Спосіб підвищення стійкості до полягання при збереженні врожайності та низького вмісту глюкозинолату рослини brassica

Номер патенту: 110111

Опубліковано: 25.11.2015

Автори: Ботс Марк, Ден Боер Барт, Лага Бенджамін

Є ще 35 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб підвищення стійкості до полягання при збереженні врожайності та низького вмісту глюкозинолату рослини Brassica, який включає введення мутантного алеля карликовості DELLA в геномну ДНК вказаної рослини шляхом трансформації або мутагенезу та селекції вказаних мутантних алелів DELLA,

в якому вказаний мутантний алель карликовості DELLA кодує білок DELLA з послідовністю SEQ ID NO: 3, в якій пролін, що відповідає Р91, є заміщеним на лейцин.

2. Спосіб за п. 1, в якому вказана рослина вибирається з групи, яка складається з В. juncea, В. napus, В. rapa, В. carinata, В. oleracea і В. nigra.

Текст

Реферат: Даний винахід стосується рослин Brassica зі зменшеною висотою або підвищеною стійкістю до полягання, які містять щонайменше один мутантний алель карликовості кодуючого гена білка DELLA, послідовностей нуклеїнових кислот, що представляють мутантні алелі карликовості DELLA, і мутантних білків карликовості DELLA. Даний винахід описує спосіб підвищення стійкості до полягання, при збереженні врожайності та низького вмісту глюкозинолату рослини Brassica, який включає введення мутантного алеля карликовості DELLA в геномну ДНК вказаної рослини шляхом трансформації або мутагенезу та селекції вказаних мутантних алелів DELLA, в якому вказаний мутантний алель карликовості DELLA кодує білок з послідовністю, в якій пролін, що відповідає Р91, є заміщеним на лейцин. UA 110111 C2 (12) UA 110111 C2 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід стосується сільськогосподарських рослин і їх частин, зокрема з родини Brassicaceae, зокрема виду Brassica, з поліпшеними агрономічними характеристиками, а конкретніше – з поліпшеною стійкістю до полягання. Цей винахід стосується також білків DELLA, конкретніше репресору білків ga1-3 1 (RGA1), і нуклеїнових кислот, кодуючих ці білки DELLA. Більш конкретно, цей винахід стосується нуклеїнових кислот, кодуючих мутантні білки DELLA, точніше мутантних білків RGA1, які зменшують висоту рослин і підвищують їх стійкість до полягання. Рівень техніки Полягання, тобто сплющення стоячих рослин дощем та/або вітром, становить серйозну проблему для багатьох насіннєвих культур, включаючи олійні, оскільки воно може приводити до труднощів при збиранні врожаю і втрати частини врожаю. Полягання можна зменшити, зменшивши висоту рослин, чого можна досягти шляхом використання регуляторів росту рослин або застосування їх карликових різновидів (Muangprom et al., Molecular Breeding 17: p 101–110, 2006). Під час "зеленої революції" в 60-тих і 70-тих роках минулого сторіччя виробництво зерна пшениці значно збільшилось завдяки використанню карликових мутантів – нових різновидів рослин зі зміненою архітектурою, тобто зменшеної висоти і збільшеного виходу зерна за рахунок біомаси соломи, які є більш стійкими до полягання, оскільки вони аномально реагують на гормон росту рослин гіберелін (GA) (Hedden, Trends Genet. 19, p 5–9, 2003). Було встановлено, що ці карликові мутанти пшениці відповідають мутаціям набуття функції в гені Rht (Peng et al., Nature 400, p 256-261, 1999), який кодує білок, що належить до родини білків DELLA. Білки DELLA, кодовані геном Rht і його ортологами, в Arabidopsis (GAI, RGA, RGL1 і RGL2), кукурудзі (d8), винограді (VvGAI), ячмені (SLN1) і рисі (SLR1) мають збережену функцію як репресори сигнальної системи GA і росту рослин (Sun and Gubler, Ann. Rev. Plant Biol. 55, p 197-223, 2004). Білки DELLA локалізуються до ядра, що дозволяє припустити, що вони діють як транскрипційні регулятори (Silverstone et al., The Plant Cell 13, p 1555–1565, 2001; Fleck and Harberd, Plant Journal 32, p 935-947, 2002; Gubler et al., Plant Physiology 129, p 191–200, 2002; Itoh et al., The Plant Cell 14, p57–70, 2002; Wen and Chang, Plant Cell 14, p 87-100, 2002). Було показано, що GA ініціює свій сигнальний шлях, викликаючи розкладання білків DELLA (Gomi and Matsuoka, Current opinion in plant biology 6, p 489-493, 2003). Білки DELLA містять N-термінальний домен DELLA і C-термінальний домен GRAS. Домен GRAS зберігся серед великої родини регуляторних білків, а саме родини GRAS (Pysh et al., The Plant Journal 18, p 111-119, 1999). Цей домен ймовірно є функціональним доменом, очевидно для транскрипційної регуляції. Крім того, було показано, що домен GRAS в білках DELLA є задіяним в зв'язуванні білка F-box (Dill et al., Plant Cell 16: p 1392–1405, 2004). Домен DELLA відіграє певну роль в індукованому GA розкладанні через взаємодію з GID1 Arabidopsis, але не обов'язково в активності цього білка, спрямованій на пригнічення росту (Peng et al., 1999 supra, Griffiths et al., The Plant Cell 18, p 3399–3414, 2006). Висувалось припущення, що делеція послідовностей DELLA перетворює мутантний білок на конститутивного репресора сигнальної системи GA (Peng et al., Genes & Development 11, p 3194–3205, 1997). Більшість мутацій DELLA для набуття функції локалізуються в домені DELLA (дивись Таблицю 1 для загального уявлення). Делеції або специфічні міссенс-мутації двох збережених мотивів (DELLA та/або VHYNP, показаних на Фіг. 1) в межах домену DELLA роблять мутантні білки резистентними до індукованого GA розкладання, приводячи до нечутливого до GA карликового фенотипу. Мутації в C-термінальному домені GRAS білків DELLA є загалом мутаціями втрати функції і викликають рецесивні слабкі фенотипи в кількох видах рослин, наводячи на думку, що цей C-термінальний домен є важливим для функції його репресора (Peng et al., 1997 supra; Gubler et al., 2002 supra; Itoh et al. supra, 2002; Dill et al., 2004 supra), за певними виключеннями. Що стосується мутантного алеля MUT1 кукурудзи D9, то мутація E600K очевидно є необхідною і достатньою для карликового фенотипу (WO 2007/124312). До того ж, виявилось, що всі мутації карликовості, ідентифіковані у Brassica, локалізовані на Cтермінальній ділянці білка RGA1. Muangprom et al. (Plant Physiology 137, p 931–938, 2005) описують нечутливий до GA алель Brassica rapa, названий brrga1-d, який відповідає заміщенню Q на R в амінокислотній позиції 328 біля ділянки VHIID. Виявилось, що напівдомінантний карликовий алель bzh B. napus є результатом заміщення E на K в амінокислотній позиції 546 (WO01/09356). Під час селекції з карликовим мутантом bzh B. napus виявились труднощі з точним визначенням гомозиготних (карликових; bzh/bzh) і гетерозиготних (напівкарликових; Bzh/bzh) рослин при розділенні потомства через вплив генетичного фону і оточуючого середовища на експресію цієї ознаки (Foisset et al., Theor Appl Genet 91, p 756-761, 1995; Barret et al., Theor Appl 1 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Genet 97, p 828-833, 1998). Також, насіння рапсу напів-карликового гібриду, одержаного при схрещуванні між карликовим