Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб виділення Coxiella burnetii, який відрізняється тим, що при виділенні збудника для його ідентифікації використовують полімеразну ланцюгову реакцію в реальному часі з метою контролю кількості ДНК збудника гарячки Ку на етапі підбору оптимальної інфікуючої дози, виявлення С. burnetii в інфікованих жовточних мішках курячих ембріонів, в досліджуваному матеріалі експериментальних лабораторних тварин.

Текст

Реферат: Спосіб виділення Coxiella burnetii, при якому при виділенні збудника для його ідентифікації використовують полімеразну ланцюгову реакцію в реальному часі з метою контролю кількості ДНК збудника гарячки Ку на етапі підбору оптимальної інфікуючої дози, виявлення С. burnetii в інфікованих жовточних мішках курячих ембріонів, в досліджуваному матеріалі експериментальних лабораторних тварин. UA 105276 U (12) UA 105276 U UA 105276 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до мікробіології та стосується виділення С. burnetii - збудника гарячки Ку для його подальшого вивчення, культивування, виготовлення діагностичних і профілактичних препаратів. Використання полімеразної ланцюгової реакції в реальному часі при виділенні С. burnetii методами зараження курячих ембріонів, морських свинок і лабораторних білих мишей дозволяє проводити не лише якісне, але й кількісне визначення ДНК збудника гарячки Ку та ефективно збільшує діагностичні можливості його виявлення. Дослідження можна проводити як з чистими культурами збудника, так і безпосередньо в біотичних та абіотичних об'єктах дослідження на фоні іншої мікрофлори, при цьому відпадає необхідність виділення чистої культури збудника і її ідентифікації за фенотипічними ознаками. Основна ланка ПЛР в реальному часі - підбір чутливих і специфічних праймерів, зокрема, через міжнародний комп'ютерний банк даних GenBank, оскільки саме вони забезпечують можливість ампліфікації та індикації специфічної нуклеотидної послідовності даного виду збудника. Набори праймерів для виявлення різних генів рикетсій відомі та можуть використовуватися в будь-якій лабораторії за наявності відповідного обладнання та кваліфікованого персоналу (Наказ МОЗ України від 24.01.2008 № 26 "Про затвердження державних санітарних норм і правил "Організація роботи лабораторій при дослідженні матеріалу, що містить біологічні патогенні агенти T-IV груп патогенності молекулярно-генетичними методами"). Задача корисної моделі полягає у виділенні збудника гарячки Ку - С. burnetii з біотичних та абіотичних об'єктів. Поставлена задача вирішується шляхом кількісного визначення специфічних нуклеотидних послідовностей його ДНК на етапі підбору оптимальної інфікуючої дози та виявлення С. burnetii в інфікованих жовточних мішках курячих ембріонів чи в патологічному матеріалі від лабораторних тварин. Прототипом запропонованого способу є виділення С. burnetii із застосуванням традиційних методів ідентифікації збудника - мікроскопії та специфічної імунодетекції. Матеріалом для досліджень на гарячку Ку можуть бути: 1) біотичні об'єкти а) від хворих чи підозрілих на захворювання людей - кров, мокрота, промивні води бронхів, спинномозкова рідина, ексудати; б) трупний матеріал - кров, ексудати, кусочки органів (легень, серця, ін.); в) матеріал від тварин (кров, послід, навколоплідні води та ін.); 2) абіотичні об'єкти а) продовольча сировина та продукти тваринного походження (молоко, сир та і п.); б) об'єкти оточуючого середовища (гризуни, кліщі, пил з повітря, ґрунт, підстилка, вода та ін.). Найбільш репрезентативним методом підтвердження рикетсійної етіології захворювання є виділення С. burnetii з біотичних об'єктів з застосуванням ПЛР в реальному часі. Проведення реакції включає три основні етапи: підготовка досліджуваної проби і виділення ДНК, власне ампліфікація та детекція амгагіфікованої ДНК, облік та інтерпретація результатів реакції. Для виділення ДНК-зразків на практиці, як правило, використовують комерційні набори реактивів, призначені для дослідження різного виду біологічного матеріалу з дотриманням техніки проведення процедури та вимог інструкцій виробника. Ефективність та надійність виявлення С. burnеtii в досліджуваних зразках забезпечується детекцією з використанням двох наборів праймерів (один - для детекції консервативних фрагментів для визначення приналежності потенційного патогену до роду Rickettsia, другий - для детекції видоспецифічних фрагментів з метою етіологічної ідентифікації збудника) і флуоресцентно-мічених олігонуклеотидних зондів або інтеркалюючих барвників (наприклад, SYBR Green І). Ампліфікацію проводять в режимі послідовно зв'язаних програм, з врахуванням температури плавлення олігонуклеотидів, на ампліфікаторі для ПЛР в реальному часі (RotorGcne, ABIPrism 7000, iCyclcr iQ та in.), особливістю яких є можливість детектувати флуоресценцію. Для забезпечення високої ефективності аналізу рекомендується використовувати концентрації зонда 250 nМ, праймерів 50-900 nМ. Облік і інтерпретація результатів реакції здійснюється автоматично за допомогою програмного забезпечення, що поставляється із ПЛР-детектором. Вимірюється інтенсивність флуоресценції і результат реакції виноситься на екран монітора у вигляді графіка залежності флуоресценції від кількості циклів в реакції. При культивуванні С. burnetii по методу Кокса (Учение о риккетсиях и риккетсиозах / П.Ф. Здродовский, Н.