інвазії клітин, особливо коли клітини втрачають їх спеціалізовану форму і стають метастазуючими раковими клітинами. Інтегрини являють собою гетеродимерні білки, складені з двох нековалентно зв'язаних субодиниць,  і . Специфічність зв'язування інтегринами диктується комбінацією деяких з 18 різних ланцюгів з деякими з 8 різних -ланцюгів. v6інтегрин може зв'язуватися з деякою кількістю лігандів, включаючи фібронектин, тенасцин, вітронектин, і нещодавно ідентифікований асоційований з латентністю пептид "LAP", пептид з 278 амінокислот, синтезований у вигляді частини білка-попередника TGF- [Munger et al., Cell 96 (3): 319-328 (1999)]. LAP відщеплюється від зрілої форми TGF- у вигляді N-кінцевого пептиду під час секреції, але залишається нековалентно асоційованим з TGF- для підтримки його латентного стану. Даний комплекс не може зв'язуватися з рецептором TGF- і тому не активний біологічно, v6інтегрин може зв'язуватися безпосередньо з RGDмотивом, що міститься всередині LAP, що приводить до вивільнення LAP і активації TGF-. Оскільки зв'язування v6 з LAP може мати значення при переході TGF- в його активний стан, блокування даного зв'язування може приводити до інгібування v6-опосередкованої активації TGF- та асоційованої фіброзної патології. Даний винахід базується на відкритті і характеристиці високоафінних антитіл проти v6, включаючи ідентифікацію і аналіз ключових амінокислотних залишків у ділянках, що визначають компліментарність (CDR) таких антитіл. Даний винахід відноситься до моноклонального антитіла, яке (а) специфічно зв'язується з v6; (b) інгібує зв'язування v6 з його лігандом, таким як LAP, фібронектин, вітронектин і тенасцин, зі значенням ІС50, меншим, ніж у антитіла 10D5 [публікація заявки на видачу Міжнародного патенту WO 99/07405]; (с) блокує активацію TGF-; (d) містить визначені амінокислотні послідовності у CDR 7 (наприклад, такі, як показано на Фіг.7А і 7В), які забезпечують специфічність зв'язування з v6; (е) специфічно зв'язується з субодиницею 6; і/або (f) розпізнає v6 у процедурах імунного забарвлення, таких як імунне забарвлення залитих у парафін тканин. Було виявлено, що антитіла, які зв'язуються з v6, можуть бути розділені на біофізичні різні класи і субкласи. Один з класів антитіл виявляє здатність блокувати зв'язування ліганду (наприклад, LAP) з v6 (блокатори). Даний клас антитіл може далі поділятися на субкласи катіон-залежних блокаторів і катіон-незалежних блокаторів. Деякі з катіон-залежних блокаторів містять пептидну послідовність аргінін-гліцин-аспартат (RGD), а катіоннезалежні блокатори не містять RGDпослідовність. Інший клас антитіл виявляє здатність зв'язуватися з v6 і при цьому не блокує зв'язування v6 з лігандом (неблокувальні антитіла). Відповідно, у деяких здійсненнях даного винаходу деякі антитіла відповідно до винаходу є катіон-залежними двовалентними відносно зв'язування v6, у той час як інші є катіон-незалежними двовалентними відносно зв'язування v6. Типовими катіонами є Са2+, Mg2+ і Мn2+. У деяких здійсненнях антитіло містить ті ж поліпептидні послідовності легких і важких ланцюгів, що і антитіло, яке продукується гібридомою 6.1А8, 6.3G9, 6.8G6, 6.2В1, 6.2В10, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1G10, 7.7G5 або 7.1С5. У деяких здійсненнях антитіла містять важкий ланцюг, ділянки, що визначають комплементарність, (CDR) 1, 2 і 3 якого складаються по суті (тобто, за винятком деяких консервативних варіацій) з послідовностей SEQ ID NO: 1, 4 і 7, відповідно, і/або легкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 10, 13 і 15, відповідно. У деяких здійсненнях антитіла містять важкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 3, 5 і 8, відповідно, і/або легкий ланцюг, CDR 1,2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 11, 14 і 17, відповідно. У деяких здійсненнях антитіла містять важкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 3, 6 і 9, відповідно, і/або легкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 12, 14 і 18, відповідно. У деяких здійсненнях антитіла містять важкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 2, 46 і 47, відповідно, і/або легкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 48, 13 і 16, відповідно. У деяких здійсненнях антитіла містять важкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 49, 51 і 53, відповідно, і/або легкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 55, 57 і 59, відповідно. У деяких здійсненнях антитіла містять важкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з 90242 8 послідовностей SEQ ID NO: 50, 52 і 54, відповідно, і/або легкий ланцюг, CDR 1, 2 і 3 якого складаються по суті з послідовностей SEQ ID NO: 56, 58 і 60, відповідно. У деяких здійсненнях антитіла містять послідовність варіабельного домену важкого ланцюга, будь-яку з SEQ ID NO: 19-36 і 61-62. У деяких здійсненнях антитіла містять послідовності варіабельних доменів важкого і легкого ланцюгів (1) SEQ ID NO:19 i 37; (2) SEQ ID NO: 20 або 21 і SEQ ID NO: 38; (3) SEQ ID NO: 22 і 43; (4) SEQ ID NO: 23 і 44; (5) SEQ ID NO: 24 і 45; (6) SEQ ID NO: 25 або 26 і SEQ ID NO: 42; (7) SEQ ID NO: 27, 28 або 29, і SEQ ID NO: 39; (8) SEQ ID NO: 34 або 35, і SEQ ID NO: 40; (9) SEQ ID NO: 36 і 41; (10) SEQ ID NO: 61 і 63; або ΚΙ 1) SEQ ID NO: 62 і 64, відповідно. У деяких здійсненнях антитіла специфічно зв'язуються з v6. але не інгібують зв'язування з пептидом, асоційованим з латентністю (LAP). Щонайменше, деякі з даних антитіл здатні зв'язуватися з v6 у залитих у парафін зрізах тканин, і тому можуть використовуватися для діагностичних цілей. Типові антитіла включають в себе 6.2А1 і 6.2Е5. Даний винахід також відноситься до антитіл, які зв'язуються з тими ж епітопами, що і будь-яке з описаних вище антитіл. Даний винахід також відноситься до композицій, які включають в себе одне або декілька антитіл відповідно до винаходу і фармацевтично прийнятний носій У деяких з даних композицій антитіла кон'югують з цитотоксичним агентом (тобтo, з агентом, який ослаблює життєздатність і/або функції клітини), таким як токсин або радіонуклід. Антитіла у даних композиціях можуть бути катіон-залежними антитілами. Композиції можуть вводитися суб'єкту (наприклад, ссавцеві, такому як людина), який страждає від захворювання, опосередкованого v6, або при ризику такого захворювання, для лікування (наприклад, полегшення, пом'якшення, зниження, запобігання, відкладення нападу) захворювання. Необмежувальні приклади таких захворювань охоплюють: фіброз (наприклад, склеродермію, рубці, фіброз печінки, фіброз легень та фіброз нирок); псоріаз: злоякісні пухлини (наприклад, епітеліальний рак; рак ротової порожнини, шкіри, шийки матки яєчників, глотки, гортані, стравоходу, легень, молочної залози, нирки або колоректальний рак); синдром Альпорта; гострі і хронічні ушкодження легенів, печінки, нирок та інших внутрішніх органів; і склероз легені, печінки, нирок та інших внутрішніх органів. Ризики виникнення таких захворювань можуть бути результатом генетичної схильності; деяких життєвих звичок, таких як паління і алкоголізм; впливу забруднювачів навколишнього середовища, таких як азбест: фізіологічних станів, таких як діабет, інфекція вірусним гепатитом (наприклад, інфекція вірусним гепатитом С), аутоімунні захворювання; і медичних процедур, таких як радіаційна терапія. Даний винахід також відноситься до способів 9 детектування v6 у зразку тканини від ссавця (наприклад, людини), що охоплюють контактування зразка тканини з антитілом за винаходом, таким як 6.2А1 і 6.2Е5. Даний винахід також відноситься до клітин гібридом 6.1А8, 6.2В10. 6.3G9. 6.8G6, 6.2В1, 6.2А1, 6.2Е5, 7.1G10, 7.7G5 і 7.1С5; виділених нуклеїнових кислот, що включають в себе кодувальну послідовність, будь-яку з SEQ ID NO: 19-45 і 61-64; виділених поліпептидів, що включають в себе амінокислотну послідовність, будь-яку з SEQ ID NO: 19-45 і 61-64. Антитіло відповідно до винаходу відноситься до повнорозмірного антитіла, наприклад, антитіла, що включає в себе два важких ланцюги і два легких ланцюги, або до фрагмента, що зв'язує антиген, повнорозмірного антитіла, такого як Fabфрагмент, Fab'-фрагмент, F(ab')2-фрагмент або F(v)-фрагмент. Антитіло відповідно до винаходу може бути мишачим антитілом або його гомологом, або повнорозмірним людським антитілом. Антитіло відповідно до винаходу також може бути гуманізованим антитілом, химерним антитілом або одноланцюговим антитілом. Антитіло відповідно до винаходу може відноситися до будь-якого ізотипу і субтипу, наприклад, до IgA (наприклад, IgA1 і IgA2). IgG (наприклад IgGl1, IgG2, IgG3 і IgG4), IgE, IgD, IgM, де легкі ланцюги імуноглобуліну можуть бути типу каппа або лямбда. У деяких здійсненнях антитіло відповідно до винаходу може включати в себе мутацію (наприклад, делецію, заміну або додавання) в одній або декількох (наприклад, 2, 3, 4, 5 або 6) конкретних позиціях у важкому ланцюгу, так що ефекторна функція антитіла (наприклад, здатність антитіла зв'язуватися з Fe-рецептором або з фактором комплементу) змінена без впливу на антигензв'язувальну активність антитіла. В інших здійсненнях антитіло відповідно до винаходу може містити мутацію в амінокислотному залишку, який являє собою ділянку глікозилування, так що ділянка глікозилування елімінується. Таке антитіло може володіти переважним для клініки зниженням ефекторних функцій або інших небажаних функцій при збереженні його антигензв'язувальної активності. Мутація ділянки глікозилювання також може бути сприятливою для розробки способу (наприклад, експресії і очищення білка). В інших здійсненнях важкі або легкі ланцюги можуть містити мутації, які підвищують спорідненість або ефективність. Деякі з гібридом злиття 6 і злиття 7 помістили на зберігання в American Type Culture Collection ("АТСС"; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108. США) за Будапештською угодою. Гібридомні клони 6.1А8, 6.2В10, 6.3G9, 6.8G6і 6.2В1 помістили на зберігання 16 серпня 2001p., і вони мають інвентарні номери АТСС РТА-3647, -3648, -3649, -3645 і -3646, відповідно. Гібридомні клони 6.2А1. 6.2Е5, 7.1G10, 7.7G5 і 7.1С5 помістили на зберігання 5 грудня 2001p., і вони мають інвентарні номери АТСС РТА-3896, -3897, -3898, -3899 і -3900, відповідно. Див. таблицю 1 нижче. Антитіла відповідно до винаходу можуть використовуватися для лікування будь-якого небажа 90242 10 ного для клініки стану або захворювання (що обговорюється у даному описі), яке опосередковане зв'язуванням v6 з його лігандом, таким як LAP і фібронектин. Дані антитіла можуть бути більш ефективними за рахунок більш високої спорідненості або авідності і залежності або незалежності зв'язування ліганду від катіонів у порівнянні з раніше відомими антитілами проти v6. На додаток до терапевтичних застосувань антитіл відповідно до винаходу, особливо блокаторів, клас неблокувальних антитіл може використовуватися для діагностичних цілей, таких як аналізи зв'язування антитіл, імуноферментпі сорбційні аналізи (ELISA), імуногістохімія і тому подібне. Інші властивості або переваги винаходу будуть зрозумілі з подальшого докладного опису, малюнків і формули винаходу. Фіг.1А і 1В являють собою гістограми, на яких показані результати аналізу з захоплення клітин, в якому визначали здатність різних моноклональних антитіл ("mAb") проти v6 зв'язувати трансфіковані 6 клітини FDC-P1 (як контроль - нетрансфіковані клітини). Фіг.2А являє собою графік, на якому показані результати аналізів ELISA, в яких визначали здатність різних очищених моноклональних антитіл проти v6, "злиття 6" зв'язувати розчинний рекомбінантний v6 людини ("hsv6"). Дані антитіла одержували шляхом імунізації мишей 6 -/- розчинним укороченим людським v6. Числа у підписі до фігури, праворуч, вказують на номери клонів. Відповідні назви клонів див. у таблиці 2. Фіг.2В являє собою графік, на якому показані результати аналізів ELISA, в яких визначали здатність різних очищених моноклональних антитіл проти v6 "злиття 7" зв'язувати розчинний рекомбінантний hsv6. Дані антитіла одержували шляхом імунізації мишей 6-/- трансфікованими 6 клітинами ΝΙΗ 3Т3 (злиття 7). Фіг.3А-F являють собою графіки, на яких показана диференційна залежність від катіонів зв'язування різних моноклональних антитіл проти v6 з hsv6. Фіг.4А і 4В являють собою графіки, на яких показано, що моноклональні антитіла злиття 6 і злиття 7, відповідно, інгібують зв'язування біотинhsv6 з і LAP. Фіг.5А-Е являють собою графіки, на яких показано, що моноклональні антитіла відповідно до винаходу інгібують зв'язування трансфікованих 6 клітин FDC-P1 з LAP. На Фіг.5А і 5В показані результати, одержані з антитілами злиття 6. На ФІГ.5С-Е показані результати, одержані з антитілами злиття 7. Фіг.6А і 6В являють собою графіки, на яких показано, що антитіла злиття 6 і злиття 7, відповідно, інгібують опосередковану v6 активацію TGF, використовуючи аналіз з використанням генарепортера РАІ-1-люциферази для моніторингу активації TGF-. Фіг.7А відображає амінокислотні послідовності варіабельних доменів важких ланцюгів моноклональних антитіл проти v6 6.1Α8, 6.8G6 (субклони 11 А і В), 7.7.G5, 6.2В1, 6.3G9, 6.2В10 (субклони А і В), 6.2G2, 6.2А1, 6.4В4 (субклони А. В і C). 