Нуклеотидна послідовність, що кодує tolc, плазміда, протеїн або пептид, бактерія, фармацевтичний препарат, діагностичний набір та зв’язуючий засіб для препаратів

Номер патенту: 84840

Опубліковано: 10.12.2008

Автори: Гоебел Вернер, Спренг Сімоне, Гентшев Івайло

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Нуклеотидна послідовність, що кодує TolC та містить визначену послідовність амінокислот, при цьому ця визначена послідовність амінокислот вставлена в регіон позаклітинної петлі TolC та вибрана з групи, що складається з будь-якого бажаного заданого пептиду або білка, будь-якої бажаної фармацевтично діючої речовини, будь-якого бажаного антигену, будь-якого бажаного антитіла або будь-якого бажаного ліганду та імунізаційної послідовності.

2. Нуклеотидна послідовність за п. 1, у якій TolC являє собою білок TolC відповідно до ACCESSION X 54049 або переважно його N-термінальну часткову послідовність чи мутант білка або часткову послідовність, при цьому для N-термінальної часткової послідовності або мутантів зберігається транспортна функція.

3. Нуклеотидна послідовність за п. 1 або 2, в якій визначена послідовність амінокислот вставлена з однієї сторони або з двох сторін над проміжною послідовністю.

4. Нуклеотидна послідовність за будь-яким з пп. 1-3, в якій визначена послідовність амінокислот вставлена в N-термінальну область TolC, переважно в область амінокислот 52-61 та/або 257-279 (в кожному з випадків базується на білкуTolC).

5. Плазміда, що містить нуклеотидну послідовність за будь-яким з пп. 1-4.

6. Протеїн або пептид, кодований нуклеотидною послідовністю за будь-яким з пп. 1-4.

7. Бактерія, що містить нуклеотидну послідовність за будь-яким з пп. 1-4, при цьому TolC забезпечує транспорт визначеної послідовності амінокислот на мембрану бактерії.

8. Бактерія за п. 7, яка відрізняється тим, що зазначена бактерія вибрана з групи, що включає Salmonella spp., Escherichia coli, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp. та Yersinia spp.

9. Фармацевтичний препарат, що містить бактерію за п. 7 чи 8, а також, опціонально, щонайменше одну фізіологічно сумісну речовину-носій, при цьому визначена послідовність амінокислот вибирається в залежності від заданої субстанції, що підлягає зв'язуванню в організмі .

10. Фармацевтичний препарат, що містить бактерію за п. 7 чи 8, а також, опціонально, щонайменше одну фізіологічно сумісну речовину-носій, при цьому визначена послідовність амінокислот являє собою імунізаційну послідовність.

11. Діагностичний набір, що містить бактерію за п. 7 чи 8, в якому визначена послідовність амінокислот специфічно зв'язує речовину-маркер, що підлягає визначенню.

12. Зв'язуючий засіб для препаратів, що містить бактерію за п. 7 чи 8, де визначена послідовність амінокислот специфічно зв'язує цільову речовину, що має бути виділена з розчину .

