Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Штам дріжджів Candida famata - стабільний синтетик рибофлавіну (вітаміну В2) з підвищеною продуктивністю синтезу, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України за № IMB Y-5033, який призначений для мікробіологічного отримання вітаміну В2.

Текст

Штам дріжджів Candida famata - стабільний синтетик рибофлавіну (ві таміну В2) з підвищеною продуктивністю синтезу, депонований в Депозитарії Інституту мікробіології та вірусології НАН України за № IMB Y-5033, який призначений для мікробіологічного отримання вітаміну В2. (19) (21) u200804577 (22) 10.04.2008 (24) 11.08.2008 (46) 11.08.2008, Бюл.№ 15, 2008 р. (72) ВОРОНОВСЬКИЙ АНДРІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ, UA, ДМИТРУК КОСТЯНТИН ВАСИЛЬОВИЧ, U A, СИБІРНИЙ АНДРІЙ АНДРІЙОВИЧ, UA, ФЕДОРОВИЧ ДАРІЯ ВАСИЛІВНА, U A, ЯЦИШИН ВАЛЕНТИНА ЮРІЇВНА, U A 3 34554 кому пивному суслі концентрацією 7°Б при 30°С, мають овальну форму, розміром 1,3-7,6´3,18,4мкм, містяться поодиноко, парами, іноді короткими ланцюжками чи невеликими гронами. Іноді утворюють псевдоміцелій. На агаризованому середовищі колонії віком 7 діб округлі, діаметром 24мм, профіль припіднятий, краї нерівні складчасті, поверхня гладка блискуча, жовтуватого кольору. На скошеному агарі 3-х добовий штрих гладкий однорідний блискучий, жовтува того забарвлення. Клітини штаму С. famata IMB Y-5033 асимілюють сахарозу, глюкозу, фруктозу, мальтозу, арабінозу, целобіозу, рафінозу, меліцитозу, трегалозу, сорбозу, крохмаль, глутамінову кислоту, сорбітол, маннозу, манніт, гліцерин, дульцит, інозит; слабо ростуть на ксилозі, рамнозі, ксиліті, лактозі, лактаті, галактозі, етанолі; проте не використовують яблучну і янтарну кислоту. Клітини запропонованого штаму не ферментують сахарозу, глюкозу, галактозу, ксилозу, лактозу, крохмаль, трегалозу, рафінозу, целобіозу та меліцитозу. Як джерело азоту клітини використовують сульфат амонію, диамоній фосфат, сечовину, але не нітрат натрію. Штам С famata 1MB Y-5033 належить до облігатних аеробів. Штам росте при температурі 2532°С, оптимум температури становить 30°С; оптимум рН становить 6,0-9,0. За умов культивування у колбах на круговій качалці (200об/хв) у середовищі, що містить 2% глюкози, 1% пептону та 0,5% дріжджового екстракту протягом 4 діб запропонований штам нагромаджує близько 400мг РФ/л. Штам С. famata ІMB Y-5033 зберігається на агаризованому сусло-агарі в холодильнику. Клонується двічі на рік, відсівають 30-40 клонів. На 4-5 день вирощування відбирають клони за маркерною ознакою “здатність до надсинтезу рибофлавіну”. Для конструювання штаму використовують такі методи: полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), конструювання рекомбінантних плазмід, виділення плазмід з Escherichia соli, рестрикційний аналіз, електрофорез в агарозному гелі, трансформація Е. соlі методом електропорації, описані в [8]. Трансформацію С famata проводять, як описано в [9]. Виділення сумарної ДНК з трансформантів С. famata проводять як для S. cerevisiae [10]. Вміст РФ визначають флуориметрично на приладі ЕФЗМ. Ідентифікація гену, що забезпечує стабільність за ознакою “надсинтез рибофлавіну”, та отримання стабільного надсинтетика цього вітаміну ілюструється графічними матеріалами. На Фіг.1 зображена лінійна схема плазміди pТb (4.0 т.п.