мутантом bzh і рослиною нормального розміру ("Avenir"), все ще демонструє на 10 % знижену врожайність порівняно зі стандартними різновидами (http://www.international.inra.fr/layout/set/print/partnerships/with_the_private_sector/live_from_the_lab s/a_semi_dwarf_hybrid_rapeseed_that_is_promised_an_excellent_future). Коли алель brrga1-d B. rapa був перенесений схрещуванням в B. napus, спостерігалось значне зменшення виходу насіння для інбредних ліній, гомозиготних у відношенні мутантного алеля. Стійкість до полягання суттєво підвищилась у рослин, гомозиготних у відношенні мутантного алеля, але тільки у деяких з гетерозиготних рослин. Крім того, очікувались труднощі у відборі гетерозиготних рослин під час зворотного схрещування, оскільки генетичний фон і оточуюче середовище можуть впливати на експресію ознаки карликовості (Muangprom et al., 2006 supra). Вплив на склад олії і вміст глюкозинолату в насінні цих рослин не досліджувався, хоча відомо, що вміст глюкозинолату є значно вищим у B. rapa. Було ідентифіковано карлика B. napus з швидким циклюванням (Zanewich et al., J Plant Growth Regul 10, p 121-127, 1991; Frick et al., J. Amer. Soc. Hort. Sci. 119, p 1137-1143, 1994), який має кілька небажаних плейотропних ефектів (Muangprom at al., 2006 supra). Таким чином, існує потреба в альтернативних, особливо нетрансгенних методах поліпшення стійкості до полягання сільськогосподарських рослин, зокрема рослин олійного рапсу, які не чинять негативного впливу на агрономічні характеристики рослин. Даний винахід вносить суттєвий внесок в існуючий рівень цієї галузі, пропонуючи рослини Brassica, які є стійкими до полягання, в той же час зберігаючи агрономічно прийнятний розвиток рослин. Зокрема, дана заявка описує рослини Brassica, точніше рослини Brassica napus, які містять в своєму геномі мутантний алель RGA1 і які мають зменшену висоту і підвищену стійкість до полягання, в той же час підтримуючи нормальні рівні врожайності, низький вміст глюкозинолату і стабільний карликовий фенотип, що легко відбирається також в гетерозиготному стані. Цю проблему вирішено, як далі буде описано в різних варіантах здійснення, прикладах і формулі винаходу. Суть винаходу В першому варіанті здійснення даний винахід стосується рослини Brassica, яка містить в своєму генотипі щонайменше один мутантний алель гену DELLA, причому вказаний мутантний алель кодує мутантний білок карликовості DELLA, що має амінокислотну послідовність SEQ ID №: 1, яка характеризується тим, що принаймні одну її амінокислоту було модифіковано. Також пропонується рослина Brassica, в якій тією принаймні одною амінокислотою послідовності SEQ ID №: 1, яку було модифіковано, є Р (пролін). Переважно пролін заміщується лейцином (L). В іншому варіанті здійснення даний винахід стосується рослини Brassica, яка містить мутантний алель карликовості DELLA, де мутантний білок карликовості DELLA з послідовністю SEQ ID №: 1 має амінокислотну послідовність з щонайменше 75 % ідентичністю послідовності з SEQ ID №: 3, SEQ ID №: 5, SEQ ID №: 7 або SEQ ID №: 9. Рослина за цим винаходом є більш стійкою до полягання та/або має зменшену висоту порівняно з рослинами, які не мають вказаного мутантного алеля. В іншому варіанті здійснення рослина за цим винаходом вибирається з групи, яка складається з B. juncea, B. napus, B. rapa, B. carinata, B. oleracea і B. nigra. Також пропонуються рослинна клітина, насіння або потомство рослини за цим винаходом. Даний винахід стосується також насіння Brassica, що містить мутантний алель RGA1 dwf2, як той, що міститься в насінні, депонованому в NCIMB Limited 18 лютого 2010 року, під номером доступу NCIMB 41697, а також рослини Brassica або її клітини, частини, насіння або потомства, одержаних з такого насіння. В ще іншому варіанті здійснення даний винахід пропонує мутантний алель карликовості DELLA, кодуючий мутантний білок карликовості DELLA з амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 1, яка відрізняється тим, що принаймні одну її амінокислоту було модифіковано. Також пропонується мутантний алель карликовості DELLA, в якому тією принаймні одною амінокислотою послідовності SEQ ID №: 1, яку було модифіковано, є Р (пролін). Переважно пролін заміщується лейцином (L). В іншому варіанті здійснення даний винахід пропонує мутантний алель карликовості DELLA, де мутантний білок карликовості DELLA з послідовністю SEQ ID №: 1 має амінокислотну послідовність з щонайменше 75 % ідентичністю послідовності з SEQ ID №: 3, SEQ ID №: 5, SEQ ID №: 7 або SEQ ID №: 9. Даний винахід пропонує також мутантний білок карликовості DELLA з амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 1, яка відрізняється тим, що принаймні одну її амінокислоту було модифіковано. Пропонується також мутантний білок карликовості DELLA, в якому тією 2 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 принаймні одною амінокислотою послідовності SEQ ID №: 1, яку було модифіковано, є Р (пролін). Переважно пролін заміщується лейцином (L). Також пропонується мутантний білок карликовості DELLA з амінокислотною послідовністю SEQ ID №: 1, яка має амінокислотну послідовність з щонайменше 75 % ідентичністю послідовності з SEQ ID №: 3, SEQ ID №: 5, SEQ ID №: 7 або SEQ ID №: 9. В ще іншому варіанті здійснення даний винахід стосується способу перенесення щонайменше одного виділеного мутантного алеля карликовості DELLA від однієї рослини до іншої рослини, який включає наступні етапи: а. забезпечення першої рослини, що містить щонайменше один виділений мутантний алель карликовості DELLA, як описано раніше, або створення першої рослини, що містить щонайменше один виділений мутантний алель карликовості DELLA, як описано раніше; b. схрещування цієї першої рослини з другою рослиною, яка не містить такого щонайменше одного виділеного мутантного алеля DELLA і збирання гібридного насіння F1 з цього гібриду; і необов'язково додаткові етапи: с. ідентифікація рослин F1, які містять цей щонайменше один виділений мутантний алель DELLA; d. зворотне схрещування рослин F1, які містять цей щонайменше один виділений мутантний алель DELLA, з другою рослиною, яка не містить цього щонайменше одного виділеного мутантного алеля DELLA впродовж принаймні одного покоління (х), і збирання насіння ВСх з цих гібридів; і е. ідентифікація в кожному поколінні ВСх рослин, які містять цей щонайменше один виділений мутантний алель DELLA. Даний винахід стосується також способу одержання рослини за цим винаходом, який включає перенесення щонайменше одного мутантного алеля DELLA від однієї рослини до іншої рослини, у відповідності до вищеописаного способу. Також пропонується спосіб підвищення стійкості до полягання рослини та/або зменшення висоти рослини, який включає перенесення щонайменше одного мутантного алеля карликовості DELLA за цим винаходом в геномну ДНК вказаної рослини. Рослина у вищеописаних способах може вибиратись з групи, яка складається з B. juncea, B. napus, B. rapa, B. carinata, B. oleracea і