Спосіб забарвлення імуногістохімічних препаратів

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб забарвлення імуногістохімічних препаратів, який включає проведення імуногістохімічної реакції до етапу візуалізації препарату після хромогену, який відрізняється тим, що гістологічні зрізи додатково забарвлюють у розчині, який складається з альціанового синього 8G - 1 г, льодяної ацетатної кислоти - 3 мл, дистильованої води - 97 мл та тимолу - 0,1 г, з наступним дозабарвленням ядер у розчині, який складається з ядерного швидкого червоного - 0,1 г, алюмінію сульфату - 5 г, дистильованої води - до 100 мл та тимолу - 0,1 г.

Текст

Реферат: UA 100999 U UA 100999 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Корисна модель належить до медицини, а саме патологічної анатомії, патоморфології і гістологічної техніки, і може бути використаною у патогістологічній діагностиці для визначення муцинів і результатів імуногістохімічної реакції на одному гістологічному зрізі. Патоморфологічне дослідження сьогодні є одним з найбільш інформативних методів діагностики найпоширеніших захворювань людини. Особливе значення має використання морфологічних методів діагностики при онкологічних захворюваннях, оскільки від встановленого гістологічного типу пухлини безпосередньо залежить спосіб лікування і, відповідно, його ефективність та прогноз для хворого. Особливе місце у патогістологічній діагностиці пухлин займає імуногістохімічний метод, який дозволяє значно підвищити точність діагностики і вивести її на якісно новий рівень. Існує багато способів візуалізації основних структурних елементів тканин, що досліджуються, після проведення імуногістохімічної реакції, однак у своїй більшості вони ґрунтуються на дозабарвленні зрізів ядерними барвниками, перш за все гематоксиліном. Проте у деяких випадках для діагностики вкрай важливим є не тільки отримання результатів імуногістохімічної реакції в гістологічних зрізах пухлини, але й виявлення в цих ділянках певних субстанцій, що досягається за допомогою гістохімічних методів. Найбільш близьким за технічною суттю та результатом, що досягається, є загальноприйнятий спосіб забарвлення гістологічних зрізів ядерними барвниками після заключного етапу проведення імуногістохімічної реакції (нанесення хромогену) [Dabbs D.J. Diagnostic Immunohistochemistry / D.J. Dabbs.-3rd ed. - New York: Ch. Livingstone, 2010.-941 p.]. Спільними суттєвими ознаками прототипу і корисної моделі, що заявляється, є такі: проведення імуногістохімічної реакції до етапу візуалізації препарату після хромогену. Цей спосіб є недостатньо ефективним, тому що після імуногістохімічної реакції і дозабарвлення зрізів гематоксиліном Майєра складно отримати повну, детальну картину мікроскопічної будови, яку можна отримати загальногістологічними методами, а також виявити певні компоненти, які візуалізуються гістохімічними методами. При зіставленні між собою мікроскопічної картини окремих препаратів, забарвлених загальногістологічними і гістохімічними методами та після проведення імуногістохімічної реакції, як правило, виникають складнощі, пов'язані з пошуком на різних скельцях одних і тих самих ділянок. В основу корисної моделі поставлено задачу удосконалення способу забарвлення імуногістохімічних препаратів шляхом проведення забарвлення у розчині альціанового синього з наступним дозабарвленням ядер, що дасть можливість не тільки оцінити результати імуногістохімічної реакції, але й виявити накопичення внутрішньоклітинних і тканинних муцинів, що дозволить підвищити якість патоморфологічної і імуногістохімічниї діагностики муцинпродукуючих пухлин та уникнути помилок при співставленні гістологічної будови та імуногістохімічних показників. Поставлена задача вирішується тим, що у способі, який включає проведення імуногістохімічної реакції до етапу візуалізації препарату після хромогену, новим є те, що гістологічні зрізи додатково забарвлюють у розчині, який