Кон’югати антагоніста пептиду аналога бомбезину

Реферат: Для забезпечення діагностичного й терапевтичного лікарського засобу, заявляється кон'югат антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має загальну формулу (І), (І) [А-(В)n]x-С, UA 103314 C2 (12) UA 103314 C2 де А являє собою хелатор металу, що містить принаймні один радіонуклідний метал, В являє собою спейсер, зв'язаний з N-кінцем С, або ковалентний зв'язок, і С являє собою антагоніст пептиду аналога бомбезину, що має послідовність, де додатково x являє собою ціле число від 1 до 3 і n являє собою ціле число від 1 до 6. 0 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Винахід належить до терапевтичних або діагностичних/візуалізуючих радіофармацевтичних засобів, препарату і їх застосування, де терапевтичні або діагностичні радіофармацевтичні засоби визначаються як зв’язувальні фрагменти, які мають спорідненість до й здатні зв'язуватися з рецепторами бомбезину й більш переважно з рецептором пептиду, що вивільняє гастрин (GRP). Зв’язувальні фрагменти мітять за допомогою метал-комплексоутворювальної групи для ізотопів, які випромінюють альфа-, бета-, гамма-промені і позитрони. Застосування охоплює обробку суб'єкта, що має новоутворення, що включає стадію введення суб'єктові ефективної кількості терапевтичного радіофармацевтичного засобу, що має метал, хелатований з хелатоутворювальною групою, приєднаною до фрагмента, здатного зв'язуватися з рецепторами бомбезину й, більш переважно, з рецептором пептиду, що вивільняє гастрин (GRP), який понадекспресується на пухлинних клітинах. Застосування включає діагностування або візуалізацію суб'єкта, що має новоутворення, використовуючи діагностичний/візуалізуючий радіофармацевтичний засіб, що має метал, хелатований з хелатоутворювальною групою, приєднаною до фрагмента, здатного зв'язуватися з рецепторами бомбезину й, більш переважно, з рецептором пептиду, що вивільняє гастрин (GRP), який понадекспресується на пухлинних клітинах. Спосіб включає створення терапевтичної або діагностичної сполуки зі сполуки-попередника, що включає метал-хелатоутворювальну групу, ковалентно зв'язану із фрагментом, здатним зв'язуватися з рецепторами бомбезину й, більш переважно, з рецептором пептиду, що вивільняє гастрин (GRP). Передумови створення винаходу При створенні ефективного радіофармацевтичного індикатора для застосування як діагностичний засіб, є надзвичайно важливим, щоб лікарські засоби мали підходящі націлювальні і фармакокінематичні властивості в умовах in vivo. Fritzberg та ін. (1992, J. Nucl. Med., 33:394) додатково вказують на те, що радіонуклідна хімія й асоційовані зв'язування потребують оптимізації приєднання й мічення хімічних модифікацій носія біологічної молекули. Отже, тип радіонукліда, тип біомолекули й спосіб, використовуваний для їх зв'язування один з одним, можуть виявляти дуже важливий вплив на властивості радіоактивного індикатора. Пептиди є біомолекулами, які приймають надзвичайно важливу участь у багатьох фізіологічних процесах, включаючи дії як нейромедіатори, гормони і антибіотики. У дослідженнях була показана їх значимість у таких галузях, як нейробіологія, імунологія, фармакологія й клітинна біологія. Деякі пептиди можуть діяти як хімічний месенджер. Вони зв'язуються з рецептором на поверхні клітини-мішені й біологічна дія ліганду передається в цільову тканину. Отже, властивість зв'язування ліганду зі специфічним рецептором може використовуватися шляхом мічення ліганду за допомогою радіонукліда. Теоретично, висока афінність ліганду до рецептора полегшує утримання радіоактивно міченого ліганду в тканинах, які експресують рецептор. Проте, зараз усе ще проводяться дослідження щодо того, які пептиди можуть бути ефективно мічені й у яких умовах слід вводити мітку. Добре відомо, що специфічність рецептора до пептиду ліганду може змінюватися при здійсненні хімічної реакції. Тому необхідно визначити оптимальну пептидну конструкцію. Пухлини понадекспресують рецептори різних типів, з якими специфічно зв'язуються пептиди. У наступних публікаціях Boerman та ін., Seminar in Nuclear Medicine, 2000, 30(3), 195); Reubi та ін. J. Nucl. Med., 2005, 46, (доп. 1) 67S; Reubi, J.C., Endocrine Reviews, 2003, 24(4), 389 наведений неповний перелік пептидів, які специфічно зв'язуються з рецепторами поверхні клітин у новоутвореннях, тобто, соматостатин, вазоактивний пептид кишечнику (VIP), бомбезин, що зв'язується з рецептором пептиду, що вивільняє гастрин (GRP), гастрин, холецистокінін (CCK) і кальцитонін. Потенційна корисність специфічних до рецепторів пептидів, мічених металом, для сцинтиграфічної візуалізації й променевої терапії пояснюється на прикладах аналогів 111 соматостатину, наприклад, In-DTPA кон’югований Октреотид, дозволений FDA діагностичний візуалізуючий засіб, Octreoscan®, який випускається Covidien у США (Lowbertz та ін., Seminars in Oncology, 1994, 1) і Reubi та ін., J. Nucl. Med., 2005, 46, 67S-75S і посилання, наведених у цих джерелах, відповідно. Октреотид і його аналоги ковалентно зв'язані з візуалізуючими ізотопами 99m 111 68 105 186/188 153 деяких металів ( Tc, In, Ga) і з терапевтичними ізотопами металів ( Rh, Re, Sm, 90 166 177 Y, Ho, Lu). Кон’югати, мічені металами, специфічно зв'язуються з рецептором, і при зв'язуванні з рецептором, конструкція інтерналізується рецептором і мічені металом специфічні для рецептора пептиди або їх метаболіти захоплюються клітинами-мішенями. Вищевказаний принцип надалі поширюється на пептиди, авідні до рецептора GRP (пептиди, які мають високу афінність до рецептора), у яких для сцинтиграфічної візуалізації й променевої терапії використовуються агоністи бомбезину, кон’юговані з металами. (Smith та ін., Anticancer Res,, 23 (2003), 63–70; Baidoo та ін., Bioconjug. Chem., 9 (1998), 218–225; Gali та ін., Bioconjug. 1 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Chem., 12 (2001), 354–363; Smith та ін., Bioconjug. Chem., 14 (2003), 93–102, Cancer Res., 63 (2003), 4082–4088; Rogers та ін., In, M. Nicolini і U. Mazzi, Editors, Technetium, rhenium and other metals in chemistry and nuclear medicine, SGE Editoriali, Italy (1999), 519–525; Zhang та ін., Cancer Res., 64 (2004), 6707–6715; Lantry та ін., EANM, Helsinki (Finland) (2004); Linder та ін., J. Nucl. Med., 45, (2004) (5), 169P [реферат 482]. Chen та ін., J. Nucl. Med., 45 (2004), 1390–1397; Johnson та ін., Cancer Biother Radiopharm. 2006, 21(2), 155-66, Smith та ін., Nucl. Med. Biol., 2005, 32 733-40). В Chen та ін. (Appl. Radiat. Isot., 2007, (In Press)), Waser та ін. (Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 2007 34, 95-100) і Lantry та ін. (J. Nucl. Med., 2006, 47, 1144-52) описали візуалізацію й 177 радіотерапію за допомогою агоніста бомбезину, Lu-DOTA, зв’язаного з -NH-CH2-CO-[4177 амінобензоїл]-QWAVGHLM-NH2))( Lu-AMBA). Деякі патенти й патентні заявки стосуються агоністів бомбезину, мічених металами. Volkert та ін. (US 2007/0065362 A) заявляють агоністи бомбезину, мічені металами загальної структури Фрагмент, мічений металом-спейсерна група-агоніст бомбезину для візуалізації й терапевтичного застосування. Інші патенти й патентні заявки цих же винахідників включають: US 6,921,526 B (2005), US 7,060,247 B, US 7,147,838 B (2006) і WO 2002/087631 A1. Рівень техніки Принцип, що лежить в основі вибору агоністів як радіофармацевтичного засобу у всіх вищевказаних публікаціях, полягає в тому, що вони продукують або проявляють відповідь за допомогою GRP рецепторів при взаємодії, де радіофармацевтичний засіб після цього інтерналізується усередину клітини за допомогою ендоцитозу. GRP антагоністи протидіють ефекту агоніста й не інтерналізуються в клітини й, отже, вважається, що антагоністи не є придатними для радіосцинтиграфічної візуалізації й радіотерапевтичних цілей. Аж до теперішнього часу загальноприйнята думка полягала в розробці сполук із властивостями хорошої інтерналізації радіоактивного ліганду, що приводило до високого накопичення в умовах in vivo радіоактивних лігандів у пухлинах, що, як вважалося, було необхідним для оптимальної візуалізації й радіонуклідної терапії в умовах in vivo. З молекулярно-фармакологічних досліджень добре відомо, що ефективна інтерналізація звичайно забезпечується агоністами (Bodei та ін., J. Nucl. Med., 2006;47, 375–377; Koenig та ін., Trends Pharmacol. Sci., 1997;18, 276– 287, Cescato та ін., J. Nucl. Med., 2006;47, 502–511. Ginj та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006; 103, 16436–16441) і недавно, було показано, що для рецепторів соматостатину, високоафінні антагоністи рецепторів соматостатину, мічені металами, погано інтерналізуються в пухлинні клітини й забезпечують еквівалентне або навіть краще в умовах in vivo поглинання в пухлину на моделях пухлин у тварин у порівнянні з відповідними агоністами, які чудово інтерналізуються. GRP рецептори понадекспресуються в деяких новоутвореннях (Cornelio та ін., Ann. Onco., 2007, 18, 1457-1466 і посилання, наведені в цьому джерелі), таких як рак і метастази передміхурової залози, рак і метастази молочної залози, шлунково-кишкові стромальні пухлини, дрібноклітинний рак легені, нирковоклітинний рак, нейроендокринні пухлини шлунковокишкового тракту й підшлункової залози, плоскоклітинний рак голови й шиї, нейробластоми й плоскоклітинний рак стравоходу. GRP рецептори також понадекспресуються в зв’язаних з пухлинами кровоносних судинах раку яєчників, ендометрію й підшлункової залози людини. (Fleischmann та ін., Cell Onc., 2007, 29, 421-33). Отже, надзвичайно важливим є створення потенційних радіофармацевтичних засобів з антагоністичними властивостями для візуалізації й радіотерапії. Jensen та ін. (Pharma. Reviews, 2008 (готується до друку)) недавно описали фармакологію рецепторів трьох різних підтипів рецептора бомбезину, де GRP рецептор належить до підтипу 2. 99m У недавній публікації Cescato та ін. (J. Nucl. Med., 2008, 49, 318-26) показали, що Tc-N4мічений антагоніст бомбезину може бути переважним у порівнянні з агоністами для націлювання на пухлині. Більш ранні винаходи в галузі сполук, націлених на GRP-рецептор, описані в WO 2007/109475 A2, WO 2007/095443 A2, US 2008/0008649 A1 і US 7,226,577 B2 з хелатоутворювальним металом-лінкером-бомбезином із загальною схемою, представленою нижче. Хелатор-лінкер - аналог бомбезину 177 Відповідно до WO 2007/095443 A2, L70 зразок із переважною послідовністю Lu-DOTA-Gly4-амінобензоїл-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2 проявляє себе як агоніст, де вимірюють поглинання через 1 і 24 години. Поглинання не є оптимальним для терапевтичних цілей і потребує поліпшення. 