Спосіб визначення активності лектинів

Реферат: Винахід стосується способу визначення активності лектинів, який включає відбір крові з крайової вени вуха кроля, потім здійснюють відмивання еритроцитів у 0,9 % розчині хлориду натрію та центрифугування отриманої суспензії, отриманий осад еритроцитів трипсинізують та відмивають еритроцити кроля шляхом гомогенізації у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8, центрифугують отриману суспензію і готують з осаду 2 % суспензію еритроцитів на фосфатно UA 108242 C2 (12) UA 108242 C2 сольовому буфері при рН 6,8, а двократне розведення вихідного розчину лектину здійснюють у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8, встановлюють титр розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією еритроцитів кроля, визначають концентрацію білка в розчині лектину, розраховують коефіцієнт лектинової активності за формулою: K LA  1/ C  120  1/ T  2 , де -1 -1 KLA - коефіцієнт активності лектинів, мкг /мл ; C - концентрація, мкг/мл; T - титр аглютинації, безрозмірна величина; 120 - ступінь розведення, разів; 1 ; 2 - постійні коефіцієнти, безрозмірна величина; і за значенням коефіцієнта лектинової активності визнають активність лектинів. UA 108242 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Спосіб належить до біології, а саме до фізіології та біохімії рослин, і може бути використаний для встановлення фізіологічної ролі лектиноподібних білків у процесах життєдіяльності рослинного організму. Відомий спосіб визначення активності лектинів [Луцик М.Д., Панасюк В.М., Луцик А.Д. Лектины. - Львов: Вища школа, 1981. - 156 с, - С. 17-18], що включає: - відбір венозної крові людини; - відмивання еритроцитів з крові шляхом їх гомогенізації у 0,9 % розчині та центрифугування; - трипсинізацію еритроцитів; - відмивання трипсинізованих еритроцитів шляхом їх гомогенізації у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8; - приготування 2 % суспензії трипсинізованих еритроцитів у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8; - двократне розведення вихідного розчину лектину фосфатно-сольовим буфером при рН 6,8; - установлення титру розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією трипсинізованих еритроцитів людини; - визначення концентрації білка в розчині лектину; - визначення активності лектинів шляхом установлення мінімальної концентрації, за якої буде спостерігатися реакція гемаглютинації. Недоліками цього способу є його складність, висока вартість, недостатня чутливість, необхідність використання значної кількості рослинної сировини для аналізу та еритроцитів крові людини з наперед визначеною за системою АВО групою, тому що більшість рослинних лектинів є групоспецифічними. Спільними ознаками з рішенням, що заявляється, є: - відбір венозної крові; - відмивання еритроцитів з крові шляхом їх гомогенізації у 0,9 % розчині та центрифугування; - трипсинізація еритроцитів; - відмивання трипсинізованих еритроцитів шляхом їх гомогенізації у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8; - приготування 2 % суспензії трипсинізованих еритроцитів на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8; - двократне розведення вихідного розчину пектину фосфатно-сольовим буфером при рН 6,8; - установлення титру розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією трипсинізованих еритроцитів; - визначення концентрації білка в розчині лектину; - визначення активності лектинів шляхом установлення мінімальної концентрації, за якої буде спостерігатися реакція гемаглютинації. Відомий спосіб визначення активності лектинів [Антонюк В.