Номер патенту: 120088

Опубліковано: 25.10.2017

Автори: Кузіна Валентина Анатоліївна, Жлудько Олена Валеріївна

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб виробництва цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м’яза ВРХ, відповідно до якого екстракцію здійснюють розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідрокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, який відрізняється тим, що здійснюють додаткове осадження цитохрому бінарним розчином кадмію хлориду і розчином калію йодиду, який далі розривають гідроокисом амонію.

2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що здійснюють додаткове очищення шляхом проведення повторного осадження баластних білків сульфатом амонію, що проводять двічі та повторного очищення цільового продукту на катіонообмінних колонках із застосуванням смоли Амберліт.

Текст

Реферат: Спосіб виробництва цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м’яза ВРХ, відповідно до якого екстракцію здійснюють розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідрокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням. Здійснюють додаткове осадження цитохрому бінарним розчином кадмію хлориду і розчином калію йодиду, який далі розривають гідроокисом амонію. UA 120088 U (54) СПОСІБ ВИРОБНИЦТВА ЦИТОХРОМУ-С UA 120088 U UA 120088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до біотехнології виробництва біологічно активних з'єднань, саме цитохрому-С, що може бути використаний в фармацевтичній промисловості та медицині для виготовлення антигіпоксичних лікарських засобів для нормалізації тканинного дихання, а також у науково-дослідницькій роботі. Відомий спосіб виділення цитохрому-С, що включає екстрагування подрібненого серцевого м'яза ссавців водним розчином сульфатів, підлужування, очищення на іонообмінних смолах з наступним виділенням цільового продукту, що відрізняється тим, що, з метою поліпшення якості цільового продукту, екстракцію проводять 0,25-0,75 % розчином сульфату амонію, потім підкислюють сірчаною кислотою при рН 4-5 і підлужують гідроокисом барію до рН 8-9 (Патент України № 1110). Даний спосіб є близьким за технічною суттю та його взято за прототип. Недоліками відомого способу є низький вихід цільового продукту та невисокий ступінь очищення цільового продукту, так як заявлені в свідоцтві етапи очищення цитохрому-С є недостатніми для очищення продукту від іонів сульфату амонію, яким проводять осадження, це викликає необхідність в додаткових способах очищення продукту. В основу корисної моделі поставлено задачу: за рахунок зміни процесу очищення цільового продукту від іонів сульфату амонію отримати продукт з вищим ступенем чистоти та збільшити вихід цитохрому-С. Поставлена задача вирішується тим, що у способі виробництва цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м'язу великої рогатої худоби (ВРХ), відповідно до якого екстракцію здійснюють розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідрокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, відповідно до корисної моделі, здійснюють додаткове осадження цитохрому бінарним розчином кадмію хлориду і розчином калію йодиду, який далі розривають гідроокисом амонію. Здійснюють також додаткове очищення шляхом проведення повторного осадження баластних білків сульфатом амонію, що проводять двічі та повторного очищення цільового продукту на катіонообмінних колонках із застосуванням смоли Амберліт. Спосіб виробництва цитохрому-С, що заявляється, здійснюють наступним чином. Перероблені на фарш серця великої рогатої худоби (ВРХ) вносять у реактор з підготовленим розчином амонію сульфату 2 %, вимішують та охолоджують до температури від 2 °C до 8 °C. Встановлюють рН 5 % розчином сірчаної кислоти (4,3±0,05), проводять екстракцію цитохрому при постійному перемішуванні у реакторі при температурі від 2 °C до 8 °C. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. В отриманому екстракті проводять осадження баластних білків розчином гідроокису барію при рН (8,5±0,05) та температурі від 2 °C до 8 °C. Після осадження розчин декантують та проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізосинеродистого або 0,01 М калію ферриціаніду. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіонообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Після отримання елюату цитохрому проводять додаткове очищення, що включає в себе осадження розчином амонію сірчанокислого протягом 12 годин при температурі від 2 °C до 8 °C. Відділення баластних білків фільтрацією на воронці Бюхнера, осадження цитохрому при рН (4,2±0,05) бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду при температурі від 2 °C до 8 °C. Отриманий осад відділяють центрифугуванням. Процес осадження повторюють та направляють отриманий розчин на очищення із застосуванням катіонообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Таким чином вихід цільового продукту зростає, що є особливо суттєвим при промисловому виробництві цитохрому-С та має вищий ступінь чистоти за рахунок проведення додаткового очищення. Ефективність способу підтверджується наступними прикладами: Приклад 1. 200 кг очищеного від крові жиру та сполучної тканини серцевого м'язу ВРХ подрібнюють та перероблюють на фарш та, при постійному перемішуванні, завантажують в реактор з підготовленим охолодженим до температури 2-8 ºС розчином 2 % сульфату амонію в кількості 50 л. Суміш в реакторі перемішують протягом 10-15 хв при температурі 2-8 ºС та обертах мішалки 25±2 об/хв. Встановлюють рН суміші 4,3±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти та проводять екстракцію цитохрому-С при температурі 2-8 ºС протягом 1,5 год. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. Отриманий екстракт збирають в другий реактор та проводять осадження баластних білків шляхом нейтралізації 1 UA 120088 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 екстракту гідроокисом барію, в кількості 3 кг, при рН 8,5±0,05 протягом 12-18 годин. При додаванні барію гідроокису в осад випадає сульфат барію та баластні білки, ізоелектрична точка яких нижче 8,5. В отриманому розчині проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання калію залізосинеродистого, в кількості 0,001 кг. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіонообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію цитохрому-С при рН 8-9, а потім десорбцію розчину, додаванням 15 л розчину 1 М натрію хлориду в 0,02 М натрій-фосфатному буфері. Для досягнення повної десорбції розчин витримують на колонках протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Отриманий елюат збирають в скляні ємності та проводять додатковий етап очищення, що полягає в повторному осадженні та очищенні цитохрому-С. Осадження баластних білків проводять додаючи 5,6 кг амонію сірчанокислого при перемішуванні та витримують розчин протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Відділяють осад фільтруванням на воронці Бюхнера, розчин збирають в скляні ємності та осаджують в ньому цитохром-С бінарним комплексом кадмію хлориду та калію йодиду (в кількості 0,25 л на 1 л розчину) при рН (4,2±0,05). Витримують протягом 302 хвилин та відділяють утворений осад центрифугуванням при 2500 об/хв. Отриманий осад розчиняють у воді очищеній та встановлюють рН 4,2±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти. Процес осадження бінарним комплексом проводять ще раз. Після осад розчиняють в 8 л води очищеної, встановлюють рН 7,5±0,05 3 % розчином аміаку, для відновлення цитохрому додають 1 г калію залізосинеродистого, перемішують та фільтрують розчин на воронці Бюхнера. Розчин очищують із застосуванням катіонообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину цитохрому-С 3 % розчином аміаку. Таким чином вихід цитохрому-С складає 0,89 г з 1 кг серцевого м'яза ВРХ, а показник чистоти складає 1,36 при (А550/А280). Приклад 2. 200 кг очищеного від крові жиру та сполучної тканини серцевого м'яза ВРХ подрібнюють та перероблюють на фарш та, при постійному перемішуванні, завантажують в реактор з підготовленим охолодженим до температури 2-8 ºС розчином 2 % сульфату амонію в кількості 50 л. Суміш в реакторі перемішують протягом 10-15 хв. при температурі 2-8 ºС та обертах мішалки 25±2 об/хв. Встановлюють рН суміші 4,3±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти та проводять екстракцію цитохрому-С при температурі 2-8 ºС протягом 1,5 год. По закінченні екстракції відділяють екстракт від жмиху шляхом центрифугування. Отриманий екстракт збирають в другий реактор та проводять осадження баластних білків шляхом нейтралізації екстракту гідроокисом барію, в кількості 3 кг, при рН 8,5±0,05 протягом 12-18 годин. При додаванні барію гідроокису в осад випадає сульфат барію та баластні білки, ізоелектрична точка яких нижче 8,5. В отриманому розчині проводять відновлення цитохрому-С шляхом додавання 0,01 М калію фериціаніду, в кількості 0,001 кг. Очищення цитохрому здійснюють із застосуванням катіонообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію цитохрому-С при рН 8-9, а потім десорбцію розчину, додаванням 15 л розчину 1 М натрію хлориду в 0,02 М натрій-фосфатному буфері. Для досягнення повної десорбції розчин