7.10Н2, 7.9Н5, 7.4А3 (субклони А і В), 7.1С5 (субклони А і В) і 7.1G10. Антитіла 6.1А8, 6.8G6 і 7.7G5 є катіонзалежними відносно зв'язування з v6. у той час як антитіла 6.2В1, 6.2А1, 6.3G9, 6.2В10, 6.4В4, 7.1С5 і 7.1G10 є катіон-незалежними (див. нижче). Номери приміток означають позиції амінокислотних залишків. CDR знаходяться у великих прямокутниках, в той час як малі прямокутники містять показані курсивом амінокислоти, що характеризуються поліморфізмом у різних клонах конкретного антитіла. На Фіг.7В відображені амінокислотні послідовності варіабельних доменів легких ланцюгів моноклональних антитіл проти v6 6.1Α8, 6.8G6, 6.4В4, 6.2А1, 7.1С5, 7.1G10, 6.2В10, 7.7G5, 6.2В1 і 6.3G9. Фіг.8 являє собою графік розсіювання, на якому показана експресія v6 у зрізах тканини раку молочної залози людини і плоскоклітинної карциноми людини. Нормальні тканини людини характеризуються лише незначними рівнями експресії v6. Фіг.9А і 9В являють собою графіки кривих другого порядку, що зображують зв'язувальні активності у розчині двох антитіл проти v6 6.8G6 і 6.3G9. відповідно відносно розчинного v6. Фіг.10А і 10В являють собою гістограми, на яких демонструється здатність очищених моноклональних антитіл конкурувати з біотинільованим 6.3G9 і біотинільованим 6.8G6, відповідно, за зв'язування з v6. Фіг.11 являє собою діаграму, на якій показаний відсоток забарвлення гладком'язового актину у нирках від тварин UUO, які були піддані лікуванню mAb проти v6. На Фіг.12 показана експресія ανβ6 у пухлинних клітинних лініях шляхом FACS-аналізу (права сторона фігури) та інгібування зв'язування ліганду LAP пухлинними клітинними лініями за рахунок mAb 6.3G9 і 6.4В4 (ліва сторона фігури). Фіг.13 являє собою діаграму, на якій демонструється інгібування зв'язування трьома пухлинними клітинними лініями ліганду LAP за рахунок mAb проти v6 6.3G9, 6.8G6 і 6.4В4. Зв'язування mAb порівнювали із загальним зв'язуванням без додавання тестових mAb (ТВ) і неспецифічним зв'язуванням лише з контролем BSA (NSB). Фіг.14А і 14В являють собою графіки, на яких показані ефекти mAb проти v6 6.3G9 і 6.4В4, відповідно, після періоду дослідження тривалістю 33 доби відносно пухлин, що виникли внаслідок імплантованих підшкірно клітин Detroit 562. Фіг.15А-С являють собою графіки, на яких показані ефекти mAb проти v6 при індукованому блеоміцином фіброзі легень. (А) Обробка антитілами з використанням mAb 6.3G9 починалася на добу 0 з моменту введення блеоміцину, і за нею стежили протягом періоду 30 діб; (В) Обробка антитілами з використанням mAb 6.3G9 починалася на добу 15 після обробки блеоміцином, і за нею стежили протягом періоду 30 діб; (С) Обробка антитілами з використанням mAb 6.3G9. 6.8G6 і 6.4В4 починалася на добу 15 після обробки блео 90242 12 міцином, і за нею стежили протягом продовженого періоду 60 діб. На Фіг.15А і 15В діаграми зліва являють собою мкг гідроксипроліну/легеня, у той час як діаграми праворуч показують відсоткове підвищення по гідроксипроліну у порівнянні з обробленими сольовим розчином мишами (без блеоміцину). На Фіг.15С на графіку показано вміст гідроксипроліну на легеню. Даний винахід відноситься до класів і субкласів антитіл, які специфічні відносно інтегрину v6. Антитіла, щонайменше, одного класу (блокатори) здатні блокувати зв'язування v6 з LAP або запобігати активації TGF-. Далі описані різні способи одержання антитіл відповідно до винаходу. Способи, відомі у даній галузі, але не описані конкретно у даному описі, також входять в об'єм даного винаходу. Наприклад, антитіла відповідно до винаходу можуть також ідентифікуватися з використанням бібліотек антитіл на основі фагового дисплея, таких як описані Smith, Science 228: 1315-7 (1985); у патентах США 5565332, 5733743, 6291650 і 6303313. Додаткові антитіла відповідно до винаходу можуть бути одержані шляхом зв'язування ідентифікованих у даному описі важких ланцюгів з неспорідненим легким ланцюгом, наприклад, легким ланцюгом, ідентифікованим за технологією фагового дисплея. Антитіла гібридом, що не відносяться до людини Моноклональні антитіла відповідно до винаходу можуть генеруватися шляхом добре відомої гібридомної технології. Для її здійснення 6-/- тварин (наприклад, мишей, щурів або кроликів) імунізують очищеними або неочищеними препаратами v6, клітинами, трансфікованими конструкціями кДНК, що кодують v,6або обидва антигени, клітинами, які конститутивно експресують ανβ6 і тому подібним. Антиген може доставлятися у вигляді очищеного білка, білка, експресованого на клітинах, фрагментів білка або його пептидів, або у вигляді голої ДНК або вірусних векторів, що кодують білок, фрагмент білка або пептид Сироватки імунізованих тварин потім тестують на наявність антитіл проти v6. З тест-позитивних тварин виділяють В-клітини і гібридоми одержують з використанням даних В-клітин. Антитіла, що секретуються гібридомами, піддають скринінгу на їх здатність специфічно зв'язуватися з v6 (наприклад, зв'язуватися з трансфікованими 6, клітинами і не зв'язуватися з нетрансфікованими вихідними клітинами) і на будь-які інші необхідні властивості, наприклад, на наявність необхідних консенсусних послідовностей CDR, на інгібування (або відсутність інгібування у випадку неблокувальних антитіл) зв'язування LAP і v6 зі значенням ІС50 нижче такого у відомого антитіла проти v6 10D5 або на інгібування активації TGF-β. Гібридомні клітини, тест-позитивні в аналізах за скринінгом. культивують у поживному середовищі в умовах, які забезпечують секрецію клітинами моноклональних антитіл у культуральне середовище. Потім приведену до належних умов 13 культуральну надосадову рідину збирають і очищають антитіла, що містяться у надосадовій рідині. Альтернативно, необхідне антитіло може продукуватися шляхом ін'єкції гібридомних клітин у черевну порожнину неімунізованої тварини (наприклад, миші). Гібридомні клітини проліферують у черевній порожнині, секретуючи антитіло, яке накопичується у вигляді асцитної рідини. Потім антитіло може бути зібране шляхом відбору шприцомасцитної рідини з черевної порожнини. Моноклональні антитіла також можуть генеруватися шляхом виділення кДНК, що кодують антитіла, з необхідних гібридом, трансфекції клітин хазяїна-ссавця (наприклад, клітин СНО або NSO) даними кДНК, культивування трансфікованих клітин хазяїна і одержання антитіла з культурального середовища. Химерні антитіла Моноклональні антитіла відповідно до винаходу також можуть генеруватися шляхом конструювання спорідненого гібридомного (наприклад, мишачого, щурячого або кролячого) антитіла. Наприклад, споріднене антитіло може бути змінене шляхом технології рекомбінантної ДНК, так що цілі ділянки шарніра і/або константні ділянки важких і легких ланцюгів або їх частини замінюють відповідними компонентами антитіла з іншого виду (наприклад, людини). Загалом, варіабельні домени сконструйованого антитіла залишаються ідентичними або по суті ідентичними відносно варіабельних доменів спорідненого антитіла. Таке сконструйоване антитіло називають химерним антитілом, і воно менш антигенне, ніж споріднене антитіло при введенні суб'єкту виду, з якого походять ділянки шарніра і/або константні ділянки (наприклад, людини). Способи одержання химерних антитіл добре відомі у даній галузі. Химерні антитіла, що відносяться до даного винаходу, можуть містити варіабельний домен важкого ланцюга, що має послідовність, ідентичну (або по суті ідентичну) будь-якій з SEQ ID NO: 1936, і/або варіабельний домен важкого ланцюга, що має послідовність, ідентичну (або по суті ідентичну) будь-якій з SEQ ID NO: 37-45. Переважні константні ділянки людини включають в себе ті, що походять від IgG1 тa IgG4. Повністю людські антитіла Моноклональні антитіла відповідно до винаходу також включають в себе повністю людські антитіла. Вони можуть бути одержані з використанням примованих in vitro людських спленоцитів, як описано Boerner et al..J. Immunol, 147: 86-95 (1991), або з використанням бібліотек антитіл фагового дисплея, як описано, наприклад, у патенті США 6300064. До деяких інших способів одержання повністю людських антитіл залучене застосування тварин, що не відносяться до людини, які містять інактивовані ендогенні локуси Ig і є трансгенними по неперебудованих генах важких ланцюгів і легких ланцюгів людських антитіл. Таких трансгенних тварин можна імунізувати v6 і потім з В-клітин, що походять звідти, одержують гібридоми. Дані способи описані, наприклад, у різних публікаціях/патентах GenPharm/Medarex (Palo Alto. Каліфо 90242 14 рнія), що стосуються трансгенних мишей, які містять мінілокуси Ig людини (наприклад, Lonberg, патент США 5789650); у різних публікаціях/патентах Abgenix (Fremont, Каліфорнія) відносно XENOMICE [наприклад. Kucherlapati, патенти США 6075181, 6150584 і 6162963; Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994); і Mendez et al., 15 (2): 146-56 (1997)]; у різних публікаціях/патентах Kirin (Японія). що стосуються "трансомних" мишей [наприклад, ЕР 843961, і Tomizuka et al., Nature Genetics 16: 133-1443 (1997)]. Гуманізовані антитіла Моноклональні антитіла відповідно до винаходу також включають в себе гуманізовані версії споріднених антитіл проти ανβ6. що походять з інших видів. Гуманізоване антитіло являє собою антитіло, що продукується за технологією рекомбінантної ДНК, де деякі або всі амінокислоти важкого або легкого ланцюга людського імуноглобуліну, які не потрібні для зв'язування антитіла (наприклад. константні ділянки і каркасні ділянки варіабельних доменів), використовують для заміщення відповідних амінокислот з легкого або важкого ланцюга спорідненого антитіла, що не відноситься до людини. Наприклад, гуманізована версія мишачого антитіла до даного антигену має в обох його важких і легких ланцюгах (1) константні ділянки людського антитіла; (2) каркасні ділянки з варіабельних доменів людського антитіла; і (3) CDR з мишачого антитіла. За необхідності один або декілька залишків у каркасних ділянках людини можуть замінюватися залишками з відповідних позицій мишачого антитіла, так що зберігається спорідненість зв'язування гуманізованого антитіла з антигеном. Дану зміну іноді називають "зворотна мутація". Гуманізовані антитіла звичайно рідше викликають імунну відповідь у людей у порівнянні з химерними людськими антитілами, оскільки перші містять помітно менше компонентів, що не відносяться до людини. Способи одержання гуманізованих антитіл описані, наприклад, у Winter. HP 239 400; Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); Riechmann et al.. Nature 332 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239: 1534-1536 (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 10029 (1989); у патенті 6180370; і Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 3833 (1989). Загалом, трансплантація мишачих (або інших, щo не відносяться до людини) CDR на антитіло людини досягається наступним чином. кДНК, що кодують варіабельні домени легких і важких ланцюгів, виділяють з гібридоми. Послідовності ДНК варіабельних доменів, включаючи CDR. визначають шляхом секвенування. ДНК, що кодують CDR, переносять у відповідні ділянки кодувальної послідовності варіабельних доменів легких і важких ланцюгів людського антитіла шляхом сайт-специфічного мутагенезу. Потім додають сегменти генів людських константних ділянок необхідного ізотипу (наприклад, 1 для СН і k для CL). Гуманізовані важкі і легкі ланцюги спільно експресують