Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб продукції ландоміцину А, який базують на уведенні додаткових копій гена-активатора, який відрізняється тим, що як ген-активатор використовують ген lanl S. cyanogenus S136 у складі інтегративного вектора pIJ6902.

Текст

Реферат: Спосіб продукції ландоміцину А базують на введенні додаткових копій гена-активатора. Як генактиватор використовують ген lanl S. cyanogenus S136 у складі інтегративного вектора pIJ6902. UA 84651 U (54) СПОСІБ ПРОДУКЦІЇ ЛАНДОМІЦИНУ А UA 84651 U UA 84651 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до генетики бактерій та біотехнології і може бути використана для створення штамів Streptomyces cyanogenus S136, що надпродукують ангуциклиновий антибіотик ландоміцин А та його похідні. Відомий спосіб отримання надпродуцентів ландоміцинів, згідно з яким спорову суспензію штама-продуцента опромінюють ультрафіолетом чи обробляють хімічним мутагеном, розсівають її на поживному агаризованому середовищі та відбирають клони із підвищеним рівнем біосинтезу антибіотика [Gromyko О, Rebets Y, Ostash В, Luzhetskyy A, Fukuhara M, Bechthold A, Nakamura T, Fedorenko V. Generation of Streptomyces globisporus SMY622 strain with increased landomycin E production and it's initial characterization. J. Antibiot.-2004. - Vol. 57. - P.383389]. Отримані мутанти синтезують у 2200 разів більше ландоміцинів порівняно з вихідним штамом. Проте зазначений спосіб є досить тривалим, включає застосування складних мікробіологічних процедур. Найближчим за технічною суттю - прототипом - є спосіб підвищення рівня синтезу ландоміцину Е штамом S. globisporus 1912 за допомогою надекспресії гена Indl, який кодує шлях-специфічний транскрипційний активатор структурних генів біосинтезу ландоміцину Е [Федоренко В.О., Ребець Ю. В, Осташ Б.О., Лужецький A.M. Спосіб отримання штамів Streptomyces globisporus з підвищеним рівнем біосинтезу ландоміцинів. Деклараційний патент України на винахід. №200310637 від 15.12.2003, Бюл. №12]. Ген Indl у складі реплікативного вектора рКС1139 або ж інтегративного вектора pSET152 введено у штам S. globisporus 1912 за допомогою кон'югації з Escherichia coli ET12567 (pUB307). Після інкубування при 30 °C протягом 16 год., кожну чашку Петрі з кон'югаційною сумішшю заливали 1 мл стерильної води, яка містить 50 мкг/мл апраміцину та 25 мкг/мл налідиксової кислоти. Інкубацію продовжували до появи транскон'югантів. Транскон'юганти, які успадкували плазміду з геном Indl, відбирали за ознаками стійкості до апраміцину, і вирощували у 50 мл рідкого середовища SG протягом п'ятьох днів. Ландоміцин Е екстрагували з усього ферментаційного середовища рівним об'ємом етилацетату (50 мл), центрифугували 10 хв при 6000 об./хв., отриманий супернатант випаровували і аналізували за допомогою тонкошарової і високоефективної рідинної хроматографії. Транскон'юганти продукували у 3-5 разів більше ландоміцину Е, ніж контрольний штам. Проте, штам S. globisporus 1912 не продукує ландоміцину А, і тому цей штам не можна використати для підвищення продукції останнього. Білковий продукт гена Indl не здатний до ефективної транскрипційної активації генів біосинтезу ландоміцину А в S. cyanogenus SI36. Крім того, у цьому способі необхідно додавати антибіотик апраміцин для підтримання гена на реплікативній плазміді рКСІ 139, що ускладнює використання методу. В основу корисної моделі поставлена задача удосконалити спосіб продукції ландоміцину А