B. nigra. Також пропонується застосування мутантного алеля карликовості DELLA за цим винаходом для одержання рослини зі зменшеною висотою або рослини з підвищеною стійкістю до полягання, а також застосування рослини за цим винаходом для одержання насіння, що містить щонайменше один мутантний алель карликовості DELLA, або для одержання культури олійного рапсу, що містить щонайменше один мутантний алель карликовості DELLA. Короткий опис малюнків Фіг. 1: Множинне зіставлення амінокислотних послідовностей B. napus (bn) RGA1, B. rapa (br) RGA1, A. thaliana (at) RGA і GAI. Домен DELLA відповідає амінокислотам (aa) 44-111, а домен GRAS – амінокислотам aa 221-581 білка atRGA. Підкресленими є: I, збережена ділянка I / мотив DELLA; II, збережена ділянка II / мотив VHYNP; III, багата на валін ділянка I; IV, сигнал ядерної локалізації; V, багата на валін ділянка II / ділянка VHIID; VI, мотив LXXLL, VII, SH2подібний домен. Ділянку, що містить мінімальну делецію мотиву VHYNP / збереженої ділянки II, яка є відомою тим, що надає карликовості, на основі d8-mpl, d8-2023 кукурудзи, і SLR1ΔTVHYNP рису, обведено рамкою. Пролін, що відповідає тому проліну, який було мутовано на лейцин в мутанті dwf2 B. napus, виділено жирним шрифтом. Загальні дефініції Термін "послідовність нуклеїнових кислот" (або молекула нуклеїнової кислоти або нуклеотидна послідовність) стосується молекули ДНК або РНК в одно- або двонитчастій формі, зокрема ДНК, кодуючої білок або фрагмент білка за цим винаходом. "Ендогенна послідовність нуклеїнових кислот" стосується послідовності нуклеїнових кислот, що знаходиться в рослинній клітині, наприклад ендогенний алель гену, кодуючого білок DELLA, є присутнім в ядерному геномі клітини Brassica. Термін "ген" означає послідовність ДНК, що містить ділянку (транскрибовану ділянку), яка транскрибується в молекулу РНК (наприклад, пре-мРНК, що містить послідовності інтронів, яка після сплайсирування (вирізання інтронів) перетворюється на зрілу РНК) в клітині, функціонально зв'язану з регуляторними ділянками (наприклад, промотором). Отже, ген може містити кілька функціонально пов'язаних послідовностей, таких як промотор, лідерна послідовність 5", що містить наприклад послідовності, задіяні в запуску трансляції, (білок) кодуючу ділянку (кДНК або геномну ДНК) і не трансльовану послідовність 3", що містить наприклад сайти термінації транскрипції. Термін "ендогенний ген" використовується для 3 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 відмежування від "чужого гену", "трансгену" або "химерного гену" і стосується гену від рослини певного роду, виду або різновиду, який не був введений в цю рослину шляхом трансформації (тобто, він не є "трансгеном"), але який звичайно є присутнім в рослинах цього роду, виду або різновиду, або який є введеним в цю рослину з рослин іншого роду, виду або різновиду, в яких він звичайно є присутнім, нормальними методами селекції або шляхом соматичної гібридизації, наприклад шляхом злиття протопластів. Подібно до цього, "ендогенний алель" гену не є алелем, введеним в рослину або рослинну тканину шляхом трансформації цієї рослини, але є, наприклад, створеним шляхом мутагенезу рослини та/або селекції або одержаним шляхом скринінгу природних популяцій рослин. Терміни "білок" або "поліпептид" використовуються взаємозамінно і стосуються молекул, що містять ланцюг амінокислот без посилання на конкретний спосіб дії, розмір, тривимірну структуру або походження. Отже, "фрагмент" або "частина" білка DELLA все ще може називатись "білком". Термін "виділений білок" використовується для позначення білка, який більше не знаходиться в своєму природному оточенні, наприклад in vitro або в рекомбінантній бактеріальній або рослинній клітині-хазяїні. Як він тут використовується, термін "білок DELLA" стосується білка (білків) або поліпептиду (поліпептидів) з гомологією репресору ga1-3 (RGA) A. thaliana, GA-INSENSITIVE (GAI) білків (нечутливих до гібереліну білків), які включають, не обмежуючись ними, білки Rht пшениці, білки d8 і D9 кукурудзи, білок SLENDER RICE1 (SLR1) рису, білки RGA Brassica (наприклад, RGA1 і RGA2), білки RGA-LIKE1 (RGL1), RGL2 і RGL3 Arabidopsis, Vvgai винограду і SLN ячменю. Білки DELLA функціонують як ядерні репресори реакцій рослинного гібереліну (GA). Вони типово містять N-термінальний домен DELLA (який відповідає амінокислотам 44-111 білка RGA A. Thaliana, представленого послідовністю SEQ ID №: 7) і C-термінальні 2/3 білків, що є дуже подібними до еквівалентної ділянки гаданого фактору транскрипції SCARECROW (SCR) від Arabidopsis, яку також називають доменом GRAS (який відповідає амінокислотам 221-581 послідовності SEQ ID №: 7). Домен DELLA містить дві збережені ділянки I і II, які також називають мотивами DELLA і VHYNP (Muangprom et al., 2005 supra; Peng et al., 1999 supra; WO07/124312). Зіставлення амінокислотних послідовностей різних білків DELLA з індикацією збережених доменів є представленим на Фіг. 1. Відповідні домени або залишки в інших білках DELLA можна визначити, наприклад, за допомогою оптимального зіставлення. Нуклеотидна послідовність амінокислотної послідовності різних білків DELLA є представленою в переліку послідовностей послідовностями SEQ ID №: 3, SEQ ID №: 5, SEQ ID №: 7 і SEQ ID №: 9. Відповідні ділянки, домени або залишки в інших послідовностях DELLA можна визначити, наприклад, за допомогою оптимального зіставлення. Білки DELLA локалізуються в ядрі, де вони пригнічують експресію генів, що реагують на GA. В присутності GA, однак, білки DELLA є мішенями для руйнування. Це було показано зв'язуванням GA з його рецептором (GID1 у рису і GID1a, GID1b і GID1c у Arabidopsis), який потім взаємодіє з комплексом убіквітин лігази SCF E3, щоб забезпечити убіквітинування і наступне руйнування DELLA (Djakovic-Petrovic et al., The Plant Journal 51, p 117–126, 2007). Взаємодія GID1–DELLA специфічно залучає збережені N-термінальні домени I і II білка DELLA (Murase et al., Nature 456, p 459-464, 2008), чим пояснюється, чому мутантні білки DELLA, у яких ці домени відсутні, надають GA-нечутливість. Вважається, що утворення комплексу GA-GID1DELLA викликає конформаційну зміну в C-термінальному домені GRAS білка DELLA, яка стимулює розпізнання субстрату убіквітин лігазою SCFSLY1/GID2 E3, протеасомну деструкцію DELLA і наступну активацію росту (Harberd et al., The Plant Cell 21, p 1328–1339, 2009). Термін "ген DELLA" або "алель DELLA" стосується тут послідовності нуклеїнових кислот, кодуючих білок DELLA. Гени всіх відомих білків DELLA є безінтронними. Зіставлення нуклеотидної послідовності різних генів/ кодуючих послідовностей DELLA є представленим на Фіг. 2. Нуклеотидна послідовність різних генів/ кодуючих послідовностей DELLA є представленою в переліку послідовностей послідовностями SEQ ID №: 2, SEQ ID №: 4, SEQ ID №: 6 і SEQ ID №: 8. Як він тут використовується, термін "алель" означає будь-яку з однієї або більше альтернативних форм гену в конкретному локусі. В диплоїдній (або