Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб контролю функціонального стану печінки та ефективності лікувальних препаратів при гепатиті, який включає дослідження протромбінового та екамулінового відношень, який відрізняється тим, що шляхом порівняння результатів одночасно проведених двох тестів на основі екамуліну та тромбопластину визначається загальний вміст у плазмі крові протромбіну та його неактивної форми - PIVKA-протромбіну, накопичення останнього є маркером порушення функціонального стану печінки, для чого у зазначених тестах змішують активатор протромбіну (тромбопластин або екамулін), розчин кальцію хлориду, досліджувану плазму крові та тромбін-специфічний хромогенний субстрат; визначають амідолітичну активність утвореного тромбіну; результати тестів представляють у вигляді протромбінового та екамулінового відношень, які розраховують як відношення амідолітичної активності тромбіну при активації досліджуваної плазми крові до амідолітичної активності тромбіну при активації контрольної плазми крові, які за ефективної терапії становлять 1,0±0,1.

Текст

Реферат: Винахід стосується способу контролю за функціональним станом печінки та ефективністю лікувальних препаратів при гепатиті. Винахід полягає у проведенні тестів на основі екамуліну та тромбопластину, результати тестів виражають у вигляді протромбінового та екамулінового відношення, що розраховують за відношенням амідолітичної активності досліджуваної плазми крові до амідолітичної активності контрольної плазми крові. UA 99046 C2 (12) UA 99046 C2 UA 99046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Винахід належить до сільського господарства, зокрема ветеринарії, і може бути використаний як спосіб контролю за функціональним станом печінки та ефективністю лікувальних препаратів при гепатиті з використанням як діагностичних тестів показників гемостазу (протромбінового та екамулінового відношень), що характеризують ступінь відновлення гепатоцитами функціональної активності білків системи зсідання крові. Активність показників системи гемостазу прямо пов'язана з функціональним станом печінки. Так, гепатоцити є основним місцем синтезу білків системи зсідання крові. При захворюваннях печінки знижується інтенсивність не тільки їх синтезу, але й пост-трансляційне карбоксилювання залишків глутамінової кислоти Гла-домену факторів зсідання крові II, VII, IX, X, протеїнів С, S і Z. Такі некарбоксильовані форми вітамін К-залежних білків називаються PIVKA-білками (протеїни, що утворюються за відсутності вітаміну К). Вони не здатні утворювати ферментні комплекси на поверхні ліпідного бішару мембран у присутності іонів кальцію, втрачають здатність виконувати відповідні функції в системі зсідання крові. Проте, дослідження вмісту вітамін К-залежних білків у плазмі крові за допомогою імунологічних тестів свідчить про відсутність значних кількісних змін. Таким чином, накопичення функціонально неактивних форм вітамін К-залежних білків системи зсідання крові при розвитку патології печінки призводить до зниження прокоагулянтного потенціалу цієї системи та може супроводжуватись виникненням кровотеч. Тому проведення відповідного лабораторного контролю за показниками системи гемостазу може бути використано для визначення ступеня порушення білоксинтезувальної функції печінки при гепатопатології та ефективності лікувальних препаратів, особливо новостворених, щодо її відновлення. Відомий спосіб (Катикова О.Ю. Особенности витаминного статуса у больных с заболеваниями печени различной этиологии. Возможности витаминотерапии / О.Ю. Катикова, Е.В. Ших // Рос. журн. гастроэнтерол. гепатол. колопроктол.-2009. - №. 3. - С. 21-31. та Gasbarrini A. Rescue therapy by portal infusion of autologous stem cells in a case of drug-induced hepatitis / A. Gasbarrini, G.L. Rapaccini, S. Rutella [et al.] // Digestive and Liver Disease.-2007. - Vol. 39. - P. 878-882), за яким визначають порушення функціонування системи гемостазу при захворюваннях печінки, що, як правило, діагностують на основі значного подовження часу зсідання плазми крові в тесті "Протромбіновий час", зростання вмісту продуктів деградації 9 фібриногену та тромбоцитопенії (менше 100×10 /л), прийнятий як аналог. Принцип тесту "Протромбіновий час" базується на визначенні часу зсідання плазми крові під дією екзогенного тромбопластину і характеризує зовнішній шлях плазменного гемостазу та опосередковано вказує на рівень функціонально активного протромбіну. При цьому протромбіновий час визначають з використанням кальцію хлориду та тромбопластину, стандартизованого за міжнародним індексом чутливості (МІЧ). Результати протромбінового часу виражають у вигляді міжнародного нормалізованого відношення (МНВ) За формулою МІЧ МНВ=(ПЧпацієнта/ПЧконтролю) , де ПЧпацієнта - протромбіновий час зсідання плазми крові хворого, ПЧконтролю - протромбіновий час зсідання плазми крові донора. Недоліком способу є те, що у тесті реалізується низка послідовних і взаємопов'язаних реакцій, а час зсідання плазми крові залежить не тільки від сумарної швидкості процесу активації коагуляційних факторів, але й від присутності інгібіторів полімеризації фібрину та інгібіторів тромбіну. Крім того, лабораторна діагностика порушень стану системи зсідання крові при розладах функціонального стану печінки коагуляційними методами ускладнена тим, що фібриноген при такій патології може мати аномалії в структурі (надлишок залишків сіалових кислот або зменшену молекулярну масу), що призводять до подовження часу зсідання плазми крові. Таким чином, при очевидній простоті виконання самого тесту "Протромбіновий час", трактування його результатів становить серйозну проблему. Відомим способом моніторингу стану системи зсідання крові є тест "екариновий чac" (Solano С. Prediction of vitamin K response using the Echis time and Echis-Prothrombin time ratio / С. Solano, R.G. Cobcrof, D.C. Scoft // Thrombosis and haemoatasis.