Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб культивування анаеробних бактерій, що передбачає створення анаеробних умов росту за рахунок звільнення поживного середовища від вільного кисню повітря, який відрізняється тим, що як поглинач кисню використовують гель дрібнодисперсного бентоніту, що вводять в середовище культивування у вигляді 5-6 %-ї водної суспензії, при цьому співвідношення поживного середовища й гелю бентоніту становить 1:1-2:1.

Текст

Дивитися

Спосіб культивування анаеробних бактерій, що передбачає створення анаеробних умов росту за рахунок звільнення поживного середовища від вільного кисню повітря, який відрізняється тим, що як поглинач кисню використовують гель дрібнодисперсного бентоніту, що вводять в середовище культивування у вигляді 5-6 %-ї водної суспензії, при цьому співвідношення поживного середовища й гелю бентоніту становить 1:1-2:1. (19) (21) u200901929 (22) 04.03.2009 (24) 27.07.2009 (46) 27.07.2009, Бюл.№ 14, 2009 р. (72) ШИРОБОКОВ ВОЛОДИМИР ПАВЛОВИЧ, ЯНКОВСЬКИЙ ДМИТРО СТАНІСЛАВОВИЧ, ДИМЕНТ ГАЛИНА СЕМЕНІВНА (73) ТОВАРИСТВО З ОБМЕЖЕНОЮ ВІДПОВІДАЛЬНІСТЮ ФІРМА "О.Д. ПРОЛІСОК" 3 тейнери системи Gas Рак. У контейнери постійно подають азот зі швидкістю 1,5-2,0л у хвилину. При обліку результатів аналізу чашки із судини виймають по одній, швидко повертаючи їх в анаеробні умови (Ефимов Б.А., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Современные методы оценки качественных и количественных показателей микрофлоры кишечника и влагалища // Ж. микробиол., эпидемиол., иммунол. - 2002. - №4. - с. 72-78). Спосіб дозволяє визначати вміст облігатних анаеробів у досліджуваному матеріалі, однак є дорогим, відрізняється високою трудомісткістю, складністю реалізації й недоступністю для використання в більшості мікробіологічних лабораторій. Відомий також спосіб культивування облігатних анаеробів, наприклад бактероїдів, біфідобактерій і молочнокислих бактерій, що передбачає анаеробне вирощування культури під годинниковими скельцями з використанням як поглинача кисню культури бактерій виду Serratia marcescens, яку засівають на поверхню щільного поживного середовища, що розлите у годинникові скельця й попередньо підрощують у термостаті протягом 4-х годин. Цими скельцями закривають ділянки агаризованого поживного середовища з краплями посівного матеріалу, скельця злегка вдавлюють у середовище, а їхні краї обмазують культурою Serratia marcescens (Грачева Н.М., Гончарова Г.И. Применение бактерийных биологических препаратов в практике лечения больных кишечными инфекциями, диагностике, лечения дисбактериозов кишечника // Методические рекомендации. - М., 1986. - 23 с). За рахунок високої кисеньпоглинаючої здатності бактерій виду Serratia marcescens створюються сприятливі умови для росту облігатних анаеробів, однак ці мікроорганізми є потенційно патогенними для людини, що значно обмежує галузі застосування методу. Крім того, вирощування анаеробів під годинниковими скельцями абсолютно не прийнятно для реалізації біотехнологічних процесів у промислових масштабах. Найбільш близьким до способу, що заявляється, є спосіб вирощування біфідобактерій, який передбачає спільне культивування в молоці біфідобактерій і оцтовокислих бактерій видів Acetobacter aceti і Acetobacter pasteurianus, що стимулюють ріст біфідобактерій та інших сахаролітичних анаеробів (Авт. свід. СРСР №1604847, C12N1/20, А23С9/12, 1990 - прототип). Спосіб передбачає використання як поглинача кисню й біологічного стимулятора анаеробів роду Bifidobacterium безпечних для здоров'я людини аеробних мікроорганізмів і дозволяє ефективно культивувати сахаролітичні анаероби, однак затрудняє виділення чистих культур анаеробних бактерій, оскільки оцтовокислі бактерії утворюють із сахаролітичними анаеробами міцні симбіози, які важко розділяються на монокультури. Крім того, спосіб не дозволяє вирощувати асахаролітичні анаеробні бактерії, які в багатьох випадках також мають велику клінічну й біотехнологічну значимість. Завданням корисної моделі є створення уніфікованого й безпечного способу культивування 42906 4 анаеробних бактерій, у якому шляхом використання як поглинача кисню гелю дрібнодисперсного бентоніту забезпечується підвищення ефективності культивування