шляхом уведення у геном S. cyanogenus S136 додаткової копії гена lаnl, що дасть змогу підвищити рівень продукції ландоміцину А, спростити і здешевити сам процес. Поставлена задача вирішується тим, що у способі підвищення біосинтезу ландоміцину А, який базується на уведенні додаткових копій гена-активатора, як ген-активатор використовують ген lanl S. cyanogenus SI36 у складі інтегративного вектора pIJ6902. Ландоміцин А - представник найбільшої родини полікетидних антибіотиків - ангуциклінів. Спорідненими до ангуциклінів є антрацикліни, серед яких виявлено низку клінічно важливих протиракових сполук, таких як доксорубіцин, аклациноміцин, ногаламіцин та інші. На відміну від антрациклінів, ландоміцин А не інтеркалює у ДНК, однак має спів мірну протипухлинну активність і ефективно знищує ракові клітини, стійкі до антрациклінів [Ostash В, Korynevska A, Stoika R, Fedorenko V. Chemistry and biology of landomycins, an expanding family of polyketide natural products. Mini Rev Med Chem.-2009. - Vol. 9. - P.1040-1051]. Це спонукає до глибшого вивчення ландоміцину А як потенційної основи для створення нового класу ліків. Світовий досвід розробки медпрепаратів на основі природних сполук свідчить, що складність їхнього отримання у значних кількостях, необхідних для біологічного тестування, часто є основною перешкодою на шляху до виявлення її позитивних властивостей. Складність отримання чистої форми препарату є основною причиною високої собівартості виробництва ліків, що знижує їх привабливість для хворих. Актиноміцетна культура Streptomyces cyanogenus SI36 - єдине джерело ландоміцину А, яке, однак, дає змогу отримати відносно невеликі кількостіцього антибіотика, приблизно 60 мг/л ферментаційного середовища. Авторами вперше запропоновано використати стабільну та індуцибельну надекспресію гена lanl для підвищення виходу продукції ландоміцину А штамом S. cyanogenus SI 36. Ген Іаnl кодує шлях-специфічний транскрипційний активатор структурних генів біосинтезу ландоміцину А. За допомогою тестування різноманітних систем експресії генів у S. cyanogenus SI36, підібрано 1 UA 84651 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 оптимальну систему для підвищеної експресії Іаnl. Вона базується на інтегративному векторі pIJ6902 [Huang, J., Shi, J., Molle, V. Cross-regulation among disparate antibiotic biosynthetic pathways of Streptomyces coelicolor. Мої. Microbiol.-2005. - Vol. 58. - P. 1276-1287], в якій транскрипція гена Іаnl буде під контролем тіострептон-індуцибельного промотора tipAp. Оскільки надекспресія генів шлях-специфічних регуляторів дає змогу швидко отримувати штами, які продукують збільшену кількість тільки певного класу антибіотиків, то це приведе до підвищення виходу продукції ландоміцину А. Суть корисної моделі пояснює креслення. Фіг.1 Хімічна будова ландоміцину А, основного представника антибіотиків ландоміцинового ряду. Фіг. 2 Результати аналізу продукції ландоміцину А штамами за допомогою спектрофотометрії, де: 1 - рівень продукції ландоміцину А штамом S. cyanogenus SI36; 2 - рівень продукції ландоміцину А штамом S. cyanogenus SI36 (рМО15). Спосіб можна проілюструвати прикладами: Конструюють плазміду рМО15. Спершу, для конструювання плазміди рМО15, фрагмент ДНК із хромосоми S. cyanogenus S136, який містить ген Іаml, ампліфіковують за допомогою праймерів lanlNdelup (5'-AAACATATGGGTCAGTTTTCGACGG-3') та lanlMdelrp (5'AAACAATTGTCACTGGTTACCGAGCCG-3'). Отриманий фрагмент розміром 0,8 т.