-1990.- Vol.64, N. 3.- P. 353-357). У цьому тесті як активатор протромбіну виступає екарин, виділений з отрути ефи піщаної (Echis carinatus). Екарин, на відміну від тромбопластину, здатний активувати протромбін та його функціонально неактивні форми вітамін К-залежних білків (PIVKA-протромбін). Таким чином, тест "екариновий час" дає інформацію про сумарний вміст протромбіну, тобто його функціонально активну і неактивну форми. Недоліком обох вищенаведених тестів є те, що вони базуються на визначенні часу зсідання плазми крові під дією активаторів протромбіну, при цьому інгібітори полімеризації фібрину подовжують час зсідання плазми крові в тесті, що призводить до спотворення результатів досліджень. 1 UA 99046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для визначення загального рівня протромбіну нами використано активатор протромбіну екамулін, виділений з отрути ефи багатолускової (Echis multisquamatis) (патент № 86856, опубл. 25.05.2009, бюл. № 10. Тест-система та спосіб контролю ефективності лікування та профілактики тромбозів антикоагулянтами непрямої дії). Екамулін, як і екарин здатний активувати в плазмі крові як протромбін, так і його PIVKAформу без присутності кофакторів. Для моніторингу функціонального стану гепатоцитів при виникненні гепатиту та контролю ефективності лікувальних препаратів необхідно визначати не тільки вміст функціонально активного протромбіну (тест "протромбіновий час"), але також контролювати вміст PIVKA-білків, оскільки накопичення PIVKA-протромбіну призводить до зниження потенціалу системи зсідання крові і свідчить про функціональну недостатність гепатоцитів. В основу винаходу поставлена задача - винайти простий у виконанні спосіб одержання вірогідної інформації щодо ступеня відновлення функціонального стану гепатоцитів за розвитку токсичного гепатиту та контролю за ефективністю дії лікувальних препаратів. Спосіб полягає у визначенні в плазмі крові функціонально неактивних форм протромбіну (PIVKA-протромбін) за різницею тромбопластинового та екамулінового відношень, що є маркером порушень білоксинтезувальної функції гепатоцитів. Використання тромбін-специфічного хромогенного субстрату дозволяє максимально незалежно від дії екзогенних та ендогенних інгібіторів системи зсідання крові фіксувати відновлення функцій печінки за визначеним вмістом функціонально активних вітамін К-залежних білків. Для удосконалення способу контролю ефективності дії препаратів для лікування гепатиту нами було розроблено умови тесту, за яких процес активації протромбіну фіксується спектрофотометрично за розщепленням тромбін-специфічного хромогенного субстрату. Такий підхід дає можливість виключити вплив інгібіторів полімеризації фібрину, оскільки тромбін, що утворився під дією активатору, призводить до розщеплення хромогенного субстрату, а не до перетворення фібриногену у фібрин та наступної його полімеризації як у коагуляційному тесті "Протромбіновий час". Дослідження стану системи гемостазу показали, що тести на основі хромогенного субстрату, на відміну від коагуляційних тестів, менш чутливі до низькомолекулярного та нефракціонованого гепарину та надають можливість визначати реальний вміст протромбіну в плазмі крові [Визначення функціонально неактивних форм протромбіну для контролю ефективності лікування антикоагулянтами непрямої дії; Д.С. Корольова, В.А. Деєв., С.І. Куповська [та ін.] // Лабор. діагностика.-2009.- № 2 (48).- С. 3-12; та використання екамуліну - активатора протромбіну з отрути ефи багатолускової в клінічній лабораторній діагностиці. Д.С. Корольова, Р.П. Виноградова, Т.М. Чернишенко [та ін.] // Лабор. діагностика.-2006- № 3 (37). – С. 18-22)]. Суть винаходу полягає у розробці способу контролю за функціональним станом печінки та ефективністю лікувальних препаратів при гепатиті. Результати тестів з використанням екамуліну та тромбопластину виражають у вигляді протромбінового та екамулінового відношення. Відношення розраховують за амідолітичною активністю утвореного тромбіну досліджуваної плазми крові до амідолітичної активності утвореного тромбіну контрольної плазми крові. Протромбінове та екамулінове відношення в нормі та при ефективній терапії відповідають 1,0±0,1. Поставлена винаходом задача вирішується тим, що спосіб контролю за відновленням білкового синтезу гепатоцитами та ефективністю дії препаратів при лікуванні гепатиту, який включає дослідження протромбінового та екамулінового відношень, згідно винаходу проведення порівняльної оцінки результатів тестів на основі тромбопластину та екамуліну дозволяє одночасно визначати загальний вміст протромбіну та PIVKA-протромбіну плазми крові за різницею амідолітичної активності утвореного тромбіну, що відбувається максимально незалежно від дії екзогенних та ендогенних інгібіторів системи зсідання крові. Таким чином, перевагами такого діагностичного підходу в гепатології є наступне: - отримання інформації про загальний вміст протромбіну синтезованого гепатоцитами та визначення частки функціонально активної форми протромбіну в плазмі крові, що характеризує ступінь відновлення функціонального стану печінки; - використання тромбін-специфічного хромогенного субстрату для визначення вмісту тромбіну, що утворюється за дії активаторів, нівелює вплив екзогенних та ендогенних інгібіторів системи гемостазу на результати тестів. Спосіб контролю за функціональним станом печінки та ефективністю лікувальних препаратів при гепатиті відрізняється