М. Голиневич. Москва.: Медицина, 1972. - 494 с.) для попереднього інкубування використовують свіжі запліднені яйця. Яйця поміщають у електричний інкубатор з хорошою вентиляцією, де витримують протягом 6-7 днів при температурі 37 °C. Після інкубації яйця 1 UA 105276 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 перед зараженням піддають овоскопії для відбору нормально розвинутих ембріонів. При цьому олівцем відмічають межі повітряної камери та розміщення ембріона. Зараження яєць проводять в стерильних боксах для уникнення бактерійних забруднень. Для дезінфекції тупий кінець яєць спочатку протирають невеликим марлевим тампоном, змоченим 50 % етиловим спиртом. Після підсихання операційне поле над повітряною камерою змазують 5 % спиртовим розчином йоду, потім змочену спиртом поверхню проводять над полум'ям. Підготовка яєць для зараження завершується пробуравленням отвору в шкаралупі над верхівкою повітряної камери для вводу голки шприца. Отвори ці роблять спеціальним буравчиком або бормашиною. Адаптовані до курячих ембріонів штами С. burnetii добре розмножуються в жовточних мішках. Інфекційну рідину в об'ємній дозі 0,1-0,5 мл вводять в порожнину жовточного мішка уколом голки шприца через повітряну камеру на глибину приблизно 2,0-2,5 см. Для цього яйце беруть лівою рукою так, щоб тупий його кінець з відміченою повітряною камерою був направлений вперед при розміщенні відмітки ембріона внизу. Після цього голку виймають і отвір в шкаралупі над повітряною камерою герметизують розплавленим стерильним парафіном (із пастерівської піпетки), а на кожному яйці роблять олівцем відповідні написи. Після кожного серійного зараження яєць необхідно проводити контрольні посіви на бактерійну стерильність того матеріалу, яким проводять зараження (посіви в бульйон, на косий агар і в напіврідкий агар). Продуктивність культивування С. burnetii в пасажах на курячих ембріонах багато в чому залежить від обраної інфікуючої дози. Для проведення пасажів інфікуючу дозу підбирають з таким розрахунком, щоб викликати максимальну загибель ембріонів на 8-9-ту добу після зараження. Тому для кожного виду рикетсій та для кожного їх штаму необхідно визначати інфікуючи дозу шляхом титрування, тобто попереднього інфікування партії ембріонів (не менше 5) різними розведеннями маточної суспензії з врахуванням загибелі ембріонів та накопичення рикетсій. Застосування методу ПЛР в реальному часі дозволяє проводити не тільки детекцію накопичених продуктів ампліфікації, а й вести кількісний облік ДНК збудника даного виду. При цьому використовують відповідні ДНК-стандарти для побудови калібрувальних кривих після проведення реакції, що дозволяє вирахувати невідому вихідну кількість копій ДНК у зразках. У зв'язку з тим що С. burnetii надзвичайно стійкі до виливу факторів зовнішнього середовища, при їх масовому культивуванні можна заготовляти концентровану (в розведенні 1:10) маточну суспензію в якості стандартного посівного матеріалу, зберігаючи її протягом тривалого часу в рефрижераторі при температурі нижче -20 °C, або використовувати стандартний ліофілізований посівний матеріал. Заражені яйця інкубують при температурі 37 °C. Ембріони, що загинули протягом перших 34-х діб після зараження, відбраковують. Починаючи з 5 діб проводять щоденну овоскопію. Після 8 діб (до 13 діб) можна вскривати живі ембріони. Тупий кінець яйця, відібраного для вскриття, змащують 5 % спиртовим розчином йоду, потім шкаралупу яйця надколюють профламбованим пінцетом приблизно на рівні нижньої межі повітряної камери та циркулярно надламують на тому ж рівні. Максимальна загибель ембріонів при правильно вибраній інфікуючій дозі переважно спостерігається на 7-9-ту добу після зараження. Після вскриття яєць відбирають жовточні мішки та проводять їх дослідження паралельно мікроскопією та методом ПЛР в реальному часі, що дозволяє встановити кількісний рівень накопичення збудника даного виду. При накопиченні отриманого ізоляту проводять пасажування на морських свинках та/або лабораторних білих мишах з метою відтворення експериментальних форм гарячки Ку у тварин. Постановка серологічних реакцій дає позитивні результати тільки при наявності достатньої концентрації антитіл у сироватці крові лабораторних тварин (через 2-3 тижні). Принциповою особливістю ПЛР в реальному часі с кількісне визначення ДНК С. burnetii на будь-якій стадії інфекційного процесу. Запропонований нами спосіб рекомендується використовувати при виділенні С. burnetii з метою культивування, накопичення збудника, бактеріологічної діагностики гарячки Ку, що є необхідною ланкою вивчення циркулюючих штамів та основою для приготування як діагностичних, так і профілактичних препаратів. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 55 60 Спосіб виділення Coxiella burnetii, який відрізняється тим, що при виділенні збудника для його ідентифікації використовують полімеразну ланцюгову реакцію в реальному часі з метою контролю кількості ДНК збудника гарячки Ку на етапі підбору оптимальної інфікуючої дози, виявлення С. burnetii в інфікованих жовточних мішках курячих ембріонів, в досліджуваному матеріалі експериментальних лабораторних тварин. 2 UA 105276 U Комп’ютерна верстка І. Скворцова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: C12Q 1/00

Мітки: спосіб, збудника, виділення, burnetii, гарячки, coxiella

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/5-105276-sposib-vidilennya-coxiella-burnetii-zbudnika-garyachki-ku.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб виділення coxiella burnetii – збудника гарячки ку</a>

Подібні патенти