у клітинах хазяїна-ссавця (наприклад, клітинах СНО або NSO) для одержання розчинного гуманізованого антитіла. Для полегшення широкомасштабного продукування антитіл часто потрі 15 бно продукувати такі гуманізовані антитіла у біореакторах, що містять клітини, які експресують антитіла, або одержувати трансгенних ссавців (наприклад, кіз, корів або овець), які експресують дане антитіло у молоці (див., наприклад, патент США 5827690). Іноді пряме перенесення CDR у каркас антитіл людини приводить до втрати спорідненості зв'язування антигену одержаного у результаті антитіла. Це відбувається тому, що у деяких споріднених антитілах деякі амінокислоти у каркасних ділянках взаємодіють з CDR і так впливають на загальну спорідненість зв'язування антитілом. У таких випадках критичним є введення "зворотних мутацій" (див. вище) у каркасні ділянки акцепторного антитіла для збереження антигензв'язувальної активності спорідненого антитіла. Загальний підхід до одержання зворотних мутацій відомий у даній галузі. Наприклад., у Queen et al. (вище), Co et al., в Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 2869-2873 (1991), та у WO 90/07861 (Protein Design Labs Inc.) описаний підхід до якого залучені дві ключові стадії. По-перше, каркасні V-ділянки людини вибирають шляхом комп'ютерного аналізу для оптимальної гомології білкової послідовності відносно каркаса V-ділянки спорідненого мишачого антитіла. Потім на комп'ютері моделюють третинну структуру мишачої V-ділянки для візуалізації амінокислотних залишків каркаса, які, ймовірно, взаємодіють з мишачими CDR. і дані мишачі амінокислотні залишки потім накладають на гомологічний каркас людини. За даним двостадійним підходом є декілька критеріїв для конструювання гуманізованих антитіл. Першим критерієм є застосування як людської акцепторної частини каркаса конкретного людського імуноглобуліну, який звичайно гомологічний донорному імуноглобуліну, що не відноситься до людини, або застосування консенсусного каркаса з багатьох людських антитіл Другим критерієм є застосування донорної амінокислоти замість акцепторної, якщо людський акцепторний залишок не є звичайним, а донорний залишок є типовим для послідовностей людини у положенні конкретного залишку каркаса. Третім критерієм є застосування донорного амінокислотного залишку каркаса, а не акцепторного, у положеннях, що безпосередньо прилягають до CDR. Також можна використовувати інший підхід, описаний, наприклад, Tempest. Biotechnology 9: 266-271 (1991). За даним підходом каркаси Vділянки, що походять з важких і легких ланцюгів NEWM і REI, відповідно, використовуються для трансплантації CDR без радикального введення мишачих залишків. Перевага застосування даного підходу полягає у тому, що тривимірні структури варіабельних ділянок NEWM і REI відомі з даних рентгенівської кристалографії, і таким чином можуть легко моделюватися конкретні взаємодії між CDR і залишками каркаса V-ділянки. Інші фрагменти Моноклональні антитіла відповідно до винаходу можуть далі включати в себе інші фрагменти для виконання необхідних функцій. Наприклад, антитіла можуть включати в себе фрагмент токси 90242 16 ну (наприклад, правцевого токсину або рицину) або радіонукліду (наприклад, 111In або 90Υ) для знищення клітин, уражених даними антитілами [див., наприклад, патент США 6307026]. Антитіла можуть включати в себе фрагмент (наприклад, біотин, флуоресцентні фрагменти, радіоактивні фрагменти, гістидинову мітку або інші пептидні мітки) для простого виділення або детектування. Антитіла можуть також включати в себе фрагмент, який може продовжувати їх період напівжиття у сироватці, наприклад, фрагмент поліетиленгліколю (PEG). Стани захворювання і моделі тварин Антитіла відповідно до винаходу можуть використовуватися при лікуванні, включаючи профілактику, опосередкованих v6 захворювань. Наприклад, дані антитіла можуть використовуватися для лікування фіброзу (наприклад, фіброзу легень, гострого ушкодження легень, фіброзу нирок, фіброзу печінки, синдрому Альпорта і склеродермії) шляхом блокування активації TGF- або блокування зв'язування v6 з будь-якими іншими лігандами, такими як фібронектин, вітронектин і тенасцин. Новизна даного підходу включає в себе наступне: (1) при ньому блокується активація TGF, а не зв'язування TGF- з його рецептором, (2) при ньому може інгібуватися TGF- місцево (тобто, у ділянках позитивної регуляції v6), а не системно, і (3) при ньому інгібується зв'язування v6 з лігандом. Крім захворювань або станів фіброзу, антитіла відповідно до винаходу можуть використовуватися при лікуванні злоякісних пухлин або метастазів злоякісних пухлин (включаючи ріст та інвазію пухлини), особливо епітеліальних раків. Підмножина епітеліальних раків включає в себе плоскоклітинну карциному, наприклад, рак голови і шиї, ротової порожнини, молочної залози, легень, передміхурової залози, шийки матки, глотки, товстої кишки, підшлункової залози і яєчників. Дослідження авторів винаходу з використанням нових моноклональних антитіл проти v6 продемонстрували, що v6 високо експресований у багатьох епітеліальних раках, особливо у найбільш вираженій ділянці пухлин. Нові антитіла також можуть використовуватися відносно багатьох інших захворювань, опосередкованих v6, включаючи псоріаз. Способи лікування відповідно до даного винаходу ефективні відносно суб'єктів, які є людьми і тваринами, уражених даними станами. Суб'єктитварини, до яких може застосовуватися даний винахід, охоплюють як домашніх тварин, так і худобу, яку тримають як улюбленців або для комерційних цілей. Прикладами є собаки, коти, велика рогата худоба, коні, вівці, свині та кози. Ефективність антитіл відповідно до винаходу може тестуватися на різних експериментальних тваринах. Моделі фіброзу легень на мишах включають в себе індукований блеоміцином [Pittet et al., J. Clin. Invest. 107 (12): 1537-1544 (2001): і Munger et al., вище] і опроміненням фіброз легень [Franko et al., Rad. Res. 140: 347-355 (1994)]. У оброблених блеоміцином мишей експресія v6 підвищується в епітеліальних альвеолярних клітинах легень. Але 17 6-нокаут-миші захищені віл індукованого блеоміцином ушкодження і фіброзу. Моделі фіброзу нирок на мишах включають в себе COL4A3-/- мишей [див наприклад, Cosgrove et al., Amer. J. Path. 157: 1649-1659 (2000)]. мишей з індукованим адріаміцином ушкодженням [Wang et al., Kidney International 58: 1797-1804 (2000); Deman et al., Nephrol Dial Transplant 16: 147-150 (2001)]. мишей db/db [Ziyadeh et al., PNAS USA 97: 8015-8020 (2000)]. і мишей з однобічним закупоренням сечоводу [Fogo et al., Lab Investigation 81: 189A (2001): і Fogo et al., Jolonal of the American Society of Nephrology 12: 819A (2001)]. У всіх цих моделях у мишей розвивається ушкодження і фіброз нирок, що може прогресувати у ниркову недостатність, v6 позитивно регулюється в епітеліальному спрямуванні висхідних і низхідних трубочок нирок COL4A3-/- мишей, оброблених адріаміцином мишей і мишей, які мають однобічне закупорення сечоводу. Ймовірно, що експресія v6 також зростає при різних моделях ушкодження нирок. Моноклональні антитіла проти v6 також можуть тестуватися на предмет їх здатності інгібувати ріст, прогресування і метастазування пухлини у таких моделях на тваринах, як стандартні моделі пухлинного росту in vivo і моделі метастазування. Див., наприклад, Rockwell et al., J. Natl. Cancer Inst. 49: 735 (1972): Guy et al., Моl. Cell Biol. 12: 954 (1992); Wyckoff et al., Cancer Res. 60: 2504 (2000): і Oft et al., Curr. Biol. 8: 1243 (1998). Значимі ліганди v6 при раку можуть включати в себе TGF-, який бере участь у метастазуванні [для огляду див. Akhurst et al., Trends in Cell Biology 11: S44-S51 (2001)], фібронектин і вітронектин. Ефективність способів лікування відповідно до винаходу можна вимірювати деякою кількістю доступних діагностичних інструментів, включаючи фізичну оцінку, тести крові, вимірювання протеїнурії, рівня креатиніну і кліренсу креатиніну, тести функції легень, рівнів азоту плазми крові і сечі (BUN), спостереження і підрахунок рубців або фіброзних осередків ушкодження, відкладення позаклітинного матриксу, такого як колаген, гладком'язовий актин і фібронектин, тести функції нирок, ультразвукове дослідження, магнітно-резонансні знімки (MRI), і КТ-сканування. Фармацевтичні композиції Фармацевтичні композиції відповідно до винаходу включають в себе одне або декілька антитіл згідно з даним винаходом або їх фармацевтично прийнятні похідні, необов'язково, з будь-яким фармацевтично прийнятним носієм. Використовуваний у даному описі термін "носій" включає в себе відомі прийнятні ад'юванти і носії. Відповідно до винаходу, фармацевтичні композиції можуть бути у вигляді стерильних препаратів для ін'єкцій, наприклад, стерильної водної або масляної суспензії для ін'єкцій. Ця суспензія може складатися за способами, відомими у даній галузі, з використанням відповідних засобів, що диспергують, зволожують і суспендують. Фармацевтичні композиції відповідно до винаходу можуть вводитися шляхом перорального, місцевого, внутрішньовенного, підшкірного, внутрішньо-черевинного, внутрішньом'язового, інтра 90242 18 медулярного, внутрішньосуглобового, інтрасиновіального, внутрішньогруднинного, інтратекального, внутрішньо-печінкового або внутрішньочерепного введення, в залежності від вимог, або безпосередньо місцево у ділянках запалення або пухлинного росту. Фармацевтичні композиції відповідно до винаходу можуть також вводитися шляхом інгаляції. наприклад, за допомогою застосування розпилювача, інгалятора сухого порошку або інгалятора з дозою, що відміряється. Дозування і потужність дози антитіл відповідно до винаходу, ефективні для продукування необхідних ефектів, залежать від різних факторів, таких як природа захворювання, що підлягає лікуванню, розмір суб'єкта, мета лікування, конкретна використовувана фармацевтична композиція і рішення лікуючого лікаря. Рівні дозування складають приблизно від 0,001 до 100мг/кг маси тіла на добу, наприклад, приблизно від 0,1 до 50мг/кг маси тіла на добу сполуки, що підлягає використанню - активного інгредієнта. Наприклад, антитіло відповідно до винаходу вводять у дозі, що змінюється від приблизно 0,01мг/кг маси тіла/доба до приблизно 20мг/кг маси тіла/доба, наприклад, що змінюється від приблизно 0,1мг/кг маси тіла/доба до приблизно 10мг/кг маси тіла/доба, і з інтервалами від однієї до чотирнадцяти діб. В іншому здійсненні антитіло вводять у дозі від приблизно 0,3 до приблизно 1мг/кг маси тіла при внутрішньочеревинному введенні. Ще в одному здійсненні антитіло вводять у дозі від приблизно 5 до приблизно 12,5мг/кг маси тіла при внутрішньовенному введенні. В одному зі здійснень композицію антитіла вводять у кількості, ефективній для забезпечення рівня антитіла у плазмі, що дорівнює, щонайменше, 1мг/мл. Способи діагностики Антитіла відповідно до винаходу можуть використовуватися для діагностики станів захворювання, асоційованих зі зміненими рівнями експресії v6. Зразок тканини з суб'єкта, такий як біопсія тканини, зразок рідини організму або лаваж (наприклад, альвеолярний лаваж), може тестуватися в аналізі захоплення антигeну. ELISA, імуногістохімічному аналізі і т.