Спосіб визначення морфології пластидного апарату рослин

Реферат: Спосіб визначення морфології пластидного апарату рослин включає: відбір проби, приготування препаратів, дослідження їх під мікроскопом, вимірювання параметрів хлоропластів, визначення за їх значенням морфології пластидного апарату рослин. Як пробу використовують ціле листя рослини, фіксують його у суміші Темпера та виготовляють парафінові мікротомні препарати. UA 106144 U (12) UA 106144 U UA 106144 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біології, а саме до фізіології та біохімії рослин, та може бути використаний у генетиці та селекції рослин. Відомий спосіб визначення морфології пластидного апарату рослин [Паушева З.П. Практикум по цитологии растений / З.П. Паушева. – М.: Агропромиздат, 1988. - 271 с., С. 56-58], який включає: відбір проби, її фіксування, виготовлення парафінових мікротомних препаратів, їх фарбування, зневоднення етиловим спиртом, заміщення в них спирту на ксилол, поміщення препаратів у канадський бальзам, просушування та дослідження їх під мікроскопом, визначення морфології хлоропластів рослин. Недоліком цього способу є дослідження хлоропластів рослин лише після додаткового фарбування препаратів. Ознаками, спільними з рішенням, що заявляється, є: - відбір проби: - фіксування проби; - виготовлення парафінових мікротомних препаратів; - дослідження препаратів під мікроскопом; - визначення морфології хлоропластів рослин. Найближчим аналогом є спосіб визначення морфології пластидного апарату рослин [Определение мезоструктурных характеристик фотосинтетического аппарата растений: руководство к лабораторным занятиям большого спецпрактикума по физиологии и биохимии растений / [составители Р.А. Борзенкова, Е.В. Храмцова]. - Екатеринбург: Издательство Уральского университета, 2006. - 27 с., С. 15], який включає відбір проби з листя рослин за допомогою пробочних свердел з відомим діаметром; приготування тимчасових препаратів, для чого проводять мацерацію тканин шляхом додавання до проби 0,5-1,0 н НСl; витримування на водяній бані при температурі 80-100 °C протягом 10-30 хв. та розмішування їх до отримання однорідної суспензії; дослідження препаратів під мікроскопом, вимірювання лінійних розмірів хлоропластів, визначення за їх значенням морфології пластидного апарату рослин. Недоліками цього способу є висока вірогідність руйнування хлоропластів під час приготування і зберігання тимчасових препаратів та неможливість довготривалого зберігання проби. Ознаками, спільними з рішенням, є відбір проби, приготування препаратів, дослідження їх під мікроскопом, вимірювання лінійних розмірів хлоропластів, визначення за їх значенням морфології пластидного апарату рослин. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб визначення морфології пластидного апарату рослин. Поставлена задача вирішується тим, що спосіб визначення морфології пластидного апарату рослин включає відбір і фіксацію листя рослин у суміші Темпера та виготовлення парафінових мікротомних препаратів дозволяє вже на ранніх етапах розвитку рослин вимірювати лінійні розміри хлоропластів, визначати за їх значенням морфологічні особливості пластидного апарату рослин; фотографувати та зберігати отримані результати; створювати їх електронну базу. Суттєвими ознаками способу є: - відбір проби цілого листя рослин; - фіксування проби в суміші Темпера; - виготовлення парафінових мікротомних препаратів; - дослідження їх під мікроскопом: - вимірювання лінійних розмірів хлоропластів: - визначення за їх значенням морфології пластидного апарату. Відмінними від прототипу ознаками є використання як проби цілого листя рослин, фіксування в суміші Темпера, виготовлення парафінових мікротомних препаратів. Заявлений спосіб здійснюють так: Відбирають проби (листя рослин) та фіксують у суміші Темпера (0,2 % хлорної міді, 0,2 % азотнокислої міді та 1 % розчин фенолу), яка дозволяє зберігати забарвлення хлоропластів [Барыкина Р.П. Справочник по ботанической микротехнике. Основы и методы / Р.П. Барыкина, Т.Д. Веселова, А.Г. Девятов, Х.Х. Джалилова, Г.М. Ильина, Н.В. Чубатова. - М.: МГУ, 2004-312 с., С. 28]. Виготовляють з них парафінові мікротомні препарати, для чого промивають проби у дистильованій воді, зневоднюють їх, послідовно просочують хлороформом та парафіном, заливають в парафін та вплавляють в парафінові блоки, що можуть тривало зберігатися, з яких роблять мікротомні зрізи, наклеюють їх на предметні скельця, просушують препарати, послідовно видаляють зі зрізів: парафін - ксилолом, ксилол - спиртом; спирт - дистильованою водою. Після чого поперечні зрізи листя поміщають у гліцерин, накривають покривними 1 UA 106144 U 5 10 15 20 25 30 35 скельцями та досліджують під мікроскопом. Спосіб дозволяє вимірювати лінійні розміри хлоропластів та визначати за їх значенням морфологічні особливості, фотографувати та зберігати отримані результати; створювати їх електронну базу. Приклад конкретного виконання. Для дослідження були використані рослини [Генетическая коллекция вида Linum usitatissimum L.: каталог / [сост. Лях В.