складається з альціанового синього 8G-1 г, льодяної ацетатної кислоти - 3 мл, дистильованої води - 97 мл та тимолу - 0,1 г, з наступним дозабарвленням ядер у розчині, який складається з ядерного швидкого червоного 0,1 г, алюмінію сульфату -5 г, дистильованої води - до 100 мл та тимолу - 0,1г. Причинно-наслідковий зв'язок між сукупністю ознак, що заявляються, та технічним результатом полягає у такому. Спосіб додаткового забарвлення імуногістохімічних препаратів у розчині альціанового синього дає можливість оцінити імуногістохімічну реакцію з топічною прив'язкою до конкретних клітинних елементів, а саме, муцин-продукуючих клітин (наприклад, клітин персневидноклітинного раку шлунка або протокової аденокарциноми підшлункової залози, і виключити реакцію у нормальних клітинах строми, запальної інфільтрації тощо) на одному гістологічному зрізі. Порівняно із загальноприйнятою практикою проведення гістохімічних і імуногістохімічних реакцій на різних гістологічних зрізах, даний спосіб дозволяє уникнути складнощів, пов'язаних із співставленням мікроскопічної картини одних і тих самих ділянок на окремих препаратах. При необхідності морфометричного дослідження результатів імуногістохімічної реакції з використанням даного способу стає можливим виявлення достовірних відмінностей імуногістохімічного забарвлення у альціанофільних (муцин-продукуючих) клітинах або ділянках пухлини порівняно з альціанонегативними клітинами (ділянками). Спосіб дозволяє також провести порівняння рівня продукції муцинів та імуногістохімічної експресії певного антигену на одному гістологічному зрізі, що значно спрощує сприйняття і прискорює отримання результату. 1 UA 100999 U 5 10 Таким чином, сукупність вищезазначених позитивних характеристик дозволить підвищити якість оцінки результатів імуногістохімічного дослідження, прискорити процес отримання кінцевого результату завдяки уникненню процесу уявного зіставлення мікроскопічної картини окремих препаратів, виявити певні закономірності імуногістохімічної експресії окремих антигенів в альціанофільних клітинах (ділянках) муцин-продукуючих пухлин. Спосіб здійснюють таким чином. Виготовляють гістологічні зрізи, які монтують на адґезивні предметні скельця, і проводять імуногістохімічну реакцію за стандартним протоколом (Dabbs D.J., 2010). Після візуалізації продуктів реакції хромогеном DAB зрізи промивають у двох змінах дистильованої води по 2 хв і інкубують протягом 30 хв у наступному розчині: альціановий синій 8G (СІ. 74240) розчин ацетатної кислоти 3 % тимол 15 (Перевіряють рН розчину і при необхідності доводять до 2,5. Розчин є стабільним протягом кількох місяців. Розчин ацетатної кислоти 3 % готують шляхом додавання 3 мл льодяної ацетатної кислоти до 97 мл дистильованої води). Далі зрізи промивають у двох змінах дистильованої води по 2 хв і дозабарвлюють протягом 5 хв у наступному розчині: ядерний швидкий червоний (СІ. 60760) алюмінію сульфат дистильована вода тимол 20 25 30 35 40 45 50 1г 100 мл 0,1 г. 0,1 г 5г до 100 мл 0,1 г. (Спочатку розчиняють сульфат алюмінію у дистильованій воді, потім додають ядерний швидкий червоний, повільно нагрівають до кипіння та охолоджують, після чого додають тимол. Розчин є стабільним протягом кількох місяців). Зрізи промивають у двох змінах дистильованої води по 2 хв, зневоднюють у спиртах, просвітляють у ксилолі і заключають у бальзам під покривне скельце за стандартною методикою. Результат: муцини (слиз, основна речовина хрящів, гранули опасистих клітин) виразно забарвлені у синьо-зелений колір, ядра клітин від темно-рожевого до червоного кольору, цитоплазма блідо-рожева. На цьому фоні чітко візуалізується хромоген DAB коричневого кольору в клітинах з позитивною імуногістохімічною реакцією. Апробація способу забарвлення імуногістохімічних препаратів проведена на базі відділення патоморфологічної і імуногістохімічної діагностики Університетської клініки Запорізького державного медичного університету при топічному визначенні експресії молекул міжклітинної адгезії Е-кадгерину у протоковій аденокарциномі підшлункової залози. Приклад У хворого Л., 1948 р.