п.н. обробляють ендонуклеазами рестрикції Ndel і Mfel і далі очищують згідно з загальновживаними методиками [Гловер Д. Молекулярное клонирование ДНК. Методы. М., Мир-1989-т.1-374с]. Також обробляють ендонуклеазами рестрикції Ndel і Mfel вектор pIJ6902 [Huang, J., Shi, J., Molle, V. Cross-regulation among disparate antibiotic biosynthetic pathways of Streptomyces coelicolor. Мої. Microbiol.-2005. - Vol. 58. - P. 1276-1287]. Лігують лінеаризований вектор і ампліфікований фрагмент. Лігазною сумішшю трансформують штам Е. coli DH5α та відбирають клони, що несуть рекомбінантні плазміди на середовищі LA з 25 мкг/мл апраміцину. Плазмідну ДНК із трансформантів аналізують рестрикційним картуванням ферментами Ndel і Mfel та за допомогою секвенування плазміди [Гловер Д. Молекулярное клонирование ДНК. Методы. М., Мир-1989-т.і-374с]. Отриману плазміду позначають рМО15. Плазмідою рМО15 трансформують штам Е. coli ET12567 (pUB307), який за рахунок trа-генів плазміди pUB307 забезпечує кон'югативне перенесення корезидентних плазмід [Flett F., Mersinias V., Smith C.P. High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA from Escherichia coli to methyl-DNA-restricting Streptomycetes II FEMS Microbiol. Lett.-1997. - vol.155. P.223-229]. Одну колонію культури Е. coli ET12567 (pUB307), вирощеної вночі упродовж 12 год., засівають у 10 мл середовища LB з 50 мкг/мл канаміцину. Культуру вирощують до оптичної густини OD600≈0,1l, переносять у мікропробірки з об'ємом 1,5 мл та осаджують центрифугуванням при 8 тис. об./хв протягом 1 хв. Зливають супернатант та клітини ресуспендують у 50 мкл середовища LB. Отриману суспензію клітин охолоджують у льоді 5 хв, додають 1 мл 0,1М розчину CaCl2 та інкубують у льоді 1 год. Клітини осаджують центрифугуванням при 8 тис. об./хв протягом 1 хв, зливають надосадову рідину та ресуспендують у 100 мкл 0.1М розчину CaCl2-Інкубують 1 год. у льоді та додають розчин плазмідної ДНК. Інкубують 1 год. у льоді, після чого клітини піддають тепловому шоку протягом 1 хв при 40 °C, охолоджують та додають 1 мл середовища LB. Інкубують 2 год. при 37 °C для індукції експресії генів стійкості та висівають на чашки з середовищем LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. Чашки інкубують при 37 °C 16 год., після чого трансформанти пересівають на свіже середовище LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину. Плазміду рМО15 у S. cyanogenus S136 переносять шляхом міжродової кон'югації з відповідним штамом Е. coli ET12567 (pUB307; pMO15). Суспензію міцелію штаму S. ghanaensis висівають на середовище ОМ г/л: вівсяне борошно - 30, агар - 18, вода водопровідна - до 1 л, рН до стерилізації - 7,0 і вирощують 7 діб при 28 °C для отримання газону клітин для кон'югаційних схрещувань. Штам Е. coli ET12567 (pUB307; pMO15) висівають на чашку із середовищем LA з 25 мкг/мл апраміцину та 50 мкг/мл канаміцину і вирощують 18 год. при 37 °C. Готують суспензію клітин в 1 мл середовища LB. Одночасно готують суспензію клітин штаму S. cyanogenus в 1 мл стерильної води. Клітини піддають тепловому шоку упродовж 5 хв при 50 °C. Суспензію клітин кишкової палички і стрептоміцетів осаджують центрифугуванням 2 хв при 8 тис. об./хв, зливають надосадову рідину, розчиняють у 100 мкл середовища LB, змішують між собою та висівають на чашки з середовищем ОМ. Чашки інкубують 20 год. при 28 °C та заливають 1 мл водного розчину 25 мкг апраміцину та 50 мкг налідиксової кислоти. 