широкого спектра мікроорганізмів, чутливих до кисню. Поставлене завдання вирішується тим, що в способі культивування анаеробних бактерій, що передбачає створення анаеробних умов за рахунок звільнення поживного середовища від вільного кисню повітря, як поглинач кисню використовують гель дрібнодисперсного бентоніту, що вводиться в середовище культивування у вигляді 5-6%-ої водної суспензії, при цьому співвідношення поживного середовища й гелю дрібнодисперсного бентоніту становить 1:1-2:1. Пропонований спосіб передбачає використання як поглинача кисню при культивуванні облігатних анаеробних бактерій гелю бентоніту. Бентоніт - це природний глинистий матеріал, що відноситься до класу алюмосилікатів і має високі гідратаційні й адсорбційні властивості. Використовуваний у пропонованому способі як сорбент гель бентоніту являє собою натрієву форму дрібнодисперсної фракції бентоніту, що одержують із сухого природного бентоніту шляхом обробки його вуглекислим натрієм і очищення від забруднюючих речовин і грубих часток бентоніту. Бентоніт є абсолютно безпечним для здоров'я людини матеріалом. Він відноситься до природних глин і йому властиві всі позитивні ефекти, об'єднані в поняття «глинотерапія». Як показали спеціально проведені дослідження, дрібнодисперсний гель бентоніту має високу кисеньзв'язуючу здатність, внаслідок чого створює оптимальні умови для активного розвитку всіх видів облігатно анаеробних бактерій без використання аеробних мікроорганізмів, анаеростатів і іншого дорогого устаткування. Крім високої кисеньпоглинаючої здатності, гель бентоніту є цінним джерелом макро- і мікроелементів, за рахунок чого додатково стимулює ріст анаеробних бактерій. При культивуванні анаеробних бактерій гель бентоніту вводиться в поживне середовище у вигляді 5-6%-ої водної суспензії. Зниження концентрації бентоніту в суспензії менш 5% знижує ефективність способу через недостатню адсорбцію кисню й зменшення стимулюючої активності бентоніту відносно облігатних анаеробних бактерій. Підвищення концентрації бентоніту в суспензії вище 6% недоцільно, оскільки не впливає на адсорбційні властивості гелю щодо кисню. При здійсненні способу співвідношення поживного середовища й 5-6%-го гелю бентоніту становить 1:1-2:1. Як показали результати досліджень, дане співвідношення є найбільш оптимальним. При зміні співвідношення у бік зменшення частки гелю бентоніту середовище не повністю звільняється від кисню, що негативно позначається на розвитку й збереженні життєдіяльності культур облігатних анаеробів. Крім того, зменшується стимулюючий ефект бентоніту відносно анаеробів за рахунок зниження в середовищі культивування рістстимулюючих мінеральних компонентів. Зміна співвідношення у бік збільшення частки гелю бентоніту не відбивається на адсорбції кисню, але може зменшувати пожив 5 ну цінність середовища за рахунок її зайвого розведення й сорбції окремих живильних сполук, що може негативно позначитися на розвитку культур анаеробних бактерій, тому є недоцільним. Різні варіанти реалізації способу наведені в прикладах. Приклад 1. Спосіб культивування анаеробних бактерій при мікробіологічних дослідженнях фекалій і вагінального секрету. Випорожнення забирають із останньої порції фекалій стерильним шпателем і поміщають у пробірку (попередньо зважену), що містить рівний об'єм стерильного 6%-го гелю дрібнодисперсного бентоніту. Вагінальний матеріал збирають у транспортні пробірки (попередньо зважені), що містять рівний об'єм стерильного 6%-го гелю дрібнодисперсного бентоніту. У бактеріологічній лабораторії проводять повторне зважування пробірок, визначаючи таким чином вагу забраного матеріалу й потім з матеріалу готують серійні розведення з використанням як розчину 5%-го стерильного гелю дрібнодисперсного бентоніту. Фекальний матеріал, поміщений при доборі в 6%-й гель дрібнодисперсного бентоніту, попередньо гомогенізують у порцеляновій ступці, а потім готують серійні розведення з використанням в якості розчину 5%-го стерильного гелю дрібнодисперсного бентоніту. Отримані розведення висівають у селективні поживні середовища, які традиційно використовуються для визначення окремих видів анаеробних бактерій. Але при готуванні кожного із селективних середовищ перед стерилізацією