Спосіб оцінки токсичності водного середовища за допомогою ліпідів організму риб

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб оцінки токсичності водного середовища за допомогою ліпідів організму риб, який включає оцінку забруднення водного середовища іонами металів, який відрізняється тим, що проводять визначення ліпідного складу клітин зябер та гепатопанкреасу риб, який модулюють концентрацією іонів цинку та кадмію, які розчинені у водному середовищі.

Текст

Реферат: Спосіб оцінки токсичності водного середовища за допомогою ліпідів організму риб включає оцінку забруднення водного середовища іонами металів. Проводяться визначення ліпідного складу клітин зябер та гепатопанкреасу риб, який модулюється концентрацією іонів цинку та кадмію, які розчинені у водному середовищі. UA 86248 U (12) UA 86248 U UA 86248 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель з області обстеження довкілля і може бути використана для оцінки забруднення водних екосистем іонами металів та якості рибної продукції. Відомий спосіб визначення фізіолого-біохімічних показників індикаторних організмів біологічної оцінки токсичності морського середовища (Патент України на корисну модель № 27484U опубл. 12.11.2007, бюл. № 18), "Спосіб біологічної оцінки токсичності морського середовища" який полягає у дослідженні фізіологічного стану риб шляхом визначення і порівняння величини ступеня окислювання білків сироватки крові риб. Недоліками цього способу є обмеженість застосування лише морським середовищем з відсутністю чітких критерії інтерпретації результатів. Відомий також спосіб (WO/2002/022859) "Визначення здоров'я екосистем шляхом оцінки множинних біомаркерів у живому організмі крім людини" який полягає у визначенні комплексу показників токсичності, за якими встановлюється рівень потенційного забруднення навколишнього середовища. Недоліками цього способу є висока собівартість дослідження, необхідність використання таксономічно різних організмів, відсутність відтворюваності стабільних показників оцінки токсичності водного середовища. В основу корисної моделі поставлено задачу створення чутливого способу біомоніторингу забруднення водойм іонами металів шляхом аналізу біологічної відповіді організму гідробіонтів на їх дію. Поставлена задача вирішується шляхом кількісного аналізу співвідношення ліпідів в клітинах зябер та гепатопанкреасу риб, яке модулюється рівнем металів у водному середовищі, що встановлюється експериментальним шляхом. Реалізація корисної моделі проілюстрована на прикладі оцінки штучно створеного забруднення водного середовища цинком та кадмієм (біогенним та небіогенним металом, 3 механізм надходження яких в організм гідробіонтів є схожим) в концентраціях 0,5 і 2 мг/дм для 2+ 3 2+ Zn і 0,005 і 0,02 мг/дм для Cd , що відповідали 0,5 та 2,0 рибогосподарським ГДК (допорогова і сублетальна концентрація). Необхідну концентрацію іонів металу у воді створювали внесенням солей ZnSO47H2O і CdCl22,5H2O кваліфікації "х.ч.". Об'єктом дослідження вибрано дворічок двох промислових видів риб - щуку (Esox Lucius L.) та коропа (Cyprinus carpio L.), що є, відповідно, пелагічною та донною рибами. У результаті цього, вони відрізняються не лише за рівнем метаболічної активності, а й за біоакумуляційною 3 здатністю. Риб утримували в акваріумах об'ємом 200 дм з відстояною водопровідною водою 3 3 (вміст О2 складав 7,5±0,5 мг/дм ; СО2 - 2,5±0,3 мг/ дм ; рН - 7,8±0,1). Період аклімації риб до іонів досліджених металів становив 14 діб, що є достатнім для формування адаптивної відповіді на дію стрес-фактору. Екстракція ліпідів. Безпосередньо перед дослідженням риб забивали шляхом декапітації та проводили екстирпацію досліджуваних тканин. Після цього їх гомогенізували в охолодженому -4 розчині такого складу: 0,22 М сахароза, 10 М ЕДТА та 0,01 М тріс-НСl (рН 7,2) у співвідношенні 1:5. Використовували глюкозу "чда", ЕДТА та тріс-НСl ("Мерк", Німеччина). Ліпіди екстрагували додаванням до гомогенату