тим, що шляхом дослідження різниці у величинах протромбінового та екамулінового відношень, що розраховують за відношенням амідолітичної активності досліджуваної плазми крові до амідолітичної активності контрольної плазми крові, можливо 2 UA 99046 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 визначати ступінь накопичення PIVKA-протромбіну, що характеризує інтенсивність відновлення білоксинтезувальної функції гепатоцитів та ефективність дії лікувальних препаратів. Для визначення амідолітичної активності тромбіну, що утворюється при дії активаторів, у планшетну лунку вносять 10 мкл досліджуваної плазми крові щура, 10 мкл 0,025 М розчину кальцію хлориду, активатор протромбіну (екамуліну 35 мкг/мл або тромбопластину 60 мкл/мл), 25 мкл 3 мМ розчину тромбін-специфічного хромогенного субстрату S2238 та 0,05 М трис-НСІ буфер, рН 7,4, що містить 0,13 М натрію хлориду. Загальний об'єм інкубаційного середовища 250 мкл. Розчин тромбопластину готували за інструкцією фірми Ренам (Москва). Інкубують суміш 5 хв. при температурі 37 °C, після чого вимірюють амідолітичну активність утвореного тромбіну спектрофотометрично при довжині хвилі 405-492 нм на спектрофотометрі для мікропланшетів Thermo Multiskan EX (Фінляндія). Результати тесту з використанням хромогенного субстрату виражали у вигляді протромбінового відношення (ПВ) та екамулінового відношення (ЕВ): ПВ=(Ад/Ак) (1), ЕВ=Ад/Ак (2), де: Ад - амідолітична активність утвореного тромбіну досліджуваної плазми крові при дії тромбопластину (1) та екамуліну (2); Ак - амідолітична активність утвореного тромбіну контрольної плазми крові при дії тромбопластину (1) та екамуліну (2). Визначають різницю між протромбіновим та екамуліновим відношенням, яка свідчить про накопичення PIVKA-протромбіну. Приклад Описаний спосіб було використано для характеристики ступеня відновлення функціонального стану печінки при застосуванні лікувальних препаратів за розвитку експериментального токсичного гепатиту у щурів (Табл.). Досліджено плазму крові щурів, яких лікували впродовж 50 діб новоствореною ліпосомальною формою біологічно активної добавки (БАД) FLP-MD (Патент 86516. Ветеринарна біологічно активна добавка ліпосомальної форми та спосіб репаративної терапії в гепатології / Мельничук Д.О., Грищенко В.А., Литвиненко О.М.; опубл. 27.04.2009, бюл. № 8) (перша група, n=20), препаратом "Есенціале-форте" ("Ей. Наттерманн енд Сайі ГмБХ", Німеччина) (друга група, n=20) та група тварин із самореабілітацією, без лікування (третя груп, n=20). Таблиця. У тварин першої та другої груп при застосуванні лікувальних фосфоліпідовмісних засобів - новоствореної ліпосомальної форми БАД FLP-MD на основі фосфоліпідів молока і відомого фармацевтичного препарату "Есенціале-форте" на основі фосфоліпідів сої, протромбінове та екамулінове відношення практично дорівнює 1,0 (PIVKA-протромбін відсутній), що свідчить про відновлення функціонального стану печінки (білоксинтезувальних процесів): відбувається повний синтез вітамін К-залежних білків та зберігається їх функціональна активність. Тобто новостворена ліпосомальна форма БАД FLP-MD діє ефективно, так як і відомий препарат "Есенціале-форте". Водночас екамулінове відношення (ЕВ) при самореабілітації щурів нижче одиниці (на 30 %). Це свідчить про те, що синтез протромбіну знижено на вказаний відсоток. Протромбінове відношення також суттєво нижче 1,0 (на 60 %), тобто функціональна активність протромбіну знижена. Про накопичення PIVKA-протромбіну свідчить низький рівень функціонально активних форм протромбіну (60 % PIVKA-протромбіну). Таким чином, у тварин при самореабілітації не відбувається повного відновлення функціонування гепатоцитів печінки. Використання способу визначення співвідношення функціонально активних та неактивних форм протромбіну дозволяє здійснювати безпосередній контроль за відновленням синтезу функціонально активних вітамін К-залежних білків. Даний тест забезпечує високу точність та відтворюваність результатів; є нечутливим до впливу екзогенних та ендогенних інгібіторів системи зсідання крові; не має вітчизняних і закордонних аналогів. 3 UA 99046 C2 Таблиця Визначення загального вмісту протромбіну та функціонально активного протромбіну в плазмі крові щурів, хворих на токсичний гепатит, за експериментальних умов (М±m, n=20) Група тварин Перша Друга Третя Екамулінове відношення (ЕВ) 0,98±0,07* 0,93±0,03* 0,70±0,06 Протромбінове відношення (ПВ) 0,95±0,08* 1,04±0,07' 0,4±0,06 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 Спосіб контролю функціонального стану печінки та ефективності лікувальних препаратів при гепатиті, який включає дослідження протромбінового та екамулінового відношень, який відрізняється тим, що шляхом порівняння результатів одночасно проведених двох тестів на основі екамуліну та тромбопластину визначається загальний вміст у плазмі крові протромбіну та його неактивної форми - PIVKA-протромбіну, накопичення останнього є маркером порушення функціонального стану печінки, для чого у зазначених тестах змішують активатор протромбіну (тромбопластин або екамулін), розчин кальцію хлориду, досліджувану плазму крові та тромбінспецифічний хромогенний субстрат; визначають амідолітичну активність утвореного тромбіну; результати тестів представляють у вигляді протромбінового та екамулінового відношень, які розраховують як відношення амідолітичної активності тромбіну при активації досліджуваної плазми крові до амідолітичної активності тромбіну при активації контрольної плазми крові, які за ефективної терапії становлять 1,0±0,1. Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for controlling liver functional state and efficacy of medicines in hepatitis