середовище змішують у співвідношенні 1:1 з 6%-м гелем бентоніту. Використання пропонованого способу дозволяє здійснювати всі операції з виділення й культивування облігатних анаеробних бактерій без використання мікроанаеростатів і спеціальних анаеробних боксів, заповнюваних інертним газом. Це дозволяє полегшити роботу з анаеробами, знизити трудомісткість і тривалість процесів і виключити необхідність використання спеціального дорогого устаткування й додаткових матеріалів. Порівняльні результати досліджень фекалій на вміст окремих представників облігатних анаеробних бактерій, проведених пропонованим і відомим способами, представлені в таблиці 1. Приклад 2. Використання пропонованого способу для діагностики інфекцій, що спричиняються неспороутворюючими анаеробами. Неспороутворюючі анаероби включають близько 800 видів мікроорганізмів різних родів і сімейств, характерними ознаками яких є відсутність спор, висока чутливість до кисню повітря й складні поживні потреби. Багато представників неспороутворюючих анаеробів (роди Bacteroides, Prevotella, Fusobacterium, Porphyromonas, Peptococcus, Peptostreptococcus, Actinomyces, Eubacterium, Veillonella і ін.) є умовно-патогенними й при створенні сприятливих умов для їхньої життєдіяльності можуть спричиняти широкий спектр важких патологічних процесів в організмі людини, успішне лікування яких вимагає етіологічного розшифрування збудника й виділення його в чистій культурі з метою призначення адекватної етіотропної терапії. Взяті для дослідження зразки (шматочки ура 42906 6 жених тканин; матеріал, узятий із глибини рани; кров; пунктати з абсцесів, флегмон, порожнини суглобів та ін.) повинні бути захищені від токсичної дії молекулярного кисню. Тому відібрані зразки патологічного матеріалу негайно поміщають у глибину стерильного 5,5%-го гелю дрібнодисперсного бентоніту, а потім транспортують у спеціалізовану лабораторію. У поживні середовища, що використовуються для виділення і ідентифікації мікроорганізмів, також додають стерильний 5,5%-ний гель дрібнодисперсного бентоніту в співвідношенні 1:1. Це дозволяє не тільки створити оптимальні умови для росту облігатних анаеробів, але й виключити розвиток аеробних і факультативно-анаеробних супутніх мікроорганізмів, що ускладнюють виділення й ідентифікацію анаеробного збудника. Використання пропонованого способу дозволяє значно спростити схему виділення й ідентифікації збудників анаеробних інфекцій і знизити вартість діагностичного методу. Приклад 3. Використання пропонованого способу для нарощування біомаси біфідобактерій при виготовленні препарату із пробіотичними властивостями. Як відомо нарощування біомаси чистих культур біфідобактерій є досить складним процесом, обумовленим інгібуванням цих мікроорганізмів молекулярним киснем. Тому поживні середовища збагачуються додатковими сполуками, що сприяють зниженню окислювально-відновного потенціалу, а в технологічний процес вводяться додаткові операції, що сприяють витисненню повітря з ферментерів. Додатковою проблемою, що обумовлена повільним розвитком монокультур біфідобактерій, є високий ризик контамінації середовища сторонніми аеробними й факультативно-анаеробними мікроорганізмами. Відповідно до пропонованого способу поживне середовище перед стерилізацією розводять в співвідношенні 1:1 5%-м гелем дрібнодисперсного бентоніту. Це виключає використання додаткових сполук і операцій, що забезпечують зниження вмісту кисню в середовищі й відповідно окислювально-відновного потенціалу. Зв'язування залишкового кисню гелем бентоніту перешкоджає розвитку сторонніх мікроорганізмів, чутливих до відсутності кисню. Динаміка росту культури біфідобактерій у середовищі з бентонітом представлена в таблиці 2. Приклад 4. Використання пропонованого способу для одержання препарату вітаміну В12 із застосуванням як продуценту пропіоновокислих бактерій. Особливість даного виробництва полягає в тому, що синтез вітаміну В12 вимагає анаеробних умов росту культури продуцента. Тому через необхідність застосування дорогої апаратури і прийняття інших мір, що забезпечують оптимальний ріст пропіоновокислих бактерій, виробництво вітаміну В12 є досить складним. Вітамін утворюється, в основному, внутрішньоклітинно й накопичується в