Текст

1. Нуклеотидна послідовність, що кодує TolC та містить визначену послідовність амінокислот, при цьому ця визначена послідовність амінокислот вставлена в регіон позаклітинної петлі TolC та вибрана з групи, що складається з будь-якого бажаного заданого пептиду або білка, будь-якої бажа 2 (19) 1 3 84840 4 цьому визначена послідовність амінокислот вибирається в залежності від заданої субстанції, що підлягає зв'язуванню в організмі . 10. Фармацевтичний препарат, що містить бактерію за п. 7 чи 8, а також, опціонально, щонайменше одну фізіологічно сумісну речовину-носій, при цьому визначена послідовність амінокислот являє собою імунізаційну послідовність. 11. Діагностичний набір, що містить бактерію за п. 7 чи 8, в якому визначена послідовність амінокислот специфічно зв'язує речовину-маркер, що підлягає визначенню. 12. Зв'язуючий засіб для препаратів, що містить бактерію за п. 7 чи 8, де визначена послідовність амінокислот специфічно зв'язує цільову речовину, що має бути виділена з розчину . Область техніки Винахід відноситься до послідовності нуклеотидів, що кодує TOLC, до плазміду, що містить таку послідовність нуклеотидів, протеїну або пептиду, кодованому такою послідовністю нуклеотидів, бактерії, що містить таку послідовність нуклеотидів, а також до різних застосувань таких бактерій. Передумови винаходу і відомі технічні рішення Бактерії з ослабленої вірулентністю, що поселилися всередині клітин, можуть викликати тривалий імунітет в якості живої вакцину. Дотепер в якості живої вакцини використовували Salmonella Typhi TYla [Levine et al., Lancet 1:1 1049-1052, 1987], Mycobacterium bovis BCG [Fine and Rodrigues, Lancet 335: 1016-1020, 1990] і Vibrio cholerare [Levine and Kaper, Vaccine 11: 207-212, 1993]. Так, наприклад, з Listeria monocytogenes, Salmonella enterica sv.Typhimurium та Typhi, а також з BCG уже використовували такі варіанти добре сумісних живих вакцин проти тифу і туберкульозу. Ці бактерії, а також їхні ослаблені мутанти, є, загалом, бактеріями, що стимулюють імунітет і можуть викликати гарну клітинну імунну відповідь і тому використовуються в якості носіїв вакцини. Перевага цих бактерій як носіїв вакцини полягає в тім, що вони, насамперед, викликають так звану імунну відповідь Thl [Hess and Kaufmann, FEMMS Immunol. Med.Microbiol. 23: 165-173, 1999]. Ця імунна відповідь відрізняється цитотоксичними лімфоцитами (CTL), а також присутністю специфічних IFN-гамма-виділяючих CD4 + Τ-клітин (також кооперує Т-клітина «клітина-помічник») [Abbas et al., Nature 383: 787-793, 1996]. Так, наприклад, L.monocytogenes стимулюють, особливо під дією активації клітин ТН1, проліферацію Т-лімфоцитів (CTL). Ці бактерії поставляють виділені антигени безпосередньо в антигенні клітини, що представляють цитозоль (АРС; макрофаги і дендритні клітини), що у свою чергу експресують спільно стимулюючі молекули і викликають ефективне стимулювання Т-лімфоцита. Лістерії частково розпадаються у фагосомальних відділеннях, а зроблені цими бактеріями-носіями антигени можуть, тому з однієї сторони представлятися через молекулу класу МНС II і тим самим приводити до індукції Т-клітин, що кооперують,. З іншої сторони лістерії після вивільнення з фагосоми роблять реплікацію в цитозолі APCs; зроблені і виділені з цих бактерій антигени представляються переважно через шлях-І МНС класу, у результаті чого збуджуються CTL. Крім того, було встановлено, що в результаті взаємодії між лістеріями і макрофагами природні клітини-вбивці (NK) та нейт рофільні зернисті лейкоцити збуджують експресію таких цитокінів, для яких було доведено протипухлинну дію [TNF-alpha, IFN-gamma, 11-2, IL-12; Unanue, Curr Opin Immunolog, 9: 35-43,1997; Mata and Paterson, J. Immunolog.163: 1449-14456]. В результаті цього, рекомбінантні бактерії були в змозі забезпечити захист проти гетерогенної пухлини [Medina et al., Eur.J.Immunol. 