Автори англійською

Melnychuk Dmytro Oleksiiovych, Melnychuk Dmytro Oleksiovych, Hryschenko Viktoria Anatoliivna, Tomchuk Viktor Anatoliiovych, Lytvynenko Olesia Mykolaivna, Chernyshenko Volodymyr Oleksandrovych, Hryschuk Volodymyr Ivanovych, Platonova Tetiana Mykolaivna

Назва патенту російською

Способ контроля функционального состояния печени и эффективностью лекарственных препаратов при гепатите

Автори російською

Мельничук Дмитрий Алексеевич, Грищенко Виктория Анатолиевна, Томчук Виктор Анатолиевич, Литвиненко Олеся Николаевна, Чернышенко Владимир Александрович, Грищук Владимир Иванович, Платонова Тетьяна Николаевна, Платонова Татьяна Николаевна

МПК / Мітки

МПК: A61B 5/00, G01N 33/49

Мітки: станом, гепатиті, ефективністю, спосіб, препаратів, печінки, лікувальних, функціональним, контролю

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/6-99046-sposib-kontrolyu-za-funkcionalnim-stanom-pechinki-ta-efektivnistyu-likuvalnikh-preparativ-pri-gepatiti.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб контролю за функціональним станом печінки та ефективністю лікувальних препаратів при гепатиті</a>

Подібні патенти