н.), де відкриту рамку трансляції гену ble Staphylococcus aureus позначено товстою сірою лінією; промотор власного гену TEF1 - товстим білим відрізком; бактерійна послідовність pUC57 - тонкою лінією; хвилястою лінією позначено хромосомну ДНК інсерційного штаму, товстою посмугованою лінією позначено ген SEF1; скорочення сайтів рестрикції: Н, HindIII; Sp, SphI; P, PstI; 4 Sl, SalI; Xb, XbaI; B, BamHI; Sm, SmaI; K, Kpnl Sc, Sacl R, EcoRl. На Фіг.2 зображено лінійну схему плазміди pTDhSEF1/DhIMH3 (13,1 т.п.н.), де відкриту рамку трансляції гену ble S. aureus позначено товстою сірою лінією; промотор гену TEF1 - товстим білим відрізком; товстою шахованою лінією позначено послідовність гену ІМН3 D. Hansenii; товстою посмугованою лінією - ген позитивної регуляції біосинтезу РФ SEF1 D. Hansenii; послідовність pUC57 - тонкою лінією; скорочення сайтів рестрикції: Н, HindIII; Sp, SphI P, PstI; Sl, SalI; Xb, XbaI; B, BamHI; Sm, SmaI; K, Kpnl Sc, Sacl R, EcoRl. На Фіг.3 зображено зміни протягом 3 днів вирощування продуктивності флавіногенезу вихідного штаму С. famata ATCC 20849 та сконструйованого штаму IMB Y-5033, де на осі абсцис відкладений час вирощування, а на осі ординат продуктивність флавіногенезу ( кількість утвореного РФ в перерахунку на мг біомаси). Штам дріжджів С. famata IMB Y-5033 - стабільний мутант-надсинтетик РФ отримують у декілька етапів. Етап 1. Ідентифікація регуляторних генів, що спричинюють нестабільність штаму С. famata ATCC 20849. Як інсерційну касету використовують інтегративну плазміду з геном ble Staphylococcus aureus, що забезпечує резистентність до флеоміцину (Фіг.1) [11]. Перед трансформацією інсерційну касету лінеаризують рестриктазою EcoRl. Трансформацію проводять методом електропорації. Для позитивної селекції трансформанти штаму С famata ATCC 20849 висівають на середовище з флеоміцином (5мг/л) та етанолом (1%) як джерелом вуглецю. Втрата здатності до надсинтезу РФ у ревертантів штаму ATCC 20849 завжди корелює з появою здатності рости в середовищі з етанолом, в той час як вихідний штам ATCC 20849 надсинтезує РФ та не росте на етанолі як єдиному джерелі вуглецю. Після серії трансформацій відбирають штам, що росте у середовищі з етанолом та виявляє резистентність до флеоміцину. Кількість копій касети в геномі відібраного штаму визначають за допомогою гібридизації за Саузерном. Для виділення касети з фланкуючими ділянками хромосомну ДНК інсерційного штаму обробляють рестриктазою HindIII, здійснюють самолігування та трансформують в Е. соli. З бактерійних трансформантів, що з'являються на середовищі з антибіотиком ампіциліном, виділяють плазмідну ДНК. Плазміда складається з вихідного вектора pUC57 та фрагменту геномної ДНК, що фланкує інсерційну касету. Послідовність нуклеотидів фланкуючої ділянки секвенують, використовуючи стандартні праймери (М13/pUC sequencing primer та М13/pUC reverse sequencing primer). Встановлено, що в ізольованого штаму касета розірвала ген SEF1, що кодує потенційний транскрипційний фактор (Фіг.1). Аналіз послідовності амінокислот виявив консервативний мотив, що відповідає за формування ДНК зв'язуючого домену Zn(2)-Cys(6), так званий цинковий палець. Він ідентифікований у багатьох дріжджових транскрипційних факторів. 5 34554 З метою отримання доказів інсерції касети саме в локус SEF1 проводять комплементацію мутації відповідним геном дикого типу. Для цього на основі плазміди pTDhSEF1 [11] сконструйовано плазміду pTDhSEF1/DhIMH3 розміром 10,1 т.п.