2 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 Крім цих патентів і заявок, були опубліковані доклінічні й клінічні дослідження (Waser та ін., Eur. J. Nucl. Medicine, 2007, 34, 95-100; J. Nucl. Med., 2006, 47, 1144-52). Відповідно до вибору антагоніста, який націлений на GPR рецептор у різному сайті з високою спорідненістю, у даному винаході було показано, що комбінація стратегії спейсеру приводить до несподівано високого й персистуючого поглинання пухлинами, у комбінації з низьким поглинанням і швидким кліренсом в органах, що не є мішенями. У порівняльному дослідженні, спостерігали значно більш високе поглинання (> 2 X) у пухлині при використанні подібного лінкеру. Виходячи з досліджень в умовах in vitro, що підтверджують вірогідність антагоністичних властивостей аналогів бомбезину, було виявлено, що навіть після додавання N-кінцевого спейсеру, хелатору й металу, ці антагоністичні дії зберігаються й передаються з дуже гарними характеристиками в умовах in vivo, що стосується співвідношень пухлина-фон. Таким чином, задачею даного винаходу є забезпечення нових кон’югатів антагоніста пептиду бомбезину, які проявляють високе поглинання й високу стабільність в умовах in vivo (сироватка й тканини людини). Суть Опис винаходу У першому аспекті, винахід стосується кон’югатів антагоніста пептиду аналога бомбезину, які селективно зв'язуються з рецепторами бомбезину й більш переважно з рецептором GRP без запуску інтерналізації в клітину й без передачі сигналів шляхом мобілізації кальцію, при цьому протидіючи ефектам, індукованим агоністом у цих двох системах, де кон’югат антагоніста пептиду аналога бомбезину має загальну формулу (I): [A-(B)n]x-С (І) де x являє собою ціле число від 1 до 3, n являє собою ціле число від 1 до 6, A являє собою хелатор металу, що містить принаймні один радіонуклідний метал, переважно придатний для діагностичного або терапевтичного застосування, більш переважно для візуалізації або променевої терапії, B являє собою спейсер, зв’язаний з N-кінцем C, або ковалентний зв'язок, C являє собою антагоніст пептиду аналога бомбезину з послідовністю C-1 - C-4, де 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C-1: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa3 -Xaa4 -ZH, де Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: CO -HN -HN CO -HN CO -HN CO S S -HN -HN CO CO -HN CO OH 35 40 K K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla, Xaa3 являє собою статин, аналоги й ізомери статину, 4-Am,5-MeHpA, 4-Am,5-MeHxA або αзаміщені амінокислоти, Xaa4 являє собою Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle, або ізо-Bu-Gly, і Z являє собою NH або O; 6 7 8 9 10 11 12 C-2: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Leu(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3, де 3 UA 103314 C2 Leu(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 являє собою Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: CO-HN CO -HN CO -HN -HN CO S S -HN CO -HN CO -HN CO OH 5 10 K і K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla; 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C-3: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa5 -Xaa6 -ZH, де Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: CO-HN CO -HN CO -HN -HN CO S S -HN -HN CO CO -HN OH 15 K K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla, Xaa5 являє собою Leu-CH2NH-, Xaa6 являє собою Cys, Phe, Trp, Tpi або Tac, де Tpi і Tac мають наступні значення: 4 CO UA 103314 C2 HN CON N S COTpi 5 Tac і Z являє собою NH, або O; 6 7 8 9 10 11 12 C-4: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa7, де Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: CO -HN -HN CO -HN CO -HN CO S S -HN -HN CO CO -HN CO OH K 10 15 20 25 30 K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla, Xaa7 являє собою Leu-O-Алкіл, або Leu-NН-алкіл. Винахід також стосується їх фармацевтично прийнятних солей цих кон’югатів антагоніста пептиду аналога бомбезину неорганічних або органічних кислот, а також гідратів, комплексів, складних ефірів, амідів, сольватів і проліків цих сполук, що мають загальну хімічну формулу (I). Опис A (хелатор металу): У переважному варіанті здійснення даного винаходу, хелатор металу (A) являє собою хелатор металу для тривалентних металів або для п'ятивалентних металів і їх близькі аналоги. Переважно, хелатор металу (A) для тривалентних металів вибирають ізгрупи, яка включає: Хелатори на основі DOTA, NODASA, NODAGA, NOTA, DTPA, EDTA, TETA і TRITA і їх близькі аналоги, де DOTA являє собою 1,4,7,10-тетразациклододекан-N,N',N",N"' тетраоцтову кислоту, DTPA являє собою діетилентриамінпентаоцтову кислоту, EDTA являє собою етилендіамін-N,N'-тетраоцтову кислоту, TETA являє собою 1,4,8,11-тетраазациклододекан-1,4,8,11-тетраоцтову кислоту, і NOTA являє собою 1,4, 7-триазациклононанацетилацетооцтову кислоту. Більш переважно, хелатор металу (A) для тривалентних металів вибирають із групи, яка включає: хелатори на основі DOTA, NOTA, DTPA і TETA та їх близькі аналоги. Структури цих хелатоутворювальних лігандів у їх повністю депротонованій формі представлені нижче. 5 UA 103314 C2 COO ( )n OOC COO N N COO OOC N N OOC N COO OOC 10 N N COO COO COO COO ( )n' DTPA 5 N N N OOC n = n' = 1 DOTA n = n' = 2 TETA NOTA Ще більш переважно, хелатор металу (A) для тривалентних металів вибирають із групи, яка включає DTPA (діетилентриамінпентаоцтова кислота) і поліаза-полікарбоксилат макроцикли, такі як DOTA (1,4,7,10-тетразациклододекан-N,N',N",N"' тетраоцтова кислота) і їх близькі аналоги. Переважно, хелатор металу (A) для п'ятивалентних металів вибирають із групи, яка включає 2-гідразино нікотинамід (HYNIC), N4-хелатори, N4-X (N4 може бути лінійним або макроциклічним і X може представляє собою азид амін, OH, галоген, o-, м-, п-аміно бензил 99m метапаракарбоксибензил, і карбокси (Nock, B. та ін. (2003 [ Tc]Demobesin 1, a novel bombesin analogue for GRP receptor-targeted tumour imaging. Eur. I. Nucl. Mol. Imaging, 30, 247-258)), Десферіоксамін (DFO), і NrS(4-r) хелатори. і R2 Y O Y HN ( )t N HN NH HN N O R R 3 R1 O HZ' NH 8 R9 R4 HN R HG G R6 7 R5 NH NH HZ' HS NH COOH Y Y R10 R11 R14 15 HN NH R12 R13 R15 N N E HN NH O O R16 R19 S R17-OC CO-R18 HO OH де R1-R15 незалежно один від одного являють собою атоми водню або (C1–C4) алкільні групи, де, у фрагменті вищенаведеної формули, t являє собою 1 або 2 або 3 і принаймні один з атомів вуглецю у вказаному 20 25 S фрагменті заміщений за допомогою Y або незаміщений за допомогою Y, R16 являє собою атом водню або CO2 (C1-C4)алкільну групу; R17 і R18 незалежно один від одного являють собою (C1-C4) алкільні групи або фенільні групи; R19 являє собою CH2-COOH або його функціональне похідне; E являє собою (C1–C4)алкілен, або фенілен; необов'язково (C1–C4)алкілен, заміщений за допомогою CO2-алкілу, CH2-COалкілу, CONH2, або CONHCH2-CO2-алкілу; необов'язково фенілен, заміщений за допомогою CO2-алкілу, 6 UA 103314 C2 5 де алкільні групи мають від 1 до 4 атомів вуглецю; G являє собою NH або S; Y являє собою функціональну групу, здатну зв'язуватися з вільною аміногрупою пептиду (Nкінця) або зі спейсером; і Z’ являє собою S або O. N4-хелатори переважно являють собою, (CH2)m HN NH NH2 H2N 10 15 20 де m являє собою ціле число від 1 до 4. NrS(4-r) хелатори визначаються, де r являє собою ціле число від 1 до 4. Вказана функціональна група Y переважно включає ізоціанато, азотіоціанато, форміл, галонітрофеніл, діазоній, епокси, трихлор-s-триазиніл, етиленіміно, хлорсульфоніл, алкоксикарб-імідоїл, (заміщений або незаміщений) алкілкарбонілоксикарбоніл, алкілкарбонілімідазоліл, сукцинімідо-оксикарбоніл; де вказана група приєднана до (C 1 -C10) вуглеводневого бірадикала. Підходящими прикладами вуглеводневих бірадикалів є бірадикали, похідні бензолу, (C1 -C6) алканів, (C2-C6) алкенів і (C1-C4)-алкілбензолів, і їх близькі аналоги. Переважно NtS(4-t) хелатори вибирають із групи, яка включає хелатори на основі бісаміно бістіолу (BAT) для радіонуклідного металу технецію, меркапто-ацетил-гліцил-гліцил-гліцин (MAG3) для радіонуклідного металу технецію і їх близькі аналоги. Більш переважно, хелатор металу (A) для п'ятивалентних металів вибирають із групи, яка включає R2 Y O Y HN ( )t HN NH O R3 HZ' R8 O R1 R9 N HN NH R4 G R HG R6 7 R5 HN N NH NH HZ' HS NH COOH Y Y E R10 R11 R14 25 30 HN NH R12 R13 R15 N N HN NH O O R16 R19 S S R17-OC CO-R18 HO OH і їх близькі аналоги, де R1-R19, Z’, Y, G і t мають значення, вказані вище. Переважно, r являє собою ціле число від 2 до 4 і більш переважно r являє собою 2 або 3. Переважно, m являє собою ціле число від 1 до 2, більш переважно m являє собою 1. Добре відомі хелатори металів, такі як лінійні, макроциклічні, тетрапіридинові й N 3S, N2S2 або N4 хелатори описані в US 5,367,080 A, US 5,364,613 A, US 5,021,556 A, US 5,075,099 A, US 5,886,142 A, розкриття яких повністю включене в дану заявку як посилання. 7 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Добре відомі хелатори металів, такі як хелатори на основі HYNIC, DTPA, EDTA, DOTA, TETA, бісаміно бістіолу (BAT), описані в US 5,720,934 A, розкриття якого повністю включене в дану заявку як посилання. Добре відомі хелатори металів, такі як Десферіоксамін (DFO), описані Doulias та ін. (2003) Endosomal and lysosomal effects of desferrioxoxamine: protection of Hela cells from hydrogen peroxide-induced DNA damage and induction of cell-cycle arrest. Free Radic. Biol. Med., тому 35, випуск 7:719-28. Доступні різні хелатоутворювальні засоби й вони описані Banerjee та ін., (Nucl. Med. and Biology, 2005, 32, 1-20 і посилання, наведені в цьому джерелі), які включені в дану заявку шляхом посилання. 2-гідразино нікотинамід (HYNIC) являє собою інший клас хелатоутворювальної групи (A), у 99m 186,188 присутності співліганду, який широко використовується для інкорпорації Tc і Re (Schwartz та ін. Bioconj. Chem., 1991, 2, 333-6; Babich та ін., J. Nucl. Med., 1993, 34, 1964-70; Nucl. Med. Biol., 1995, 22, 25-30; Nucl. Med. Biol., 1995, 22, сс. 32, сс. 1-10) DTPA використовується в Octreoscan® (що випускається на ринок Covidian) для 111 комплексоутворення In і деякі модифікації описані в літературі (Brechbiel та ін., Biocon. Chem., 1991, 2, 187-194; Li та ін., Nucl. Med. Biol., 2001, 28, 145-154). Хелати DOTA типу для застосування при променевій терапії описані Tweedle та ін., Патент US 48885363. Інші поліаза макроцикли для хелатоутворення з ізотопами тривалентних металів описані Maecke та ін. в Bioconj. Chem., 2002, 13, 530 і включені в дану заявку шляхом посилання. 99m N4-хелатори, Tc-N4-хелатор використовується для мічення пептидів у випадку мінігастрину для націлювання на CCK-2 рецептори (Nock та ін., J. Nucl. Med., 2005, 46, 1727-36). У переважному варіанті здійснення даного винаходу, радіонуклідний метал придатний для комплексоутворення з хелатором металу й приводить до одержання радіоактивного хелатору металу для візуалізації. Переважно, радіонуклідний метал вибирають із групи, яка включає 133m 99m 67 In, Tc, Ga, 52 68 72 111 97 203 62 64 51 52m 157 123 124 131 75 76 Fe, Ga, As, In, Ru, Pb, Cu, Cu, Cr, Mn, Gd, I, I, I, Br, Br, 77 64 82 99m Br, Cu і Br. Більш переважно, радіонуклідний метал вибирають із групи, яка включає Tc, 67 68 111 123 68 Ga, Ga, In, і I. Ще більш переважно радіонуклідний метал являє собою Ga. Ще більш 99m переважно радіонуклідний метал являє собою Tc. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, радіонуклідний метал придатний для комплексоутворення з хелатором металу й приводить до одержання радіоактивного хелатору металу для променевої терапії. Переважно, радіонуклідний метал вибирають із групи, яка 186 90 67 68 , 69 121 127 142 143 198 199 161 109 188 186 включає Re, Y, Cu, Ga Er, Sn, Te, Pr, Pr, Au, Au, Tb, Pd, Rd, Re, 188 77 166 166 149 151 153 159 172 90 111 169 175 177 105 Re, As, Dy, Ho, Pm, Pm, Sm, Gd, Tm, Y, In, Yb, Yb, Lu, Rh, 111 125 123 213 225 129 64 177m Ag,, I, I,, Bi, Ac, I, Cu і Sn. Більш переважно, радіонуклідний метал вибирають 186 188 90 153 68 177 із групи, яка включає Re, Re, Y, Sm, Ga, і Lu. У подальшій альтернативі першого аспекту радіонуклідний метал являє собою радіоактивний галоген (ізотопи йоду й брому), радіоактивний галоген зв'язується безпосередньо з пептидом, наприклад, шляхом хімічної реакції з Tyr або Trp фрагментом у пептиді, або необов'язково A може представляє собою Tyr або Trp. 67 111 90 153 177 Переважні радіодіагностичні засоби ( Ga, In) і радіотерапевтичні засоби ( Y, Sm, Lu) необов'язково містять хелатований +3 іон металу із класу елементів, відомих як лантаноїди. 