А. Использование эритроцитов, хранившихся при умеренно низких температурах, для поиска лектинов и оценки их активности // Проблемы криобиологии. - 1994, № 3. - С. 50-55], що включає: - відбір крові з крайової вени вуха кроля; - відмивання еритроцитів кроля шляхом їх гомогенізації у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8 та центрифугування; - приготування 2 % суспензії еритроцитів кроля на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8; - двократне розведення вихідного розчину лектину фосфатно-сольовим буфером при рН 6,8; - установлення титру розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією еритроцитів кроля; - визначення концентрації білка в розчині лектину; - визначення активності лектинів шляхом установлення мінімальної концентрації, за якої буде спостерігатися реакція гемаглютинації. Недоліком цього способу є його недостатня чутливість, що зумовлено використанням як тест-об'єкта нативних еритроцитів кроля, а також значна кількість рослинної сировини, необхідної для аналізу. Спільними ознаками з рішенням, що заявляється, є: - відбір крові з крайової вени вуха кроля; - відмивання еритроцитів кроля та наступне центрифугування; 1 UA 108242 C2 - приготування 2 % суспензії еритроцитів кроля на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8; - двократне розведення вихідного розчину лектину фосфатно-сольовим буфером при рН 6,8; 5 10 15 20 25 30 35 - установлення титру розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією еритроцитів кроля; - визначення концентрації білка в розчині лектину; - визначення активності лектинів шляхом установлення мінімальної концентрації, за якої буде спостерігатися реакція гемаглютинації. Відомо [Антонюк В.О. Лектини та їх сировинні джерела. - Львів: Вид-во ПП "Кварт", 2005. 554 с. - С. 22-27], що для тестування лектинів різного походження еритроцити кроля є більш придатними тому, що мають більшу чутливість у порівнянні з еритроцитами людини. Рецептори еритроцитів кроля містять багато манози та не містять на поверхні полісахаридної "оболонки", яка заважає проходженню реакції гемаглютинації. Тому як тест-об'єкт при визначенні гемаглютинуючої активності для багатьох рослинних лектинів, особливо для представників родин бобових та злакових, які відносяться до групи манозоспецифічних лектинів, еритроцити кроля є більш придатними. В основу винаходу поставлено задачу розробити спосіб визначення активності лектинів, який шляхом використання як тест-об'єкта трипсинізованих еритроцитів кроля дозволяє підвищити чутливість способу та зменшити кількість рослинного матеріалу, необхідного для аналізу. Суттєвими ознаками рішення, що заявляється, є: - відбір крові з крайової вени вуха кроля; - відмивання еритроцитів кроля шляхом їх гомогенізації у 0,9 % розчині хлориду натрію та центрифугування; - трипсинізація еритроцитів кроля; - відмивання еритроцитів кроля шляхом їх гомогенізації у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8 та центрифугування; - приготування 2 % суспензії еритроцитів кроля на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8; - двократне розведення вихідного розчину лектину фосфатно-сольовим буфером при рН 6,8; - установлення титру розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією еритроцитів кроля; - визначення концентрації білка в розчині лектину; - розрахунок коефіцієнта активності лектинів за формулою: KLA  1/ C  120   1/ T  2 , (1) де KLA - коефіцієнт активності лектинів, мкг-1/мл-1; C - концентрація, мкг/мл; 40 45 50 55 T - титр аглютинації, безрозмірна величина; 120 - ступінь розведення, разів; 1 ; 2 - постійні коефіцієнти, безрозмірна величина; - визначення активності лектинів за значенням цього показника. Відмінними від прототипу ознаками є: - відмивання еритроцитів кроля шляхом їх гомогенізації у 0,9 % розчині хлориду натрію та центрифугування; - трипсинізація еритроцитів кроля; - розрахунок коефіцієнта активності лектинів за формулою 1. - визначення активності лектинів за значенням цього показника. Спосіб здійснюють таким чином. З крайової вени вуха кроля здійснюють забір крові, з якої відмивають еритроцити шляхом їх гомогенізації у 0,9 % розчині хлориду натрію та центрифугують. Проводять трипсинізацію еритроцитів кроля шляхом додавання розчину трипсину до