н., яка містить новий домінантний селекційний маркер для С. famata - ген ІМНЗ Debaryomyces hansenii, що кодує інозинмонофосфат дегідрогеназу і визначає стійкість до мікофенольної кислоти (Фіг.2). Сконструйовану плазміду, що містить новий селе 6 кційний маркер (ген ІМНЗ) та ген SEF1D. hansenii, використовують для комплементації мутації інсерційного штаму АТСС 20849. У трансформантів інсерційного штаму АТСС 20849 плазмідою pTDhSEF1/DhINH3 втрачається здатність рости в середовищі з етанолом (табл.1), натомість відновлюється здатність до надсинтезу РФ, що свідчить про те, що ген SEF1 комплементує мутантний фенотип відібраного інсерційного штаму. Таблиця 1 Ріст на етанолі та здатність до утворення РФ різними штамами С. Famata Штам АТСС 20849 Dsef1 Ревертанти АТСС 20849 І II III IV Трансформанти Dsef1SEF1 Ревертанти АТСС 20849/ SEF1трансформанти І II III| IV Додатково отримано Трансформанти з геном SEF1 D. hansenii чотирьох незалежних спонтанних ревертантів АТСС 20849 (І, II, III, IV), які з'являються з високою частотою на середовищі з етанолом. У відповідних трансформантів спостерігається аналогічний фенотип: відновлення здатності до надсинтезу РФ, а також втрата здатності рости в середовищі з етанолом (табл.1). Таким чином, можна стверджувати, що ген SEF1 залучений у регуляцію біосинтезу РФ. Пошкодження цього гену у штаму АТСС 20849 призводить до втрати здатності надсинтезувати вітамін В2. Етап 2. Одержання рекомбінантних штамів С. famata і додатковою копією гену SEF1. Стабілізацію штаму продуцента РФ С. famata ATCC 20849 здійснюють шляхом введення в його геном додаткової копії гену SEF1 D. hansenii. З цією метою його трансформують плазмідою pTDhSEF1 (Фіг.2). Стабільність штамів оцінюють за нездатністю до росту на середовищі з етанолом. Рекомбінантні штами, отримані шляхом трансформації спонтанних ревертантів (І, II, III, IV) С. famata АТСС 20849, та отриманого інсерційного штаму з розірваним геном SEF1 плазмідою pTDh SEF1/DhINH3, не здатні до росту на середовищі, Ріст на етанолі ± + Утворення РФ + + + + + + + + + + що містить етанол як єдине джерело вуглецю (табл.1). Штам дріжджів С. famata IMB Y-5033 пройшов лабораторне випробування. Етап 3. Перевірка стабільності сконструйованого штаму та його здатності до надсинтезу РФ. Для перевірки стабільності штами висівають на чашки з середовищем YPD, через 1 добу засівають у 50мл цього ж середовища в колби об'ємом 100мл. Після вирощування протягом 1,5 доби клітини осаджують центрифугуванням, двічі промивають стерильною дистильованою водою і висівають на синтетичне середовище Беркгольдера, що містить 1% етанол як джерело вуглецю, в кількості 15´106 клітин на чашку. Через 10-14 днів підраховують кількість колоній на чашці і розраховують частоту реверсії. Відсутність росту на середовищі з етанолом чітко корелює зі здатністю до надсинтезу РФ. Як видно з таблиці 2, сконструйований штам С. famata IMB Y-5033 з додатковою копією гену SEF1, характеризується підвищенням стабільності приблизно в 3-4 рази порівняно з штамом АТСС 20849. 7 34554 8 Таблиця 2 Частота появи клонів, здатних до росту на етанолі у штамів С. famata ATCC 20849 і IMB Y-5033 Штам Частота реверсії 54´10-6 13,8´10-6 С. famata ATCC 20849 C. famata IMBY-5033 Для перевірки здатності до синтезу РФ штам С. famata IMB Y-5033 вирощують на чашці Петрі на агаризованому середовищі Беркгольдера із 0,5% дріжджовим екстрактом при 30°С протягом 1 доби. Отриману культуру висівають в колби (300мл) із рідким середовищем Беркгольдера, що містить 0,5% дріжджовий екстракт (50мл в колбі), витримують протягом 1-6 діб на круговій качалці (швидкість обертання 200об./хв) при 28°С після чого визначають вміст РФ в культуральній рідині. Результати досліджень наведені в табл.3. Таблиця 3 Динаміка продукування РФ штамом