90 111 149 Типові радіоактивні метали в цьому класі включають ізотопи Ітрій, Індій, Прометій, 153 166 166 175 177 Самарій, Диспрозій, Гольмій, Ітербій і Лютецій. Усі ці метали (і інші в класі лантаноїдів) мають дуже подібні хімічні властивості, у тому розумінні, що вони залишаються в +3 окисненому стані й переважно хелатують ліганди, які несуть важкі (кисень /азот) донорні атоми. Опис B (спейсер): B являє собою спейсер, зв’язаний з N-кінцем C, або ковалентний зв'язок. У переважному варіанті здійснення даного винаходу B являє собою сполуку, що має формулу (II) B1-B2 (II) де B1 представляє собою ковалентний зв’язок, амінокислоту, яка зустрічається в природі, амінокислоту, яка не зустрічається в природі, лінійний діамін або циклічний діамін, B2 представляє собою ковалентний зв’язок, амінокислоту, яка зустрічається в природі, амінокислоту, яка не зустрічається в природі, лінійну карбонову кислоту або ціклічну карбонову кислоту 8 UA 103314 C2 5 за умови, що обидва B1 й B2 не можуть одночасно представляє собою ковалентний зв’язок й що, коли B1 представляє собою діамін, то B2 представляє собою карбонову кислот (тобто, B2 не може представляє собою зв'язок або амінокислоту, яка зустрічається в природі, або амінокислоту, яка не зустрічається в природі, в цьому випадку) Переважно, амінокислота, що не зустрічається в природі, представляє собою сполуку, яка має будь-яку з формул (III), (IV), (V) або де 2 3 1 -HN-(CH2)a 4 (III) (CH2)b-CO10 де a являє собою ціле число від 0 до 3, b являє собою ціле число від 0 до 3, і відносні схеми заміщення або необов'язково 1,2-, 1,3- або 1,4Переважно, a являє собою 0 або 1, b являє собою 0 або 1, O c (CH2)d-CO -HN 15 20 (IV) де c являє собою ціле число від 1 до 24, d являє собою ціле число від 1 до 6. Переважно, c являє собою ціле число від 1 до 15, більш переважно c рівний від 1 до 8, d являє собою ціле число від 1 до 3, більш переважно d рівний 1 . E' (CH2) f-CO(CH2)g-NH (V) N H 25 30 35 де E’ являє собою NH, або CH2, f являє собою ціле число від 0 до 6, g являє собою ціле число від 0 до 6; коли E’ являє собою CH2, то 6-ти членне кільце необов’язково заміщене в будь-якому положенні вуглецю 6-ти членного кільця на тому ж самому вуглеці кільця або на різних вуглецях, коли E' являє собою NH, то 6-ти членне кільце необов’язково заміщене в будь-якому положенні вуглецю 6-ти членного кільця на тому ж самому атомі вуглецю кільця або на різних атомах вуглецю та/або на атомі азоту за умови, що f або g являє собою ціле число, рівне або більше 1. Переважно, E' являє собою NH, f являє собою ціле число від 0 до 3, g являє собою ціле число від 0 до 3; P -HN 40 ( )i ( )j NH-CO-CH2-CH2-CO (VI) де i являє собою ціле число від 1 до 6, j являє собою ціле число від 1 до 6, P являє собою O або H2. Переважно, i являє собою ціле число від 1 до 3, j являє собою ціле число від 1 до 3, P являє собою O. 9 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Більш переважно спейсер вибирають із групи, яка включає 4-аміно-1карбоксиметилпіперидин, (R,S)-діамінооцтову кислоту, PEG1-24, Sar5-10, 8-амінооктанову кислоту, 6-амінокапронову кислоту, 4-(2аміноетил)-1-карбоксиметил піперазин, діаміномасляну кислоту, гіпурову кислоту, 4-аміно-1-Boc-піперидин-4-карбонову кислоту, Gly-амінобензойну кислоту, 5аміно-3-окса-пентил-напівамід янтарної кислоти, Peg1-24-4-аміно-1-карбоксиметил піперидин, Dab(шикимову кислоту), (D-Gln)x, (D-Asn)x. Опис C (послідовність антагоніста пептиду аналога бомбезину) У переважному варіанті здійснення даного винаходу, послідовність антагоніста пептиду аналога бомбезину вибирають із групи, яка включає C-1 - C-3, переважно C-1 - C-2. Переважно, послідовність антагоніста пептиду аналога бомбезину вибирають із групи, яка включає: Посл. сполуки 1: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ; Посл. сполуки 9: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3; Посл. сполуки 12: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH2NH)-Phe-NH2; Посл. сполуки 13: Dphe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu(CH2NH)-Cys-NH2. Переважно, кон’югат антагоніста пептиду аналога бомбезину, що має формулу (I), що містить принаймні один радіонуклідний метал, вибирають із групи, яка включає Сполука 1: DOTA-Gly-амінобензоїл-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 ; Сполука 2: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-LeuNH2; Сполука 3: DOTA-4-аміно-1-піперидин-4-карбонова кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisSta-Leu-NH2; Сполука 4: DOTA-15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота-D-Phe-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Sta-Leu-NH2; Сполука 5: DOTA-(15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота)-(4-аміно-1карбоксиметил-піперидин)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; Сполука 6: DOTA-діаміномасляна кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; Сполука 7: DOTA-4-(2-аміноетил)-1-карбоксиметил-піперазин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisSta-Leu-NH2; Сполука 8: DOTA-(5-аміно-3-окса-пентил)-напівамід янтарної кислоты-D-Phe-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Sta-Leu-NH2; Сполука 9: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3; Сполука 10: DOTA-(15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота-4-аміно-1карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3; Сполука 11: DOTA-15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота -D-Phe-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3; Сполука 12: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeuψ(CH2NH)-Phe-NH2; Сполука 13: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeuψ(CH2NH)-Cys-NH2; Сполука 14: N4-триазоли-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2. Інші переважні варіанти здійснення: У переважному варіанті здійснення даного винаходу, для сполуки, що має формулу (I), x являє собою ціле число від 1 до 2, переважно x являє собою 1. Якщо x рівний або більше 2, то (B)n являє собою лінійний спейсер або розгалужений, зв’язаний з N-кінцем антагоніста пептиду аналога бомбезину (C). У переважному варіанті здійснення даного винаходу, для сполуки, що має формулу (I), n являє собою ціле число від 1 до 4, переважно n являє собою 1 або 3, більш переважно 1. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, для сполуки, що має формулу (I), A додатково являє собою хелатор металу, що містить принаймні один атом холодного металу, що відповідає або еквівалентний до перерахованого вище радіонуклідному металу. Такі сполуки придатні для досліджень зв'язування в умовах in-vitro in-vivo і як порівняльні сполуки. Перераховані вище переважні варіанти здійснення винаходу застосовуються в даній заявці. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, для сполуки, що має формулу (I), K додатково являє собою H або переважно H. У другому аспекті, винахід стосується попередників кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, які селективно зв'язуються з рецепторами бомбезину і які більш переважно зв'язуються з GRP рецептором без запуску інтерналізації в клітину й без передачі сигналів 10 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 шляхом мобілізації кальцію, при цьому протидіючи ефектам, індукованим агоністом у цих двох системах, де кон’югат антагоніста пептиду аналога бомбезину має загальну формулу (I’) [A’-(B)n]x-С (I’) де x являє собою ціле число від 1 до 3, n являє собою ціле число від 1 до 6 A’ являє собою хелатор металу, B являє собою спейсер, зв’язаний з N-кінцем C, або ковалентний зв'язок, C являє собою антагоніст пептиду аналога бомбезину з послідовністю C-1 - C-4. Хелатор металу A’ являє собою хелатор металу без радіонуклідного металу, як визначено в першому аспекті для A. Спейсер B і антагоніст пептиду аналога бомбезину C мають значення, вказані вище в першому аспекті. Винахід також стосується них фармацевтично прийнятних солей кон’югатів антагоніста пептиду аналога бомбезину неорганічних або органічних кислот, і гідратів, комплексів, складних ефірів, амідів, сольватів і проліків цих сполук, що мають загальну хімічну формулу (I'). У переважному варіанті здійснення даного винаходу, x являє собою ціле число від 1 до 2, переважно x являє собою 1. Якщо x рівний або більше 2, то (B) n являє собою лінійний спейсер або розгалужений спейсер, зв’язаний з N-кінцем антагоніста пептиду аналога бомбезину (C). У переважному варіанті здійснення даного винаходу, у формулі (I'), n являє собою ціле число від 1 до 4, переважно n являє собою 1 або 3, більш переважно 1. У третьому аспекті, винахід стосується фармацевтичної композиції, яка містить кон’югати антагоніста пептиду аналога бомбезину, які мають формулу (I) або (I’), і фармацевтично прийнятний носій. У четвертому аспекті, винахід стосується застосування кон’югатів антагоніста пептиду аналога бомбезину, які мають формулу (I) або (I’), для зв'язування з рецепторами бомбезину й більш переважно рецептора пептиду, що вивільняє гастрин (GRP), та/або для інгібування рецепторів бомбезину й більш переважно рецептора пептиду, що вивільняє гастрин (GRP). У п'ятому аспекті, винахід стосується способу приготування кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має загальну формулу (I) [A-(B)n]x-С (I) де n, x, A, B і C мають значення, вказані вище, який включає стадію - Радіоактивне хелатування кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має загальну формулу (I'), як визначено вище, з підходящим радіонуклідним металом або атомом металу, що відповідають радіонуклідному металу, перерахованому вище. Переважно, спосіб приготування кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має загальну формулу (I), включає стадію радіоактивного хелатування з підходящим радіонуклідним металом. В подальшому варіанті здійснення, спосіб приготування кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має загальну формулу (I) [A-(B)n]x-С (I) де n, x, A, A’, B і C мають значення, вказані вище, включає додатково стадії: a) Сполучення спейсеру B з антагоністом пептиду аналога бомбезину C для одержання спейсеру- антагоніста пептиду аналога бомбезину з послідовністю C-1 - C-4, необов'язково повтор стадії a); і б) сполучення спейсеру- антагоніста пептиду аналога бомбезину з хелатором металу A’ для одержання кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має загальну формулу (I’), необов'язково повтор стадії б), вищеописані стадії здійснюють перед радіохелатуванням кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має загальну формулу (I') з підходящим радіонуклідним металом або атомом металу, що відповідають або еквівалентним радіонуклідному металу, перерахованому вище. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, n, x, хелатор металу A, хелатор металу A’ спейсер B і антагоніст пептиду аналога бомбезину C мають значення, вказані вище. У шостому аспекті, винахід стосується способу візуалізації рецепторів бомбезину й більш переважно пухлинних клітин, які експресують GRP рецептор, та/або пухлинних і перипухлинних судин у пацієнта, який включає стадії: 11 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 - введення пацієнтові радіофармацевтично ефективної кількості кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має формулу (I); і - візуалізацію радіонуклідного металу в пацієнта. Переважний варіант здійснення шостого аспекту охоплює застосування радіофармацевтично ефективної кількості кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має формулу (I), для приготування візуалізуючого засобу для візуалізації рецепторів бомбезину й більш переважно пухлинних клітин, які експресують GRP рецептор, та/або пухлинних і перипухлинних судин. У переважному варіанті здійснення пухлинні клітини стосуються злоякісних новоутворень, які вибирають із групи, яка включає: - рак передміхурової залози, включаючи метастази, - рак молочної залози, включаючи метастази, - шлунково-кишкові стромальні пухлини, - дрібноклітинний рак легені, - нирковоклітинний рак, - нейроендокринні пухлини шлунково-кишкового тракту й підшлункової залози, - плоскоклітинний рак голови й шиї, - нейробластоми, і - плоскоклітинний рак стравоходу. Ще більш переважно, пухлинні клітини стосуються злоякісних новоутворень, які вибирають із - раку передміхурової залози, включаючи метастази, і - раку молочної залози, включаючи метастази. В подальшому переважному варіанті здійснення пухлинні й перипухлинні судини стосуються злоякісних новоутворень, які вибирають із - раку яєчників, - раку ендометрію, і - раку підшлункової залози. Переважно, пухлинні й перипухлинні судини стосуються раку яєчників. У сьомому аспекті, винахід стосується способу лікування або запобігання захворювань, зв’язаних з пухлинними клітинами та/або пухлинними й перипухлинними судинами, який включає стадію: - введення терапевтично ефективної кількості кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має формулу (I). Переважний варіант здійснення сьомого аспекту охоплює застосування терапевтично ефективної кількості кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину, який має формулу (I), для приготування лікарського засобу для лікування або запобігання захворювань, зв’язаних з пухлинними клітинами та/або пухлинними й перипухлинними судинами. У переважному варіанті здійснення захворювання, зв’язані з пухлинними клітинами, стосуються злоякісних новоутворень, які вибирають із групи, яка включає: - рак передміхурової залози, включаючи метастази, - рак молочної залози, включаючи метастази, - шлунково-кишкові стромальні пухлини, - дрібноклітинний рак легені, - нирковоклітинний рак, - нейроендокринні пухлини шлунково-кишкового тракту й підшлункової залози, - плоскоклітинний рак голови й шиї, - нейробластоми, і - плоскоклітинний рак стравоходу. Ще більш переважно, захворювання, зв’язані з пухлинними клітинами, стосуються злоякісних новоутворень, які вибирають із групи, яка включає: - рак передміхурової залози, включаючи метастази, і - рак молочної залози, включаючи метастази. В подальшому переважному варіанті здійснення захворювання, зв’язані з пухлинними й перипухлинними судинами, стосуються злоякісних новоутворень, які вибирають із групи, яка включає: - рак яєчників, - рак ендометрію, і - рак підшлункової залози. 