29: 693-699, 1999; Pan et al., Cancer Res.59: 5264-5269, 1999; Woodlock et al. J.Immunother 22: 251-259, 1999; Paglia et al., Blood 92: 3172-3176, 1998; Paglia et al., Paglia et al., Eur.J. Immul.27: 1570-1575, 1995; Pan et al., Cancer Res.55: 4776-4779, 1995]. Таким чином, у результаті введення L.monocytogenes, що були перенесені за допомогою трансдукції для експресії антигенів пухлини, гальмували специфічний для антиген ріст експериментальної пухлини [Pan et al., Nat. Med.1: 471477, 1995; Cancer Res.59: 5264-5269, 1999; Voest et al., Natl.Cancer Inst 87: 581-586, 1995; Beatty and Paterson, J.Immul.165: 5502-5508, 2000]. Штами Salmonella enterica з ослабленою вірулентністю, у які були введені нуклеотидні послідовності, кодовані для антигенів пухлини, можуть, в якості носіїв бактерій, що експресують антигени пухлини після перорального введення, викликати специфічний захист проти різних експериментальних пухлин [Medina et.al., Eur J.Immul. 30: 768-777, 2000; Zoller und Christ J.Immul.166: 3440-34450, 2001; Xiang et al., PNAS 97: 5492-5497,2000]. Рекомбіновані штами Salmonella виявляли також ефективність в якості профілактичної вакцини проти вірусної інфекції [HPV; Benyacoub et al., Infect. Immun. 67: 3674-3679, 1999] і для терапевтичного лікування викликаної пухлинним вірусом (HPV) несмертельної пухлини миші [Revaz et al., Virology 279: 354-360, 2001]. Для застосування в якості носія вакцини були розроблені різні способи експресії на мембрану клітини цих бактерій експресійних продуктів, введених у бактерії послідовностей нуклеїнової кислоти або способи секреції експресійних продуктів такими бактеріями. Базою цих способів є гемолізинна система HlyAs Eschericia colli, що являє собою прототип секреторної системи типу І грамнегативних бактерій. За допомогою HlyAs були складені секреторні вектори, що дозволяють ефективно виводити антигени протеїну в Salmonella enterica, Yersinia enterocoli tica і Vibrio cholerae. Такі секреторні вектори містять кДНК будьякого антигену протеїну, зв'язаного з нуклеотидною послідовністю для сигнального пептиду НіуА, гемолізованого секреторного апарата, hlуВ та і hlyD, а також для специфічного для hly промотору. 5 84840 За допомогою цього секреторного вектора можна експресувати білок, наприклад, на поверхню цієї бактерії. Генетично модифіковані в такий спосіб бактерії викликають в якості вакцини сильний імунний захист у порівнянні з бактеріями, в яких усередині клітин присутній експресований із введеної нуклеїнової кислоти білок [Donner et al. EP 1015023 A; Gentschev et al., Gene 179: 133-140, 1996; Vaccine 19: 2621-2618, 2001; Hess et al.PNAS 93: 1458-1463, 1996]. Однак недоліком цієї системи є те, що в результаті застосування Hlyспецифічного промотору, кількість експресованого з бактерії білку є незначним. Інші транспортні системи в бактеріях представляють, наприклад і) транспортний сигнал для протеїну із шаром S (Rsa А), у якому для секреції і для експресії з постійною мембраною необхідно застосовувати С-термінали транспортного сигналу RsaA [Umelo-Njaka et al. Vaccine 19: 1406-1415, 2001] та іі) транспортний сигнал для інтерналіна А від Listeria monocytogenes. Для секреції необхідний N-термінальний транспортний сигнал, а для експресії з постійною мембраною N-термінальний транспортний сигнал разом з С-термінальною частиною, що містить мотивом LPXTG, та відповідає за закріплення на стінці клітини [Dhar et al., Biochemistry 39; 3725-3733, 2000]. З інших причин відомий повний мембранний білок TolC E.coli. Він являє собою багатофункціональний, пороутворюючий білок зовнішньої мембрани E.coli, що поряд з функціями, наприклад, поглинання коліцину E1 [Morona et al., J.Bacteriol. 153: 693-699, 1983] і секреції коліцину V [Fath et al., J.Bacteriol. 173: 7549-7556, 1991] служить також і як рецептор для U3-фагов [Austin et al., J.Bacteriol. 