п. з використанням антитіл. Зразок тканини з нормального суб'єкта використовують як контроль. При втіленні даного винаходу будуть використовуватися, крім вказаних інакше випадків, загальноприйняті способи клітинної біології, культури клітин, молекулярної біології, мікробіології, рекомбінантної ДНК, білкової хімії та імунології, які відносяться до даної професійної галузі. Такі способи описані у літературі. Див., наприклад, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd edition (Sambrook et al., Eds.), 1989; Oligonucleotide Synthesis, (M.J. Gait, Ed.), 1984; патент США 4683195, виданий Mullis et al.; Nucleic Acid Hybridization, (B.D. Hames and S. J. Higgins), 1984; Transcription and Translation, (B.D. Hames and S.J. Higgins), 1984; Culture of Animal Cells (R.I. Freshney, Ed.), 1987; Immobilized Cells and Enzymes, IRL Press, 1986; A Practical Guide to Molecular Cloning (B. Perbal), 1984: Methods in Enzymology, Volumes 154 and 155 (Wu et al., Eds.), Academic Press, New York; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.H. Miller and 19 M.P. Calos, Eds.), 1987; Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Mayer and Walker, Eds.), 1987; Handbook of Experiment Immunology, Volumes I-IV (D.M. Weir and C.C. Blackwell, Eds.), 1986; Manipulating the Mouse Embryo, 1986. Крім випадків, де оговорено інакше, всі використовувані у даному описі технічні і наукові терміни мають значення, подібні до тих, які розуміються звичайним фахівцем у даній галузі, до якої відноситься даний винахід. Типові способи і матеріали описані нижче, хоча способи і матеріали, подібні дο або еквівалентні описаним у даному описі, також можуть використовуватися при втіленні даного винаходу. Всі публікації або інші посилання, наведені у даному описі, включені у всій своїй повноті як посилання. У випадку конфлікту для контролю буде служити наступна специфікація, що включає в себе визначення. Матеріали, способи і приклади є лише ілюстративними, а не обмежувальними. У межах даного опису слово "включати в себе" або такі його варіанти як "включає в себе" або "такий, що включає в себе", як це розуміється, має на увазі включення встановленого об'єкта і групи об'єктів, але не виключення будьякого іншого об'єкта або групи об'єктів. Приклади Наступні приклади призначені для ілюстрації способів і матеріалів даного винаходу. Відповідні модифікації і адаптації описаних умов і параметрів. що звичайно зустрічаються у галузі застосування антитіл, які очевидні фахівцям у даній галузі, знаходяться у межах суті і об'єму даного винаходу. У наступних прикладах одержують 6-/- мишей, як це описано у Huang et al , в J. Cell Biol. 133: 921 (1996). Рекомбінантний LAP людини придбавали у R&D Systems (Minneapolis, Міннесота). Антитіло 10D5 придбавали у Chemicon (Temecula, Каліфорнія). Гібридому L230 придбавали в АТСС, і антитіло, яке секретують, очищали з надосадової рідини насичених культур шляхом афінної хроматографії на іммобілізованому білці А. Визначення ізотипу антитіл проводили з використанням набору ISOSTRIP (Roche Diagnostics) відповідно до інструкцій виробника. Трансфіковану 6 клітинну лінію SW480 одержували, як описано у Weinacker et al., в J. Biol. Chem. 269: 6940-6948 (1994). Приклад 1: Одержання трансфікованих 6 стабільних клітинних ліній Трансфіковані 6 клітини ΝΙΗ 3Т3 і FDC-P1 одержували шляхом електропорації батьківських клітинних ліній ДНК-конструкціями, що містять повнорозмірну мишачу кДНК β6 і селективний маркер неоміцин. Стабільно трансфіковані клітини відбирали шляхом пасирування клітин у культуральному середовищі, що містить G418, протягом 14 діб з подальшим сортуванням активованих флуоресценцією клітин (FACS) для виділення клітин, які експресують найвищий рівень поверхневого β6. Трансфіковані клітини FDC-P1 культивували у DMEM, доповненій 4мМ L-глутаміну, доведеній до вмісту 1,5г/л бікарбонату натрію, 4,5г/л глюкози і 1,0мМ пірувату натрію, 10% FBS, 2,5% домішки для культури мишачого IL-3 і 1,5мг/мл активного G418. Трансфіковані клітини ΝIΗ 3Т3 культивували у 90242 20 DMEM, доповненій 10% FBS, 2мМ L-глутаміну, пеніциліном/стрептоміцином і 1мг/мл активного G418. Приклад 2: Очищення розчинного v6 Білок v6 очищали по суті як описано Weinacker вище. Культивували клітинну лінію СНО, що експресує hsv6, і одержану у результаті надосадову рідину збирали центрифугуванням. Інтегрин очищали шляхом афінної хроматографії з використанням антитіла проти v L230. Очищене L230 перехресно зв'язували з активованою CNBr сефарозою 4В (Sigma) відносно 4,8мг антитіла/мл смоли. Надосадову рідину v6 завантажували відносно 0,5мг антитіла/мл смоли на афінну колонку з L230, і колонку промивали 10 об'ємами колонки з використанням кожного разу (1) 50мМ Tris-Cl, рН7,5, 1Μ NaCl, 1мМ MgCl2; (2) 50мМ Tris-Cl, рН7,5, 50мМ NaCl, 1мМ MgCl2; і (3) 10мМ Na3PO4, рН7,0. Hsv6 елюювали 100мМ гліцину, рН 2,5 в 1:10 об'єму 1М Na3PO4, рН8,0. Білок діалізували проти декількох змін забуференого фосфатом сольового розчину (PBS) і зберігали при -20°С. Приклад 3: Імунізація 6-/- мишей β6-/- мишей імунізували шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції (IP) 25мкг очищеного рекомбінантного людського v6, емульгованого у повному ад'юванті Фрейнда (CFA) при об'ємному співвідношенні 1:1 у загальному об'ємі 200мкл. Альтернативно, 6-/- мишей імунізували шляхом внутрішньочеревинної ін'єкції з 4106 трансфікованими 6 клітинами ΝΙΗ 3Т3, ресуспендованими у 100мкл PBS, доповненого 1мг/мл СаСl2 і 1мг/мл MgCl2, і тим же мишам робили ін'єкції у прилеглу ділянку 100мкл CFA. Через два та чотири тижні після першої імунізації мишей подібним чином стимулювали тими ж реагентами за винятком того, що замість CFA використовували неповний ад'ювант Фрейнда. Мишей забивали через 7 діб після остаточної стимуляції і визначали титри проти 6 шляхом зв'язування сироватки з очищеним рекомбінантним людським v6 або з трансфікованими 6, клітинами. У випадку імунізації мишей очищеним рекомбінантним людським v6, мишей залишали у спокої на 3 місяці і повторно імунізували тим же антигеном, змішаним з ImmunEasy (Qiagen). За три доби до виділення селезінок для злиття гібридом мишей імунізували 12,5мкг очищеного рекомбінантного білка v6, людини шляхом внутрішньочеревинної і внутрішньовенної ін'єкції. У добу злиття тварин фіксували, діставали їх селезінки і гомогенізували їх у суспензію одиничних клітин. Спленоцити іморталізували шляхом злиття з таким, що підлягає селекції, лікарським засобом клітинним партнером по злиттю. Приклад 4: Скринінг гібридом Дві групи антитіл генерували шляхом імунізації 6-/- мишей. Один набір антитіл генерували шляхом імунізації розчинним людським укороченим v6 (злиття 6). Інший набір антитіл генерували шляхом імунізації мишачими трансфікованими β6 клітинами ΝΙΗ 3Т3 (злиття 7). Скринінг антитіл проти v6 проводили з використанням як тих, що базуються на клітинах, так і безклітинних аналізів зв'язування і функціональних аналізів, як це опи 21 90242 сано нижче. Початкова селекція позитивних клонів базувалася на зв'язуванні очищеного hsv6 і трансфікованих β6 людських і мишачих клітин (нетрансфіковані клітини як контроль). Вибрані клони розмножували, і кінцеві культури повторно оцінювали на предмет зв'язування з трансфікованими β6 і з нетрансфікованими клітинами в аналізі захоплення клітин (приклад 5b, див. нижче) (репрезентативні приклали показані на Фіг.1А і 1В, де префікси "6." або "7." назв mAb, які означають злиπя 6 і злиття 7, відповідно, пропущені; див. також таблицю 2 нижче). Деякі антитіла зв'язуються переважно з трансфікованими β6-клітинами, у той час як інші зв'язуються з трансфікованими і з нетрансфікованими клітинами, і це вказує на те, що лише підмножина антитіл має перевагу відносно 6 (Фіг.1Α і 1В). Подальший відбір базувався на здатності антитіл блокувати зв'язування біотинільованого hsv6 і трансфікованих 6 мишачих клітин з LAP. Вибрані клони субклонували з використанням 22 FACS і зберігали замороженими до використання. Моноклональні антитіла піддавали скринінгу на специфічність зв'язування з v6, базуючись на їх здатності зв'язувати трансфіковані 6 клітини і відсутності зв'язування ними нетрансфікованих вихідних клітин. Далі підтверджували, що моноклональні антитіла являють собою засоби специфічного зв'язування v6, і не зв'язуються з іншими v-інтегринами і неспецифічними інтегринами (тобто інтегринами, що не відносяться до v, які зв'язуються з лігандами, що містять RGD), базуючись на їх нездатності зв'язуватися з клітинними лініями, що експресують v3, v8, 51, v1 або 51. Вони включали в себе стабільні трансфіковані клітини, а також нетрансфіковані клітинні лінії JY. K562. SW480. NIH3T3 i FDCP1. Деякі з антитіл, які були депоновані в АТСС, перераховані нижче у таблиці 1. Таблиця 1 Депоновані гібридоми Клони гібридоми 6.1А8 6.2В10 6.3G9 6.8G6 6.2В1 6.2А1 6.2Е5 7.1G10 7.7G5 7.1С5 № АТСС РТА-3647 РТА-3648 РТА-3649 РТА-3645 РТА-3646 РТА-3896 РТА-3897 РТА-3898 РТА-3899 РТА-3900 Приклад 5: Аналізи за скринінгом і характеристикою a. ELISA v6 96-ямковий планшет для мікротитрування (Corning COSTAR EASY-WASH) покривали 50мкл/ямка 5мкг/мл hsv6 при 4°С протягом ночі. Планшет промивали буфером для промивання (0,1% TWEEN-20 у PBS) чотири рази в автоматичному пристрої для промивання планшетів. Потім додавали 180мкл/ямка 3% BSA у TBS та інкубували протягом 1год. при 25°С для блокування неспецифічного зв'язування. Планшет промивали, як описано вище, і додавали розведення гібридомної надосадової рідини (для аналізів за скринінгом) або очищеного антитіла (для характеристики) у TBS, що містить 1мг/мл BSA, 1мМ СаСl2 і 1мМ MgCl2 (50мкл/ямка). Планшет інкубували протягом 1год. при 25°С, промивали і потім інкубували протягом 1год. з 50мкл/ямка кон'югованого з пероксидазою антитіла кози проти мишачих IgG+A+M (Сарреl). Зв'язане антитіло детектували з використанням 3,3',5,5'-тетраметилбензидину (ТМВ). Зв'язування виявляли за поглинанням, що вимірюється при 450нм. b. Аналіз захоплення клітин 96-ямковий планшет для мікротитрування покривали 50мкл/ямка розчину вторинного антитіла Дата депонування 16 серпня 2001р. 16 серпня 2001р. 16 серпня 2001р. 16 серпня 2001р. 16 серпня 2001р. 5 грудня 2001р. 5 грудня 2001р. 5 грудня 2001р. 5 грудня 2001р. 5 грудня 2001р. (антитіло віслюка проти IgG миші (Jackson Immunoresearch); 5мкг/мл, розчиненого у 50мМ бікарбонаті натрію, рН 9,2) при 4°С протягом ночі. Планшети промивали двічі 100мкл/ямка буферу для аналізу (RPMI +2% BSA) і потім блокували 100мкл/ямка буферу для аналізу при 37°С протягом 1 год. Для клітин FDC-P1 і трансфікованих 6 клітин FDC-P1 планшети блокували антитілами проти мишачих Ig (Jackson ImmunoResearch; 20мкг/мл) протягом 10хв. при кімнатній температурі для зниження неспецифічного зв'язування вторинним антитілом Fc-рецепторів (пропускається для інших клітинних типів). У той час як планшети блокували, клітини мітили 2мкМ флуоресцентною міткою (Calcein-AM, Molecular Probes) у буфері для аналізу при концентрації 5106 клітин/мл. Клітини інкубували з міткою у буфері для аналізу при обережному змішуванні на водяній бані при 37°С протягом 15хв., збирали центрифугуванням, і ресуспендували у буфері для аналізу до 5106 клітин/мл. Після стадії блокування буфер відкидали шляхом витрушування планшета і у планшет додавали 25мкл/ямка надосадової рідини або очищеного антитіла. Після 15хв. інкубації при 37°С додавали 25мкл/ямка мічених клітин і планшет інкубували протягом 1год. при 37°С. Планшет промивали 3-5 разів буфером для аналізу 23 (100мкл/ямка) і фіксували флуоресценцію, що випромінюється захопленими клітинами на планшеті. Відсоток зв'язування визначали шляхом порівняння флуоресценції перед кінцевою стадією промивання (тобто, загального числа доданих клітин) з такою після промивання (тобто, клітин, що зв'язалися). с FACS Клітини збирали шляхом трипсинізації, один раз відмивали PBS і потім ресуспендували у буфері для FACS (1Х PBS, 2% FBS, 0,1% NaN3, 1мМ СаСl2. і 1мМ MgCl2). Потім 0,2105 клітин інкубували на льоду протягом 1 години у буфері FACS, що містить гібридомну надосадову рідину у загальному об'смі 100мкл. Після інкубації клітини відмивали два рази льодяним буфером для FACS, ресуспендували у 100мкл буфера для FACS, що містить 5мкг/мл антитіла віслюка проти мишачих IgG ΡΕ (Jackson ImmunoResearch) та інкубували на льоду протягом 30хв. Клітини потім двічі промивали льодяним буфером для FACS і ресуспендували у 200мкл буфера для FACS. За зв'язуванням міченого РE вторинного антитіла стежили шляхом проточної цитометрії. d. Зв'язування бioтин-hsv6 з LAP 96-ямкові планшети для мікротитрування (Corning COSTAR EASY-WASΗ) покривали 0,3мкг/мл рекомбінантного людського LAP (R&D Systems, кат. номер 246-LP), розведеного у PBS (50мкл/ямка) при 4°С протягом ночі Після того, як розчин для покриття був видалений, планшети блокували 180мкл/ямка 3% BSA/TBS при 25°С протягом 1год. В окремому 96-ямковому круглодонному планшеті 60мкл/ямка 2х маточного розчину (0,5мкг/мл (1,25нМ) біотин-v6, 2мМ СаСl2, і 2мМ MgCl2 у TBS, що містить 1мг/мл BSA) суміщали з 60мкл/ямка 2х маточного розчину гібридомної надосадової рідини (для скринінгу) або очищеного антитіла (також у TBS, що містить 1 мг/мл BSA) та інкубували при 25°С протягом 1год. Після 4разового промивання покритого LAP планшета буфером для промивання (0,1% TWEEN-20 у PBS) в автоматичному пристрої для промивання планшетів 100мкл суміші антитіло-v6 переносили у планшет та інкубували протягом 1год. при 25°С. Планшет промивали, як вказано вище та інкубували з 50мкл/ямка розведення 1:1000 кон'югату екстравідин-пероксидаза хрону (Sigma) у TBS (1мг/мл BSA) протягом 1год. при 25°С. Зв'язаний білок детектували з використанням субстрату ТМВ. е. Адгезія клітин 6-FDC-Pl до LAP 96-ямковий планшет для мікротитрування покривали 50мкл/ямка 0,5мкг/мл і рекомбінантного людського LAP (R&D Systems), розведеного у 50мМ бікарбонату натрію, рН 9,2, при 4°С протягом ночі. Планшет двічі промивали PBS (100 мкл/ямка) і блокували 1% BSA у PBS (100мкл/ямка) протягом 1год при 25°С. Планшет промивали двічі 100мкл/ямка буфера для аналізу (повний TBS плюс 1мМ СаСl2 і 1мМ MgCl2). Далі, до окремих ямок планшета додавали 25мкл гібридомної надосадової рідини (або очищеного антитіла) і 25мкл клітин 6-FDC-Р1 (5106 клітин/мл, помічених Calcein AM, як описано вище). Планшет інкубували при 25°С протягом 1год. і потім проми 90242 24 вали 4-6 разів буфером для аналізу (100мкл/ямка). Фіксували флуоресценцію, що випромінюється клітинами, захопленими на планшет. Відсоток зв'язування визначали шляхом порівняння сигналу флуоресценції перед кінцевою стадією промивання (тобто, загального числа доданих клітин) з таким після промивання (тобто, клітин, що зв'язалися). f. Біоаналіз TGF- Використовуваний у даному описі біоаналіз TGF- являв собою варіант аналізу у спільній культурі з епітеліальними клітинами легень норки (MLEC) з РАІ-1-люциферазою, описаний Abe et al., в Anal. Biochem. 