12 UA 103314 C2 5 10 Переважно, захворювання, зв’язані з пухлинними й перипухлинними судинами, стосуються раку яєчників. У восьмому аспекті, винахід стосується набору для препарату радіофармацевтичного засобу або радіофармацевтичного візуалізуючого засобу, який має формулу (I), де набір включає флакон, що містить заздалегідь визначену кількість кон’югата антагоніста пептиду аналога бомбезину формули (I’) і прийнятний носій, розріджувач, наповнювач або ад’ювант для мічення хелатору металу радіоактивним ізотопом. У дев'ятому аспекті, винахід стосується антагоніста пептиду аналога бомбезину з послідовністю C-1 - C-4, де 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C-1: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa3 -Xaa4 -ZH, де Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: CO-HN -HN CO -HN CO -HN CO S S -HN -HN CO CO -HN CO OH 15 20 K K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla, Xaa3 являє собою статин, аналоги й ізомери статину, 4-Am,5-MeHpA, 4-Am,5-MeHxA або αзаміщені амінокислоти, Xaa4 являє собою Leu, Cpa, Cba, CpnA, Cha, t-buGly, tBuAla, Met, Nle, або ізо-Bu-Gly, і Z являє собою NH або O; 6 7 8 9 10 11 12 C-2: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Leu(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3, де Leu(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 являє собою 25 Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: 13 UA 103314 C2 CO -HN CO -HN CO -HN -HN CO S S -HN CO -HN CO -HN CO OH K 5 і K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla; 6 7 8 9 10 11 12 13 14 C-3: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa5 -Xaa6 -ZH, де Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: CO-HN CO -HN CO -HN -HN CO S S -HN -HN CO CO -HN OH 10 K K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla, Xaa5 являє собою Leu-CH2NH-, Xaa6 являє собою Cys, Phe, Trp, Tpi або Tac, де Tpi і Tac мають наступні значення: HN CON N 15 COTpi S Tac і 14 CO UA 103314 C2 5 Z являє собою NH, або O; 6 7 8 9 10 11 12 C-4: Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa7, де Xaa1 являє собою D-Phe, D-Cpa, D-Tyr, D-Trp або залишок, що має будь-яку з формул, представлених нижче: CO-HN CO -HN CO -HN -HN CO S S -HN -HN CO CO -HN CO OH 10 15 20 25 30 35 40 K K являє собою F, Cl, I, або NO2, Xaa2 являє собою Gly або β-Аla, Xaa7 являє собою Leu-O-Алкіл, або Leu-NН-алкіл. Визначення Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “алкіл”, сам або як частина іншої групи, стосується прямоланцюгової або розгалуженої алкільної групи з 1 - 20 атомами вуглецю, такої як, наприклад, метил, етил, пропіл, ізо-пропіл, бутил, ізо-бутил, трет-бутил, пентил, ізо-пентил, нео-пентил, гептил, гексил, децил. Алкільні групи також можуть бути заміщені, наприклад, атомами галогену, гідроксильними групами, C 1-С 4-алкокси групами або C6-С12-арильними групами. Більш переважно алкіл являє собою C1-С10-алкіл, C1-С6-алкіл або C1-С 4-алкіл. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “нижчий нерозгалужений або розгалужений алкіл(ен)” будуть мати наступні значення: заміщений або незаміщений, нерозгалужений або розгалужений одновалентний, двовалентний або тривалентний радикал, що складається з вуглеців і воднів, який не містить ненасиченості і який має від одного до восьми атомів вуглецю, наприклад, включаючи, але не обмежуючись тільки ними, метил, етил, н-пропіл, н-пентил, 1,1-диметилетил (трет-бутил), н-гептил і інші. Цей фрагмент може бути незаміщений або заміщений, наприклад, атомами галогену, гідроксильними атомами, C1-С 4-алкокси групами або C6-С12-арильними групами. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “феніленова” група ґрунтується на дво- або необов’язково три-заміщеному бензольному кільці. Наприклад, полі(п-фенілен) представляє собою полімер, побудований з пара-феніленових повторюваних одиниць. Фенілен може бути заміщеним або незаміщеним. Він може бути заміщений галогеном, OH, алкокси, переважно C1-С4-алкокси, карбокси, складним ефіром, переважно C1-С4-складним ефіром, амідом, нітро. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “алкен” буде мати наступні значення: ненасичена аліфатична або аліциклічна хімічна сполука, що містить принаймні один вуглець-вуглецевий подвійний зв'язок. Найпростіші алициклічні алкени, тільки з одним подвійним зв'язком і без інших функціональних груп, утворюють CnH2n, наприклад, етилен (C2H4), пропілен (C3H6). Алкени можуть бути заміщені або незаміщені. Якщо алкен заміщений, то вони можуть бути заміщені атомами галогену, гідроксильними групами, C1С4-алкокси групами, C6-С12-арильними групами або ін. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “арил” буде позначати ненасичену кільцеву систему, переважно ароматичну кільцеву систему, що більш переважно містить 6 - 12 атомів вуглецю в кільцевому скелеті. Їхніми прикладами є феніл і нафталеніл. Арильні фрагменти можуть бути незаміщені або заміщені, наприклад, атомами галогену, гідроксильними групами, C1-С4-алкокси групами або C6-С12-арильними групами. 15 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “бензол” буде мати наступні значення: органічна хімічна сполука з формулою C6H6. Бензол являє собою ароматичний вуглеводень і другий [н]-анулен([6]-анулен), циклічний вуглеводень із безперервним pi зв’язком. Бензол може бути незаміщений або заміщений, наприклад, атомами галогену, гідроксильними групами, C1-С4-алкокси групами або C6-С12-арильними групами. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, терміни “алкеніл” і “алкініл” аналогічним чином визначаються як алкіл, але містять принаймні один вуглецьвуглецевий подвійний або потрійний зв'язок, відповідно. Алкеніл більш переважно може представляє собою C2-С6-алкеніл і алкініл більш переважно може представляє собою C 2-С6алкініл. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “галоген” буде позначати F, Cl, Br або I. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, терміни “солі неорганічних або органічних кислот”, “неорганічна кислота” і “органічна кислота” стосується мінеральних кислот, включаючи, але не обмежуючись тільки ними, такі кислоти, як: вугільна, азотна, фосфорна, соляна, перхлорна або сірчана кислота або їх кислі солі, такі як солі калію, натрію, кальцію, магнію, наприклад, гідросульфат калію, або підходящих органічних кислот, які включають, але не обмежуючись тільки ними: кислоти, такі як аліфатичні, циклоаліфатичні, ароматичні, араліфатичні, гетероциклічні, карбонові й сульфонові кислоти, прикладами яких є мурашина, оцтова, трифтороцтова, пропіонова, янтарна, гліколева, глюконова, молочна, яблучна, фумарова, піровиноградна, бензойна, антранілова, мезилова, фумарова, саліцилова, фенілоцтова, мигдалева, ембонова, метансульфонова, етансульфонова, бензолсульфонова, пантотенова, толуолсульфонова, трифторметансульфонова й сульфанілова кислота, відповідно. Аналогічно до цього, органічні кислоти також можуть бути представлені у вигляді із солей, таких як солі калію, натрію, кальцію, магнію. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “фармацевтично прийнятна сіль” стосується солей неорганічних і органічних кислот, таких як мінеральні кислоти, включаючи, але не обмежуючись тільки ними, такі кислоти як вугільна, азотна або сірчана кислота, або органічні кислоти, включаючи, але не обмежуючись тільки ними, такі кислоти, як аліфатичні, циклоаліфатичні, ароматичні, араліфатичні, гетероциклічні, карбонові й сульфонові кислоти, прикладами яких є мурашина, оцтова, трифторoоцтова, пропіонова, янтарна, гліколева, глюконова, молочна, яблучна, фумарова, піровиноградна, бензойна, антранілова, мезилова, саліцилова, фенілоцтова, мигдалева, ембонова, метансульфонова, етансульфонова, бензолсульфонова, пантотенова, толуолсульфонова й сульфанілова кислота. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “проліки” означає будь-яку ковалентно зв'язану сполуку, яка вивільняє активний вихідний фармацевтичний засіб відповідно до формули (I). Термін "проліки", як використовується в даній заявці, також охоплює фармацевтично прийнятні похідні, такі як складні ефіри, аміди й фосфати, таким чином, що в результаті біоперетворення в умовах in vivo продукт похідного являє собою активний лікарський засіб, як визначено у формулі (I). У джерелі Goodman і Gilman (The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8-а ред., McGraw-HiM, міжн. вид. 1992,"Biotransformation of Drugs", 13-15) описані проліки, розкриття цього джерела включене в дану заявку як посилання. Проліки сполуки згідно із даним винаходом одержують шляхом модифікації функціональних груп, які присутні у сполуці, таким чином, що модифікації відщеплюються, або при загальноприйнятій обробці або in vivo, у вихідну сполуку. Проліки сполук згідно із даним винаходом включають ті сполуки, у яких, наприклад, гідрокси група, така як гідрокси група на асиметричному атомі вуглецю, або аміногрупа зв’язана з будь-якою групою так, що при введенні проліків пацієнтові, вона відщеплюється з утворенням вільного гідроксилу або вільного аміно, відповідно. Типові приклади проліків описані, наприклад, в WO 99/33795 A, WO 99/33815 A, WO 99/33793 A і WO 99/33792 A, розкриття яких повністю включене в дану заявку як посилання. Проліки характеризуються дуже гарною розчинністю у воді, підвищеною біодоступністю й легко метаболізуються в активні інгібітори в умовах in vivo. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, терміни "амінокислотна послідовність" і “пептид” визначаються в даній заявці як поліамід, одержуваний шляхом (полі)конденсації принаймні двох амінокислот. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін "амінокислота" означає будь-яку молекулу, що містить принаймні одну аміногрупу й принаймні одну карбоксильну групу, але не містить пептидного зв'язку у молекулі. Інакше кажучи, 16 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислота являє собою молекулу, яка має функціональну групу карбонової кислоти й амінний азот, що має принаймні один вільний водень, переважно в альфа-положенні відносно нього, але не містить амідного зв'язку в молекулярній структурі. Таким чином, дипептид, що має вільну аміногрупу на N-кінці й вільну карбоксильну групу на C-кінці, не може розглядатися як одинична "амінокислота" згідно з вищенаведеним визначенням. Амідний зв'язок між двома суміжними амінокислотними залишками, який одержують при такій конденсації, визначається як "пептидний зв'язок". Амідний зв'язок, як використовується в даній заявці, означає будь-який ковалентний зв'язок, що має структуру -C(=O)-NH-CH- або -HC-HN-(O=)Cде карбонільна група забезпечується однією молекулою, а NH-група забезпечується іншою молекулою, які з'єднуються разом. Амідний зв'язок між двома суміжними амінокислотними залишками, який одержують при такій поліконденсації, визначається як "пептидний зв'язок". Необов'язково, атоми азоту поліамідного скелету (позначається як NH вище) незалежно можуть бути алкіловані, наприклад, за допомогою -C1-С6-алкілу, переважно за допомогою -CH3. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, амінокислотний залишок має походження з відповідної амінокислоти шляхом утворення пептидного зв'язку з іншою амінокислотою. Як використовується надалі у описі даного винаходу й у пунктах формули, амінокислота являти собою амінокислоту, яка зустрічається в природі, або амінокислоту, яка не зустрічається в природі, де амінокислота, яка не зустрічається в природі, представляє собою синтетичний / штучний амінокислотний залишок, протеїногенний та/або не-протеїногенний амінокислотний залишок. Не-протеїногенні амінокислотні залишки надалі можуть класифікуватися як (a) гомо аналоги протеїногенних амінокислот, (b) β-гомо аналоги протеїногенних амінокислотних залишків і (c) подальші не-протеїногенні амінокислотні залишки. Таким чином, амінокислотні залишки мають походження з відповідних амінокислот, наприклад, з протеїногенні амінокислоти, а саме Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr і Val; або не- протеїногенні амінокислоти, такі як гомо аналоги протеїногенних амінокислот, де боковий ланцюг подовжений за допомогою метиленової групи, наприклад, гомоаланін (Hal), гомоаргінін (Har), гомоцистеїн (Hcy), гомоглутамін (Hgl), гомогістидин (Hhi), гомоізолейцин (Hil), гомолейцин (Hle), гомолізин (Hly), гомометіонін (Hme), гомофенілаланін (Hph), гомопролін (Hpr), гомосерин (Hse), гомотреонін (Hth), гомотриптофан (Htr), гомотирозин (Hty) і гомовалін (Hva); β-гомоаналоги протеїногенних амінокислот, де метиленова група вставлена між α-вуглецем і карбоксильною групою, приводячи до утворення β-амінокислот, наприклад, β-гомоаланін (βHal), β-гомоаргінін (βHar), β-гомоаспарагін (βHas), β-гомоцистеїн (βHcy), β-гомоглутамін (βHgl), β-гомогістидин (βHhi), β-гомоізолейцин (βHil), β-гомолейцин (βHle), β-гомолізин (βHly), βгомометіонін (βHme), β-гомофенілаланін (βHph), β-гомопролін (βHpr), β-гомосерин (βHse), βгомотреонін (βHth), β-гомотриптофан (βHtr), β-гомотирозин (βHty) і β-гомовалін (βHva); подальші не-протеїногенні амінокислоти, наприклад, α-аміноадипінова кислота (Aad), βаміноадипінова кислота (β Aad), α-аміномасляна кислота (Abu), α-аміноізомасляна кислота (Aib), β аланін (βAla), 4-аміномасляна кислота (4-Abu), 5-аміновалеріанова кислота (5-Ava), 6амінокапронова кислота (6-Ahx), 8-амінооктанова кислота (8-Aoc), 9-амінононанова кислота (9Anc), 10-амінокапринова кислота (10-Adc), 12-амінолауринова кислота (12-Ado), αаміносуберинова кислота (Asu), азетидин-2-карбонова кислота (Aze), β-циклогексилаланін (Cha), цитрулін (Cit), дегідроаланін (Dha), γ-карбоксиглутамінова кислота (Gla), αциклогексилгліцин (Chg), пропаргілгліцин (Pra), піроглутамінова кислота (Glp), α-третбутилгліцин (Tle), 4-бензоїлфенілаланін (Bpa), δ-гідроксилізин (Hyl), 4-гідроксипролін (Hyp), алоізолейцин (aIle), лантіонін (Lan), (1-нафтил)аланін (1-Nal), (2-нафтил)аланін (2-Nal), норлейцин (Nle), норвалін (Nva), орнітин (Orn), фенілгліцин (Phg), піпеколінова кислота (Pip), саркозин (Sar), селеноцистеїн (Sec), статин (Sta), β-тієнілаланін (Thi), 1,2,3,4-тетрагідроізохінолін-3карбонова кислота (Tic), ало-треонін (aThr), тіазолідин-4-карбонова кислота (Thz), γаміномасляна кислота (GABA), ізо-цистеїн (ізо-Cys), діамінопропіонова кислота (Dpr), 2,4діаміномасляна кислота (Dab), 3,4-діаміномасляна кислота (γβDab), біфенілаланін (Bip), фенілаланін, заміщений в пара-положенні за допомогою -C1-C6-алкілу, - галогеніду, -NH2, -CO2H або Phe(4-R) (де R = -C1-C6-алкіл, -галогенід, -NH2, або -CO2H); пептидні нуклеїнові кислоти (PNA, порівн., P.E. Nielsen, Acc. Chem. Res., 32, 624-30); або їх Nалкіловані аналоги, такі як їх N-метиловані аналоги. 17 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Циклічні амінокислоти можуть бути протеїногенними або не-протеїногенними, такі як Pro, Aze, Glp, Hyp, Pip, Tic і Thz. Для подальших прикладів і подробиць можна навести посилання, наприклад, J.H. Jones, J. Peptide Sci., 2003, 9, 1-8, розкриття якого повністю включене в дану заявку як посилання. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, терміни "непротеїногенна амінокислота" і "не-протеїногенний амінокислотний залишок" також охоплює похідні протеїногенних амінокислот. Наприклад, боковий ланцюг протеїногенного амінокислотного залишку може бути дериватизирований, у такий спосіб перетворюючи протеїногенний амінокислотний залишок в "не-протеїногенний". Аналогічне застосовується й для похідних C-кінця та/або N-кінця протеїногенного амінокислотного залишку, які знаходяться на кінцях амінокислотної послідовності. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, протеїногенний амінокислотний залишок має походження із протеїногенної амінокислоти, вибраної із групи, яка включає Ala, Arg, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr і Val або в L- або D-конфігурації; другий хіральний центр в Thr і Ile може мати або R- або Sконфігурації. Таким чином, наприклад, будь-яка посттрансляційна модифікація амінокислотної послідовності, така як N-алкілування, яка може відбуватися в природі, надає відповідному модифікованому амінокислотному залишку "непротеїногенність", хоча в природі вказаний амінокислотний залишок включений у білок. Переважно модифіковані амінокислоти вибирають із N-алкілованих амінокислот, ß-амінокислот, γ-амінокислот, лантіонінів, дегідро амінокислот, і амінокислот з алкілованими гуанідиновими фрагментами. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін "карбонова кислота" або “дикарбонова кислота” означає органічні сполуки, що мають один COOH фрагмент або два COOH фрагменти, відповідно, такі як, наприклад, мурашина кислота, оцтова кислота, пропіонова кислота, масляна кислота, циклогексан карбонова кислота, бензойна кислота, саліцилова кислота, молочна кислота (карбонові кислоти) або щавлева кислота, малонова кислота, янтарна кислота, адипінова кислота, фумарова кислота, малеїнова кислота, яблучна кислота, фталева кислота (дикарбонові кислоти), відповідно. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін "діамін” означає органічні сполуки, що мають два NR'R” фрагменти, де R' і R” незалежно один від одного можуть представляє собою алкіл, алкеніл, алкініл, арил. Діаміни можуть являти собою, наприклад, етилендіамін, 1, 4-циклогексан діамін, піперазин. Що стосується визначених у даному винаході вище амінокислот, карбонових кислот, дикарбонових кислот або діамінів, на які наводяться посилання, вони також специфічно включають відповідні радикали, отримані з таких амінокислот, карбонових кислот, дикарбонових кислот або діамінів, відповідно, і це охоплюється сполуками згідно з винаходом, тобто, -HN-…CO- (амінокислота), -OC-… (карбонова кислота), -OC-…-CO- (дикарбонова кислота), -HN-…-NH- (діамін), наприклад. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “хелатор металу” визначається як молекула, яка утворює комплекс із радіонуклідним металом з одержанням комплексу металу, який стабільний у фізіологічних умовах і який також може бути кон’югований із цільовою групою за допомогою спейсеру. Хелатор металу утворює комплекс або не утворює комплекс із радіонуклідним металом. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули; формулювання “радіонуклідний метал” визначається як радіонуклід, який являє собою атом з нестабільним ядром, де ядро характеризується надлишковою енергією, яка доступна для передачі або до знову створеної радіоактивної частинки в межах ядра, або ще до атомного електрона (див. внутрішнє перетворення). Радіонуклідні метали, використовувані в даній заявці, особливо придатні для діагностичного або терапевтичного застосування, більш переважно для візуалізації або променевої терапії. Радіонуклід, у цьому процесі, зазнає радіоактивного розпаду, і емітують (a) гамма-промені та/або елементарні частинки. Ці частинки становлять іонізуюче випромінювання. Радіонукліди можуть зустрічатися в природі, а також можуть бути отримані штучно. Ці радіонуклідні метали включають, але не обмежуючись тільки ними, галій (наприклад, 67 68 67 64 і 99m 94m Ga, Ga) мідь (наприклад, Cu і Cu); технецій (наприклад, Tc і Tc); реній (наприклад, 186 188 212 212 109 Re і Re); свинець (наприклад, Pb); вісмут (наприклад, Bi); і паладій (наприклад, Pd). Способи одержання цих ізотопів відомі. Комерційно доступні генератори молібден/технецій для 99m 186 одержання Tc. Процедури для одержання Re включають процедури, описані Deutsch та ін., (Nucl. Med. Biol., том 13:4:465-477, 1986) і Vanderheyden та ін. (Inorganic Chemistry, том 24:1666188 1673, 1985), і способи одержання Re описані Blachot та ін. (Intl. J. of Applied Radiation and 18 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 Isotopes, том 20:467-470, 1969) і Klofutar та ін. (J. of Radioanalytical Chem, том 5:3-10, 1970). 212 212 21 Одержання Pd описане в Fawwaz та ін., J. Νucl. Med, (1984), 25:796. Одержання Pb і Bi описане в Gansow та ін., Amer. Chem. Soc. Symp, Ser. (1984), 241:215-217, і Kozah та ін., Proc. 99m Νat'l. Acad. Sci. USA, (January 1986), 83:474-478. Tc є переважним для діагностичного застосування, і інші радіонукліди, перераховані вище, мають терапевтичне застосування. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “спейсер” визначається як зв’язувальна група між хелатором металу й антагоністами пептиду бомбезину. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули; формулювання “агоніст” означає речовину (ліганд), який зв'язується зі специфічним сайтом на рецепторній молекулі клітини й у такий спосіб активує передачу сигналів у клітці. Це приводить до вимірюваного ефекту. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули; формулювання “антагоніст” означає речовину (ліганд), яка зв'язується із сайтом на рецепторній молекулі, який специфічний для речовини-агоніста, блокуючи в такий спосіб цей сайт для агоніста, без здійснення ефекту. Таким чином, антагоніст інгібує дію агоніста. Як використовується надалі в описі даного винаходу й у пунктах формули, термін “аналог статину” визначається як ди-пептидний міметик з наступною загальною структурою Статин R2 = OH, R1 може значно змінюватися, але звичайно вони мають такі ж значення, що й бокові ланцюги амінокислот Аналоги статину R2 = H, R1 може значно змінюватися, але звичайно вони мають такі ж значення, що й бокові ланцюги амінокислот Скорочення: NODASA = 1,4,7-ТРИАЗАЦИКЛОНОНАН-1-ЯНТАРНА КИСЛОТА-4,7-АЦЕТООЦТОВА КИСЛОТА NODAGA =1,4,7-триазациклононан-N-глутарова кислота-N’,N’’-ацетооцтова кислота TRITA = 1,4,7,10 тетраазациклотридекан-1,4,7,10 N, N', N", N'"-тетраоцтова кислота Cpa = (S)-4-карбоксамідофенілаланін 4-Am-5-MeHpA = 4-аміно-5-метилгептанова кислота 4-Am-5-MeHxA = 4-аміно-5-метилкапронова кислота DFO = N'-[5-(ацетил-гідрокси-аміно)пентил]-N-[5-[3-(5-амінопентил-гідроксикарбамоїл)пропаноїламіно]пентил]-N-гідрокси-бутандіамід O NH O 35 N N H O HS NH S HN S H COOH триамід монотіол (MAG3) H H бісамін біс тіол (BAT) 19 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 NODAGA Без додаткових досліджень, припускають, що фахівець у даній галузі техніки може, застосовуючи попередній опис, використовувати даній винахід у його найбільш повному обсязі. Таким чином, наступні переважні специфічні варіанти здійснення інтерпретуються винятково як ілюстративні, і жодним чином не обмежують дане розкриття. Фігури Фігура 1: Криві залежності «доза-ефект» аналогів бомбезину, визначені за допомогою аналізу вивільнення кальцію. Аналіз вивільнення кальцію здійснювали, як описано в матеріалах і методах. PC3 клітини обробляли або бомбезином при концентраціях у діапазоні від 0,01 нмоль/л до 10 мкмоль/л () окремо, або в присутності 10 мкмоль/л аналогів бомбезину Сполука 1 (), або In- Сполука 1 (), або аналогів бомбезину Сполука 1a ().