172: 5312-5325, 1990]. Цей протеїн присутній не тільки в E.coli., а і в багатьох грамнегативних бактеріях [Wiener, Structure Fold Des., 8: 171-5,2002]. Кристалічна структура білка TolC показує, що він у якості гомотримера утворить тунельний канал довжиною 120 ангстрем, при цьому велика частина гомодимерів тунельних доменів локалізовані в периплазмі і тільки невелика петля (амінокислоти 52-61 і 257-279) упроваджується на поверхні бактерії [Koronakis et al., nature 405: 914-919, 2000]. Ген TolC має нуклеотидну послідовність, яку було опубліковано [Niki et al, Nucleotide sequence of the tolC gene of Escherichia coli, Nucleic Acids Res. 18 (18), 5547 (1990)]. TolC являє собою частину, щонайменше, чотирьох різних бактеріальних експортних систем, бо він являє собою мембранний тунель, через який забезпечується можливість експорту бактеріального білка. Так, наприклад, у транспортній системі НіуА зв'язок між HlyD і периплазматичним кінцем TolC дозволяє відбуватися експорту гемолізину HlyD в мембранний тунель TolC [Gentschev et al. Trends in Microbiology 10: 3945, 2002]. Технічна задача винаходу В основу винаходу покладена технічна задача створити транспортну систему, за допомогою якої експресійний продукт можна представляти на зовнішній оболонці мембрани клітини з високою ефективністю. 6 Основна концепція винаходу і переважні варіанти здійснення Для рішення цієї технічної задачі відповідно до винаходу пропонується нуклеотидна послідовність, що кодує TolC, а також визначена амінокислотна послідовність, при цьому амінокислотна послідовність вставлена в рекомендовану зовнішню область TolC. За допомогою винаходу створена нова транспортна система в грамнегативних бактеріях, за допомогою якої більша у порівнянні з відомими дотепер транспортними системами кількість виділеного з гена в межах бактерії білка може транспортуватися на зовнішню мембрану клітини бактерії. Несподівано, транспортна система дозволила білку TolC Escheria coli проводити більш сильну експресію з постійною мембраною (будь-якого) пептиду або білка в порівнянні з відомими дотепер транспортними білками, а саме в великій кількості грамнегативних бактеріях. Експресія з постійною мембраною визначеної амінокислотної послідовності і продуктів, вироблюваних генами, досягається при цьому виключно за допомогою ТоlС. Визначена амінокислотна послідовність може бути будь-яким заданим пептидом або білком, будь-якою фармацевтично діючою речовиною, будь-яким антигеном, будь-яким антитілом або будь-яким лігандом. ТоІС може бути (типовим вихідним «диким») протеїном ТоІС відповідно до ACCESSIN X 54049, на що робиться чітке посилання або його частковою послідовністю (переважно N-термінали), чи мутантом білка, або частковою послідовністю чи мутантом, що отримав транспортну функцію. Під N-термінальною частковою послідовністю тут мається на увазі часткова послідовність амінокислот, що починаються в N-термінальній області від 1 до 50 білка ТоІС і закінчуються С-термінальним закінченням петлі, що впровадилася на поверхні бактерії. Таким чином, перевага віддається Nтермінальному транспортному сигналу ТоІС , але також і середньої частини білка, що представляє позаклітинні області ТоІС. Мутант може включати інсерцію, делецію або заміщення доти, поки його транспортна функція не буде чітко ослаблена. Для деяких областей застосування буде доцільно, якщо визначена послідовність амінокислоти з однієї чи з двох сторін буде вставлена в проміжну послідовність. Це, зрозуміло, буде дуже зручно в тому випадку, якщо визначена послідовність амінокислот повинна бути представлена у визначеній просторовій структурі, наприклад, у випадку антигену, однак, це не відбувається в необхідному ступені під дією визначеної послідовності амінокислот навіть по просторових причинах або причинах конфігурації. У такому випадку проміжна послідовність може утворитися, особливо за допомогою природно пов'язаною з визначеною послідовністю амінокислоти послідовності, у результаті чого визначена послідовність амінокислоти складається таким чином, як і в природному антигені. Проміжна послідовність може бути також і штучною, якщо в результаті цього досягається необхідне представлення та/або складчастість визначеної амінокислотної послідовності. Це можна легко розрахува ти 7 84840 за допомогою теоретичних методів у місці інсерції в ТоІС. Окремо перевага віддається в