молодій культурі, яка інтенсивно розмножується. Тому кількість утвореного вітаміну прямо залежить від інтенсивності утворення біомаси клітин. Культуру пропіоновокислих бактерій вирощують у середовищі, яке традиційно використовуєть 7 42906 ся для цих цілей та містить глюкозу, кукурудзяний екстракт, сірчанокислий амоній і сіль кобальту. Однак перед внесенням культури в поживне середовище додають 6%-й гель бентоніту у співвідношенні 2:1. Процес ферментації проводять протягом 96г із безперервною нейтралізацією кислоти, що утворюється в результаті бродіння, розчином гідроксиду натрію (NaOH). Після завершення ферментаційного процесу біомасу відокремлюють центрифугуванням і виділяють із неї вітамін шляхом екстракції гарячою водою, підкисленою до pH 4,5-5,0. Потім біомасу відокремлюють, водний розчин вітаміну охолоджують, очищають від сторонніх домішок і кристалізують. Динаміка накопичення біомаси й продукції вітаміну В12 представлена в таблиці 3. У таблиці 1 представлена порівняльна характеристика ефективності відомого й пропонованого способу при виділенні з фекалій окремих предста 8 вників анаеробних бактерій. Як видно із представлених у таблиці даних, пропонований спосіб дозволяє більш точно визначити вміст анаеробів у досліджуваному матеріалі. У таблиці 2 представлена динаміка наростання клітин біфідобактерій у поживному середовищі при використанні відомого й пропонованого способу. Як видно з даних таблиці, при використанні пропонованого способу помітно збільшується швидкість розвитку культури біфідобактерій, концентрація життєдіяльних клітин і кількість біомаси. У таблиці 3 представлені дані, що характеризують динаміку наростання біомаси й синтезу вітаміну В12 пропіоновокислими бактеріями, при використанні відомого й пропонованого способу. Використання пропонованого способу дозволяє оптимізувати технологічний процес за рахунок більш інтенсивного росту культури, накопичення більшої кількості біомаси клітин і вітаміну В12. Таблиця 1 Результати аналізу фекалій на вміст окремих видів облігатних анаеробів при використанні відомого й пропонованого способу Концентрація клітин, lg КУО/см3 Відомий спосіб Пропонований спосіб 9,1 10,7 8,4 8,9 5,8 7,0 8,8 10,3 5,1 6,9 3,6 5,0 0 3,9 5,8 6,7 6,4 7,7 4,8 6,0 0 3,5 Мікроорганізм Вifidobacterium Lactobacillus Propionibacterium Bacteroides Fusobacterium Prevotella Porphyromonas Peptococcus Peptostreptococcus Eubacterium Veillonella Таблиця 2 Динаміка росту клітин і накопичення біомаси біфідобактерій при використанні відомого й пропонованого способу культивування для одержання пробіотика Показник 4 Концентрація клітин, КУО/см3 (відомий спо- 2,2х107 сіб) Концентрація клітин, КУО/см3 (пропонований 3,4х107 спосіб) Біомаса, г/л (відомий 3,1 спосіб) Біомаса, г/л (пропоно3,9 ваний спосіб) Час культивування, год 16 20 8 12 24 28 5,1х107 1,7х108 3,3х108 5,8х108 1,8х109 2,4x109 9,5х107 4,8х108 1,4х109 4,3х109 8,4х109 9,1х109 3,8 4,6 5,8 7,7 9,1 10,1 5,4 6,8 8,2 9,8 14,5 18,4 9 42906 10 Таблиця 3 Динаміка накопичення біомаси пропіоновокислих бактерій і синтезу вітаміну В12 при використанні відомого й пропонованого способів 12 Показник Концентрація вітаміну В12, мг/л (відомий спосіб) Концентрація вітаміну В12, мг/л (пропонований спосіб) Біомаса, г/л (відомий спосіб) Біомаса, г/л (пропонований спосіб) 24 Час культивування, година 48 60 72 4,9 6,3 8,4 12,3 8,1 12,9 22,7 3,1 3,8 5,8 9,4 Комп’ютерна верстка А. Крулевський 84 96 17,9 20,6 25,8 33,0 49,5 61,7 63,8 4,6 5,8 7,7 9,1 10,1 14,0 17,2 20,8 26,5 29,4 Підписне Тираж 28 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for cultivation of anaerobic bacteria

Автори англійською

Shyrobokov Volodymyr Pavlovych, Yankovskyi Dmytro Stanislavovych, Dyment Halyna Semenivna

Назва патенту російською

Способ культивирования анаэробных бактерий

Автори російською

Широбоков Владимир Павлович, Янковский Дмитрий Станиславович, Димент Галина Семеновна

МПК / Мітки

МПК: A61K 35/66, C12N 1/20, A23C 9/12

Мітки: анаеробних, спосіб, бактерій, культивування

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/5-42906-sposib-kultivuvannya-anaerobnikh-bakterijj.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб культивування анаеробних бактерій</a>

Подібні патенти