Сполука 1, тестували окремо при концентрації 1 мкмоль/л і 10 мкмоль/л Сполука 1 (), In- Сполука 1 () і сполука 1a () не має дії на вивільнення кальцію в PC3 клітинах. Сполука 1a стосується зв’язувальної послідовності 1, без лінкеру й хелату (D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2). Сполука 1 стосується хелату (DPhe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2).In-сполука 1 стосується In-хелатованого (D-Phe-GlnTrp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2). Фігура 2: Імунофлуоресцентна мікроскопія HEK-GRPR клітин Імунофлуоресцентна мікроскопія при введенні Сполуки 1, In-Сполуки 1, Сполуки 1b і GRPRАНТАГ, використовуючи мишине моноклональне антитіло з HА-епітопом і HEK-GRPR клітинами. (a) без пептиду, (b) 10 нмоль/л бомбезину, (c) Сполука 1b, (d) Сполука 1b + 10 нмоль/л бомбезину, (d, f, h, j) клітини, оброблені 10 нмоль/л бомбезину в присутності 1 мкмоль/л аналогів Сполука 1b, GRPR-АНТАГ, Сполука 1, і In-Сполука 1, (c, e, g, i) клітини, оброблені Сполукою 1b, GRPR-АНТАГ, і Сполукою 1. Фігура 3a, 3b, 4a, 4b: PET-Візуалізація в мишей, що несуть пухлину PC-3 (3) і LNCaP (4) для Ga-68-DOTA Сполуки 2. a) 1 година після ін'єкції 10 МБк радіоактивного індикатору, b) блоковано за допомогою 100 мкг бомбезину. Фігура 6: SPECT/CT (однофотонна емісійна комп'ютерна томографія/ комп'ютерна 99m томографія) зображення Tc-АRN4-06 (15 МБк/200 пмоль) у мишей, що несуть PС-3-пухлину 99m Фігура 8: SPECT/CT зображення Tc-АRN4-05 (15 МБк/200 пмоль) у мишей, що несуть PС3-пухлину. Фігура 9: ВЕРХ аналіз Ga-68-DOTA Сполуки 2 на колонці із оберненою фазою. Фігура 10a, b, c, d, e: Дослідження стабільності Ga-68-DOTA Сполуки 2 у плазмі й сечі мишей, при аналізі за допомогою ВЕРХ. Фігура 11: Стабільність у сироватці людини Lu-177-DOTA Сполуки 2. Фігура 12: Порівняння пухлина /тканина Ga-68 RM2 з F18 FDG і F18 холіном Повне (і) розкриття усіх заявок, патентів і публікацій, процитованих у даній заявці, повністю включені в даний винахід як посилання. Наступні приклади можуть бути повторені з подібним успіхом при заміні реагентів та/або умов здійснення, описаних у загальному або специфічно в даній заявці, на ті, які використовуються у вищепредставлених прикладах. З вищенаведеного опису, фахівець у даній галузі техніки може встановити суттєві характеристики даного винаходу й, без відхилення від суті й обсягу винаходу, може здійснити різні зміни й модифікації для адаптації до різних використань і умов. Приклади де A має значення A, а також A', у відповідних випадках, для всіх прикладів, описаних далі. Приклад 1 (A-B-C) де A має значення A, а також A', у відповідних випадках, для всіх прикладів, описаних далі. a) Синтез кон’югатів антагоніста пептиду бомбезину із загальною послідовністю (A = DOTA, B = Спейсер B1 – B2, C = Пептид з N-кінцевим амідом Z [Z = NH]) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 DOTA-Спейсер-Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Sta -Leu -NH2 20 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Пептиди синтезували вручну на твердій фазі, використовуючи Fmoc-Стратегію. Для одержання N-кінцевих амідів, використовували Rink амід MBHA полімер LL (100-200 меш) ( 4(2’,4’-Диметоксифеніл-Fmoc-амінометил)-феноксіацетамід-норлейцил-4-Метилбензгідриламін полімер. У цілому, Rink амід MBHA полімер з теоретичним завантаженням 0,34 ммоль/г полімеру вводили в реактор. У реактор додавали N, N-Диметилформамід (ДМФА) і струшували протягом 30 хвилин для можливості набрякання полімеру. Після видалення розчинника, додавали розчин 20 % піперидину в ДМФА й полімер струшували протягом 15 хвилин для видалення 9-флуоренілметоксикарбонільної (Fmoc) захисної групи. Цю стадію повторювали двічі. Після здійснення цієї процедури, полімер промивали три рази протягом 5 хвилин із ДМФА. Піперидиновий розчин і ДМФА розчин з останніх трьох промивань збирали й наповнювали етанoлом до 100 мл. Із цього розчину відбирали аліквоти для визначення кількості вилучених Fmoc-захисних груп спектрофотометрично. Перед комбінацією Fmoc-амінокислотний дериватизований полімер промивали два рази протягом 2 хвилин із ДМФА. 2 еквіваленти Fmoc-амінокислот, попередньо активованих з 2 еквівалентами N, N-Діізопропілкарбодііміду (DIC) / N-Гідроксибензотриазолу (HOBt), додавали до полімеру й значення pН доводили до 8-9 шляхом додавання близько 4 еквівалентів NЕтилдіізопропіламіну (DIPEA). Реакцію інкубували протягом 2 годин при обережному струшуванні. Після реакції, розчин видаляли й тверду фазу два рази промивали протягом 5 хвилин із ДМФА. За здійсненням реакції спостерігали за допомогою тесту Kaiser. Певну кількість кульок полімеру промивали 3 рази етанoлом, 50 мкл розчину 1 (20 г фенолу в 10 мл етанoлу змішували з 1 мл розчину 0,01 M KCN в 49 мл піридину) і 50 мкл розчину 2 (500 г нінгідрину в 10 мл етанoлу) додавали й кульки нагрівали протягом 10 хвилин при 95 °C. Сині кульки вказували на незв'язані функціональні аміногрупи. Усі амінокислоти використовували у вигляді N-кінцевих Fmoc-захищених похідних і їх об’єднували аналогічним способом. Триптофан використовували із третбутилоксикарбонільною (Boc) захисною групою на боковому ланцюзі, тоді як гістидин і глутамін були Trt захищені. Якщо Kaiser тест здійснювали після зв'язування кожної з амінокислот, і він вказував на неповне зв'язування функціональних аміногруп, зв'язування повторювали. Після створення повної бажаної пептидної послідовності, полімер промивали 5 разів із ДХМ, після цього 5 разів промивали простим діетиловим ефіром, кожного разу протягом 2 хвилин і висушували у вакуумі. t b) Зв'язуванням зі СПЕЙСЕРом і прохелатором DOTA( Bu)3 t Прохелатор DOTA( Bu)3 одержували від Macrocyclics Inc., Dallas, USA. Перед зв'язуванням зі СПЕЙСЕРом, N-кінцевий Fmoc-захист видаляли з пептидів, зв’язаних з полімером. Полімер набухав протягом 15 хвилин у ДМФА, його два рази обробляли розчином 20 % піперидину в ДМФА (15 хвилин) і промивали три рази за допомогою ДМФА. Розчин з піперидинових обробок і наступні ДМФА промивання збирали для визначення кількості відщеплених Fmoc груп. 2 еквіваленти Спейсеру, попередньо активованого з гексафторфосфатом 2-(1Н-9Азабензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметил-амінію (HATU) протягом 20 хвилин у ДМФА, додавали до полімеру. Значення pН доводили до 8-9 шляхом додавання DIPEA. Реакційну суміш струшували протягом 2 години й за зв'язуванням спостерігали за допомогою тесту Kaiser. t Прохелатор DOTA( Bu)3 зв'язували аналогічним способом після видалення Fmoc, як було t описано раніше. DOTA( Bu)3 зв'язування струшували протягом ночі. Після видалення розчину, полімер промивали 3 рази ДМФА, 5 раз ДХМ, після цього 5 раз промивали простим діетиловим ефіром, кожного разу протягом 2 хвилин і висушували у вакуумі. c) Зняття захисту, відщеплення й очищення Пептид-Полімер відбирали в шприц, обладнаний фритою. Додавали розчин трифтороцтової кислоти (ТФО)/тіоанізолу (TA)/триізопропілсилану (TIS)/H 2O (94/2/2/1) і шприц збовтували протягом 2 годин. Розчин додавали до суміші 50 % діізопропілового ефіру й 50 % діетилового ефіру на льоді, надаючи можливість осадитися пептиду. Пептид збирали шляхом центрифугування при 3000 об./хв. протягом 5 хвилин і супернатант відкидали. Осад декілька разів промивали діетиловим ефіром і висушували у вакуумі. Неочищений продукт розчиняли у воді й очищали шляхом напівпрепаративної ВЕРХ із оберненою фазою на системі Metrohm ВЕРХ LC-CaDI 22–14 (Herisau, Switzerland) із колонкою Macherey-Nagel VP 250/21 Nucleosil 100– 5 C18 (елюенти: елюент 1 =0,1 % ТФО у воді й елюент 2 = ацетонітрил; градієнт: 0-20 хв., 90 %50 % елюент 1; потік: 15 мл/хв.). Кон’югати аналізували шляхом аналітичної ВЕРХ із оберненою фазою й характеризували шляхом мас-спектроскопії (ESI-MS). A-B-C-1 6 7 8 9 10 11 12 13 14 DOTA-Спейсер-Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa3 - Xaa4 -ZH (Z = NH) 21 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Сполука 1: A = DOTA, B1 = Gly, B2 = 4-амінобензоїл; Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu, DOTA-Gly-амінобензоїл-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C80H114N20O20, + розраховано (m/z): 1675,8, виявлено [M+K] : 1715,1. Сполука 2: A = DOTA, B1 = 4-аміно-1-карбоксиметил-піперидиніл; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; + C79H118N20O19; розраховано (m/z): 1639,9, виявлено [M+K] : 1678,1 Сполука 3: A = DOTA, B1 = 4-аміно-1-піперидин-4-карбокси; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu DOTA-4-аміно-1-піперидин-4-карбонова кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 + C77H116N20O19, розраховано (m/z): 1624,9, виявлено [M+K] : 1663,7 Сполука 4: A = DOTA, B1 = 15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоїл; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu DOTA-15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His+ Sta-Leu-NH2; C82H127N19O23, розраховано (m/z): 1747,8, виявлено [M+K] : 1785,1 Сполука 5: A = DOTA, B1 = 15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоїл; B2 = 4-аміно-1піперидин-4-карбокси, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu DOTA-(15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота)-(4-аміно-1-карбоксиметилпіперидин)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C89H139N21O24, розраховано (m/z): 1886,0, + виявлено [M+K] : 1924,9 Сполука 6: A = DOTA, B1 = діаміномасляна кислота; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu DOTA-діаміномасляна кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C75H114N20O19, + розраховано (m/z): 1598,9, виявлено [M+K] : 1638,4 Сполука 7: A = DOTA, B1 =4-(2-аміноетил)-1-карбоксиметил-піперазиніл; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu DOTA-4-(2-аміноетил)-1-карбоксиметил-піперазин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu+ NH2; C79H121N21O19, розраховано (m/z): 1667,9, виявлено [M+Na] : 1691,2 Сполука 8: A = DOTA, B1 = (5-аміно-3-окса-пентил)-напівамід янтарної кислоти; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu DOTA-(5-аміно-3-окса-пентил)-напівамід янтарної кислоти-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-StaLeu-NH2 + C79H120N20O21, розраховано (m/z): 1685,9, виявлено [M+K] : 1723,7 Приклад 2 (A-B-C) a) Синтез кон’югатів антагоніста пептиду бомбезину із загальною послідовністю (A = N4-азидо, B = Спейсер B1 – B2, C = пептид з N-кінцевим амідом Z [Z = NH2]) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 N триазоли-dPEG1-Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Sta -Leu -NH2 6 7 8 9 10 11 12 13 14 a) Синтез пептидів: Fmoc-Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Sta -Leu -NH2 Пептиди синтезували вручну на твердій фазі, використовуючи Fmoc-стратегію. Для одержання N-кінцевих амідів, використовували Rink амід MBHA полімер LL (100-200 меш). Синтез здійснювали, як описано в прикладі 1. b) Сполучення з алкільною групою пропаргіл-dPEG1-NHS-складного ефіру Перед комбінацією з алкільною групою, N-кінцевий Fmoc-захист видаляли з пептидів, зв’язаних з полімером. Полімер набухав протягом 15 хвилин у ДМФА, його два рази обробляли розчином 20 % піперидину в ДМФА (15 хвилин) і промивали три рази за допомогою ДМФА. Розчин з піперидинової обробки й наступні ДМФА промивання збирали для Fmoc визначення. 2 еквіваленти пропаргіл-dPEG1-NHS-складного ефіру додавали до полімеру. Значення pН доводили до 8-9 шляхом додавання DIPEA. Реакційну суміш струшували протягом 24 години й за зв'язуванням спостерігали за допомогою тесту Kaiser. c) Зняття захисту, відщеплення й очищення Пептид-Полімер відбирали в шприц, обладнаний фритою. Додавали розчин ТФО/TIS/H 2O (94/2,5/2,5) і шприц збовтували протягом 2 годин. Розчин додавали до суміші 50 % діізопропілового ефіру й 50 % діетилового ефіру на льоді, надаючи можливість осадитися пептиду. Пептид збирали шляхом центрифугування при 3000 об./хв. протягом 5 хвилин і супернатант відкидали. Осад декілька разів промивали діетиловим ефіром і висушували у вакуумі. Неочищений продукт розчиняли у воді й очищали шляхом напівпрепаративної ВЕРХ із оберненою фазою, як описано вище. Кон’югати аналізували шляхом аналітичної ВЕРХ із оберненою фазою й характеризували шляхом мас-спектроскопії (ESI-MS). 