осаду еритроцитів та залишають при температурі 37 °C на 40-50 хв. для збільшення їх чутливості. Після чого трипсинізовані еритроцити кроля відмивають шляхом їх гомогенізації у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8 та центрифугують отриману суспензію. У результаті еритроцити утворюють осад, з якого готують 2 % суспензію еритроцитів кроля на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8. Здійснюють двократне розведення вихідного розчину лектину фосфатно-сольовим буфером при рН 6,8 та визначають титр його розведення шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією еритроцитів кроля. Реакцію гемаглютинації проводять у планшетах з U-подібними 2 UA 108242 C2 5 10 лунками. Результати оцінюють візуально через 60-120 хв: за наявності аглютинації еритроцити рівномірно розподіляються по дну лунки планшета у вигляді "парасольки", а при відсутності концентруються у центрі дна у вигляді "ґудзика". Кількість білка визначають спектрофотометричним методом - вимірюють оптичну густину розчину на спектрофотометрі при двох довжинах хвилі: 260 та 280 нм, кількість білка розраховують за формулою (2) [Практикум по биохимии / под ред. С.Е. Северина и Г.А. Соловьёвой. - [2-е изд.]. - М.: МГУ, 1989.-509 с, С. 83]. C  145  A280  0,74  A260 , (2) , де C - концентрація білка в розчині, мг/мл A 280 - оптична густина при λ = 280 нм, безрозмірна величина; A 260 - оптична густина при λ = 260 нм, безрозмірна величина; 145 та 0,74 - постійні коефіцієнти. , 15 20 25 30 35 40 45 50 Розраховують коефіцієнт активності лектинів за формулою 1 та за його значенням визначають активність лектинів як мінімальну концентрацію, при якій спостерігається реакція гемаглютинації. Приклад конкретного виконання З крайової вени вуха кроля відбирали 5 мл крові за допомогою стерильного шприца, обробленого 0,5 мл гепарину для перешкоджання згортання крові. Проводили відмивання еритроцитів: до 2 мл зібраної крові додавали 8 мл 0,9 % розчину хлориду натрію та центрифугували отриману суспензію протягом 10 хв. при 1000 g, при цьому еритроцити випадали в осад. Надосадову рідину зливали, а осад промивали у 10 мл 0,9 % розчину хлориду натрію та знову центрифугували отриману суспензію протягом 10 хв. при 1000 g. Таке промивання проводили 3-4 рази до появи безбарвної надосадової рідини після центрифугування. Отриманий осад еритроцитів кроля трипсинізували для збільшення їх чутливості до реакції гемаглютинації, для чого до 1 мл еритроцитів додавали 2 мл розчину трипсину в концентрації 1 мг/мл та залишали в термостаті при 37 °C на 40-50 хв. Трипсинізовані еритроцити відмивали у фосфатно-сольовому буферному розчині при рН 6,8. З трипсинізованих еритроцитів кроля готували 2 % суспензію на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8:0,5 мл суспензії еритроцитів кроля поміщали у мірну колбу на 25 мл, доводили до мітки буфером та збовтували. З листя льону олійного сортів Антарес, Ціан та Айсберг екстрагували лектиноподібні білки 0,02 М калій-фосфатним буфером при рН 6,8 з додаванням 0,36 М сахарози, 0,1 М аскорбінової кислоти та 0,01 М ЕДТА. Титр розчинів лектиноподібних білків визначали за допомогою реакції гемаглютинації, яку проводили у планшетах з U-подібними лунками: у кожну лунку планшета вносили по 10 мкл суспензії еритроцитів та розчину лектину. Для визначення титру розчину лектиноподібних білків готували серію його дворазових послідовних розведень: у першу лунку вносили 20 мкл розчину лектину і 10 мкл з них переносили у наступні, де знаходилося по 10 мкл фізіологічного розчину. При цьому титр розведення у першій лунці складав 1:0, у другій - 1:1, у третій - 1:2, у четвертій - 1:4, у п'ятій - 1:8 і т. ін. Результати оцінювали візуально за 60-120 хв.: за наявності аглютинації еритроцити рівномірно розподілялися по дну лунки планшета у вигляді "парасольки", а при відсутності - концентрувалися в центрі дна у вигляді "ґудзика". Для визначення концентрації білка 