амфідиплоїдній) клітині організму алелі даного гену є локалізованими в специфічному місці або локусі на хромосомі. Один алель є присутнім на кожній хромосомі пари гомологічних хромосом. Як він тут використовується, термін "гомологічні хромосоми" означає хромосоми, які містять інформацію для тих самих біологічних ознак і містять ті самі гени в тих самих локусах, але можливо різні алелі цих генів. Гомологічні хромосоми є хромосомами, які паруються під час мейозу. "Негомологічні хромосоми", що представляють всі біологічні ознаки організму, утворюють комплект, і кількість комплектів у клітині називається плоїдністю. Диплоїдні організми 4 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 містять два комплекти негомологічних хромосом, де кожна гомологічна хромосома успадковується від іншого з батьків. У амфідиплоїдних видів існують по суті два комплекти диплоїдних геномів, завдяки чому хромосоми цих двох геномів називаються "гомеологічними хромосомами" (і, подібно до цього, локуси або гени цих двох геномів називаються гомеологічними локусами або генами). Диплоїдний або амфідиплоїдний вид рослин може містити велику кількість різних алелів в якомусь конкретному локусі. Як він тут використовується, термін "гетерозиготний" означає генетичний стан, існуючий тоді, коли два різні алелі знаходяться в якомусь специфічному локусі, але є розміщеними індивідуально на відповідних парах гомологічних хромосом в клітині. Навпаки, термін "гомологічний", як він тут використовується, означає генетичний стан, існуючий тоді, коли два ідентичні алелі знаходяться в якомусь специфічному локусі, але є розміщеними індивідуально на відповідних парах гомологічних хромосом в клітині. Як він тут використовується, термін "локус" означає специфічне місце або місця або сайт на хромосомі, де, наприклад, знаходиться ген або генетичний маркер. Наприклад, "локус RGA1" стосується положення на хромосомі, де може знаходитись ген RGA1 (і два алелі RGA1). Термін "суттєво подібна", як він тут використовується, стосується послідовностей, які мають щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичність послідовностей. Такі послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також "значною мірою ідентичними" або "суттєво ідентичними" до послідовностей DELLA, наведених в переліку послідовностей. "Ідентичність послідовностей" двох споріднених нуклеотидних або амінокислотних послідовностей, виражена як відсоток, стосується кількості позицій в цих двох, оптимально зіставлених послідовностях, які мають ідентичні залишки (х100), поділеної на кількість порівнюваних позицій. Пропуск, тобто позиція в зіставленні, де залишок є присутнім в одній послідовності, але не в іншій, вважається позицією з неідентичними залишками. "оптимальне зіставлення" двох послідовностей встановлюється шляхом зіставлення двох послідовностей по всій довжині за алгоритмом глобального зіставлення Needleman і Wunsch (Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53) в The European Molecular Biology Open Software Suite (EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276—277; дивись, наприклад http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html) з використанням установок по умовчанню (штраф за відкриття пропуску = 10 (для нуклеотидів) / 10 (для білків) і штраф за протяжність пропуску = 0,5 (для нуклеотидів) / 0,5 (для білків)). Для нуклеотидів використовуваною матрицею замін по умовчанню є EDNAFULL, а для білків матрицею замін по умовчанню є EBLOSUM62. "Суворі умови гібридизації" можуть використовуватись для ідентифікації нуклеотидних послідовностей, які є значною мірою ідентичними або подібними до даної нуклеотидної послідовності. Суворі умови залежать від послідовності і будуть відрізнятись за різних обставин. 0 Загалом, суворі умови вибираються такими, щоб бути приблизно на 5 С нижче термографічної температури плавлення (Tm) для конкретних послідовностей при визначеній іонній силі і рН. T m – це температура (при визначеній іонній силі і рН), при якій 50 % цільової послідовності гібридизуються з довершено підібраним зондом. Типово будуть вибиратись такі суворі умови, при яких концентрація солі становить приблизно 0,02 моль/л, а температура становить 0 щонайменше 60 С. Зниження концентрації солі та/або підвищення температури збільшують суворість. Суворі умови для гібридизацій РНК-ДНК (Нозерн блоти з використанням зонду з, наприклад, 100 нуклеотидів) є прикладом тих, які передбачають щонайменше одне промивання в 0,2X SSC при 63 °C впродовж 20 хвилин або еквівалентні умови. "Умови високої суворості" можуть бути забезпечені, наприклад, гібридизацією при 65 °C у водному розчині, що містить 6x SSC (20x SSC містить 3,0 M NaCl, 0,3 M Na-цитрату, pH 7,0), 5x Denhardt's (100X Denhardt's містить 2 % Ficoll, 2 % полівініл піролідону, 2 % альбуміну бичачої сироватки), 0,5 % натрію додецил сульфату (SDS) і 20 мкг/мл денатурованого ДНК-носія (однонитчаста ДНК спермію риби, з середньою довжиною 120-3000 нуклеотидів) в якості неспецифічного конкурента. Після гібридизації промивання високої суворості може здійснюватись в кілька етапів, з кінцевим промиванням (біля 30 хвилин) при температурі гібридизації в 0,2-0,1× SSC, 0,1 % SDS. "Умови помірної суворості" стосуються умов, еквівалентних гібридизації у вищеописаному 0 розчині, але при температурі біля 60-62 С. Промивання помірної суворості може здійснюватись при температурі гібридизації в 1x SSC, 0,1 % SDS. "Низька суворість" стосується умов, еквівалентних гібридизації у вищеописаному розчині, 0 але при температурі біля 50-52 С. Промивання низької суворості може здійснюватись при температурі гібридизації в 2x SSC, 0,1 % SDS. Дивись також Sambrook et al. (1989) і Sambrook and Russell (2001). 5 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Термін "ортолог" гену або білка стосується тут гомологічного гену або білка, знайденого у іншого виду, який має ту саму функцію, що й цей ген або білок, але (звичайно) розходиться в послідовності з того моменту часу, коли види, що містять ці гени, розійшлись (тобто, гени еволюціонували від спільного предка шляхом видоутворення). Відповідно, ортологи гену DELLA, наприклад ген RGA1 B. napus, можуть бути ідентифіковані у інших видів рослин (наприклад, B. juncea, B. napus, B. rapa, B. carinata, B. oleracea і B. nigra) на основі порівнянь обох послідовностей (наприклад, на основі відсотків ідентичності послідовностей для всієї послідовності або для специфічних доменів) та/або функціонального аналізу. Термін "мутант" або "мутація" стосується, наприклад, рослини або алеля гену, які відрізняються від так званої рослини або алеля/ гену "дикого типу", який стосується типової форми, наприклад, рослини або алеля/ гену, яка найчастіше трапляється в природі. "Рослина дикого типу" стосується рослини з найпоширенішим фенотипом такої рослини в природній популяції. "Алель дикого типу" стосується алеля гену, необхідного для одержання фенотипу дикого типу. Мутантна рослина або алель можуть