22 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 d) Синтез N4-азидо хелатору. У синтезі задіяно 3 стадії. i) Синтез N,N’,N’’, N'''-тетракіс(трет-бутилоксикарбоніл)-6-(азидо)-1,4,8,11-тетраазаундекану (N4(Boc)4-N3) [3]: a) N,N’,N’’, N'''-тетракіс(трет-бутилоксикарбоніл)-6-(гідрокси)-1,4,8,11-тетраазаундекан (N4(Bob)4-OH) [1]: Розчин 6-(гідрокси)-1,4,8,11-тетраазаундекану (1 г, 3,1 ммоль) у ДМФА (10 мл) охолоджували до 0 °C. До нього додавали розчин ди-трет-бутилдикарбонату (3,32 мл, 15,5 ммоль) у ДМФА (5 мл), потім додавали DIPEA (2,7 мл, 15,5 ммоль). Після цього реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 18 годин. Після завершення цього часу реакції, реакційну суміш розподіляли між водою й етилацетатом. Водний шар екстрагували тричі за допомогою етилацетату й об'єднану етилацетатну фазу промивали розчином хлориду натрію й висушували над безводним сульфатом натрію. При здійсненні фільтрації й упарюванні розчинника при зниженому тиску одержували вказану в заголовку сполуку з виходом 86 %. ii) N,N’,N’’,N’’’-тетракіс(трет-бутилоксикарбоніл)-6-(O-метил сульфоніл))-1,4,8,11тетраазаундекан (N4(Bob)4-O-SO2CH3) [2]: До розчину 1 (300 мг, 0,54 ммоль) у піридині (3 мл) додавали метилсульфоніл хлорид (84 мкл, 1,08 ммоль). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі до її завершення, за чим спостерігали за допомогою ТШХ. Розчинник упарювали при зниженому тиску, залишок ресуспендували в етилацетаті. Етилацетат промивали три рази за допомогою 10 % NaНСО3 і води й висушували над безводним сульфатом натрію. При здійсненні фільтрації й упарюванні розчинника при зниженому тиску одержували неочищений продукт, який додатково очищали шляхом колонкової хроматографії на силікагелі, одержуючи вказану в заголовку сполуку з виходом 84 %. iii) N,N’,N’’, N'''-тетракіс(трет-бутилоксикарбоніл)-6-(азидо)-1,4,8,11-тетраазаундекан (N4(Boc)4-N3) [3]: Суспензію 2 (250 мг, 0,38 ммоль) і азиду натрію (100 мг, 1,52 ммоль) у ДМФА (3 мл) перемішували при 75 °C протягом 5 годин. Цю реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 18 годин. Потім реакційну суміш розподіляли між водою й етилацетатом. Водний шар екстрагували тричі за допомогою етилацетату й об'єднаний етилацетат промивали розчином хлориду натрію й висушували над безводним сульфатом натрію. При здійсненні фільтрації й упарюванні розчинника при зниженому тиску, одержуючи неочищений продукт, який потім очищали шляхом колонкової хроматографії. (вихід 88 %). d) Сполучення в розчині Пептид (6,2 мг, 5 мкм) з кінцевою алкільною групою й 3 (3 мг, 5 мкм) розчиняли в суміші 1:1 вода й трет-бутиловий спирт (1 мл). Додавали мідний порошок (10 мг), потім додавали 0,1 M водний пентагідрат сульфату міді (60 мкл, 6 мкм, 1,2 еквів.) і реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 24 годин. Мідний порошок відфільтровували, розчинник видаляли при зниженому тиску. Неочищений пептид очищали шляхом напівпрепаративної ВЕРХ із оберненою фазою. Кон’югат хелатор-пептид обробляли за допомогою ТФО:TIS:H2O (95:2:3) протягом 2 годин. Розчинник видаляли при зниженому тиску. Неочищений продукт розтирали в порошок з діетиловим ефіром і очищали шляхом напівпрепаративної ВЕРХ із оберненою фазою, як описано вище. Кон’югати аналізували шляхом аналітичної ВЕРХ із оберненою фазою й характеризували шляхом мас-спектроскопії (ESI-MS). Сполука 14: A =N4-азидо, B1 = пропаргіл-dPEG1-NHS-складний ефір; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Sta; Xaa4 = Leu N4-триазоли-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2; C68H105N21O13, розраховано + (m/z): 1424,7, виявлено [M+H] : 1425,5 Приклад 3 (A-B-C2) 6 7 8 9 10 11 12 DOTA-Спейсер- Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Leu(CHOH)-(CH2)2-CH3 Усі псевдопептиди синтезували в рідкій фазі шляхом конденсації гептапептиду Fmoc-D-PheGln-Trp-Ala-Val-Xaa2-His-OH з модифікованою амінокислотою H-Leuψ(CHOH)-(CH2)3-CH3. a) Синтез гептапептиду Fmoc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Xaa2-His-OH Пептиди синтезували вручну на 2-хлортритил хлорид полімері, використовуючи Fmoc стратегію. У цілому, 2-хлортритил хлорид полімер з теоретичним завантаженням 1,4 ммоль/г полімеру вводили в реактор. Полімер набухав у ДХМ протягом 30 хвилин і першу амінокислоту зв'язували шляхом додавання 1 еквівалента амінокислоти, змішаної з 4-кратним молярним надлишком DIPEA у ДХМ. Суміш для реакції сполучення перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин і потім полімер два рази промивали сумішшю ДХМ/MeОН/DIPEA (17/2/1), два рази ДХМ і на завершення він набухав у ДМФА. Fmoc знімали захист, 23 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 використовуючи 20 % піперидин у ДМФА, і кількість вилученої Fmoc- захисної групи визначали спектрофотометрично при 300 нм. Наступну амінокислоту зв'язували шляхом додавання 2кратного молярного надлишку амінокислоти, змішаної з еквімолярними кількостями DIC/HOBt, і 4-кратним молярним надлишком DIPEA у ДМФА. Полімер збовтували при кімнатній температурі протягом 2 годин і за здійсненням спостерігали за допомогою нінгідринового тесту Kaiser. Кожну амінокислоту зв'язували, використовуючи аналогічну стратегію. t b) Зв'язування зі СПЕЙСЕРом і прохелатором DOTA ( Bu)3 Зв'язування здійснювали, як описано вище. c) Відщеплення й очищення Повністю захищені пептиди відщеплювали від твердої основи шляхом суспендування полімеру в суміші ТФО/TIS/ДХМ (1/5/94). Декілька разів відсмоктували аж до об'єму 5 мл відщепленого розчину за допомогою шприца, інкубували протягом 10 хвилин і відщеплені фракції збирали в колбу об'ємом 50 мл. Після збору всіх фракцій, у колбу додавали 3X10 мл толуолу, розчинники упарювали й згодом продукт висушували протягом 1 години при вакуумі з масляним насосом. d) Синтез Boc-Leuψ(CHOH)-(CH2)3-CH3. Синтез здійснювали в три стадії. i) Синтез Boc-Leu-N(OCH3)CH3 Boc-Leu-ОН (1 г, 4,3 ммоль) розчиняли в ДХМ (30 мл) і додавали тетрафторборат 2-(1Н бензотриазол-1-іл)-1,1,3,3-тетраметилуронію (TBTU)(1,380 г, 4,3 ммоль), HOBt (0,581 г, 4,3 ммоль) і DIPEA (743 мкл, 4,3 ммоль) при 0 °C. Після перемішування протягом 5 хвилин, додавали гідрохлорид O, N-Диметилгідроксиламіну (0,461 г, 4,73 ммоль) і DIPEA (817 мкл, 4,73 ммоль). Усі тверді речовини розчинялися протягом 10 хвилин і суміш перемішували протягом ночі при КТ. Розчинник упарювали, реакційну суміш повторно розчиняли в AcOEt і декілька разів промивали за допомогою H2O, 5 % лимонної кислоти, H2O, 5 % водного розчину NaНСО3, насиченого розчину NaCl. Розчин висушували над MgSO4 і розчинник видаляли у вакуумі. Бажану сполуку очищали шляхом колонкової хроматографії на силікагелі. ESI-MS: розр. 269; + виявлено 292 [M +Na] . ii) Синтез Boc-Leu-(CH2)3-CH3 Магній (0,330 г, 13,6 ммоль) активували шляхом суспендування в толуолі протягом 30 хвилин в атмосфері N2. Толуол видаляли й Mg висушували в атмосфері N 2. До суспензії Mg у ТГФ (20 мл) додавали бромбутан (1,46 мл, 13,6 ммоль) по краплях і суміш нагрівали в колбі зі зворотним холодильником. Після розчинення всього магнію, по краплях додавали Boc-LeuN(OCH3)CH3 у ТГФ і реакцію перемішували протягом 2 годин при 0 °C. Додавали 1M HCl (150 мл), потім додавали етилацетат (100 мл). Органічний шар промивали 1M гідросульфатом калію, водою, висушували (Na2SO4) і концентрували у вакуумі. Очікуваний продукт очищали шляхом 1 13 колонкової хроматографії на силікагелі. Продукт характеризували шляхом Н-ЯМР і C-ЯМР. + ESI-MS: розр. 271; виявлено 293,3 [M +Na] . iii) Синтез Boc-Leuψ(CHOH)-(CH2)3-CH3 До розчину Boc-Leu-(CH2)3-CH3 (0,190 г, 0,7 ммоль) у метанoлі (5 мл) додавали NaBH4 (0,104 г, 2,8 ммоль). Реакційну суміш додатково перемішували протягом 1 години, потім нейтралізували оцтовою кислотою й розчинник видаляли при зниженому тиску. Очікуваний продукт осаджували з насиченим бікарбонатним розчином. Пептид збирали шляхом фільтрації, 1 13 промивали водою, гексаном і висушували. Продукт характеризували шляхом Н-ЯМР і C-ЯМР. + + ESI-MS: розр. 272; виявлено 273 [M +H] ; 547,7 [2M+H] . iv) Зв'язування в розчині Boc-Leuψ(CHOH)-(CH2)3-CH3 знімали захист, використовуючи розчин 80 % ТФО в ДХМ. Через 1 годину розчин концентрували, декілька разів промивали ДХМ і висушували. Хелатор-Спейсер-Пептид розчиняли в ДМФА, додавали HATU (1,2 еквівалента) і суміш перемішували протягом 1 години. H-Leuψ(CHOH)-(CH2)3-CH3 розчиняли в ДМФА й додавали до пептиду. Значення pН доводили до 8, використовуючи DIPEA, і реакцію перемішували протягом 4 годин при RT. Розчинник концентрували й пептид, повністю захищений, одержували шляхом осадження з H2O на льоді. Неочищений пептид осаджували, охолоджували, центрифугували й відокремлювали від розчинника шляхом декантування. Для одержання повністю незахищеного пептиду, його солюбілізували в суміші ДХМ/ТФО/TIS/H2O 10/85/2,5/2,5. Через 4 години розчин концентрували й пептид осаджували, використовуючи суміш 50 % діетилового ефіру й 50 % діізопропілового ефіру на льоді. Після цього пептид збирали шляхом центрифугування при 3000 об./хв. протягом 5 хвилин і супернатант відкидали. Осад декілька разів промивали діетиловим ефіром і після цього неочищений продукт витримували у вакуумі протягом ночі для видалення 24 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 розчинників, що залишилися. Неочищений продукт розчиняли у воді й очищали шляхом препаративної, як описано раніше. Кон’югати аналізували шляхом аналітичної ВЕРХ із оберненою фазою й характеризували шляхом мас-спектроскопії (ESI-MS). Сполука 9: A = DOTA, B1 = 4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH2)+ (CH2)2-CH3, C74 Н112N18O17, розраховано (m/z): 1524,8, виявлено [M+K] : 1564,3 Сполука 10: A = DOTA, B1 = 15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоїл; B2 = 4-аміно-1карбоксиметил-піперидин, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; DOTA-PEG4-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH+ CH2)-(CH2)2-CH3; C86H135N19O22, розраховано (m/z): 1786,9, виявлено [M+K] : 1811,1 Сполука 11: A = DOTA, B1 = 15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканоїл; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; DOTA-PEG4-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 + C78H121N17O21, розраховано (m/z): 1632,8, виявлено [M+K] : 1672,2 Приклад 4 (A-B-C-3) 6 7 8 9 10 11 12 13 14 DOTA-Спейсер-Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Xaa3 -Xaa4 -NH2 6 7 8 Синтез кон’югатів бомбезину із загальною послідовністю : DOTA-Спейсер-Xaa1 -Gln -Trp 9 10 11 12 Ala -Val -Xaa2 -His - Leuψ(CH2NH)-Phe-NH2 6 7 8 9 10 11 12 a) Синтез пептиду: Fmoc- Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His - Leuψ(CH2NH)-Phe-NH2 Пептиди синтезували вручну на MBHA полімері LL (100-200 меш) HCl, використовуючи Boc стратегію. У цілому, MBHA полімер з теоретичним завантаженням 0,59 ммоль/г вводили в реактор і він набухав у ДХМ протягом 30 хвилин. Полімер обробляли 3 рази (10 хв.) з розчином 10 % DIPEA у ДХМ. Перше зв'язування Boc-Leuψ(CH2NH)-Phe-ОН здійснювали, використовуючи 2 еквіваленти Boc-амінокислоти, активованої з 2 еквівалентами HOBt і 2 еквівалентами DIC. Суміш для реакції зв'язування перемішували при кімнатній температурі протягом 2 годин і за здійсненням реакції спостерігали за допомогою Kaiser нінгідринового тесту. Boc-захист знімали, використовуючи 30 % ТФО в ДХМ, і цю стадію повторювали два рази. Після цього полімер обробляли розчином 10 % DIPEA у ДХМ і сполучення здійснювали, як описано вище. (H-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH2NH)-Phe-NH2: C56H76N14O9, розраховано (m/z): + 1089,3, виявлено [M+H] : 1089,8 t b) Зв'язування зі СПЕЙСЕРом і прохелатором DOTA ( Bu)3 Зв'язування здійснювали, як описано вище. c) Зняттязахисту, відщеплення й очищення Пептид обробляли із ТФО (1 мл) і TIS (30 мкл) і суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 5 хвилин. Потім суміш охолоджували на льодяній бані й по краплях додавали трифторoметансульфонову кислоту (TFMSA) (100 мкл) при перемішуванні. Колбі запечатували пробкою й суміш перемішували при кімнатній температурі протягом 2 години. Об'єм зменшували у вакуумі й пептид осаджувався при додаванні холодного діетилового ефіру. Осад декілька разів промивали діетиловим ефіром і неочищений продукт висушували у вакуумі. Неочищений продукт розчиняли у воді й очищали шляхом препаративної ВЕРХ, як описано вище. Кон’югати аналізували шляхом аналітичної ВЕРХ із оберненою