С. famata lMB Y-5033 Час росту, діб Вміст РФ, мг/л 1 2 3 4 5 6 25,7±2,0 401,4±32,2 416,7±35,0 455,7±45,6 523,5±40,1 524,2±23,3 Продукція РФ сильно зростає після 1 доби культивування і досягає максимуму на 5 добу. Продуктивність флавіногенезу (кількість утвореного РФ в перерахунку на одиницю біомаси) сконструйованого штаму С. famata IMB Y-5033 зростає у 3-4 рази порівняно вихідним штамом Candida famata ATCC 20849 (Фіг.3). Флавіногенна активність штаму С. famata IMB Y-5033 і вихідного штаму Candida famata ATCC 20849, вирощених на середовищах різного складу, представлена в табл.4. Культури обох штамів вирощують протягом 4-5 діб при 28°С у рідких синтетичних середовищах різного складу: СБ – цукрово - мінеральне середовище, СБ+ДЕ - те ж + 0,5% дріжджового екстракту. Таблиця 4 Флавіногенна активність штамів Candida famata IMB Y-5033 та ATCC 20849 Тривалість вирощування, діб 4 5 Вміст РФ (мг/л) в к ультуральному середовищі IMB Y-5033 ATCC 20849 СБ СБ+ДЕ СБ СБ+ДЕ 112,9±10,6 445,7±40,6 94,7±5,4 295,6±19,5 177,0±12,1 523,5±40,1 157,0±12,1 400,4±32,0 За даними табл.4 штам С. famata IMB Y-5033 відрізняється від штаму ATCC 20849 більшою флавіногенною активністю на обидва використаних середовищах. Сконструйований штам С. famata IMB Y-5033 може бути використаний у виробництві як набагато ефективніший продуцент РФ завдяки підвищеній флавіногенній активності та високій стабільності за ознакою “надсинтез РФ”. Джерела інформації: 1. Березовский В.М. Химия витаминов. -М.: Пищевая пром., 1973. -632с. 2. Stahmann K.P. et al. Microbiol. and Biotechnol. -2000. -Vol.53, N5 -P.509-516. 3. Патент США №3 433707, опубл. 18.03.1969. 4. Патент США №009822, опубл 15.12.1988. 5. Патент США №811234, опубл. 20.12.1985. 6. Патент США №5164303, опубл. 17.11.1992. 7. Патент США №5231007, опубл. 27.07.1993. 8. Sambrook J., Fritsh E. F., Maniatis Т. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 1989. 9. Voronovsky A.A. et al. //FEMS Yeast Research. -2002. -Vol.2. -P.381-388. 10. Wach A., Pick H., Philipsen P. In: Molecular Genetics of Yeast. A Practical Approach (Johnston, J.R., Ed.), IRL Press, Oxford. -1994. -P.1-16. 11. Dmytruk K.V. et al. //Curr Genet. -2006. Vol.50, N3. -P.183-191. 9 34554 10 11 Комп’ютерна в ерстка Л.Литв иненко 34554 Підписне 12 Тираж 28 прим. Міністерство осв іт и і науки України Держав ний департамент інтелектуальної в ласності, вул. Урицького, 45, м. Київ , МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислов ої в ласності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Strain of the yeast candida famata imb y-5033 -stabile producer of riboflavin vitamin b2)

Автори англійською

Voronovskyi Andrii Yaroslavovych, Dmytruk Kostiantyn Vasyliovych, Sybirnyi Andrii Andriiovych, Fedorovych Dariia Vasylivna, Yatsyshyn Valentyna Yuriivna

Назва патенту російською

Штамм дрожжей candida famata imb y-5033 - стабильный продуцент рибофлавина (витамина b2)

Автори російською

Вороновский Андрей Ярославович, Дмитрук Константин Васильевич, Сибирный Андрей Андреевич, Федорович Дария Васильевна, Яцишин Валентина Юрьевна

МПК / Мітки

МПК: C12N 1/19

Мітки: дріжджів, famata, рибофлавіну, штам, вітаміну, y-5033, продуцент, candida, стабільний

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/6-34554-shtam-drizhdzhiv-candida-famata-imb-y-5033-stabilnijj-producent-riboflavinu-vitaminu-b2.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Штам дріжджів candida famata imb y-5033 – стабільний продуцент рибофлавіну (вітаміну b2)</a>

Подібні патенти