траплятись в природній популяції або завдячувати втручанню людини, наприклад у вигляді мутагенезу, а "мутантний алель" стосується алеля гену, необхідного для одержання мутантного фенотипу. Як він тут використовується, термін "мутантний алель DELLA" стосується алеля DELLA, який відрізняється від відповідного алеля дикого типу в одній або більше нуклеотидних позиціях, тобто він містить одну або більше мутацій в своїй послідовності нуклеїнових кислот у порівнянні з алелем дикого типу. Мутантний алель або білок можуть називатись також варіантним алелем або білком. Мутації в послідовностях нуклеїнових кислот можуть містити, наприклад: (а) "міссенс мутацію", яка є зміною послідовності нуклеїнових кислот, що має своїм результатом заміщення однієї амінокислоти іншою амінокислотою; (b) "нонсенс мутацію" або "мутацію СТОП кодону", яка є зміною послідовності нуклеїнових кислот, що має своїм результатом введення недозрілого СТОП кодону і відповідно припинення трансляції (одержується усічений білок); рослинні гени містять стоп кодони трансляції "TGA" (UGA в РНК), "TAA" (UAA в РНК) і "TAG" (UAG в РНК); отже, заміщення, вставка або делеція нуклеотиду, які приводять до того, що один з цих кодонів який буде в зрілій мРНК, що транслюється (в рамці зчитування), припинить трансляцію; (с) "мутація вставки" однієї або більше амінокислот завдяки одному або більше кодонів, які були додані в кодуючу послідовність даної нуклеїнової кислоти; (d) "мутація делеції" однієї або більше амінокислот завдяки одному або більше кодонів, які були видалені з кодуючої послідовності даної нуклеїнової кислоти; (е) "мутація зміщення рамки", яка призводить до того, що послідовність нуклеїнових кислот транслюється в іншу рамку по ходу мутації. Мутація зміщення рамки може мати різні причини, такі як вставка, делеція або дуплікація одного або більше нуклеотидів, але також мутації, які порушують сплайсинг пре-мРНК (мутації сайту сплайсингу), можуть викликати зміщення рамки; (f) "мутації сайту сплайсингу", які змінюють або припиняють правильний сплайсинг послідовності пре-мРНК, що має своїм результатом білок з іншою амінокислотною послідовністю, ніж послідовність дикого типу. Наприклад, один або більше ексонів можуть бути пропущені під час сплайсингу РНК, що дасть білок, у якому відсутні амінокислоти, кодовані пропущеними ексонами. Альтернативно, рамка зчитування може бути зміненою внаслідок неправильного сплайсингу, або може залишитись один або більше інтронів, або можуть утворитись додаткові донори або акцептори сплайсингу, або сплайсинг може початись в іншій позиції (наприклад, в межах інтрону), або можуть генеруватись додаткові сигнали поліаденілування. Правильний сплайсинг пре-мРНК є складним процесом, на який можуть впливати різні мутації в нуклеотидній послідовності генів. У вищих евкаріотів, таких як рослини, основна сплайсингосома вирізає інтрони, що містять GU в сайті сплайсингу 5' (донорний сайт) і AG в сайті сплайсингу 3' (акцепторний сайт). Це правило GU-AG (або правило GT-AG; дивись Lewin, Genes VI, Oxford University Press 1998, spp 885-920, ISBN 0198577788) виконується приблизно в 99 % сайтів сплайсингу ядерних евкаріотичних генів, тоді як інтрони, що містять інші динуклеотиди в сайті сплайсингу 5" і 3", такі як GC-AG і AU-AC, відповідають тільки за приблизно 1 % і 0,1 %, відповідно. Як він тут використовується, термін "модифікована" у відношенні послідовності нуклеїнових кислот або послідовності амінокислот, стосується однієї або більше мутацій, що приводять до делеції, вставки та/або заміщення однієї або більше нуклеїнових кислот або амінокислот в цій послідовності у порівнянні з відповідною послідовністю нуклеїнових кислот або амінокислот дикого типу. 6 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Як він тут використовується, термін алель "карликовості" стосується мутантного алеля DELLA, що спрямовує експресію мутантного білка DELLA (білка карликовості DELLA), який забезпечує карликовий фенотип (тобто, зменшену висоту) рослини, в якій він експресується, тим самим дозволяючи одержати рослину з підвищеною стійкістю до полягання. Такий мутантний білок карликовості DELLA містить щонайменше одну вставку, делецію та/або заміщення амінокислоти відносно білка дикого типу, що має своїм результатом білок, який не розкладається або розкладається значно менше у відповідь на GA (тобто, є GA-нечутливим), тим самим діючи як конститутивний репресор індукованого GA росту. Такий мутантний алель, коли експресується в рослині, буде забезпечувати зменшену чутливість рослини до індукованого GA росту і тим самим давати рослину зменшеної висоти, тобто карликову рослину, та/або рослину з підвищеною стійкістю до полягання. По суті, будь-яка мутація, яка має своїм результатом білок, що містить принаймні одну вставку, делецію та/або заміщення амінокислоти відносно білка дикого типу, може привести до мутантного білка DELLA карликовості. Однак зрозуміло, що мутації в певних частинах кодуючої послідовності білка з більшою ймовірністю приводять до алеля DELLA карликовості, такі як мутації в ділянках ДНК, кодуючих збережені домени, подібні домену DELLA (що містить мотив DELLA, спейсерну ділянку, тобто ділянку між DELLA і VHYNP, та мотив VHYNP). "Мутація dwf2" або "мутантний алель dwf2", як ці терміни тут використовуються, стосуються мутації в алелі DELLA, яка приводить до заміщення кодованого білка DELLA проліну, що відповідає Р91 амінокислотної послідовності RGA1 B. napus (SEQ ID №: 3), на іншу амінокислоту, переважно лейцин (L). В такому мутантному алелі dwf2 кодон, що відповідає нуклеотидам 271-273 геномної ДНК RGA1 B. napus/ кодуюча послідовність (SEQ ID №: 2) було змінено таким чином, що він більше не кодує пролін, а кодує іншу амінокислоту, переважно лейцин (наприклад CCC мутовану до CTC). Визначення відповідних амінокислот або нуклеотидних позицій в інший послідовності може бути здійснено методом відомим в цій галузі, таким як оптимальне зіставлення, яке вже описувалось. "Гібереліни" або "GA" – це рослинні гормони які регулюють ріст і впливають на різні процеси розвитку, включаючи видовження стебла, проростання, стан спокою, цвітіння, вираженість статевих ознак, індукцію ферментів, а також старіння листя і плодів. GA – це дитерпеноїдні (дигідроабієтинові) кислоти, які синтезуються терпеноїдним провідним шляхом в пластидах, а потім модифікуються в ендоплазматичному ретикулумі і цитозолі, доки не досягнуть своєї біологічно активної форми. Гіберелінова кислота, яка була першим структурно охарактеризованим гібереліном, є відомою як GA3. "Карликова рослина" має означати атипову малу рослину. Загалом, така "карликова рослина" має змінену архітектуру в тому відношенні, що вона має статуру або висоту, що є зменшеною від висоти типової рослини приблизно на 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % або більше. Загалом, але не виключно, така карликова рослина характеризується зменшеною довжиною стебла, черешка або стовбура у порівнянні з типовою