хлороформ-метанолової суміші у співвідношенні 2:1 за методом Фолча. Неліпідні домішки з екстракту видаляли шляхом їх відмивання 1 % розчином KСl. Дослідження вмісту неполярних ліпідів та їх окремих класів. Розділення неполярних ліпідів на окремі фракції проводили методом висхідної одномірної тонкошарової хроматографії на пластинках "Sorbfil". Рухомою фазою служила суміш гексану, діетилового ефіру та льодяної оцтової кислоти у співвідношенні 70:30:1. Одержані хроматограми проявляли в камері, насиченій парами йоду. Для ідентифікації окремих фракцій ліпідів використовували специфічні реагенти і очищені стандарти. Виявлено такі фракції: фосфоліпіди (ФЛ), діацилгліцероли (ДАГ), холестерол (ХЛ), неетерифіковані жирні кислоти (НЕЖК), моноацилгліцероли (МАГ) і триацилгліцероли (ТАГ). Кількість неполярних ліпідів визначали біхроматним методом. Дослідження вмісту фосфоліпідів та їх окремих фракцій. Розділення фосфоліпідів на окремі фракції проводили методом висхідної тонкошарової хроматографії на пластинках "Sorbfil". Для визначення фракцій фосфоліпідів пластинки елюювали у суміші хлороформ-метанол-льодяна оцтова кислота-дистильована вода у співвідношенні 60:30:7:3. Виявлено такі фракції: лізофосфатидилхолін (ЛФХ), фосфатидилсерин (ФС), фосфатидилетаноламін (ФЕА), фосфатидилхолін (ФХ), сфінгомієлін (CM) та фосфатидилінозитол (ФІ). Хроматограми після висушування проявляли у камері, насиченій парами йоду. Для ідентифікації окремих фракцій використовували очищені стандарти. Кількість фосфоліпідів визначали за методом Васьковського. 1 UA 86248 U 5 10 15 20 25 30 Визначення вмісту акумульованого металу. Визначення вмісту кадмію здійснювали після спалювання зябер в перегнаній нітратній кислоті у співвідношенні 1:5 (маса:об'єм) на атомноадсорбційному спектрофотометрі С-115, і виражали в нг/мг білка. Визначення вмісту продуктів пероксидного окиснення ліпідів. Вміст ТБК-активних продуктів вимірювали після реакції з 2-тіобарбітуратною кислотою. Вміст гідропероксидів ліпідів визначали методом В.В. Мирончинка. Для визначення ферментативної активності виділені мітохондрії після промивання ресуспендували в 0,1 М фосфатному буфері (рН 7,8). Температура інкубації становила 18 °C. Визначення ферментативної активності цитохромоксидази (ЦО) проводили методом Штрауса. На основі дослідження ліпідного складу клітин досліджуваних тканин риб визначається співвідношення ліпідів за наступною залежністю: ФЕА  ЛФХ  НЕЖ К співвідношення ліпідів  ФХ  СМ  ТАГ  ХЛ . У чисельнику формули знаходиться показники суми вмісту ліпідів, що спричиняють порушення структури клітинної мембрани і збільшують їх проникність. Це відбувається внаслідок того, що ЛФХ і НЕЖК мають детергентні властивостями, а накопичення ФЕА з одночасним зниженням вмісту ФХ порушує структуру ліпідного бішару. У знаменнику розміщені показники вмісту ліпідів, що сприяють підтриманню функціональної структури мембрани у нормі, її ущільненню, зниженню проникності для іонів металів та захисту від патологічної дії АФК і лізосомальних ліпаз. Збільшення коефіцієнта, порівняно з контрольними значеннями, свідчить про формування адаптивної відповіді клітин шляхом ущільнення клітинної мембрани та зниження її проникності. Натомість, зниження його значення свідчить про розвиток патологічного стану мембран обумовленого зміною структури біліпідного та накопиченням ліпідів з детергентними властивостями. 3 2+ За впливу 0,5 мг/дм іонів Zn у зябрах та гепатопанкреасі коропа і щуки встановлено зниження запропонованого співвідношення ліпідів, що вказує на анаболічну перебудову ліпідного обміну у цих тканинах риб, а отже, і на не токсичну дію цієї концентрації металу. Підтвердженням цього є стан антиоксидантної системи зябер і печінки риб та зростання ферментативної активності цитохромоксидази (табл. 1). 3 Вплив 2,0 мг/дм цинку індукував у клітинах зябер та печінки риб розвиток патологічних процесів, підтвердженням чого є накопичення гідропероксидів ліпідів, ТБК-активних продуктів і зниження активності цитохромоксидази. Такі зміни підтверджуються збільшенням значення запропонованого нами співвідношення ліпідів. 