Спосіб виготовлення специфічного антивидового овісного пероксидазного кон’югату для діагностики захворювань інфекційної етіології у сироватці крові дрібної рогатої худоби імуноферментним методом (elisa)

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб виготовлення специфічного антивидового овісного пероксидазного кон'югату для діагностики захворювань інфекційної етіології у сироватці крові дрібної рогатої худоби імуноферментним методом (ELISA), що включає осадження імуноглобулінів (Ig) ПЕГом, центрифугування, отримання загальної фракції гаммаглобуліну, який відрізняється тим, що осадження ПЕГом проводять одноразово, центрифугують при 3000 об./хв. протягом 15 хв. та додатково проводять іонообмінну хроматографію з подальшою фільтрацією отриманого розчину Ig, імунізацію гетерогених тварин з виділенням IgG із антисироватки та кон'югацією отриманих IgG за методом Nakane з пероксидазою хрону.

Текст

Реферат: Спосіб виготовлення специфічного антивидового овісного пероксидазного кон'югату для діагностики захворювань інфекційної етіології у сироватці крові дрібної рогатої худоби імуноферментним методом (ELISA) включає осадження імуноглобулінів (Ig) ПЕГом, центрифугування, отримання загальної фракції гаммаглобуліну. Осадження ПЕГом проводять одноразово, центрифугують при 3000 об./хв. протягом 15 хв. та додатково проводять іонообмінну хроматографію з подальшою фільтрацією отриманого розчину Ig, імунізацію гетерогених тварин з виділенням IgG із антисироватки та кон'югацією отриманих IgG за методом Nakane з пероксидазою хрону. UA 84118 U (12) UA 84118 U UA 84118 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до ветеринарної імунології, зокрема до виготовлення специфічного антивидового овісного пероксидазного кон'югату для імуноферментних методів при діагностиці захворювань інфекційної етіології у сироватці крові дрібної рогатої худоби. Відомо, що існує тест-система діагностична імуноферментна для визначення протибруцельозних антитіл у сироватках крові людини або великої рогатої худоби (ВРХ) (патент України на винахід № 48811, МПК А61К 39/21, Тест-система діагностична імуноферментна для визначення протибруцельозних антитіл у сироватках крові людини або великої рогатої худоби (ВРХ), 15.08.2002. Бюлетень № 8), в складі якої як кон'югат використовують антивидові антитіла (анти IgM+IgG людини або анти-ВРХ), мічені ферментом, але компоненти не можуть бути використані для виділення специфічних антитіл у сироватці крові дрібної рогатої худоби при постановці імуноферментного аналізу. Найбільш близьким до корисної моделі є спосіб виділення імуноглобуліну G із сироватки крові курей (АС № 1695931. Способ выделения иммуноглобулина G из сыворотки крови кур, 07.12.1991. Бюлетень № 45). За цим способом отримують IgG багатостадійним методом, а саме: дворазово осаджують ПЕГом, центрифугують 4 рази, інкубують 3 рази та проводять одноразово діаліз. Недоліком даного способу є те, що він трудомісткий, тривалий у виконанні та передбачає виділення Ig G лише з сироватки курей. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб виготовлення специфічного антивидового овісного пероксидазного кон'югату для діагностики захворювань інфекційної етіології у сироватці крові дрібної рогатої худоби імуноферментним методом (ELISA), що включає осадження імуноглобулінів (Ig) ПЕГом, центрифугування, отримання загальної фракції гаммаглобуліну, шляхом одноразового осадження ПЕГом, центрифугування при 3000 об./хв. протягом 15 хвилин, та додаткового проведення іонообмінної хроматографії з подальшою фільтрацією отриманого розчину Ig, імунізації гетерогенних тварин, з виділенням Ig G із антисироватки та кон'югації отриманих Ig G за методом Nakane з пероксидазою хрону. Порівняльний аналіз з прототипом дозволяє зробити висновок, що спосіб, який пропонується, відповідає критерію "новизна". Спосіб виконується таким чином. На першому етапі із сироватки крові дрібної рогатої худоби одержують загальну гаммаглобулінову фракцію. Для осадження загальної гаммаглобулінової фракції сироватку крові 3 дрібної рогатої худоби в об'ємі 100,0 см доводять до рН 7,2-7,4, використовуючи 10 % розчин соляної кислоти або 1 М бікарбонату натрію. У сироватці з рН 7,2-7,4 розчиняють наважку ПЕГ115 до кінцевої концентрації 7-8 %. Після розчинення ПЕГ-115 при постійному перемішуванні 10-15 хвилин у вигляді пластівців випадає осад, який являє собою гаммаглобуліни. Осад видаляють шляхом відстоювання протягом 2-10 год. або центрифугування протягом 15 хв. при 3000 об./хв. При цьому температура рідини повинна бути в межах від 5,0 °C до 10,0 °C. 3 Одержаний осад розчиняють у 10,0 см фізіологічного розчину (0,85 % натрію хлористого). Наступний етап - одержання