тому випадку, якщо визначена послідовність амінокислоти вставляється в N-термінальну область ТоІС, зокрема в область амінокислот 52-61 та/або 257-259 (відповідно в співвідношенні з білком ТоІС). Далі предметом винаходу нуклеотидна послідовність по даному винаходу, що містить плазмід, а також чи білок пептид, закодовані за допомогою нуклеотидної послідовності по даному винаходу. Далі винахід відноситься бактерії, що містить нуклеотидну послідовність, при цьому ТоІС забезпечує транспорт визначеної нуклеотидної послідовності на мембрану бактерії. Іншими словами, у бактерії під дією білка ТоІС відбувається експресія з постійною мембраною, вироблюваного генами продукту. Отже, предметом винаходу є також грамнегативна бактерія, що містить, щонайменше, одну нуклеотидну послідовність, що кодує, щонайменше, одну визначену нуклеотидну послідовність і, принаймні, одним вироблюваний геном ТоІС продукт Е.соіі. Цей вироблюваний геном ТоІС продукт Е.соіі., є переважно диким типом. Однак, предметом дійсного винаходу є також і вироблювані геном ТоІС продукти Е.соіі, що зазнали мутації, але у яких збереглася активність транспортних сигналів. Переважно бактерію вибирають з групи, що включає "Salmonella spp, Escherichia coli, Vibrio cholerare, Pseudomonas aeruginosa, Shigella spp. і Yersinia spp.". Нуклеотидна послідовність і бактерії відповідно до винаходу можуть застосовуватися в різних областях. Таким чином, даний винахід відноситься також і до фармацевтичного препарату, що містить бактерію згідно із даним винаходом, а також як варіант, щонайменше, до одного фізіологічно сумісного речовини-носія, при цьому визначена послідовність амінокислоти вибирається відповідно до попередньо заданому, підлягаючому зв'язуванню в організмі субстанцією. За допомогою такого фармацевтичного препарату можна зв'язувати й у такий спосіб гальмувати субстанції, що порушують звичайний клітинний обмін речовин, наприклад, екзогенні отруйні речовини чи обумовлені мутацією ендогенні субстанції, наприклад, онкогени. Можна також за допомогою зв'язування визначених клітинних цільових речовин моделювати процеси обміну речовин за рахунок видалення нормальних чи обумовлених хворобою комплексів партнерів з високим ступенем регулювання. У результаті цього загальмовується, наприклад, визначена асоціація, а взаємозалежне з ним регулювання човникового руху знижується. Такий процес можна у свою чергу використовувати для регулювання з високим ступенем інших взаємозалежних процесів. Таким чином, визначену нуклеотидну послідовність амінокислот потрібно вибирати тільки відповідно до цільової молекул, що підлягає ігібуванню з високим ступенем специфічності. Отже, такий фармацевтичний препарат служить в остаточному підсумку для терапевтичних цілей. Прийнятний для щеплення фармацевтичний препарат містить бактерію згідно із даним винахо 8 дом, а також як варіант, щонайменше один, фізіологічно сумісний матеріал-носій, при цьому визначена послідовність амінокислоти являє собою імунізуючу послідовність. Імунізуюча послідовність стимулює в організмі утворення антитіл проти природного антигену, що як часткову послідовність містить або складається з неї. Для діагностичних цілей винахід пропонує бактерію, що містить діагностичний комплект по одному з пп. 7-9, при цьому визначена послідовність амінокислот специфічно зв'язує речовину-маркер, що підлягає визначенню. Якщо, наприклад, в організмі відбирається проба тканини чи рідини і ця проба після попередньої обробки, якщо вона необхідна, з відділенням небажаних складових частин із проби інкубується з бактерією, то в такому випадку можна визначити механізми зв'язування у визначеній послідовності амінокислот і у випадку зв'язування встановлюють, що специфічна речовина, що зв'язується з визначеною послідовністю амінокислот, присутня у пробі. Підтвердження процесу зв'язування можна зробити при цьому усілякими відомими фахівцю способами. І, нарешті, винахід відноситься до бактерії, що містить зв'язуючу речовину для препарату, при цьому визначена послідовність