0,25 мл розчину лектину розводили у 120 разів доводили об'єм розчину до 30 мл у зв'язку з тим, що метод визначення має високий поріг чутливості. Концентрацію білка визначали методом Варбурга-Крістіана: вимірювали оптичну густину розчину на спектрофотометрі СФ-46 при довжині хвилі 260 на 280 нм та за формулою (2) визначали концентрацію білка в розчині. Розраховували коефіцієнт активності лектинів за формулою 1 та за його значенням визначали активність лектинів. Для порівняння як тест-об'єкт використовували еритроцити різного походження: людини з різною груповою належністю (І, II, III та IV групи крові) та кроля. Усі еритроцити піддавали трипсинізації для збільшення рівня чутливості до лектинів. Результати наведено у таблиці. 3 UA 108242 C2 Таблиця Титр аглютинації лектинів льону олійного різних генотипів залежно від тест-об'єкта № п/п 1. 2. 3. 5 10 15 генотип льону Антарес Ціан Айсберг титр аглютинації еритроцити людини, група крові І II III IV 1:2 1:16 1:1 1:8 1:1 1:8 Еритроцити кроля 1:16254 1:8128 1:8128 У результаті досліджень було встановлено, що лектини льону олійного є специфічними до IV групи крові людини, оскільки титр аглютинації є найвищим при використанні еритроцитів людини саме цієї групи крові. Залежно від генотипу льону він складає 1:8-1:16. При використанні еритроцитів І та II груп крові аглютинація взагалі не спостерігалася, а при використанні еритроцитів III групи складала 1:1-1:2. Такий показник активності є безумовно слабким та може виявитися недостатньо специфічним для проведення порівняльного аналізу. Найчутливішими до лектинів льону олійного виявилися трипсинізовані еритроцити кроля, титр аглютинації при використанні яких як мінімум у 1000 разів вищий, ніж при використанні еритроцитів людини IV групи та становить від 1:8128 до 1:16254. Обрані для аналізу генотипи льону мають схожі показники лектинової активності, а їх відмінності мають однаковий характер при використанні як еритроцитів IV групи крові людини, так і кроля. Запропонований спосіб дозволяє значно підвищити чутливість способу та знизити кількість необхідного для аналізу рослинного матеріалу. ФОРМУЛАВИНАХОДУ 20 25 30 35 40 Спосіб визначення активності лектинів, який включає відбір крові з крайової вени вуха кроля, відмивання еритроцитів кроля та центрифугування, приготування з них 2 % суспензії на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8, здійснення двократного розведення вихідного розчину, установлення титру розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією еритроцитів кроля, визначення концентрації білка в розчині лектину, визначення активності лектинів шляхом установлення мінімальної концентрації, за якої буде спостерігатися реакція гемаглютинації, який відрізняється тим, що після відбору крові з крайової вени вуха кроля, здійснюють відмивання еритроцитів у 0,9 % розчині хлориду натрію та центрифугування отриманої суспензії, отриманий осад еритроцитів трипсинізують та відмивають еритроцити кроля шляхом гомогенізації у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8, центрифугують отриману суспензію і готують з осаду 2 % суспензію еритроцитів на фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8, а двократне розведення вихідного розчину лектину здійснюють у фосфатно-сольовому буфері при рН 6,8, встановлюють титр розведення розчину лектину шляхом проведення реакції гемаглютинації з 2 % суспензією еритроцитів кроля, визначають концентрацію білка в розчині лектину, розраховують коефіцієнт лектинової активності за формулою: K LA  1/ C  120  1/ T  2 , (1) де -1 -1 KLA - коефіцієнт активності лектинів, мкг /мл ; C - концентрація, мкг/мл; T - титр аглютинації, безрозмірна величина; 120 - ступінь розведення, разів; 1 ; 2 - постійні коефіцієнти, безрозмірна величина; і за значенням коефіцієнта лектинової активності визнають активність лектинів. Комп’ютерна верстка Л. Бурлак Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4