216: 276-284 (1994). де трансфіковані 6 клітини спільно культивували з репортерними клітинами для моніторингу активації TGF- за рахунок v6 (Munger. вище). Даний кількісний біоаналіз TGF-β, базується на його здатності індукувати експресію інгібітору активатора плазміногену-1 (РАІ-1). У даному аналізі клітини MLEC стабільно трансфіковані конструкцією, що експресує, яка містить укорочений промотор РАІ-1, злитий з геном-репортером люциферази світлячка. Вплив трансфікованих клітин MLEC на активний TGF- (від 0,2 до >30пМ) приводить до залежного від дози підвищення люциферазної активності у клітинних лізатах. Для проведення даного аналізу клітини TMLC (лінія епітеліальних клітин легень норки Mv 1 Lu) трансфікували конструкцією РАI-1-люцифераза. Трансфіковані клітини вирощували у DMEM+10% FBS з L-Gln, пен./стрепт. і 200мкг/мл G418. Клітини SW480, трансфіковані конструкцією інтегрину 6, (клітини "6-SW480" або "SW480-6") вирощували у DMEM+10% FBS з L-Gln і пен./стрепт. Клітини підіймали з флаконів за допомогою PBS +5мМ EDTA, промивали у PBS+0,5% BSA, підраховували у гемоцитометрі і поміщали у 96-ямкові планшети. Клітини SW480-6 поміщали у кількості 4x104 клітин/ямка у буфері для промивання. Моноклональні антитіла розбавляли DMEM (безсироватковою), додавали до клітин SW480~p6 і заздалегідь інкубувадм протягом 20 хв. при кімнатній температурі. Потім додавали клітини TMLC у кількості 2хЮ4 клітин/ямка до кінцевого об'єму 100 мкл. Планшети інкубували протягом 20год. у зволоженій, збагаченій СО2 атмосфері інкубатора. Надосадову рідину з планшетів відкидали і замінювали 100мкл PBS+1мМ Са2+ і 1мМ Mg2+. Клітини у планшетах потім лізували і рівень люциферазної активності детектували за допомогою набору Packard LUCLITE для реакцій світлового типу (6016911) і люмінометра для мікропланшетів TROPIX. Приклад 6: Очищення антитіл Вісім гібридомних клонів зі злиття 6 (позначених префіксом "6") і чотирнадцять гібридомних клонів зі злиття 7 (позначених префіксом "7") вибирали для подальшого розмноження і характеристики (таблиця 2). Одержували культуру малого масштабу (150мл) кожної гібридоми, і надосадову рідину збирали шляхом центрифугування. Антитіла очищали з даних зразків надосадової рідини з використанням афінної хроматографії білком А. Для ан 25 90242 титіл ізотипу IgG2a надосадову рідину завантажували безпосередньо на Protein A Sepharose 4 Fast Flow (Amersham Pharmacia Biotech, AB, Упсала. Швеція) (1мл осадженого об'єму). Колонку промивали PBS і фракцію IgG елюювали з використанням 25мМ фосфорної кислоти, 100мМ NaCl pH2,8, в 1:20 об'єму 0,5Μ Na3PO4, pH8,6. Для мишачих 26 антитіл IgGl надосадову рідину доводили перед завантаженням до рН8,9, використовуючи 1,5М гліцин, 3М NaCl, і колонку промивали 25мМ Na3PO4, 3М NaCl, pH8,6, перед елююванням. Ці препарати використовували для описаної у даному описі біохімічної характеристики in vitro. Таблиця 2 Характеристика гібридомних клонів Назва клону 6.1А8 6.2В10 6.3G9 6.4В4 6.6В5 6.8В4 6.8G6 6.2В1 7.1C5 7.1G10 7.2Α1 7.2F5 7.2Н2 7.4А3 7.7G5 7.8Н12 7.9D4 7.9G8 7.9Н5 7.10D7 7.10Н2 № клону 2 10 25 30 46 55 56 85 2 5 6 11 12 17 32 39 40 41 43 44 46 Ізотип IgG2a IgG2a IgGl IgGl IgGl IgGl IgGl IgGl IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgGl IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a IgG2a Блокатор* Υ Υ Υ Ν Ν Ν Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Ν Υ Υ Υ Υ *Блокатор визначається як антитіло, яке блокує зв'язування v6 з LAP, що визначено шляхом блокування зв'язування ліганду hsv6 або клітин, що експресують 6. Для застосування в експериментальних тваринах гібридомні клони поступово розмножували до 2л середовища і вирощували протягом 4 тижнів у Lifecell Culture Bags-PL732 (Nexell, кат.№R4R2113). Антитіла з гібридом спочатку очищали шляхом афінної хроматографії білком А, як описано вище, з подальшою стадією іонообмінної хроматографії на сефарозі Q (Amersham Pharmacia). Елюат хроматографічної стадії з білком А доводили до значення рН8,6 з використанням 2M основи Tris, розведеної у 10 разів водою, і завантажували на колонку з сефарозою Q (20мг білка/мл смоли), яку зрівноважували 10мМ Na3PO4, 25мМ NaCl, pH8,6. Колонку промивали 5 об'ємами колонки буфера для зрівноважування і зв'язаний білок елюювали з використанням 25мМ Na3PO4, 150мМ NaCl, pH7,2. Елюйовані білки стерильно фільтрували (0,45мкм) і зберігали при 70°С до використання. Приклад 7: Характеристика очищених антитіл Очищені антитіла (таблиця 2, див. вище) піддавали кількісній характеристиці відносно їх здатності (1) зв'язувати hsv6, (2) зв'язувати трансфіковані 6 клітини SW480 і FDC-P1, (3) інгібувати зв'язування біотин-v6 з LAP, (4) інгібувати зв'язування трансфікованих 6 клітин FDC-P1 з LAP, і (5) блокувати опосередковану v6 активацію TGF- в аналізі MLEC (вище). Відносну дієвість за кожним з даних аналізів порівнювали з такою відомого антитіла проти v6 10D5 [Huang et al., J. Cell Sci. 111: 2189 (1998)] та, у деяких випадках, з антитілом проти v L230. Для характеристики антитіл злиття 7 як позитивний контроль також використовували антитіло 6.8G6 злиття 6. Експеримент щодо початкового зв'язування (приклад 5а, вище), проведений ν присутності 1мМ Са2+ і 1мМ Mg2+, показав, що більшість очищених антитіл зв'язували hsv6 (Фіг.2А і 2В). Однак, несподівано, не спостерігалося зв'язування 10D5 і клонів 7.2F5 і 7.10D7. У наступному експерименті встановлено, що зв'язування 10D5 (Фіг.ЗЕ), 7.2F5, і 7.10D7 лише слабо підтримувалося Ca2+/Mg2+ але більш сильно 1мМ МпСl2. Серед нових клонів три (6.1А8 (Фіг.ЗА). 7.7G5 і 6.8G6 (Фіг.3С)) характеризувалися вимогою відносно двовалентних катіонів, хоча не спостерігалося відмінності між станом Ca2+/Mg2+ і станом зв'язування Мn2+. Клони, що залишилися, не характеризувалися вимогою до двовалентних катіонів, тобто могли зв'язувати антиген у присутності 10мМ EDTA (Фіг.ЗВ, 3D і 3F). FACS-аналіз зв'язування антитіл з 27 90242 трансфікованими 6 клітинами ΝΙΗ 3T3 ; або клітинами SW480 виявив подібний профіль за винятком того, що 10D5 у даному контексті зв'язувався еквівалентно у станах Ca2+/Mg2+ і Мn2+. Вимоги для зв'язування з розчинним v6 можуть відрізнятися від таких для експресованого на клітинній поверхні v6 внаслідок відмінності у конформації білка або ефектів авідності. Ці результати вказують на те, що у даній групі є, щонайменше. З різних класи антитіл, що блокують 6. Один з даних класів (10D5) відрізняє умови Ca2+/Mg2+ і Мn2+. Інший клас (що включає в себе 6.1А8, 7.7G5 і 6.8G6) вимагає наявності катіонів, але не розрізняє Ca2+/Mg2+ і Мn2+. Останній клас (що включає в себе антитіло проти v L230, 6.2В10, 6.3G9 (Фіг.3В) і 6.2В1 (Фіг.3D), 7.1C5 і 7.1G10) є катіон-незалежним. Потім очищені антитіла оцінювали на їх здатність інгібувати взаємодію v6-LAP. У безклітинному аналізі за прикладом 5d, див. вище, антитіла 6.1А8, 6.2В1, 6.3G9 і 6.8G6 характеризувалися значеннями ІС50, меншими, ніж таке для 10D5 (Фіг.4А; таблиця 3). 6.2В 10 характеризувалося більш високим ІС50, але при цьому давало повне інгібування (Фіг.4А). 6.4В4 характеризувалося тільки частковим інгібуванням, у той час як 6.6В5 і 6.8В4 не характеризувалися інгібуванням (Фіг.4А). З використанням тієї ж системи для аналізу антитіла 7.1С5, 7.1G10, 7.2А1, 7.4А3, 7.7G5, 7.9G8, 7.9Н5 і 7.10Н2 характеризувалися значеннями ІС50. меншими. ніж таке для 10D5 (Фіг.4В; таблиця 3). Антитіла 7.2F5, 7.2Н2 і 7.8H12 характеризува 28 лися майже ідентичними або більш високими значеннями ІС50 і ще давали повне інгібування (Фіг.4В). У клітинному аналізі, описаному у прикладі 5е вище, спостерігали подібну тенденцію за винятком 6.1А8, 6.2В10 і 7.9D4, які були менш дійовими на клітинах, ніж очищений білок (Фіг.5А-Е; таблиця 3). Всі разом дані результати вказують на те, що авторами винаходу успішно одержані антитіла, які специфічно інгібують взаємодію людського і мишачого v6 з LAP. Деякі з даних антитіл зв'язувалися з v6 з високою спорідненістю (виявлені Kd 0,3нМ, що визначено шляхом проточної цитометрії), інгібували зв'язування трансфікованих 6 клітин з LAP з ІС50 0,05нМ (8нг/мл) і запобігали опосередкованій v6 активації TGF-1 з ІС50 0,58нМ (87нг/мл). Нарешті, очищені антитіла оцінювали на їх здатність блокувати опосередковану v6 активацію TGF- в аналізі гена репортера РАІ1/люцифераза (приклад 5f, вище). Знову 6.3G9, 6.8G6, 6.2В1, 7.1G10 і 7.7G5 були здатні інгібувати опосередковану v6 активацію TGF- зі значеннями ІС50, меншими, ніж у 10D5, у той час як антитіла, що залишилися, як виявилося, були значно менш дійовими у даному аналізі (Фіг.6А і 6В; таблиця 3). Таким чином, здатність блокувати взаємодію v6 з LAP корелює зі здатністю інгібувати активацію TGF- in vitro. Таблиця 3 Характеристика гібридомних клонів Назва клону № клону 6.2В1 6.3G9 6.8G6 10D5 6.1А8 6.2В10 6.4В4 6.6В5 6.8В4 L230 7.1G10 7.7G5 7.1C5 7.2A1 10D5 7.4А3 7.10Н2 7.2Н2 7.9Н5 7.9G8 85 25 56 2 10 30 46 55 5 32 32 6 17 46 12 43 41 ЕС50 ELISA зв'язування v6 (нг/мл) 34,7 76,7 17,5 3,7 78,9 25,4 17,1 94,4 27,1 4,2 13,0 2,5* 5* 43* 5,7 6,6 9,3 7,3 6,2 ІС50 блокування v6-LAP (нг/мл) ІС50 блокування FDCP1-LAP (нг/мл) 225 271 169 605 179 1950 >50000 >50000 >50000 229 113 155 80* 300* 377 204 254 370 230 264 8 17 23 50 2520 >30000 >30000 >30000 >30000 n.t.** 30 51 83 101 n.t. 67 63 106 55 284 ІС50РАІ-1люциферази (нг/мл) 87 375 312 2070 40000 >40000 >40000 >40000 >40000 n.t. 250 700 n.t. n.t. 2000 3500 3500 5500 7000 >20000 29 90242 30 Продовження таблиці 3 Характеристика гібридомних клонів Назва клону № клону 7.8H12 7.2F5 7.9D4 7.10D7 39 11 40 44 ЕС50 ELISA зв'язування v6 (нг/мл) 46,0 >5000 1,7 >5000 ІС50 блокування v6-LAP (нг/мл) ІС50 блокування FDCP1-LAP (нг/мл) 1140 529 Неповне 3000* 969 1490 >10000 1120 ІС50РАІ-1люциферази (нг/мл) >20000 >20000 >20000 n.t. *: Дані одержані з різних експериментів **: Не тестували. ***: Всі експерименти, підсумовані у таблиці 3, проводили у присутності 1мМ Са2+ і 1мМ Mg2+. ****: Антитіла, виділені напівжирним шрифтом, являють собою антитіла 10D5 і L230, відомі раніше у даній галузі, і нові антитіла з особливо високою інгібіторною силою відносно v6. Потім значення спорідненості 6.3G9 і 6.8G6 відносно розчинного v6 визначали шляхом використання аналізу кінетичного виключення (КіnЕхА). Серію розведень розчинного інтегрину (від 110-8M до 2,410-10М) інкубували з 110-10М антитіла протягом 3 год. Дані зразки потім пропускали через гранули поліметилметакрилату, покриті інтегрином, з використанням інструмента КіnЕхА (Sapidyne Instruments, Inc., Boise, Айдахо). У випадку 6,8G6 у буфери для інкубації і аналізу включали 1мМ СаСl2 і 1мМ MgCl2. Кількість зв'язаного і вільного антитіла визначали з використанням міченого Су5 вторинного антитіла проти мишачих антитіл. Підгонку до кривої другого порядку проводили з використанням програмного забезпечення КіnЕхА з одержанням константи дисоціації (Kd) для кожної взаємодії. Kd, визначені з використанням даного способу, складали 15.6пМ для 6.3G9 і 22,8пМ для 6.8G6 (Фіг.9А і 9В). Таким чином, обидва даних антитіла характеризувалися дуже високими значеннями спорідненості відносно v6.