2 UA 84651 U 5 10 15 20 25 30 Отриманий штам S. cyanogenus SI 36 (рМО15) перевіряють на наявність плазміди. Вирощують у 15 мл рідкого середовища TSB та виділяють сумарну ДНК, зразками якої трансформують штам Е. coli DH5α [Kieser Т., Bibb M.J., Buttner M.J., Chater K.F., Hopwood D.A. Practical Streptomyces genetics // John Innes Foundation, Norwich, United Kingdom.-2000.-613 pages]. Плазмідну ДНК з трансформантів аналізують секвенуванням. Порівнюють рівні продукції ландоміцину А вихідним і рекомбінантним штамом S. cyanogenus S136. Штами висівають у колби об'ємом 0,3 л, що містять 30 мл середовища TSB та вирощують протягом 2 діб при 30 °C на орбітальній качалці (200 об/хв.). 1 мл попередньої культури інокулюють у колби об'ємом 0,5 л, що містять 200 мл середовища SG, г/л: соєвий пептон -10, глюкоза - 20, карбонат кальцію безводний - 2, хлорид кобальту — 0,001, та вирощують протягом 3 діб при 30 °C на орбітальній качалці (200 об/хв.). Потім доводять рН ферментаційного середовища до значення ≈ 7, і екстрагують рівним об'ємом етилацетату при 25 °C протягом 6 год. на поступально-зворотній качалці (170 коливань/хв.) Органічну фазу відділяють від ферментаційного середовища центрифугуванням (10 хв, 6000 об/хв.), і випаровують до сухого залишку у роторному випаровувачі. При проведенні досліду використовують: для визначення температури - ртутний термометр з похибкою показань ± 0,5 °C; об'єму рідин - мірні циліндри з похибкою показань ± 0,5 мл та лабораторні дозатори з похибкою показів ± 0,05-0,5 мкл; маси речовин - аналітичну вагу "Sartorius" з похибкою показань ± 0,00005 г та лабораторну вагу AXIS з похибкою показань ± 0,05 г; час - електронним годинником з похибкою показань ± 0,5 сек. Спектрофотометричний аналіз продукції ландоміцинів виконують на приладі NanoDrop 2, з похибкою вимірювання 0,01 %. Сухий залишок розчиняють у метанолі. Визначають концентрацію ландоміцину А у спиртовому розчині за допомогою визначення оптичної густини розчину при довжині хвилі λ=445 нм (оптимум поглинання ландоміцину А у видимій частині спектру) на спектрофотометрі NanoDrop. Отримані дані нормалізують відносно однакової кількості біомаси - сухої ваги і переводять у відсотки продукції, де 100 % - рівень продукції вихідного штаму. Експеримент повторюють тричі і визначають середнє значення, похибку та стандартне відхилення ς. Результати експериментів (Фіг. 2), свідчать про те, що рекомбінантний штам продукує приблизно у 5 разів більше ландоміцину А, що підтверджує отримання передбачуваного результату. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 35 Спосіб продукції ландоміцину А, який базують на уведенні додаткових копій гена-активатора, який відрізняється тим, що як ген-активатор використовують ген lanl S. cyanogenus S136 у складі інтегративного вектора pIJ6902. 3 UA 84651 U Комп’ютерна верстка А. Крижанівський Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Ostash Iryna Stepanivna, Ostash Bohdan Omelianovych, Fedorenko Viktor Oleksandrovych, Luzhetskyi Andrii Mykolaiovych

Автори російською

Осташ Ирина Степановна, Осташ Богдан Емельянович, Федоренко Виктор Александрович, Лужецкий Андрей Николаевич

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/04, C12Q 1/00

Мітки: продукції, ландоміцину, спосіб

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/6-84651-sposib-produkci-landomicinu-a.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб продукції ландоміцину а</a>

Подібні патенти