н., була виявлена пухлина головки підшлункової залози, яка патогістологічно була верифікована як протокова аденокарцинома, після чого новоутворення було видалено оперативно. Патогістологічне дослідження операційного матеріалу засвідчило діагноз: "Протокова аденокарцинома головки підшлункової залози з рясною десмопластичною стромою та інвазивним ростом в оточуючу тканину підшлункової залози та стінку дванадцятипалої кишки" Матеріал пухлини фіксували у 10 % забуференому формаліні й ущільнили у парапласт. З отриманих блоків виготовлені серійні гістологічні зрізи товщиною 4 мкм, які монтували на окремі предметні скельця. Один серійний зріз був забарвлений альціановим синім за загальноприйнятою методикою (Меркулов Г.А., 1969), на другому була виконана імуногістохімічна реакція з Е-кадгерином (Monoclonal Mouse Anti-Human E-Cadherin, Clone NCH-38 (DAKO, USA)), третій зріз із серії після постановки імуногістохімічної реакції з Екадгерином був дозабарвлений альціановим синім за запропонованим способом. Візуальна оцінка гістологічних препаратів пухлини, забарвлених альціановим синім за загальноприйнятим способом (зріз № 1), показала, що значна кількість пухлинних клітин злоякісних дуктулоподібних структур протокової аденокарциноми, а також нормальний протоковий епітелій підшлункової залози є муцин-вмісними. Слабку та помірну альціанофілію мала також рясна десмопластична строма злоякісної пухлини. Аналіз імуногістохімічної експресії молекул міжклітинної адгезії Е-кадгерину (зріз № 2) показав, що клітини нормального 2 UA 100999 U 5 10 протокового епітелію та значна кількість пухлинних клітин злоякісних дуктулоподібних структур мали виразне мембранне імунозабарвлення, що свідчило про збереженість міжклітинних контактів. Водночас спостерігалось кількісне і якісне зниження експресії Е-кадгерину у деяких ділянках пухлини та у зонах інвазії у стінку дванадцятипалої кишки. На препаратах пухлини, які дозабарвлені альціановим синім за запропонованим способом після проведення імуногістохімічної реакції (зріз № 3), у багатьох ділянках інвазивного росту протокової аденокарциноми відзначалось менш виразне імунозабарвлення цитолеми пухлинних клітин на Е-кадгерин з одночасним зниженням або відсутністю в них внутрішньоклітинного накопичення альціанофільної субстанції. Це свідчило про те, що зниження рівня продукції муцинів клітинами протокової аденокарциноми підшлункової залози корелює з підвищенням їх здатності до інвазивного росту. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 15 20 Спосіб забарвлення імуногістохімічних препаратів, який включає проведення імуногістохімічної реакції до етапу візуалізації препарату після хромогену, який відрізняється тим, що гістологічні зрізи додатково забарвлюють у розчині, який складається з альціанового синього 8G - 1 г, льодяної ацетатної кислоти - 3 мл, дистильованої води - 97 мл та тимолу - 0,1 г, з наступним дозабарвленням ядер у розчині, який складається з ядерного швидкого червоного - 0,1 г, алюмінію сульфату - 5 г, дистильованої води - до 100 мл та тимолу - 0,1 г. Комп’ютерна верстка І. Мироненко Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП "Український інститут інтелектуальної власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 3

Дивитися

Додаткова інформація

Автори англійською

Tumanskyi Valerii Oleksiiovych, Yevsieiev Anton Volodymyrovych

Автори російською

Туманский Валерий Алексеевич, Евсеев Антон Владимирович

МПК / Мітки

МПК: A61B 10/00

Мітки: препаратів, спосіб, імуногістохімічних, забарвлення

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/5-100999-sposib-zabarvlennya-imunogistokhimichnikh-preparativ.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб забарвлення імуногістохімічних препаратів</a>

Подібні патенти