· Далі автори винаходу ідентифікували класи антитіл проти v6. які розпізнавали "активовані" стани інтегрину. Є два потенційних активованих стани v6. У першому стані активований інтегрин визначається, як такий, що має більш високу спорідненість відносно свого ліганду. Антитіла, специфічні відносно даного активованого стану, характеризувалися підвищеним зв'язуванням з даним інтегрином у присутності активуючих катіонів, таких як 1мМ МnСl2. Порівняння ступеня зв'язування в 1мМ МnСl2 і 1мМ MgCl2 (неактивуючий катіон) шляхом проточної цитометрії показало, що деякі з антитіл, які описуються у даному описі, проти v6, включаючи 6.1А8 і 6.6В5, характеризувалися знач но підвищеним зв'язуванням у присутності МnСl2. У другому активованому стані v6 інтегрин може активувати латентний TGF-, як описано вище. Одержували клітинну лінію, яка експресує укорочений v6 (SW480 (6-770Τ)). Дана клітинна лінія була здатна зв'язувати LAP, але не могла активувати TGF- в аналізі TMLC-люциферази (Munger et al., вище). Антитіла, які зв'язуються з трансфікованими повнорозмірними 6 клітинами SW480. але не з трансфікованими укороченим білком клітинами 770Т, таким чином, були специфічні до форми v6, яка здатна активувати TGF-. Антитіла 7.8ВЗ і 7.8С9 задовольняли даним критеріям. Приклад 8: Картування епітопів шляхом конкуренції антитіл Очищені моноклональні антитіла також тестували на їх здатність конкурувати з 6.8G6 за зв'язування з біотинільованим v6 у форматі ELiSA. У даному аналізі 6.8G6 покривали планшет для ELISA і суміш конкуруючого антитіла і біотинільованого v6 додавали у буфер, що містить Са2+ і Mg2+ no 1мΜ кожного. Зв'язаний інтегрин детектували з використанням кон'югату екстравідин-HRP і конкуруючі антитіла відмічали за їх здатністю блокувати зв'язування. Всі консенсусні блокатори (таблиця 2) крім 6.2В10 (слабкий блокатор). як було показано, конкурують у різній мірі з 6.8G6 (таблиця 4). Ці дані підтверджують, що дані консенсусні блокатори зв'язуються з одним і тим же епітопом, що і 6.8G6. або з епітопом, що перекривається з ним. Таблиця 4 Картування епітопів шляхом конкуренції антитіл Клон 6.2A1 6.4В4 6.6В5 6.8В4 Консенсусний блокатор? N N N N Конкуренція з 6.8G6 31 90242 7.9D4 Y/N 32 Продовження таблиці 4 Картування епітопів шляхом конкуренції антитіл Клон 10D5 L230 6.1А8 6.2В10 6.3G9 6.8G6 6.2В1 7.1С5 7.1G10 7.2А1 7.2F5 7.2Н2 7.4А3 7.7G5 7.8Н12 7.9G8 7.9Н5 7.10D7 7.10Н2 Консенсусний блокатор? Υ Υ Υ Υ (слабке) Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Очищені моноклональні антитіла тестували на їх здатність конкурувати з біотинільованим 6.3G9 або біотинільованим 6.8G6 за зв'язування з v6 в ELiSA. У даному аналізі неміченим v6 покривали планшет для ELISA і суміш конкуруючого антитіла і біотинільованого антитіла додавали у буфер, що містить Са2+ і Mg2+ по 1мМ кожного. Зв'язане біотинільоване антитіло детектували з використанням кон'югату нейтравідин-HRP. Ці дані показали, що найбільш дійові блокувальні антитіла (наприклад, 6.2В1, 7.1С5 і 7.1G10) конкурували як з Конкуренція з 6.8G6 ++ ++ ++ + ++ ++ +++ +++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ + ++ 6.3G9. так і з 6.8G6 за зв'язування з v6 (таблиця 4.1, і Фіг.10А і 10В). Антитіла 6.1А8 і 7.7G5 характеризувалися меншою конкуренцією, можливо, внаслідок більш низької афінності відносно v6. Жодне з неблокувальних антитіл, як і антитіло проти v L230, не показало у даному аналізі якоїнебудь конкуренції з 6.3G9 або 6.8G6. Ці результати вказують на те, шо специфічні відносно v6 блокувальні антитіла зв'язуються на v6 з одним і тим же або епітопами, що перекриваються. Таблиця 4.1 Картування епітопів шляхом конкуренції антитіл Клон Консенсусний блокатор? 6.3G9 6.2B1 6.8G6 7.1С5 7.1G10 7.7G5 6.1А8 6.2A1 6.2Е5 6.2G2 6.4В4 7.8В3 7.8С9 L230 Υ Υ Υ Υ Υ Υ Υ Ν Ν Ν Ν Ν Ν Υ Приклад 9: Послідовності CDR Виділяли кДНК деяких з очищених моноклональних антитіл і визначали їх послідовність з використанням стандартних способів, описаних у Coligan et al. (eds), Current Protocols in Immunology, Конкуренція з біотинільо- Конкуренція з біотинільованим 6.8G6 ваним 6.3G9 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ ++ + ++ + Wiley, Media, PA (2001). Передбачені амінокислотні послідовності показані на Фіг.7А і 7В. Амінокислотні послідовності CDR важких ланцюгів антитіл з високою спорідненістю зв'язування 6.8G6, 6.1А8, 6.2В1, 6.3G9 і 6.2А1 і неблокуваль 33 ного антитіла 6.2G2, порівнюють наступним чином (тире означають пропуски). У SEQ ID NO: 7 "R" напівжирним шрифтом (дванадцятий залишок) вказує на те, що даний залишок є предметом поліморфізму і може являти собою, наприклад, Q. Амінокислотні послідовності CDR легких ланцюгів даних чотирьох антитіл з високою спорідненістю зв'язування і неблокувального антитіла 6.2G2, порівнюють наступним чином. Як показано на Фіг.7А і 7В, mAb, які входять до складу класу двовалентних катіон-залежних антитіл (наприклад, 6.1А8 і 6.8G6), як здається, містять дуже подібні амінокислотні послідовності всередині CDR, у той час як двовалентні катіон-незалежні mAb (наприклад, 6.2В1 і 6.3G9) містять інший на 90242 34 бір мотивів у своїх CDR. Дієвість і специфічність моноклональних антитіл проти v6 може тонко керуватися різними амінокислотними залишками. У випадку 6.1А8 і 6.8G6 амінокислотні послідовності варіабельних доменів дуже подібні і містять 10 відмінностей амінокислот у важкому ланцюгу, три з яких консервативні, та 11 відмінностей амінокислот у легкому ланцюгу. При цьому дані антитіла характеризуються тим, що мають приблизно 100-разову відмінність в активності при аналізах in vitro. Відмінності амінокислот розподілені по варіабельних доменах поліпептидного ланцюга, і дані залишки можуть діяти поодинці або синергічно із залишками того ж ланцюга або партнерського ланцюга, впливаючи на дієвість антитіл. У важкому ланцюгу сім залишків розташовані так, що вони. ймовірно, знаходяться близько до ανβ6 або грають активну роль у його зв'язуванні. RGD-мотив був виявлений у деякій кількості білків (лігандів), що зв'язують інтегрини. Даний мотив, як було показано, опосередковував їх взаємодію з інтегринами шляхом безпосереднього контакту зі зв'язувальним карманом на інтегрині. Оскільки RGD сам по собі досить звичайний у білках, що зв'язують інтегрини, залишки, що фланкують, по боках від даного мотиву повинні грати роль у доданні взаємодії інтегрин-ліганд специфічності зв'язування. У 6.1А8 і 6.8G6 один такий залишок, що фланкує, знаходиться у положенні 101 у важкому ланцюгу всередині CDR3. Даний амінокислотний залишок фланкує RGD-мотив і може розташовуватися у ділянці розпізнавання антигену, що здійснює внесок у дієвість і специфічність зв'язування. Інші залишки, що відрізняються, у межах одних і тих же CDR важкого ланцюга 6.1А8 і 6.8G6 включають в себе ті, що знаходяться у положенні 33 (CDR1); у положеннях 52, 57 і 65 (CDR2); та у положенні 115 (CDR3). Інша відмінність у важкому ланцюгу знаходиться у положенні 4 у каркасній ділянці 1, яка близька до N-кінця. Даний залишок, як передбачено шляхом кристалографічних моделей, знаходиться внаслідок фолдингу поблизу CDR антитіла і може грати важливу роль у зв'язуванні v6. Три відмінності, що залишилися, між 6.1А8 і 6.8G6 являють собою консервативні відмінності у положеннях 20 (каркасна ділянка 1), 44 (каркасна ділянка 2) і 82 (каркасна ділянка 3). Амінокислотні послідовності катіоннезалежних антитіл також високо гомологічні. Вони можуть поділятися на два класи: ті, що конкурують з антитілом 6.8G6, яке містить RGD (тобто, 6.2В1, 6.3G9, 7.10Н2, 7.9Н5, 7.1С5, 7.1G10 і 7.4А3); і ті, що не конкурують з ним (тобто, 6.2А1, 6.2В10 і 6.4В4). Клас конкуруючих з 6.8G6 антитіл містить мотив FXY у CDR3 важкого ланцюга, тоді як клас не конкуруючих антитіл не містить його. Дана відмінність вказує на те, що мотив FXY важливий для опосередкування катіон-незалежного зв'язування v6. Крім того, клас антитіл, що містить FXY, можливо, зв'язується з епітопом на v6, який перекривається з карманом, що зв'язує RGD, хоча і відрізняється від нього. Антитіла 6.2В 10 і 6.4В4 не містять мотив FXY і є слабкими блокаторами v6. Вони, як було пока 35 90242 зано, зв'язуються з частиною v6, подібною до Ідомену і визначають ще один епітоп, з яким зв'язуються антитіла проти v6. Цікаво, що моноклональне антитіло 6.2А1 належить до катіоннезалежного класу, але не містить RGDпослідовності, як інші катіон-незалежні mAb. Моноклональне антитіло 7.7G5 відноситься до катіон-залежного класу. Однак послідовність легкого ланцюга 7.7G5 високо гомологічна катіоннезалежному антитілу 6.2В10, що зв'язує І-домен. Важкий ланцюг 7.7G5 також подібний до катіоннезалежних антитіл у CDR1. При цьому його CDR2 і CDR3 ближче до таких катіон-залежного класу. Дане спостереження вказує на те, що конкретні CDR наділяють антитіло специфічністю. Це особливо вірно для CDR3 важкого ланцюга, мабуть, внаслідок високого ступеня мінливості у межах даної частини антитіла. Фактично два з трьох катіон-залежних і сім з дев'яти катіон-незалежних антитіл містять послідовності CDR3 важкого ланцюга, які, ймовірно, грають важливу роль у розпізнаванні v6. Примітно, що 7.7G5 не містить мотиву RGD, але містить мотив XGD у CDR2 його важкого ланцюга. Даний мотив XGD може функціонувати подібним до RGD чином і забезпечувати спорідненість/специфічність зв'язування 7.7G5. Вказані вище спостереження послідовностей і зроблені з них висновки забезпечують основу для раціонального конструювання конкретних амінокислотних послідовностей варіабельних ділянок, які 36 приносять конкретні властивості зв'язування. Приклад 10: Діагностичні антитіла Антитіла, які можуть детектувати експресію v6 у залитих у парафін зрізах тканин або інших зразках тканин, можуть використовуватися як діагностичні засоби. Дані діагностичні засоби можуть використовуватися, наприклад, для детектування позитивної регуляції v6 у зрізах тканин при таких захворюваннях, як злоякісна пухлина або фіброз. Для ідентифікації антитіл, які детектують v6 у залитих у парафін тканинах, автори винаходу спочатку піддавали панель антитіл скринінгу на зв'язування очищеної шляхом ВЕРХ субодиниці 6. Антитіла, які зв'язують дану субодиницю. ймовірно, розпізнають лінійні пептидні епітопи, і тому очікувалося, що вони мають високу ймовірність успіху зв'язування у залитих у парафін тканинах. Зв'язування з очищеною субодиницею 6 проводили з використанням формату ELISA, ідентичного тому, який був описаний для вимірювання зв'язування v6 (вище), за винятком застосування очищеного інтегрину 6, іммобілізованого на планшеті, а не білка v6. З використанням даного способу ідентифікували деяке число антитілзлиття 6, здатних зв'язувати як очищений білок v6, так і очищену субодиницю 6. Див. нижче таблицю 5, де префікс "6" у назві клону пропущений. Таблиця 5 Зв’язування антитіл з очищеним v6 або очищеною субодиницею 6 Назва клону Зв'язування з v6 1А1 1А8 1Α11 1Е1 1Ε6 1Н10 2Α1 2А10 2В8 2В10 2С4 2C7 2E5 2G3 3Α6 3B1 3B2 3В11 3С2 3D5 3D10 3F1 3G3 3G5 3G9 3Н2 3Н11 4А4 + + + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + + +/ Зв'язування з очищеною шляхом ВЕРХ субодиницею 6 6 + + + + + + + + + + + + 37 90242 38 Продовження таблиці 5 Зв’язування антитіл з очищеним v6 або очищеною субодиницею 6 Назва клону Зв’язування з v6 4В2 4В4 4В10 4D2 4Е4 4G3 4G4 4Н4 4Н12 5А2 5В6 5D6 5D8 5G9 5G10 5Н3 6В1 6В5 6C4 6D12 6Е6 6Е10 6G3 7С7 7Е5 7F8 8В4 8G6 9В5 9В7 9В9 9В10 9D11 9Е12 9F5 9F7 9G1 9Н11 10А2 10А3 10А4 10А8 10А9 10В10 10D3 10D11 10E4 10F1 10F12 10G1 10G2 10Н11 1A7 1D6 1D9 1F6 2B1 2D9 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + + +/+ + + + + + + + + + + + + + + + + Зв’язування з очищеною шляхом ВЕРХ субодиницею 6 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 39 90242 40 Продовження таблиці 5 Зв’язування антитіл з очищеним v6 або очищеною субодиницею 6 Назва клону Зв'язування з v6 2G2 3D9 3E5 4C12 4E6 4G5 5A3 5B3 5B8 5B9 5F7 6C10 6D8 6F4 6G9 6H8 6H9 7А5 7A11 7Е6 7G9 7Н3 9А2 9А3 9А4 9А9 