рослиною. Переваги карликових рослин включають можливість дуже раннього посіву; відсутність необхідності опилювання регуляторами росту через менше видовження стебла до настання зими; краща стійкість до морозів; легкість моніторингу врожаю через менший розмір, що полегшує обробки з метою захисту рослин; підвищена стійкість до полягання; легкість збирання врожаю, менші його втрати і збільшений вихід. Термін "полягання", як він тут використовується, стосується сплющення стоячих рослин дощем та/або вітром, внаслідок чого вертушки або стручки опиняються нижче рівня різака під час збирання врожаю. Полягання типово призводить до труднощів при збиранні врожаю і втрати врожаю/втрати виходу. Отже, "стійкість до полягання" стосується рослин, що є менш схильними до полягання ніж типова рослина. Терміни "підвищена стійкість до полягання" або "зменшене полягання", як вони тут використовуються, стосуються рослин, які менше вражаються поляганням ніж типова рослина. Стійкість до полягання можна оцінювати, наприклад, шляхом визначення відношення висоти незайманої рослини до висоти випрямленої рослини, як наприклад описано Muangprom et al. (1996), або як наприклад описано далі в масштабі 1 до 9. Стійка до полягання рослина має стійкість до полягання, яка збільшується, або полягання, яке зменшується від такого типової рослини приблизно на 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % або більше. Рослина з підвищеною стійкістю до полягання викликає менше труднощів при збиранні врожаю, а значить забезпечує менші втрати врожаю, ніж рослини більш низькою стійкістю до полягання, тим самим поліпшуючи загальний вихід. Підвищена стійкість до полягання може бути результатом зменшеної висоти або статури рослин. Як він тут використовується, термін "зменшена висота" рослини стосується статури або висоти, яка є 7 UA 110111 C2 5 10 15 20 зменшеною від такої типової рослини приблизно на 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 % або більше. Термін "мутантний білок DELLA", як він тут використовується, наприклад мутантний білок RGA, стосується білка, кодованого мутантною послідовністю нуклеїнових кислот DELLA ("алелем DELLA" або "геном DELLA"), завдяки чому ця мутація має своїм результатом зміну амінокислотної послідовності цього білка у порівнянні з білком дикого типу. "Білок карликовості DELLA" – це мутантний білок DELLA, який, коли експресується в рослині, буде мати своїм результатом рослину зі зменшеною висотою (тобто, карликову рослину) та/або підвищену стійкість до полягання у порівнянні з рослиною, яка не експресує такий білок. Типово, в такому білку карликовості DELLA амінокислоти або амінокислотні домени, суттєво важливі для здатності білка розкладатись під дією GA, є заміщеними, вилученими або зруйнованими, що робить цей білок GA-нечутливим. Такий білок карликовості DELLA все ще діє як репресор росту. Отже, мутація, яка спричинює до того, що білок DELLA за цим винаходом надає карликового фенотипу, є мутацією набуття функції, завдяки чому мутантний білок DELLA діє як конститутивний репресор росту. Мутантний білок DELLA за цим винаходом не містить білок DELLA з втратою мутації функції, оскільки такі мутації будуть викликати збільшену висоту рослини через втрату репресорної функції DELLA. Мутантний білок DELLA кодується мутантним алелем або геном DELLA. Приклади мутантних алелей/білків карликовості DELLA є відомими в цій галузі, і огляд таких мутантів представлений в Таблиці 1. Ефект карликовості цих мутацій був підтверджений експресією мутантних білків GAI, що несуть відповідні мутації, у Arabidopsis (Willige et al., The Plant Cell 19, p 1209-1220, 2007). Таблиця 1 Огляд мутантних білків DELLA, які надають карликовий фенотип, з посиланням на відповідні джерела, які всі є включеними сюди за посиланням Вид ген Z.mais d8 назва мутанта мутація посилання D8-Mpl D8-1 D8-2023 Δ1-105 D55G, Δ56-59 Δ87-98 N11S, R15M, A108T, G427D, INDEL511525, E600K Peng et al., 1999 supra Peng et al., 1999 supra Peng et al., 1999 supra ΔDELLA Δspace ΔTVHYNP ΔpolyS/T/V Δ39-55 Δ69-80 Δ87-104 Δ175-237 Itoh et al., 2002 supra Itoh et al., 2002 supra Itoh et al., 2002 supra Itoh et al., 2002 supra T. aestivum Rht-B1a Rht-D1a H.vulgare B1b D1b Q64stop  Δ1-67 E64stop  Δ1-67 Peng et al., 1999 supra Peng et al., 1999 supra SLN1 sln1d G46E Chandler et al., Plant Physiology 129, p181– 190, 2002 gai rga-Δ17 Δ27-43 Δ44-60 Peng et al., 1997 supra Dill et al., PNAS 98, p14162–67, 2001 brrga1-d Q328R Muangprom et al., 2005 supra bzh E546K WO01/09356 D9 O.sativa SLR1 A.thaliana GAI RGA B.rapa RGA1 B. napus RGA1 25 MUT1 WO 07/124312 GA-чутливість білка DELLA можна оцінити, наприклад, за (над)експресією цього білка в рослині методами, відомими в цій галузі, і впливом на висоту рослини або за (тимчасовою) (над)експресією цього білка в рослині або рослинній клітині і розщепленням білка у відповідь на 8 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 обробку GA, як описано, наприклад, у Itoh et al., 2002 supra; Gubler et al., 2002 supra, Muangprom et al., 2005 supra. GA-чутливість рослини, що містить (алелі, кодуючі) білки DELLA, можна оцінити екзогенно, застосувавши GA і визначивши його вплив на висоту рослини, як описано, наприклад у Itoh et al., 2002 supra. "Мутагенез", як цей термін тут використовується, стосується процесу, в якому рослинні клітини (наприклад, певна кількість насіння Brassica або інших частин, таких як пилок і т.п.) піддаються процедурі, яка викликає мутації в ДНК цих клітин, такій як контакт з мутагенним агентом, таким як хімічна речовина (наприклад, етилметилсульфонат (ЕМС), етилнітрозосечовина (ЕНС) і т.п.), альфа-промені, гамма-промені (такі як від джерела Кобальту 60), рентгенівські промені, УФ опромінення і т.п.), або комбінація двох або більше з них. Отже, бажаний мутагенез одного або більше алелів DELLA може бути здійснений шляхом використання хімічних засобів, наприклад за допомогою контакту однієї або більше рослинних тканин з етилметилсульфонатом (ЕМС), етилнітрозосечовиною і т.п., шляхом використання фізичних засобів, наприклад за допомогою рентгенівських променів, гамма-опромінення, такого як від джерела Кобальту 60. Якщо мутації, створювані опроміненням, часто є великими делеціями або іншими об'ємистими ураженнями, такими як транслокації або складні перестройки, то мутації, викликані хімічними мутагенами, часто є більш дискретними ураженнями, такими як точкові мутації. Наприклад, ЕМС алкілує гуанінові основи, що приводить до помилкового спарювання основ: алкілований гуанін буде паруватись з тіміновою основою, що має своїм результатом в основному транзиції G/C до A/T. Після мутагенезу рослини Brassica регенерують з оброблених клітин за допомогою відомих методів. Наприклад, одержане насіння Brassica може бути висіяне у відповідності до звичайних методик вирощування, і після самозапилення на цих рослинах утворюється насіння. Як варіант, здвоєні гаплоїдні ростки можуть видалятись, щоб негайно утворити гомозиготні рослини, наприклад як описано у Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Canada). Додаткове насіння, яке утворюється в результаті такого самозапилення в цьому або наступному поколінні, може бути зібране і піддане скринінгу на присутність мутантних алелів DELLA. Відомі кілька методик TM для скринінгу на специфічні мутантні алелі, наприклад Deleteagene (Delete-a-gene; Li et al., 2001, Plant J 27: 235-242) використовує аналізи з полімеразною ланцюговою реакцією (ПЛР), щоб відібрати делеційні мутанти, які утворились під час мутагенезу під дією швидких нейтронів. TILLING (targeted induced local lesions in genomes (цільові індуковані локальні ураження в геномах); McCallum et al., 2000, Nat Biotechnol 18:455-457) ідентифікує викликані ЕМС точкові мутації і т.