фазою й характеризували шляхом мас-спектроскопії (ESI-MS). Сполука 12: A = DOTA, B1 = 4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Leu(CH2NH); Xaa4 = Phe Xaa3-Xaa4= H N NH2 N H O 25 UA 103314 C2 5 10 15 20 DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH2NH)-PheNH2 + C79H114N20O17, розраховано (m/z): 1615,9, виявлено [M+K] : 1654,9 6 7 8 Синтез кон’югатів бомбезину із загальною послідовністю: DOTA-Спейсер-Xaa1 -Gln -Trp 9 10 11 12 Ala -Val -Xaa2 -His -Leuψ(CH2NH)-Cys-NH2 6 7 8 9 10 11 12 a) Синтез пептиду: Fmoc- Xaa1 -Gln -Trp -Ala -Val -Xaa2 -His -Leuψ(CH2NH)-Cys-NH2 Пептиди синтезували вручну за допомогою твердої фази на MBHA полімері (0,59 ммоль/г), використовуючи Boc-Стратегію. Boc-Cys(4-MeOBzl)-OH (2,5 екв.) зв'язували з полімером, використовуючи DIC (2,5 екв.) і HOBt (2,5 екв.) як активуючий реагент. Значення pН доводили 13 14 до 8 за допомогою DIPEA (5 екв.). Введення відновленого зв'язку ψ (CH2-NH) здійснювали за допомогою Boc-Leu-альдегіду (2,5 екв.), розчиненого в підкисленому диметилформаміді. Повільно додавали NaBH3CN (2,5 екв.) у ДМФА, протягом 20 хвилин, і реакцію перемішували протягом 1 години при КТ. Після утворення відновленого пептидного зв'язку, усі реакції зв'язування здійснювали з використанням N-Boc-захищених амінокислот. t b) Зв'язування зі СПЕЙСЕРом і прохелатором DOTA ( Bu)3 Зв'язування здійснювали, як описано вище. c) Зняття захисту, відщеплення й очищення Зняття захисту, відщеплення й очищення здійснювали, як описано раніше. Кон’югати аналізували шляхом аналітичної ВЕРХ із оберненою фазою й характеризували шляхом масспектроскопії (ESI-MS). Сполука 13: A = DOTA, B1 = карбоксиметил-піперидин; B2 = нема, Xaa1 = DPhe; Xaa2 = Gly; Xaa3 = Leu(CH2NH)-; Xaa4 = Cys SH Xaa3-Xaa4= H N NH2 N H O 25 30 35 40 45 50 DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CH2NH)-Cys+ NH2; C73H110N20O17S, розраховано (m/z): 1571,8, виявлено [M+Na] : 1593,6 Приклад 4 Введення радіоактивної мітки в синтезовані кон’югати (сполуки 1-13) Загальна процедура До 10 мкг аліквоти кон’югату антагоніста пептиду хелатор-бомбезин у воді додавали 1-2 мКі 111 177 67/68 водного розчину ( InСl3, LuСl3 або GaСl3) і 250-500 мкл 0,4M натрій-ацетатного буфера (рН=5). Цей розчин нагрівали протягом 30 хвилин при 95 °C і охолоджували до кімнатної температури протягом 10 хвилин. Аліквоту 5 мкл реакційної суміші додавали до 25 мкл CaDTPА розчину (0,1 M, рН 5,2) і аналізували за допомогою ВЕРХ для визначення кількості неміченого радіонукліда. Приклад 5 115 Введення радіоактивної мітки в синтезовані кон’югати за допомогою In. nat Комплексоутворення аналогів бомбезину з In здійснювали згідно з аналогічним nat nat протоколом. In використовували у формі InСl3 розчину й при молярному співвідношенні 1:1. Приклад 6 (In vitro дослідження) Матеріали й методи для in vitro характеристики антагоністів GRP рецепторів Реагенти й пептиди Усі реагенти були найкращими з можливих класів і їх одержували з комерційних джерел. Мишине моноклональне антитіло з гемаглютиніновим (HA) епітопом одержували від Covance (Berkeley, CA). Вторинні антитіла Alexa Fluor 488 козячі антимишині IgG (H+L) одержували від 6 13 14 Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Бомбезин і антагоніст [D-Phe , Leu-NHEt , des-Met ]бомбезин(6-14) ( GRPR-АНТАГ) одержували від Bachem (Bubendorf, Switzerland). RM26, RM1b, 175 In-RM1b, і Lu-AMBA були надані H.R. Mäcke (Basel, Switzerland). Набір для дослідження кальцію «Fluo-4NW Calcium Assay» одержували від Molecular Probes, Inc. (Eugene, OR). Клітинні лінії Клітини нирки людських ембріонів 293 (HEK293), які стабільно експресують HА-епітоп, націлені на рецептор GRP людину (HEK-GRPR), створювали, як було описано раніше (Cescato та ін., 2008) і культивували при 37 °С і 5 % CO2 у середовищі Ігла, модифікованому за способом 26 UA 103314 C2 TM 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Дульбеко, з GlutaMAX -I (DMEM), що містить 10 % ( об./ об.) фетальної бичачої сироватки (FBS), 100 од./мл пеніциліну, 100 мкг/мл стрептоміцину й 750 мкг/мл G418. Клітини раку передміхурової залози людину (PC3 клітини) одержували від DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen Gmbh; DSMZ №: ACC465) і культивували при 37 °С і 5 % CO2 у середовищі Хема F12K, що містить 2 мM L-Глутаміну й доповненого 10 % (об./ об.) FBS, 100 од./мл. пеніциліну й 100 мкг/мл стрептоміцину. Усі культуральні реагенти одержували від Gibco BRL (Grand Island, NY). Вимірювання зв’язувальної здатності Зв’язувальну здатність до GRP рецептора для різних сполук визначали шляхом авторадіографії рецепторів in vitro на кріостатних зрізах або добре вивченому раку передміхурової залози, або на зрізах клітинної маси HEK-GRPR або PC3, як було описано раніше (Markwalder та ін., Can. Res., 1999; 59, 1152-1159; Reubi та ін., Eur. J. Nucl. Med., 2000;27: 273-282; Reubi та ін., Clin. Cancer Res. 2002;8 1139-1146). Використовуваними радіоактивними 125 4 лігандами були I-[Tyr ]-бомбезин, який, як відомо, переважно мітить GRP рецептори (Vigna та 125 6 11 13 14 ін., Gastroenterology. 1987;93: 1287-1295) і I-[D-Tyr , -Ala , Phe , Nle ]-бомбезин(6-14) як універсальний ліганд рецептора бомбезину (Gastroenterology. 1987;93: 1287-1295). Результати представлені в таблиці 1. Імунофлуоресцентна мікроскопія Імунофлуоресцентну мікроскопію, засновану на інтерналізації, з HEK-GRPR клітинами здійснювали, як було описано раніше (Cescato та ін., 2006; Cescato та ін., 2008). Коротко, HEKGRPR клітини вирощували на покриті полі-D-лізином (20 мкг/мл) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 35 мм планшетах на 4 лунки (Cellstar, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany). Для експерименту, клітини обробляли або 10 нM бомбезину, або 1 мкM різних аналогів бомбезину, або, для оцінки потенційного антагонізму, 10 нM бомбезину в присутності 100-кратного надлишку цих різних аналогів протягом 30 хвилин при 37 °C і 5 % CO2 у ростовому середовищу, і потім обробляли для імунофлуоресцентної мікроскопії, використовуючи мишине моноклональне антитіло з HА-епітопом при розведенні 1:1,000 як первинне антитіло й Alexa Fluor 488 козяче антимишине IgG (H+L) при розведенні 1:600 як вторинне антитіло. Клітини візуалізували, використовуючи флуоресцентний мікроскоп Leica DM RB і камеру Olympus DP10. Інтерналізації GRP рецептора, індукованій бомбезином, ефективно протидіяли аналоги бомбезину Сполука 1, In-Сполука 1, Сполука 1b і GRPR-АНТАГ. HEK-GRPR клітини обробляли протягом 30 хвилин або наповнювачем (без пептиду, a), або 10 нмоль/л бомбезину (b), концентрацією, яка індукує субмаксимальну інтерналізуючу дію. На панелях (d, f, h, j) представлені клітини, оброблені 10 нмоль/л бомбезину в присутності 1 мкмоль/л аналогів Сполуки 1b, GRPR-АНТАГ, Сполуки 1, і In-Сполуки 1. Дія Сполуки 1b, GRPR-АНТАГ, Сполуки 1, і In-Сполуки 1 окремо при концентрації 1 мкмоль/л презентована на панелях (c, e, g, i, k). Після інкубування з пептидами, клітини обробляли для імуноцитохімії, як описано вище. Чітке точкове перинуклеарне фарбування визначали для клітин, оброблених бомбезином. Це точкове фарбування ефективно знімається надлишком аналогів Сполука 1, In-Сполука 1, Сполука 1b і GRPR-АНТАГ. Сполука-1, In-Сполука 1, Сполука 1b і GRPR-АНТАГ при самостійному введенні не виявляють впливу на інтерналізацію GRP рецептора. Див. результати в таблиці 1 і фігурі 2. Дослідження вивільнення кальцію. Внутрішньоклітинне вивільнення кальцію вимірювали в PC3 клітинах, використовуючи набір для аналізу кальцію «Fluo-4NW Calcium Assay», як описано раніше (Magrys та ін., J. Clin. Immunol. 2007, 27, 181-192; Michel та ін.,; Cescato та ін., J. Nucl. Med. 2008; 49: 318-326). Коротко, PC3 клітини висівали (10 тис. клітин лунку) у планшети на 96 лунок і культивували протягом 2 днів при 37 °С і 5 % CO2 у культуральному середовищі. У день експерименту, клітини промивали буфером для аналізу (1 x HBSS, 20 мM HEPES) що містить 2,5 мM пробенециду, і потім додавали 100 мкл/лунку Fluo-4NW барвника в буфері для аналізу, що містить 2,5 мM пробенециду протягом 30 хвилин при 37 °С і 5 % CO2 і потім додатково протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Для вимірювання внутрішньоклітинної мобілізації кальцію після стимуляції тестованими аналогами бомбезину, клітини, до яких був доданий барвник, e переносили в Spectramax M2 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Внутрішньоклітинну мобілізацію кальцію записували в кінетиці протягом 60 секунд при кімнатній температурі, спостерігаючи за випромінюванням флуоресценції при 520 нм (з ex = 485 нм) у присутності аналогів у вказаних концентраціях. Максимальну флуоресценцію (F-max) вимірювали після додавання 25 мкM іономіцину. Вимірювання вихідного рівня (F-baseline) проводили на необроблених клітинах з доданим барвником. Дані представлені у вигляді максимальної кальцієвої відповіді (F-max – F-baseline = 100 % максимальної кальцієвої відповіді), як було 27 UA 103314 C2 5 10 15 20 25 30 описано раніше (Magrys та ін., J. Clin. Immunol. 2007, 27, 181-192; Michel та ін., Cescato та ін., J. Nucl. Med. 2008; 49: 318-326).). Усі досліди повторювали принаймні три рази в трьох повторах. На фігурі 1 показано, що In-Сполука 1 і сполука 1a поводяться як антагоністи, зрушуючи криву залежності «доза-ефект» вправо в присутності бомбезину (BB). Результати представлено в таблиці 1 і фігурі 1. Сполука 1: DOTA-Gly-амінобензоїл-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 Сполука 2: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-LeuNH2 Сполука 3: DOTA-4-аміно-1-піперидин-4-карбонова кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisSta-Leu-NH2 Сполука 4: DOTA-15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота-D-Phe-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Sta-Leu-NH2 Сполука 5: DOTA-(15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота)-(4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин)-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 Сполука 6: DOTA-діаміномасляна кислота-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2 Сполука 7: DOTA-4-(2-аміноетил)-1-карбоксиметил-пиперазин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisSta-Leu-NH2 Сполука 8: DOTA-(5-аміно-3-окса-пентил)-напівамід янтарної кислоти-D-Phe-Gln-Trp-Ala-ValGly-His-Sta-Leu-NH2 Сполука 9: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 Сполука 10: DOTA-(15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота-4-аміно-1карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 Сполука 11: DOTA-15-аміно-4,7,10,13-тетраоксапентадеканова кислота -D-Phe-Gln-Trp-AlaVal-Gly-His-Leuψ(CHOH-CH2)-(CH2)2-CH3 Сполука 12: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeuψ(CH2NH)-Phe-NH2 Сполука 13: DOTA-4-аміно-1-карбоксиметил-піперидин-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HisLeuψ(CH2NH)-Cys-NH2 Сполука 14: N4-триазоли-dPEG1-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Sta-Leu-NH2. Таблиця 1 Властивості аналогів BN щодо зв'язування, передачі сигналів і інтерналізації GRP рецептора при дослідженні in vitro Сполука 1 In-1 2 115 In-2 3 4 5 6 7 8 9 115 In-9 10 115 Зв'язування IC50 (нM) середнє значення ± СПС 30±4,5 16±5,3 9,7±3,8 9,3±1,9 43±14 21±6,5 7,3±0,6 7,4±2,2 11±0 19±3,0 3,2±1,3 2,5±0,2 6,9±0,5 Передача сигналів ++ Ca мобілізація Інтерналізація рецептора АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії NA NA АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії АНТАГ / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії NA NA Антаг / немає агоністичної дії Антаг / немає агоністичної дії NA 115 35 Зв’язувальні здатності сполук 1, 2 і 9 вимірювали після комплексоутворення з In нерадіоактивним ізотопом. Отримані дані свідчать про те, що комплексоутворення з ізотопом не виявляє впливу на здатність зв'язуватися з рецептором, а також на антагоністичні властивості. Стандартні методи в релевантних публікаціях: Cescato R, Schulz S, Waser B, та ін. Internalization of sst2, sst3 and sst5 receptors: Effects of somatostatin agonists and antagonists. J. Nucl. Med., 2006;47:502-511. 28