9D2 9D3 9Е4 9F1 9F12 9G11 10B5 10B7 10B9 10C5 10C7 10D6 10E12 10F7 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + +/+/+/+/+/ Як показано вище, деякі антитіла зв'язувалися з очищеною субодиницею 6. Вони з високою ймовірністю будуть зв'язувати денатурований v6 і, таким чином, можуть використовуватися при детектуванні v6 у залитих у парафін зрізах тканин. Обидва типи антитіл використовували для забарвлення денатурованих, залитих у парафін трансфікованих 6 клітин SW480 і нетрансфікованих вихідних клітин, і дані показані у таблиці 6. Для забарвлення залитих у парафін тканин або клітин предметні стекла з тканиною спочатку депарафінізували шляхом інкубації у наступних розчинах: (1) ксилол, 5хв., двічі; (2) 100% етанол, 2хв., двічі; (3) 95% етанол, 2хв., двічі; (4) 50% етанол, 2хв., один раз; і (5) дистильована вода, 2хв., один раз. Потім предметні стекла інкубували у розчині, що складається з 200мл метанолу і 3мл Зв'язування з очищеною шляхом ВЕРХ субодиницею 6 + + + + + + + + + + 30%-ної Н2О2 протягом 15хв. для блокування ендогенної пероксидази. Предметні стекла обполіскували двічі у PBS протягом 2хв. кожного разу. Зрізи парафіну на предметних стеклах потім демаскували за допомогою пепсину (Zymed 00-3009) протягом 5хв. при 37°С. Предметні стекла знову двічі обполіскували у PBS протягом 2хв. кожного разу. Потім тканину на предметних стеклах блокували авідином і потім біотином (Vector SP-2001; Vector Laboratories, Burlingame, Каліфорнія), по 10хв. кожним при кімнатній температурі з описаним вище промиванням між всіма інкубаціями. Після випаровування блокувального розчину з предметних стекол первинне антитіло (культуральна надосадова рідина гібридоми), розведене у PBS/0,1% BSA, наносили на предметні стекла, та інкубували протягом ночі при 4°С. 41 90242 На наступний день предметні стекла обполіскували у PBS, як описано вище. У цей час одержували розчин комплексу авідин-біотин-пероксидаза хрону (реагент ABC) наступним чином: 1мл PBS змішували з 20мкл розчину А (1:50) і 20мкл розчину В (1:50) з набору Vector PK-6102; і суміш інкубували перед використанням протягом 30хв. при кімнатній температурі. Протягом цього часу предметні стекла інкубували протягом 30хв. при кімнатній температурі з біотинільованим антитілом проти мишачих антитіл (1:200) з набору Vector з 15мкл/мл нормальної сироватки. Предметні стекла обполіскували два рази у PВS. 2хв. кожного разу. Потім описаний вище реагент ABC наносили на предметі стекла та інкубували протягом 30хв. при кімнатній температурі. Предметні стекла обполіскували знову, як описано вище. Потім субстрат (Vector SK-4100). 100мкл DAB (3,3'-діамінобензидин), наносили на предметні стекла та інкубували протягом 5хв. при кімнатній температурі. DAB одержували наступним чином: до 5мл Н2О додавали 2 краплі маточного розчину буфера (Buffer Stock Solution), добре змішували; потім додавали 4 краплі маточного розчину DAB, добре перемішували; і потім додавали 2 краплі розчину Н2О2, добре змішували. Потім предметні стекла обполіскували водою протягом 2хв. Після чого сигнал DAB посилювали для всіх пред 42 метних стекол з тканиною наступним чином: промивали парафінові зрізи у 0,05М бікарбонату натрію, рН9,6, протягом 10хв.; видаляли надлишок буфера: наносили посилюючий розчин для DAB на 15 секунд і потім швидко обполіскували водою протягом 1хв. для зупинки реакції. Потім предметні стекла забарвлювали у гематоксиліні Майєра (зворотне забарвлення ядра) протягом 1хв. Предметні стекла обполіскували у воді, що тече, протягом 1хв. і потім занурювали у PBS на 1хв., так що гематоксилін ставав блакитним. Потім предметні стекла знову обполіскували у воді, що тече, протягом 1хв., збезводнювали та очищали наступним чином: занурювали в (1) 95% етанол на 1хв., двічі; (2) 100% етанол на 1хв., двічі; і (3) ксилол на 2 хв., двічі. Потім на предметні стекла поміщали покривні стекла з використанням Permount. Результати вказували на те, що антитіла злиття 6 1А1, 2С4, 3В2, 3В11, 5D6. 5G9, 5Н3, 6D12, 7С7, 9В5, 9В7, 9D11, 9F5, 10Е4, 10Н11, 6Н8, 7А5, 7G9, 9А3, 2А1, 2Е5, 4Е4, 4Н4, 8В4, 2G2 і 4Е6, з яких всі могли зв'язуватися з очищеною субодиницею β6 (таблиця 5), дійсно сильно забарвлювали занурені у парафін трансфіковані 6 клітини SW480, у той час як не забарвлювали нетрансфіковані вихідні клітини (таблиця 6). Таблиця 6 Зв'язування антитіл із зануреними у парафін клітинами SW480 ID 1 2 3 4 5 7 10 11 12 13 17 18 25 30 33 35 36 39 40 42 43 44 46 48 52 54 55 56 57 58 61 Назва клону 1А1 1А8 1А11 1E1 1Е6 2А1 2В10 2С4 2С7 2Е5 3В2 3В11 3G9 4В4 4Е4 4G4 4Н4 5В6 5D6 5G9 5G10 5H3 6B5 6D12 7C7 7F8 8B4 8G6 9B5 9B7 9D11 Зв'язування з SW480/6 +++ + ++ + ++ +++ +++ +++ +++ ++ + +++ +++ + +++ +++ +++ +++ ++ +++ ++ ++ ++ Зв'язування з SW480 + + + 43 90242 44 Продовження таблиці 6 Зв'язування антитіл із зануреними у парафін клітинами SW480 ID 62 63 68 75 80 85 87 91 95 98 102 104 107 110 Назва клону 9E12 9F5 10A3 10E4 10H11 2В1 2G2 4Е6 5В8 6С10 6Н8 7А5 7G9 9А3 Приклад 11: Діагностика злоякісної пухлини v6 звичайно експресований у здорових тканинах дорослих на непомітних або низьких рівнях. Однак експресія v6 позитивно регулюється при ушкодженні, фіброзі або злоякісній пухлині (див., наприклад, Thomas et al., J. Invest. Dermatology 117: 67-73 (2001); Brunton et al., Neoplasia 3: 215226 (2001); Agrez et al., lnt. J. Cancer 81: 90-97 (1999); Breuss, J. Cell Science 108: 2241-2251 (1995)). Таким чином. антитіла, які специфічно зв'язуються з v6, експресованим у залитих у парафін тканинах, можуть використовуватися у стандартних способах імуногістохімії для детектування експресії v6 для діагностики фіброзу, злоякісної пухлини, і будь-яких інших захворювань, в яких v6 позитивно регулюється. Як описано вище, деякі антитіла відповідно до даного винаходу зв'язуються в очищеним ВЕРХ інтегрином 6 і залитими у парафін та фіксованими трансфікованими 6 клітинами. Дані антитіла, як було показано, також зв'язуються з репрезентативними тканинами плоскоклітинного раку і раку молочної залози при імунному забарвленні. Див., наприклад, Фіг.8, де моноклональне антитіло 6.2А1 використовували для того, щоб показати відносне забарвлення залитих парафіном тканин карциноми молочної залози і плоскоклітинної карциноми. Таким чином, дані нові антитіла можуть використовуватися як діагностичні інструменти. Приклад 12: Ефекти блокувальних mАb проти v6 у мишей Альпорта Миші з нокаутом колагену 4А3 (COL4A3) (Альпорт) були встановлені як модель in vivo фіброзу нирок і їх використовували для тестування терапевтичних ефектів фармакологічних засобів (вище). Автори винаходу тестували mAb 6.8G6 (катіон-залежне) і 6.3G9 (катіон-незалежне) у мишей Альпорта для визначення того, чи будуть вони інгібувати фіброз, що звичайно спостерігається у мишей Альпорт у віці семи тижнів. Як показано вище, ці два антитіла, як виявлено. інгібують зв'язування v6 з LAP та інгібують активацію TGF- у біоаналізі. Антитіло 1Е6 застосовували як негати Зв'язування з SW480/6 + ++ +++ ++ + +++ +++ + ++ +++ +++ +++ Зв'язування з SW480 + вний контроль. Мишам Альпорт у віці трьох тижнів вводили 3 рази на тиждень внутрішньочеревинні ін'єкції з одним з наступних антитіл: (1) 6.8G6. 4мг/кг (7 мишей); (2) 6.3G9, 4мг/кг (4 миші); і (3) 1Е6, 1мг/кг (6 мишей). Ін'єкції продовжували протягом 4 тижнів. Потім мишей забивали і діставали їх нирки. Залиті у парафін зрізи нирок одержували, як описано вище, і потім забарвлювали з метою детектування гладком'язового актину, маркера міобластів і відкладення матриксу при фіброзі нирок. Автори винаходу виявили значиме зниження забарвлення гладком'язового актину в інтерстиціальних і гломерулярних ділянках нирок з мишей Альпорта, оброблених mAb 6.8G6 або 6.3G9, у порівнянні з мишами, обробленими 1Е6. На Фіг.11А і 11В показана точкова діаграма забарвлення гладком'язового актину у гломерулярних та інтерстиціальних ділянках нирки Альпорта. Мало місце значиме знижене забарвлення гладком'язового актину у нирках мишей Альпорта, оброблених 6.8G6 і 6.3G9, у порівнянні з мишами негативного контролю, обробленими 1Е6. Приклад 13: Ефективність mAb проти v6 при профілактиці нефросклерозу, індукованого однобічним закупоренням сечоводу Автори винаходу застосовували іншу модель прогресії фіброзу нирок на мишах для тестування протифіброзної ефективності 6.8G6 і 6.3G9. У даній моделі на мишах сечовід тварини лігують, що приводить до однобічного закупорення сечоводу (UUO). UUO викликає прогресуючий нефросклероз без швидкого розвитку ниркової недостатності у мишей, оскільки незакупорена нирка може відносно нормально підтримувати функцію нирок. У той час як закупорена нирка зазнає швидкого загального фіброзу, незакупорена нирка зазнає адаптивної гіпертрофії. Дане дослідження піддає морфометричному кількісному аналізу вплив обробки антитілами проти v6 на індукований UUO фіброз нирок. Використовували мишей-самців C57BL у віці 8-12 тижнів, без вірусних антигенів, масою 25,5±0,2г (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Мен). Перед початком 45 90242 дослідження мишам давали можливість акліматизуватися протягом семи діб. Миші мали вільний доступ до розсіяного стандартного мишачого корму і стерильної води під час періоду акліматизації та експерименту. Періодично вимірювали масу тіла, як частину моніторингу здоров'я тварин. Результати показували, що відповідні за віком неоперовані миші додавали приблизно 10% маси тіла протягом періоду двотижневого дослідження. Миші UUO втрачали приблизно 9% маси тіла на добу 2, але поступово компенсували втрату маси на добу 14. Даний профіль зміни маси. як виявилося, не залежав від терапевтичної обробки. Для індукції фіброзу нирок лівий сечовід асепГрупа 1 2 3 4 5 Обробка 6.8G6 (катіон-залежне mAb проти v6) 6.3G9 (катіон-незалежне mAb проти v6) 1Е6 (mAb негативного контролю) PBS - контрольний носій Неоперований, необроблений контроль 46 тично виділяли шляхом лапаротомії лівіше серединної лінії під анестезією кетаміном:ксилазином (100:10мг/кг підшкірно). Дві щільних лігатури шовку 6-0, що закупорюють, накладали на сечовід на рівні нижнього краю нирки і сечовід перетинали між лігатурами. Черевну стінку закривали швом Vicryl 4-0, а шкіру закривали нейлоном 4-0. Тваринам давали можливість відновитися на електрогрілці, і давали підшкірно 0,05мг/кг бупренорфіну два рази на добу на добу 0 і 1. Процедура була адаптована за Ma et al., Kidney Int. 53 (4): 937-944 (1998). Потім мишей поділяли на наступні досліджувані групи: Доза(мг/кг, в./ч.) 4 4 4 (100мкл) n* 9 8 10 8 8 *Число тварин Всі тварини, крім групи 5, одержували дозу два рази на тиждень, починаючи з доби до хірургічного втручання. Потім тварин піддавали евтаназії діоксидом вуглецю на 10 добу після лігування і піддавали дисекції. У мишей UUO ниркова миска і сечовід були помітно роздуті і повні рідиною над лігатурою, що закупорює. Ступінь здуття і ступінь маси, що залишилася, ниркової тканини варіювали у групах обробки. Група 2 характеризувалася здуттям приблизно наполовину більшим у порівнянні з групами негативного контролю. Ліговані нирки були блідого кольору Протилежні нирки були яскраво червоними і збільшеними приблизно на третину. Далі, обидві нирки (ліва лігована, права нелігована) тварин видаляли і розтинали поперечно через центр ниркової миски. Половину кожної нирки поміщали у 10% нейтрально забуферений формалін для забарвлення фіксованої тканини. Іншу половину кожної нирки поміщали у 15%-ну сахарозу, потім у 30%-ну сахарозу для імуногістохімічного забарвлення. Фіксовані формаліном зрізи нирки піддавали імунному забарвленню на виявлення міофібробластів (гладком'язового актину), маркерів фіброзу. Знімки робили з використанням стандартизованих умов освітлення і настройок експозиції цифрової камери, відкоректованих для фону, і з калібруванням віддаленими стандартами. Знімки протяжних полів, що покривають зріз цілої нирки, одержували від кожної тварини для кількісного аналізу. Гладком'язовий актин виражали як відсоток від загальної площі тканини у межах виміряних полів. Вони включали в себе всю коркову і медулярну тканину зі зрізу, за винятком ниркового сосочка. У результаті миші, оброблені 6.3G9 і 6.8G6, характеризувалися істотним зниженням фіброзу. Приклад 14: Ефективність блокування mAb проти v6 індукованого блеоміцином фіброзу