амінокислот специфічно зв'язує відокремлювану від розчину цільову речовину. За допомогою такої зв'язуючої речовини можна специфічно, з одного боку, зі зразка видалити небажані речовини за допомогою інкубування розчину з бактерією, і після відділення видалити бактерію. З іншого боку, відповідним чином може відбутися чи відділення збагачення цільової речовини, а саме, якщо після інкубації цільова бактерія буде елюйована від бактерії. Також і в цьому взаємозв'язку винахід може застосовуватися для відділення та/або збагачення антигенів, антитіл, пептидів, білків, або ліганд. Приклади здійснення винаходу Приклад 1. Ген ТоІС з Е.соіі разом з його типовим диким промотором за допомогою PCR (1хв. 94°С, 1хв. 66°С, 1хв. 30 секунд 72°С) був розширений олеонуклеотидами 5' ТоІС (5'TAACGCCCTATGTCGACTAACGCCAACCTT-3') і 3' ТоІС (5'AGAGGATGTCGACTCGAAATTGAAGCGAGA-3') із плазміду рАХ629 (C.Wandersman, Institute Pasteur, Paris). При цьому на обох кінцях був вставлений додатковий розріз SaIl. Очищений продукт PCR (швидкий QIA PCR очищувальний комплект Qiagen, Hilden, Germany) був переварений рестрикційною ендонуклеазою Sall та клонований у попередньо розщеплений Sall вектор pBR322. Сконструйований у такий спосіб вектор назвали pBR322tol. Функціональність клонованого гена ТоІС була згодом перевірена за допомогою численних випробувань. Приклад 2. Інсерція антигенної послідовності в послідовність білка ТоІС У послідовності ТоІС, що закодована для позаклітинних петель був іденти фікований розріз Kpnl. Він був використаний для клонування антигенної послідовності пептиду білка р60 (іар-ген) Listeria monocytogenes та дозволив зробити інсер 9 84840 цію сторонніх антигенів в амінокислоту 271 зрілого білка ТоІС. Послідовність іар, що закодована для клітини pitop (амінокислоти 301-322) протеїну р60, була клонована у вигляді фрагмента Kpnl у розрізаний Kpnl вектор pBR322tolC (Фіг.1). Отриманий у такий спосіб плазмід був позначений як pBR322tolC:: LisTB. На Фіг.1 показана стратегія клонування для інсерції специфічної для р60 епітопослідовності в типовим диким, кодованим плазмідом ген tolC E.coli на векторі pBR322. Сюди відносять: стійкий до ампіциліну ген; Тс-тетрациклін; Т-Listeria monocytogenes p60-T pitop клітини (AS 301-312); ВListeria monocytogenes р60-Т pitop клітини (AS 291301); Ptol - типовий дикий промотор TolC E.coli. Приклад 3. Експресія антигену на мембрану грамнегативної бактерії Escheria coli Експресія епітопів білка р60 з Listeria monocytogenes у межах протеїну ТоІС була доведена в Western Blot. Для цього минулого ізольовані білки клітині-лізата з E.coli СС118 tolC, E.coli CC118322 tolC/pBR322tol і з E.coli CC118tolC/pBR322tolC: LisTB у пізнішій логарифмічній фазі. Загальна кількість нанесених клітин білка складає приблизно 100млн. бактерій. Білки були відділені в 15-процентному гелі SDS поліакриламіду й експресія хімерних білків ТоІС, а також уставлених епітопів була визначена з однієї сторони поліклональною сироваткою проти білка ТоІС, а з іншого боку, моноклональным антитілом К317 [Rowan et al., J.Clin.Microbiol. 38: 2643-2648, 2000], що специфічно спрямовано проти епітопа клітини В з Listeria monocytogenes (Фіг.2В). Як і очікували, у клітині лізата CC118tolC не були виявлені білок tolC, що можна пояснити мутацією в хромосомному гені tolC у цьому штамі [Scholer et al., Mol. Gen Genet.256: 306-319, 1997]. Комплементація з pBR322tolC привела в цьому штамі до експресії протеїну tolC величиною 52 kDа. Вставка епітопа Listeria monocytogenes у протеїн tolC не завдала впливу на експресію tolC і привела до незначного зсуву величини химерного білка приблизно на 3 kDа. Експресію специфічного р60 епітопу в Е.соіі СС118tol/pBR322tol::LisTB можна було підтвердити моноклональным р60 антитілом К317. Приклад 4. Підтвердження вираженої локалізації р60 епітопа Listeria monocytogenes в Salmonella enteritidis SM6T (tolC). Оскільки місце вставки обох р60 епітопів лістерїї знаходилося в позаклітинній петлі TolC в амінокислоту 271 зрілого білка, воно повинно бути виражене на поверхні Salmonella enteritidis SM6T [Stone et al., Mol.Microbiol. 