д. Інші методики скринінгу на присутність специфічних мутантних алелів DELLA є описаними в прикладах далі. "(Молекулярний) маркер", як цей термін тут використовується, стосується вимірної генетичної ознаки з фіксованим положенням в геномі, яка звичайно унаслідується менделівським чином і яка може бути використана для картування тієї характеристики, що становить інтерес. Природа цього маркеру залежить від використовуваного молекулярного аналізу і може бути виявлена на рівні ДНК, РНК і білка. Генетичне картування може здійснюватись з використанням молекулярних маркерів, таких як, але без обмеження ними, RFLP (поліморфізми довжини фрагментів рестрикції; Botstein et al. (1980), Am J Hum Genet 32:314-331; Tanksley et al. (1989), Bio/Technology 7:257-263), RAPD (випадкова ампліфікована поліморфна ДНК; Williams ef a/. (1990), NAR 18:6531-6535), AFLP (поліморфізми довжини ампліфікованих фрагментів; Vos et al. (1995) NAR 23:4407-4414), SNPs (однонуклеотидні поліморфізми) або мікросателіти (також називаються SSR's; Tautz et al. (1989), NAR 17:6463TM 6471), технологія Invader (як описано, наприклад, в патенті США № 5,985,557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage, які включено сюди за посиланням), методи виявлення на основі ПЛР або ПЛР зі зворотною транскрипцією, такі як TaqMan® (Applied Biosystems), або інші методи виявлення, такі як SNPlex, і подібні. Про молекулярний маркер кажуть, що він "зчеплений" з геном або локусом, коли маркер і ген або локус мають більшу асоціацію в спадковості, ніж можна було б очікувати з незалежного асортименту, тобто маркер і локус виділяються разом в популяції, що розщеплюється, і знаходяться на тій самій хромосомі. "Зчеплення" стосується відстані між маркером і геном або локусом (або двома локусами або двома маркерами). Чим щільнішим є зчеплення, тим меншою є ймовірність явища рекомбінації між маркером і геном або локусом. Генетична відстань (відстань на генетичній карті) обчислюється за частотами рекомбінації і виражається в сантиморганах (сМ) (Kosambi (1944), Ann. Eugenet. 12:172-175). 9 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Будь-яке посилання на "рослину" або "рослини" за цим винаходом включає також частини рослини (клітини, тканини або органи, насіннєві стручки, насіння, частини, які відрізаються, такі як коріння, листя, квіти, пилок і т.п.), потомство рослин, яке зберігає відмінні ознаки батьків, таке як насіння, одержане шляхом самовідтворення або схрещування, наприклад гібридне насіння (одержане при схрещуванні двох інбредних батьківських ліній), гібридні рослини і частини рослини, одержані з них, якщо не зазначається інше. "Сільськогосподарська рослина" стосується рослинного виду, що культивується як продуктивна рослина, така як, але не обмежуючись цим, рослина Brassica, включаючи Brassica napus (AACC, 2n=38), Brassica juncea (AABB, 2n=36), Brassica carinata (BBCC, 2n=34), Brassica rapa (синонім B. campestris) (AA, 2n=20), Brassica oleracea (CC, 2n=18) або Brassica nigra (BB, 2n=16). Ця дефініція не охоплює бур'яни, такі як Arabidopsis thaliana. "Різновид", як цей термін тут використовується згідно конвенції UPOV, стосується групи рослин в єдиному ботанічному таксоні найнижчого відомого рангу, яку можна визначити за експресією ознак, що є результатом даного генотипу або комбінації генотипів, яку можна відрізнити від будь-якої іншої групи рослин за експресією щонайменше однієї з вказаних ознак і яка розглядається як одиниця у відношенні її придатності для розмноження у незмінному вигляді (стабільною). Як він тут використовується, термін "така, що не трапляється у природі" або "культивована", коли застосовується у відношенні рослини, означає рослину з геномом, який був модифікований людиною. Трансгенна рослина, наприклад, є рослиною, що не трапляється у природі, яка містить екзогенну молекулу нуклеїнової кислоти, наприклад химерний ген, що включає транскрибовану ділянку, яка, коли транскрибується, дає біологічно активну молекулу РНК, що транслюється в білок, такий як білок DELLA за цим винаходом, а значить була модифікована людиною. Крім того, рослина, що містить мутацію в ендогенному гені, наприклад мутацію в ендогенному гені DELLA, (наприклад, в регуляторному елементі або в кодуючій послідовності) як результат дії мутагенного агента, також вважається неприродною рослиною, оскільки її було генетично модифіковано людиною. Більше того, рослина конкретного виду, такого як Brassica napus, яка містить мутацію в ендогенному гені, наприклад в ендогенному гені DELLA, якого у природі не трапляється у цього конкретного виду рослин, як результат, наприклад, спрямованих процесів виведення і селекції, таких як виведення з використанням маркеру і селекції або інтрогресії з рослиною того самого або іншого виду, такого як Brassica juncea або rapa, такою рослиною, яка також вважається такою, що не трапляється у природі. З іншого боку, рослина, яка містить тільки спонтанні мутації або мутації, що трапились природним шляхом, тобто рослина, яку не було генетично модифіковано людиною, не є "рослиною, що не трапляється у природі" за встановленим тут визначенням. Спеціалісту має бути зрозумілим, що хоча рослина, що не трапляється у природі, типово має нуклеотидну послідовність, яка змінена у порівнянні з рослиною, що трапляється у природі, рослина, що не трапляється у природі, також може бути генетично модифікованою людиною без зміни її нуклеотидної послідовності, наприклад шляхом модифікації її профілю метилування. Як він тут використовується, термін "агрономічно придатний розвиток рослини" стосується розвитку рослини, зокрема рослини олійного рапсу, який не впливає несприятливо на її характеристики за нормальної сільськогосподарської практики, точніше на її приживання у полі, життєвість, час цвітіння, висоту, дозрівання, вихід врожаю, стійкість до хвороб, стійкість до розкривання стручків, вміст і склад олії і т.