імуноглобуліну G із гаммаглобулінової фракції. Для роботи необхідно: - ДЕАЕ сефадекс А-50; - 0,1 М і 0,01 М фосфатний буфер з рН 6,5; - 0,1 М соляна кислота; - 0,5 М гідроксид натрію. Перед використанням заряджають іонообмінник загальновідомим методом. Заряджений іонообмінник урівноважують 0,1 М фосфатним буфером з рН 6,5, потім 0,01 М фосфатним 3 буфером з рН 6,5. До 10,0 см розчину гаммаглобуліну додають 20,0 г урівноваженого ДЕАЕ сефадексу А-50. Суміш періодично перемішують протягом 60 хв. за температури 4,0 °С. Потім 3 фільтрують та 4 рази відмивають 0,01 М фосфатним буфером порціями по 50,0 см . Фільтрат та промивну рідину об'єднують і змішують із 20,0 г ДЕАЕ сефадексу за тими ж самими умовами. Знову фільтрують і відмивають 0,01 М фосфатним буфером. Імуноглобулін класу G міститься у об'єднаному фільтраті. Для отримання антитіл проти імуноглобуліну G вівці проводять гіперімунізацію кролів за наступною схемою. Ґрунт-імунізація - вводять підшкірно багатоточковими ін'єкціями по хребту та 3 внутрішньом'язово в ділянці підколінного лімфовузла в об'ємі 2,0 см , з розрахунку на одну 3 тварину 1,0-2,0 мг імуноглобулінів G вівці в 1,0 см фізіологічного розчину, змішаного з однаковим об'ємом "montanite" або масляного ад'юванту Фрейда. Наступні імунізації проводяться через місяць після ґрунт-імунізації, кожні 24 години 3 внутрішньовенно у краєву вену вуха із зростаючою дозою (0,5; 0,7; 1,0 см ) із вмістом 1,0-2,0 мг 3 імуноглобуліну G вівці в 1,0 см фізіологічного розчину. 1 UA 84118 U 5 10 15 20 25 30 35 40 Після досягнення титру антитіл у сироватці крові не менше 1:16 в РІД кролів знекровлюють, відбираючи стерильно кров. Після ретракції згустку відбирають антисироватку. Потім з антисироватки виділяють імуноглобулін класу G, за методикою як вказано раніше. Кон'югацію одержаного імуноглобуліну G з пероксидазою хрону проводять методом перйодатного окислення (метод Nakane). Для стабілізації кон'югату додають бичачий сироватковий альбумін (БСА) 1,0 %, мертіолят 0,02 % або гліцерин 50,0 % і зберігають невеликими порціями за температури - (18,0-20,0) °С. Приклад 1. Специфічність, активність та чистоту отриманої антисироватки визначали у реакції імунодифузії (РІД) з імунізуючою суспензією Ig G вівці, де визначені титри сироваток 1:16 з наявністю однієї лінії преципітації, що є характерним показником чистоти імунізуючої суспензії по відношенню до примісних білків. Приклад 2. Визначення активності специфічного антивидового овісного пероксидазного кон'югату проводили шляхом титрації в ІФА з позитивними та нормальними сироватками. Для постановки ІФА були взяті бруцелаовісний імуносорбент, специфічний антивидовий овісний пероксидазний кон'югат, позитивні і нормальні сироватки з "Набору для серологічної діагностики інфекційного епідидиміту баранів в РТЗК" (ТУ У 46.15.247-97), фосфатно-сольовий буфер, твин20 (ФСБтв), рН-7,2, 0,1 % розчин бичачого сироваткового альбуміну, 0,04 % розчин ортофенілендіаміну, дистильована вода, 8N сірчана кислота. Постановку непрямого методу ІФА проводили за стандартною методикою з дотриманням контролів: контроль неспецифічної сорбції антигену, контроль субстракту, контроль неспецифічного зв'язування антитіл. Облік результатів реакції проводили спектрофотометрично за довжиною хвилі 492 нм на аналізаторі імуноферментному "Sunrise" (Tecan), програма автоматичного комп'ютерного обліку "Magellan". Було встановлено, що отриманий специфічний антивидовий овісний пероксидазний кон'югат має робоче розведення 1:400, яке забезпечує виявлення специфічних антитіл у максимальних розведеннях та не приводить до значних збільшень оптичної екстинції (ОЕ

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Stehnii Borys Tymofiiovych, Obukhovska Ol`ha Valeriivna, Babkin Anatolii Fedorovych, Mykhailova Svitlana Anatoliivna

Автори російською

Стегний Борис Тимофеевич, Обуховская Ольга Валериевна, Бабкин Анатолий Федорович, Михайлова Светлана Анатольевна

МПК / Мітки

МПК: A61K 39/395

Мітки: овісного, етіології, захворювань, імуноферментним, elisa, дрібної, діагностики, пероксидазного, виготовлення, специфічного, інфекційної, антивидового, крові, худоби, методом, спосіб, рогатої, сироватці, кон'югату

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/5-84118-sposib-vigotovlennya-specifichnogo-antividovogo-ovisnogo-peroksidaznogo-konyugatu-dlya-diagnostiki-zakhvoryuvan-infekcijjno-etiologi-u-sirovatci-krovi-dribno-rogato-khudobi-imunofe.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виготовлення специфічного антивидового овісного пероксидазного кон’югату для діагностики захворювань інфекційної етіології у сироватці крові дрібної рогатої худоби імуноферментним методом (elisa)</a>

Подібні патенти