легень у мишей Індукований блеоміцином фіброз легень у мишей приймали як модель фіброзу легень in vivo і застосовували для тестування терапевтичних ефектів фармакологічних засобів. Запалення звичайно помітне через 5-15 діб після обробки блеоміцином. У мишей лінії 129 ступінь фіброзу легень прогресивно зростає протягом періоду не більше 60 діб після обробки блеоміцином. Накопичення матриксу звичайно стає таким, що виявляється приблизно на 15 добу. У даному прикладі mAb 6.3G9 вводили внутрішньочеревинною ін'єкцією у концентрації 4мг/кг/доза мишам з фіброзом легень, що індукується блеоміцином, починаючи з доби 0 або з доби 15, по три рази на тиждень. Фіброз легень індукували на добу 0 шляхом введення єдиної внутрішньотрахейної дози блеоміцину у концентрації 0,03 одиниць/кг у 50мкл стерильного сольового розчину. Тварин забивали на добу 30 та оцінювали ступінь фіброзу легень. Антитіло 1Е6 використовували як негативний контроль. Від кожної тварини забирали легені і вимірювали вміст гідроксипроліну як індекс відкладення колагену у легенях, як описано у Munger et al., вище. Як показано на Фіг.15А, обробка 6.3G9, що почалася на добу 0, значимо інгібувала індуковане блеоміцином підвищення вмісту гідроксипроліну у легенях. Важливо те, що обробка 6.3G9 була, щонайменше, такою ж ефективною, коли починалася через 15 діб після введення блеоміцину, у момент, коли вже почалося відкладення колагену. Автори винаходу оцінювали ефекти 6.3G9, катіон-залежного 6.8G6 і неблокувального антитіла 6.4В4 за інгібуванням більш істотних ступенів фіброзу легень у продовженому протоколі індукованого блеоміцином фіброзу (триває 60 діб). Для цього автори винаходу починали обробку антитілами через 15 діб після введення блеоміцину (доба 15). Потім легені забирали на добу 60 для визначення вмісту гідроксипроліну. Як показано на Фіг.15С, обробка 6.8G6 значимо інгібувала фіброз, що індукується блеоміцином (більше 70%-ного зниження у 47 вмісті гідроксипроліну у порівнянні з тваринами, обробленими блеоміцином і сольовим розчином). Обробка 6.3G9 також показала тенденцію до захисного ефекту, але дані результати не досягали статистичної значимості (Фіг.15С). У результаті, як катіон-залежні, так і катіоннезалежні антитіла, що блокують v6, знижували фіброз легень у мишей, оброблених блеоміцином. Більш того, дане втручання було ефективним, навіть коли обробка антитілами не починалася після першого нападу фіброзу. Приклад 15: Позитивна регуляція v6 у псоріазних осередках ушкодження у людини Для визначення того, чи залучений v6 до псоріазу, оцінювали експресію v6 у біопсіях шкіри з осередками ушкодження і без них від п'яти пацієнтів і псоріазом і чотирьох нормальних суб'єктів. З використанням імунного забарвлення mAb 6.2A1 автори винаходу виявили значиме підвищення експресії v6 у псоріазних осередках ушкодження у порівнянні з неушкодженою шкірою пацієнтів з псоріазом і нормальними контрольними суб'єктами. Таким чином, позитивна регуляція v6 у псоріазних осередках ушкодження вказує на діагностичне і терапевтичне застосування для використання антитіл проти v6. Приклад 16: Позитивна регуляція v6 у миші та людини із захворюванням жовчної протоки Як описувалося раніше, експресія v6 стосувалася ушкодження тканини У даному дослідженні експресію v6 досліджували у печінці миші та людини. ушкодженій захворюванням жовчної протоки. Ушкодження печінки у мишей індукували шляхом лігування жовчної протоки. Див., наприклад, George et al., PNAS 96: 12719-24 (1999); George et al., Am J. Pathol 156: 115-24 (2000). З використанням mAb 6.2G2, автори винаходу виявили, що експресія v6 значно підвищувалася на добу 9, 14 і 16 після лігування жовчної протоки. Подібним чином, зрізи печінки людини від пацієнтів із захворюванням жовчної протоки характеризувалися позитивною регуляцією експресії v6, що визначено шляхом імуногістохімії з використанням mAb 6.2G2. Підвищену експресію v6 спостерігали, наприклад, у зразках печінки від чоловіка у віці 44 років з гострим холестазом, чоловіка у віці 59 років після пересадження, з гострим закупоренням жовчної протоки, чоловіка у віці 22 років з атрезією жовчної протоки, і чоловіка у віці 24 років з хронічним закупоренням жовчної протоки. У результаті нові антитіла проти v6 є корисними як засіб діагностики і терапії захворювань печінки. Приклад 17: Позитивна регуляція v6 при різних злоякісних пухлинах людини Інтегрин v6 звичайно експресований у тканинах здорових дорослих людей на рівнях від незначних до низьких. Різні пухлинні тканини людини оцінювали па предмет експресії v6 з використанням антитіла 6.2А1 і способів, в основному описаних у даному описі. Результати показували, що експресія інтегрину v6 значимо підвищено регу 90242 48 лювалася при деяких епітеліальних раках людини. Примітно, що імуногістологія виявила особливо виражену експресію v6 на краях пухлинних острівців при багатьох епітеліальних раках. Для подальшого дослідження експресії v6 в епітеліальних ракових клітинах клітини Детройт 562 (карцинома глотки) і клітини SCC-14 (плоскоклітинна карцинома язика), а також клітини SW480 6 (див. вище) забарвлювали 6.3G9 і 6.4В4 та аналізували шляхом проточної цитометрії. На правій стороні Фіг.12 показана експресія v6 у різних пухлинних клітинних лініях, на що вказує зв'язування 6.3G9 при сортуванні активованих флуоресценцією клітин (FACS). Зафарбований пік являє собою зв'язування 6.3G9. у той час як незафарбований пік являє собою фонове зв'язування одного вторинного mAb. Графік лінії на лівій стороні Фіг.12 показує інгібування зв'язування пухлиннихклітинних ліній з лігандом LAP за рахунок концентрацій. що підвищуються, 6.3G9 або 6.4В4. 6.4В4 був істотно менш потужним інгібітором зв'язування v6 з LAP у порівнянні з 6.3G9 (>10-разового ІС50 для Детройт 562, >30-разового ІС50 для SW480 6 і >100-разового ІС50 для SCC14). Це узгоджується з попередніми результатами, одержаними in vitro, які вказують на те, що 6.3G9 являє собою потужне блокувальне mAb, a 6.4B4 являє собою слабке блокувальне mAb. Ці дані також узгоджуються з малозначною інгібуючою активністю 6.4В4 у детройтській моделі ксенотрансплантату (Фіг.14В). На Фіг.13 далі показане відносне інгібування зв'язування пухлинних клітинних ліній з LAP різними mAb проти v6. Як 6.3G9, так і 6.8G6 характеризувалися еквівалентною інгібуючою активністю (відповідно до всіх попередніх даних), у той час як 6.4В4 було істотно менш потужним інгібітором зв'язування v6 з LAP. Приклад 18: Ефекти блокувальних mAb проти v6 на моделі ксенотрансплантату пухлини людини Тварини з імунодефіцитом (наприклад, голі миші і SCID-миші), яким пересаджували ксенотрансплантат пухлини людини, були прийняті як придатна модельна система in vivo для тестування терапевтичних ефектів протиракових засобів [див., наприклад, van Weerden et al., Prostate 43 (4): 26371 (2000); Bankert et al., Front Biosci 7: С.44-62 (2002)]. Таким чином, блокувальні моноклональні антитіла проти v6 за даним винаходом можуть тестуватися in vivo на моделі ксенотранспланатату на їх здатність інгібувати пухлинний ріст. У даному експерименті автори винаходу тестували здатність деяких з нових антитіл проти v6 інгібувати пухлинний ріст у безтимусних голих самок мишей, яким пересаджували ксенотранспланат раку глотки людини (клітинна лінія Детройт 562). Для цього клітини Детройт 562 (АТСС) пасирували in vitro у мінімально необхідному середовищі (Eagle) з 2 мМ L-глутаміном і BSS Ерла, доведеному до вмісту 1,5г/л бікарбонату натрію, 0,1мМ замінних амінокислот і 1,0мМ пірувату натрію, і 10% фетальної сироватки великої рогатої худоби, без антибіотиків. Приблизно 5106 клітин/0,2мл середовища (без сироватки) імплантували підшкі 49 рно голим мишам у правий бік. Через три-чотири доби почалися вимірювання розміру пухлини і продовжувалися до досягнення пухлинами розмірів приблизно 5мм (у довжину) на 5мм (у ширину). Мишей розділяли випадковим чином і піддавали внутрішньочеревинній ін'єкції антитілами, що тестуються, або контрольними розчинами на добу 1, з наступними трьома ін'єкціями щотижня протягом періоду 33 діб. Антитіла, що тестуються, і контрольні розчини являли собою: (1) 6.3G9, 1мг/кг, 10 мишей; (2) 6.3G9, 4мг/кг, 10 мишей; (3) 6.3G9, 10мг/кг, 10 мишей; (4) 6.4В4, 1мг/кг, 10 мишей; (5) 6.4В4, 4мг/кг, 10 мишей; (6) 6.4В4, 10мг/кг, 10 мишей; і (7) розчин носія (PBS), 0,2 мл/на мишу, 30 мишей. Крім того, 10 мишам підшкірно вводили цис-платин у дозі 2мг/кг як хіміотерапевтичний контроль. Ін'єкції цис-платином проводили на добу 1 і потім кожні 2 доби загалом за шість введень. У кінці періоду 33 діб вимірювали масу тварин і розміри пухлин, оцінювали експресію v6 шляхом імуногістології і вимірювали рівні антитіл проти v6 у сироватці. Імуногістологічне забарвлення показало, що імплантовані пухлинні клітини сильно експресували v6 in vivo. Дані по масі пухлини далі показали, що блокувальне mAb 6.3G9 ефективно інгібувало пухлинний ріст у всіх трьох концентраціях, що тестуються (Фіг.14А). mAb 6.4B4, що слабо блокує, навпаки, не інгібувало пухлинний ріст (Фіг.14В). У сумі блокувальні антитіла інгібували пухлинний ріст у оброблених мишей на 40-50%. Антитіло проти v6, що слабо блокує, навпаки, не інгібувало пухлинний ріст. Приклад 19: Інтерналізація антитіл проти v6 Антитіла, які інтерналізуються клітинами, мають перевагу для деяких клінічних додатків, таких як злоякісні пухлини, оскільки дані антитіла можуть потім кон'югуватися з токсинами, радіоактивними сполуками або іншими протираковими засобами для селективного націлювання та інгібування росту ракових клітин. Здатність антитіл проти v6 інтерналізуватися досліджували у клітинах SW480 90242 50 6 (див. вище) і SCC-14. Клітини розділяли 1:5 і висівали на 4-камерні скляні предметні стекла для інкубації протягом ночі при 37°С, 5% СО2. На наступну добу mAb 6.8G6, 6.1А8, 6.3G9, 7.1С5, 6.4В4, 10D5 і 8В3 розбавляли до кінцевої концентрації 20мкг/мл. mAb або тільки середовище додавали у відповідні ямки. Часовий курс інтерналізації тривав від 0год. до 48год. Включені у дослідження часові відрізки складали 0, 5, 10 і 30хв., і 1, 4, 24 і 48год. Вторинне антитіло (антитіло проти мишачих антитіл Аlеха 594) додавали як негативний контроль. Інтерналізацію зупиняли після кожного часового відрізка шляхом видалення антитіла і промивання шару клітин буфером. Аглютинін зародка пшениці Аlеха488 додавали протягом 20хв. при 18°С для забарвлення зовнішньої межі клітин зеленою флуоресценцією. Після промивання клітин додавали розчин Cytofix/Cytoperm на 20хв. при 18°С для фіксації і забезпечення проникності клітин. Клітини знову промивали і додавали вторинне антитіло проти мишачих антитіл Аlеха 594 (червона флуоресценція) на 20хв. при 18°С для мічення зв'язаного або інтерналізованого мишачого антитіла проти v6. Клітини потім промивали і фіксували шляхом додавання 2% параформальдегіду і оцінювали шляхом конфокальної мікроскопії. Потім знімали зображення за допомогою об'єктиву Leitz PlanApochromatic 63 (1,32 числова апертура, масляна імерсія) (Leica) з цифровим збільшенням 2. Кожна рамка являла собою один оптичний зріз від середнього зрізу клітин, які спостерігали на предмет інтерналізації за всіх умов. В ядрі забарвлення не спостерігалося. Інтерналізацію спостерігали для катіонзалежних mAb (що містять RGD міметиків ліганду), таких як 6.8G6 і 6.1А8. Для катіон-незалежних mAb, таких як 6.3G9, 7.1С5 і 6.4В4, інтерналізації не спостерігалося. 51 90242 52 53 90242 54 55 90242 56 57 90242 58 59 90242 60

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Monoclonal antibody which specifically binds to avb6

Автори англійською

Violette Shelia M., Weinreb Paul H., Simon Kenneth J., Sheppard Dean, Leone Diane R.

Назва патенту російською

Моноклональное антитело, которое специфически связывается с avb6

Автори російською

Вайолетт Шилья М., Вейнреб Пол Х., Саймон Кеннет Дж., Шеппард Дин, Леоне Дайан Р.

МПК / Мітки

МПК: G01N 33/53, C12N 5/18, A61P 35/00, A61K 39/395, C07K 16/24

Мітки: яке, специфічно, моноклональне, антитіло, зв'язується

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/61-90242-monoklonalne-antitilo-yake-specifichno-zvyazuehtsya-z-avb6.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Моноклональне антитіло, яке специфічно зв’язується з avb6</a>

Подібні патенти