17: 701-712, 1995]. Визначена позаклітинна локалізація специфічного 10 р60 у Salmonella enteritidis SM6T була перевірена за допомогою непрямої імунної флуоресценції. 25 m1 настояної протягом ночі культури Salmonella enteritidis SM6T/pBR322tolC та Salmonella enteritidis SM6T/pBR322tolC::LisTB наносили покраплинно на носій об'єкта і висушували на повітрі. Клітини офарблювалися моноклинальним р60 антитілом К317 (1:200) а зв'язані антитіла на закінчення визначали маркірованою FITC вторинною протимишачою сироваткою (Dianova, Germany, Arbeitstiter: 1:40). Аналізи за допомогою флуоресцентної мікроскопії підтвердили позаклітинну локалізацію специфічних епітопів Listeria monocytogenes в штамі Salmonella enteritidis SM6T/pBR322tolC::LisTB. Приклад 5. Досліди по імунізації з грамнегативними бактеріями та аналіз захисних імунних відповідей після інфекції типовими дикими L. monocytogenes Для того щоб досліджувати, чи приводить виражена експресія Т-клітинного епітопа з білка р60 L. monocytogenes у мишачій моделі Listeriose до захисту, пероральній імунізації піддали 8 самок Balb/c-мишей (Charles River, Sulzfeld, Німеччина) у віці шість тижнів дозою 1´107 S. enteritidis pBR322tolC::LisTB. Для контролю піддали пероральної імунізації 5 самок мишей за допомогою S. enteritidis SM6T. Через три тижні тварин повторно імунізували з такою ж дозою бактерій. Успіх імунізації був перевірений через п'ять тижнів після першої імунізації в імуноблоті, на який були нанесені вистояні білки Listeria monocytogenes. При цьому можна було підтвердити наявність противо-p6-специфічних антитіл у сиворотці імунізованих S. enteritidis SM6T/pBR322tolC::LisTB мишей. Через три тижні після другої імунізації тварини були заражені внутрішньовенно 5´104 L. monocytogenes EGD, дозою, що у 5 разів перевищує летальну дозу. У той час як виживаність Balb/c мишей імунізованих S. enteritidis SM6T/pBR322tolC::LisTB після внутрішньовенної інфекції L. monocytogenes EGD склала 88%, то виживаність у контрольній групі складала усього 20%. Тим самим експресія р60 специфічного епітопа в межах позаклітинної петлі ТоІС в ослабленому штамі-носії S. enteritidis SM6T призводила до індукції імунних відповідей, специфічних для Listeria monocytogenes, що могли захистити Balb/cмишей від, як правило смертельної, інфекції. Тому що індукцію антитіл проти клітинного В-епітопу з білка р60 можна було знайти в Western Blot, тобто природно, що імунна реакція при участі антитіл викликала захист мишей, що спостерігається тут, від, як правило смертельної, інфекції під дією L.monocytogenes. 11 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко 84840 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Nucleotide sequence that codes tolc, plasmid, protein or peptide, bacteria, pharmaceutical preparation, diagnostic kit and binding mean for preparations

Автори англійською

Goebel Verner, Gentshev Ivailo, Spreng Simone

Назва патенту російською

Нуклеотидная последовательность, которая кодирует tolc, плазмида, протеин или пептид, бактерия, фармацевтический препарат, диагностический набор и связующее средство для препаратов

Автори російською

Гоебел Вернер, Гентшев Ивайло, Спренг Симоне

МПК / Мітки

МПК: A61P 31/04, C12N 15/09, C07K 14/255, A61K 39/00, C07K 14/195, C12N 1/21, G01N 33/53, C07K 14/21, C07K 14/245

Мітки: набір, плазміда, нуклеотидна, діагностичний, фармацевтичний, пептид, протеїн, препарат, послідовність, зв'язуючий, препаратів, засіб, tolc, кодує, бактерія

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/6-84840-nukleotidna-poslidovnist-shho-kodueh-tolc-plazmida-proten-abo-peptid-bakteriya-farmacevtichnijj-preparat-diagnostichnijj-nabir-ta-zvyazuyuchijj-zasib-dlya-preparativ.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Нуклеотидна послідовність, що кодує tolc, плазміда, протеїн або пептид, бактерія, фармацевтичний препарат, діагностичний набір та зв’язуючий засіб для препаратів</a>

Подібні патенти