А., Мищенко Л.Ю., Полякова И.А.]. - Запорожье, 2003. - 60 с., С. 17, 19], вирощені в польових умовах: - сорт льону олійного Циан; - мутантні лінії на його основі: - М-80 (viridis); - М-81 (xantha). Для аналізу пластидного апарату у всіх ліній, вирощених у польових умовах, на стадії бутонізації відбирали листя та витримували в 10-кратному об'ємі фіксатора - суміші Темпера (0,2 % хлорної міді, 0,2 % азотнокислої міді та 1 % розчин фенолу) протягом 10 днів у темряві, після чого пробу промивали великою кількістю дистильованої води. Здійснювали зневоднення проби, для чого проводили рослинний матеріал через 12 змін спиртів: по дві зміни відповідно 20 %, 40 %, 60 %, 70 %, 96 % та 100 % спирту. У кожній зміні спиртів пробу витримували по 1 годині. Потім проводили просвітлення проби, для чого пробу послідовно витримували по 1 годині в кожному з таких розчинів: спирт з хлороформом у співвідношенні 3:1; 1:1; 1:3 та двох змінах хлороформу. Пробу залишали в хлороформі, а зверху нашаровували парафін, витримували в термостаті при температурі 55-57 °C до повного випаровування хлороформу (заливка в парафін). Потім виготовляли "парафінові пряники", для чого парафін разом із пробою виливали на пласку поверхню та залишали вистигати; та вплавляли їх у парафінові блоки (5×5×5 см). З парафінових блоків виготовляли серії зрізів товщиною 10 мкм, поміщали їх на воду з температурою 40 °C для розправлення. Зрізи наклеювали на предметні скельця. Як клей використовували суміш білка курячого яйця з гліцерином (у співвідношенні 1:2) з додаванням антисептика (тимолу чи фенолу). Залишали їх у термостаті при 40 °C для випаровування зайвої води. Проводили депарафінування зрізів, для цього скельця з наклеєними зрізами промивали у трьох змінах ксилолу, двох змінах 100 % спирту, одній зміні 75 % спирту та одній 50 % спирту та трьох змінах дистильованої води. Час перебування у кожній зміні - 20-30 хв. Потім поміщали зрізи у гліцерин та накривали покривними скельцями. Розміри хлоропластів (довжину й ширину) вимірювали стандартними методами за допомогою окуляр-мікрометра. При вимірюванні хлоропластів на п'яти зрізах у тридцятикратному повторенні в кожному зразку стандартними методами було виявлено, що хлоропласти мутантних зразків за лінійними параметрами значно відрізнялися від хлоропластів контрольних рослин (таблиця). Отримані препарати фотографували за допомогою тринокулярного мікроскопа MS-3330 і окулярної камери МА88-500 при збільшенні ×640 і ×1600 разів. 40 Таблиця Морфологія пластид Генотип льону олійного Циан (контроль) М-80 (viridis) М-81 (xantha) Параметри хлоропластів Довжина, мкм Ширина, мкм 5,4±0,22 2,3±0,11 2,4±0,4** 1,8±0,14* 4,2±0,26* 0,8±0,27** Примітка: *,** - відмінності від контролю суттєві при Р < 0,01; 0,001. 45 На фіг. 1 зображено хлоропласти контрольного зразка Циан. На фіг. 2 зображено хлоропласти хлорофільного мутанта М-80 (viridis). На фіг. 3 зображено хлоропласти хлорофільного мутанта М-81 (xantha). Хлоропласти мутантних ліній мали менші розміри в порівнянні з контрольним зразком. Хлоропласти контрольного зразка Циан мали довжину - 5,4 мкм та ширину - 2,3 мкм. У хлорофільного мутанта М-80 хлоропласти мали менші розміри, ніж у контролю. У хлорофільного мутанта М-81 хлоропласти були значно вужчі порівняно з контролем. Хлоропласти усіх досліджуваних рослин розміщувались по периметру клітини. 2 UA 106144 U 5 10 15 Отримані дані вказують, що морфологічні характеристики хлоропластів змінювалися залежно від типу хлорофільних змін рослини. Найбільші зміни в морфології хлоропластів спостерігалися у хлорофільного мутанта типу xantha. У мутанта типу viridis зменшення лінійних розмірів хлоропластів було менш вираженим. Заявлений спосіб дозволяє визначати морфологію пластидного апарату вже на ранніх етапах розвитку рослини, досліджувати лінійні розміри хлоропластів та їх морфологічні особливості; фотографувати та зберігати отримані результати, він є простим та не потребує високовартісного обладнання. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб визначення морфології пластидного апарату рослин, що включає: відбір проби, приготування препаратів, дослідження їх під мікроскопом, вимірювання параметрів хлоропластів, визначення за їх значенням морфології пластидного апарату рослин, який відрізняється тим, що як пробу використовують ціле листя рослини, фіксують його у суміші Темпера та виготовляють парафінові мікротомні препарати. 3 UA 106144 U Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 4