35 Таблиця 1 Вплив іонів цинку на організм коропа та щуки контроль короп зябра 3 0,5 мг/дм співвідношення 0,64 0,42 ліпідів пероксиди ліпідів Е/г 3,44±0,23 3,20±0,15 ТБК-продукти нмоль/г 5,71±0,52 5,83±0,44 акумуляція нг/мг білка 1901,4±87,0 2126±112,0* ЦО мкг/мл за 20 хв 168,7±8,8 272,8±10,4* короп печінка співвідношення 0,84 0,58 ліпідів пероксиди ліпідів Е/г 2,53±0,23 2,12±0,2* ТБК-продукти нмоль/г 5,21±0,31 4,68±0,27* акумуляція нг/мг білка 1056±83,6 1094±77,0 ЦО мкг/мл за 20 хв 50,04±3,8 74,4±6,7* 2 мг/дм контроль щука зябра 3 0,5 мг/дм 2 мг/дм 1,18 0,62 0,46 1,37 3,87±0,31* 8,3±0,46* 2357±121,3* 89,4±6,4* 5,38±0,37 7,67±0,33 172,93±6,9 188,98±9,7 4,21±0,43* 6,78±0,55* 213,43±7,2* 261,08±8,8* щука печінка 6,42±0,39* 9,16±0,51* 231,63±9,0* 119,54±6,6* 1,37 0,89 0,78 1,66 3,59±0,25* 7,52±0,35* 1812±111,5* 35,94±4,2* 4,08±0,19 6,73±0,2* 89,08±5,5 58,74±5,8 3,12±0,21* 5,18±0,24* 133,03±8,9* 73,61±8,3* 5,39±0,28* 8,24±0,33* 182,7±9,2* 46,2±6,6* 3 3 Результати впливу іонів кадмію на організм коропа та щуки представлені у таблиці 2. 2 UA 86248 U Таблиця 2 Вплив іонів кадмію на організм коропа та щуки короп зябра 3 3 контроль 0,005 мг/дм 0,02 мг/дм контроль співвідношення 0,64 0,93 1,59 0,63 ліпідів пероксиди ліпідів 3,75±0,27 4,83±0,36* 6,38±0,33* 5,23±0,24 Е/г ТБК-продукти 5,05±0,32 6,49±0,2* 9,74±0,38* 7,48±0,29 нмоль/г акумуляція нг/мг 197,75±26,3 250,63±37,2* 340,73±39,2* 298,21±31,3 білка ЦО мкг/мл за 20 хв 171,0±9,2 141,4±10,1* 88,90±6,4* 197,48±8,5 короп печінка співвідношення 0,84 1,18 1,64 0,87 ліпідів пероксиди ліпідів 2,38±0,19 2,96±0,22* 4,76±0,24* 4,83±0,28 Е/г ТБК-продукти 5,41±0,42 6,29±0,29* 9,5±0,37* 6,46±0,33 нмоль/г акумуляція нг/мг 162,57±11,3 194,4±9,7* 243,74±12,5* 183,40±5,7 білка ЦО мкг/мл за 20 хв 54,40±4,8 61,60±5,9* 31,40±5,2* 60,27±4,2 5 10 15 20 щука зябра 3 3 0,005 мг/дм 0,02 мг/дм 0,81 1,47 6,21±0,19* 9,58±0,42* 8,80±0,41* 10,94±0,36* 334,83±40,0* 446,79±29,7* 163,38±8,8* 111,37±5,1* щука печінка 0,53 1,14 3,68±0,23* 6,17±0,18* 5,32±0,27* 9,49±0,39* 195,65±4,9* 217,47±18,8* 70,28±3,3* 42,84±2,3* Зниження вмісту продуктів пероксидації ліпідів та активація ферментативної активності 3 2+ цитохромоксидази встановлено лише у гепатоцитах щуки за дії 0,005 мг/дм іонів Cd , поряд з цим значення досліджуваного показника знизилося. У той же час в інших тканинах щуки та коропа за дії обох досліджуваних концентрацій кадмію встановлено зростання процесу пероксидації ліпідів та інгібування цитохром с-оксидази. Такі зміни стану досліджуваних тканин риб спричинене токсичною дією іонів кадмію, що відповідно позначилося і на запропонованому ліпідному співвідношенні. Таким чином, запропонований нами спосіб оцінки токсичності водного середовища, шляхом визначення співвідношення ліпідів дозволяє кількісно оцінити стан забруднення водного середовища іонами металів за змінами ліпідного складу клітин гепатопанкреасу для цинку та зябер для кадмію природних популяцій риб. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ Спосіб оцінки токсичності водного середовища за допомогою ліпідів організму риб, який включає оцінку забруднення водного середовища іонами металів, який відрізняється тим, що проводять визначення ліпідного складу клітин зябер та гепатопанкреасу риб, який модулюють концентрацією іонів цинку та кадмію, які розчинені у водному середовищі. Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: C11C 1/00, G01N 33/12

Мітки: організму, водного, допомогою, оцінки, риб, середовища, спосіб, ліпідів, токсичності

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/5-86248-sposib-ocinki-toksichnosti-vodnogo-seredovishha-za-dopomogoyu-lipidiv-organizmu-rib.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб оцінки токсичності водного середовища за допомогою ліпідів організму риб</a>

Подібні патенти