витримують на колонках протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Отриманий елюат збирають в скляні ємності та проводять додатковий етап очищення, що полягає в повторному осадженні та очищенні цитохрому-С. Осадження баластних білків проводять додаючи 5,6 кг амонію сірчанокислого при перемішуванні та витримують розчин протягом 12-18 годин при температурі 2-8 ºС. Відділяють осад фільтруванням на воронці Бюхнера, розчин збирають в скляні ємності та осаджують в ньому цитохром-С бінарним комплексом кадмію хлориду та калію йодиду (в кількості 0,25 л на 1 л розчину) при рН (4,2±0,05). Витримують протягом 302 хвилин та відділяють утворений осад центрифугуванням при 2500 об/хв. Отриманий осад розчиняють у воді очищеній та встановлюють рН 4,2±0,05 5 % розчином сірчаної кислоти. Процес осадження бінарним комплексом проводять ще раз. Після осад розчиняють в 8 л води очищеної, встановлюють рН 7,5±0,05 3 % розчином аміаку, для відновлення цитохрому додають 1 г калію фериціаніду, перемішують та фільтрують розчин на воронці Бюхнера. Розчин очищують із застосуванням катіонообмінних колонок, де в якості сорбенту застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину цитохрому-С 3 % розчином аміаку. Таким чином вихід цитохрому-С складає 0,88 г з 1 кг серцевого м'язу ВРХ, а показник чистоти складає 1,32 при (А550/А280). Відповідно до технології, що заявляється, додаткове очищення включає в себе осадження розчином амонію сірчанокислого протягом 12 годин при температурі від 2 °C до 8 °C. Відділення баластних білків фільтрацією на воронці Бюхнера, осадження цитохрому при рН (4,2±0,05) 2 UA 120088 U 5 10 15 20 бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду при температурі від 2 °C до 8 °C. Наступним відділенням осаду центрифугуванням. Процес осадження повторюють та направляють отриманий розчин на очищення із застосуванням катіонообмінних колонок, де як сорбент застосовують смоли Амберліт з розміром гранул 0,45-0,5 мм. Проводять спочатку адсорбцію, а потім десорбцію розчину. Осадження бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду є додатковим етапом. При проведенні даного осадження утворюється комплекс з цитохромом-С, який випадає в осад, інші домішки та баластні речовини залишаються в розчині. Шляхом центрифугування відділяють осад, розчиняють його в воді очищеній та проводять ще раз осадження бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду з наступним відділенням осаду центрифугуванням. Осад розчиняють у воді очищеній та додають 3 % розчину аміаку, при цьому встановлюють рН 7,5±0,05. При даному значенні рН відбувається розрив комплексу цитохрому з бінарним розчином кадмію хлориду та розчином калію йодиду, що дозволяє виділити та очистити цитохром-С подальшим очищенням на катіонообмінних колонках. Запропоновані зміни в технології виробництва цитохрому-С, які полягають в додатковому очищенні продукту, дозволяють отримати більший вихід цільового продукту, що є особливо значущим в промисловому виробництві при напрацюванні великих об'ємів продукту. Таким чином, показники якості, зокрема показник чистоти, свідчать про вискоку якість готового продукту. Таким чином, застосування даних змін в технології дозволило отримати продукт з показником чистоти, що складає 1,32 при (А550/А280), а вихід цільового продукту склав 0,88-0,89 г цитохрому-С з 1 кг серцевого м'язу ВРХ. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 30 35 1. Спосіб виробництва цитохрому-С шляхом екстрагування подрібненого серцевого м’яза ВРХ, відповідно до якого екстракцію здійснюють розчином сульфату амонію з подальшим підкисленням сірчаною кислотою та підлужуванням гідрокисом барію до рН 8,5±0,05, осадження баластних білків та сульфату барію і подальшим відновленням з отриманого розчину цитохрому-С та його очищенням, який відрізняється тим, що здійснюють додаткове осадження цитохрому бінарним розчином кадмію хлориду і розчином калію йодиду, який далі розривають гідроокисом амонію. 2. Спосіб за п. 1, який відрізняється тим, що здійснюють додаткове очищення шляхом проведення повторного осадження баластних білків сульфатом амонію, що проводять двічі та повторного очищення цільового продукту на катіонообмінних колонках із застосуванням смоли Амберліт. Комп’ютерна верстка Г. Паяльніков Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: A61K 35/34, C07K 14/80

Мітки: спосіб, цитохрому-с, виробництва

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/5-120088-sposib-virobnictva-citokhromu-s.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виробництва цитохрому-с</a>

Подібні патенти