д. Як він тут використовується, термін "глюкозинолати" стосується низькомолекулярних глюкозидів, що містять сірку, які продукуються і запасаються майже у всіх тканинах представників Capparales, найважливішими серед яких є група рослин Crucifer (хрестоцвітих). Вони складаються з двох частин – частини глікону і змінної частини, бічного ланцюга глікону, похідного від α-амінокислот. Відомо, що споживання великих кількостей глюкозинолатів і продуктів їх розщеплення є токсичним для тварин і людини (WO97/016559). В Канаді термін "канола" описує олійний рапс з обмеженими рівнями глюкозинолатів і ерукової кислоти в зібраному насінні, точніше після подрібнення висушена на повітрі маса містить менше ніж 30 мікромолів (мкмоль) глюкозинолатів на грам обезжиреного (вільного від олії) шроту (WO/1993/006714). Існують кілька аналізів для визначення як загальних, так і індивідуальних глюкозинолатів, наприклад алкеніл глюкозинолатів) в рослинах або їх частинах (наприклад, Chavadej et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, p 2166-2170, 1994; Leonardo and Becker, Plant Breed. 117: p 97-102, 1998; Wu et al., J. China Cereal Oil Assoc. 17: p 59-62, 2002). Як він тут використовується, термін "низький вміст глюкозинолатів" стосується вмісту глюкозинолатів в насінні, нижчого ніж 30 мкмоль/г, переважно навіть ще нижчого, тобто нижчого ніж 25 мкмоль/г, нижчого ніж 20 мкмоль/г, нижчого ніж 15 мкмоль/г обезжиреного шроту. 10 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як він тут використовується, термін "нуклеотидна послідовність SEQ ID №: Z від позиції X до позиції Y" визначає нуклеотидну послідовність, включаючи обидві нуклеотидні кінцеві точки. Термін "що містить" має інтерпретуватись як такий, що визначає присутність вказаних частин, етапів або компонентів, але не виключає присутності однієї або більше додаткових частин, етапів або компонентів. Отже, рослина, що містить певну ознаку, може містити додаткові ознаки. Зрозуміло, що коли слово дається в однині (наприклад, рослина або корінець), сюди включається також множина (наприклад, певна кількість рослин, певна кількість корінців). Отже, посилання на якийсь елемент не виключає тієї можливості, що присутнім є більше ніж один елемент, якщо контекст чітко не вимагає, щоб був один і тільки один з елементів. Однина звичайно щось, про що можна сказати "щонайменше один". Докладний опис винаходу Мутагенізована популяція рослин Brassica napus оцінювалась у відношенні рослин з карликовим фенотипом, тобто зменшеною висотою. Одну таку карликову рослину, яку було названо dwarf2 (dwf2), можна було ідентифікувати як таку, що несе точкову мутацію в геномній ДНК RGA1, яка приводить до амінокислотного заміщення проліну (Р) на лейцин (L) (міссенс мутація), що відповідає амінокислотній позиції 91 в білку RGA1 B. napus (SEQ ID №: 3). При зворотному схрещуванні такого алеля dwf2 в елітну лінію B. napus карликовий фенотип стабільно підтримувався, хоча негативного впливу на розмір врожаю, який звичайно асоціюється з цим типом мутацій у виду Brassica, не спостерігалось. Більше того, рівні глюкозинолатів в насінні від таких рослин виявився значно нижчим ніж тоді, коли подібний карликовий алель brrga1 RGA1 B. rapa вводився зворотним схрещуванням в ту саму елітну лінію B. napus. Це заміщення P91L відбувається в мотиві/збереженій ділянці ІІ VHYNP (показана на Фіг. 1), яка, як відомо, коли піддається делеції, надає карликового фенотипу кукурудзі і рису. Peng et al. (1999) описують два домінантні мутанти сильної карликовості кукурудзи – mlp і 2038, що містять делецію в білку DELLA D8 амінокислот 1-105 і 87-98, відповідно. Itoh et al. (2002) описують подібний мутант сильної карликовості у рису, який відповідає делеції амінокислот 87-104 білка DELLA SLR1. На основі цих даних можна дійти висновку, що найменша ділянка, яку необхідно піддати делеції, щоб забезпечити карликовий фенотип, має відповідати амінокислотам 92-103 білка RGA1 B. napus (поміщено в рамку на Фіг. 1). Винахідниками тепер було встановлено, що модифікація щонайменше однієї з амінокислот на цій мінімальній ділянці є достатньою, щоб надати карликового фенотипу рослинам Brassica, які експресують цей варіант білка. Отже, в першому варіанті здійснення цей винахід пропонує рослину, яка містить в своєму геномі щонайменше один мутантний алель гену DELLA, причому вказаний мутантний алель кодує мутантний білок карликовості DELLA, що містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 1, яка характеризується тим, що принаймні одну амінокислоту вказаної послідовності було модифіковано. Як вони тут використовуються, терміни "модифікований" або "модифікація" стосуються зміни в амінокислотній послідовності, яка може полягати в заміщенні однієї або більше амінокислот або в делеції або вставці однієї або більше амінокислот. або має своїм результатом конкретне амінокислотне заміщення, делеція або вставка білок DELLA, який надає карликовий фенотип рослині, в якій він експресується, та/або білок DELLA, що є GA-нечутливим, можна тестувати методами, які були описані раніше. В одному варіанті здійснення така модифікація може включати модифікацію амінокислоти Р (проліну) в амінокислотній послідовності SEQ ID №: 1. Амінокислота Р може бути заміщеною будь-якою іншою амінокислотою або може бути піддана делеції. В іншому варіанті здійснення амінокислота Р може бути модифікованою на L (лейцин). Має бути зрозумілим, що рослини за цим винаходом мають значно зменшену висоту та/або є значно більш стійкими до полягання у порівнянні з рослинами, що не містять мутантного алеля карликовості DELLA. Переважно, рослини за цим винаходом дають не зменшений вихід врожаю у порівнянні з рослинами, що не містять мутантного алеля карликовості DELLA, і навіть можуть давати кращий вихід через менші втрати при збиранні врожаю. Рослини за цим винаходом також переважно зберігають агрономічно прийнятний розвиток і низький вміст глюкозинолатів в насінні. Даний винахід пропонує також послідовності нуклеїнових кислот, що представляють алелі карликовості DELLA. Послідовності нуклеїнових кислот алелів DELLA дикого типу є представленими в переліку послідовностей, тоді як мутанти цих послідовностей і послідовності, суттєво подібні до них, є описаними далі і в Прикладах з посиланням на послідовності DELLA дикого типу. 11 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 "Послідовності нуклеїнових кислот DELLA" або "варіантні послідовності нуклеїнових кислот DELLA" у відповідності до цього винаходу є послідовностями нуклеїнових кислот, кодуючими амінокислотну послідовність, яка має щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичність послідовності з SEQ ID №: 3, SEQ ID №: 5, SEQ ID №: 7 або SEQ ID №: 9, або послідовностями нуклеїнових кислот, які мають щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичність послідовності з SEQ ID №: 2, SEQ ID №: 4, SEQ ID №: 6 або SEQ ID №: 8. Ці послідовності нуклеїнових кислот можуть називатись також "суттєво подібними" або "суттєво ідентичними" з послідовностями DELLA, наведеними в переліку послідовностей. Пропонуються послідовності нуклеїнових кислот мутантних алелів карликовості DELLA (що містять одну або більше мутацій, які приводять до зміни амінокислотної послідовності відповідного білка DELLA, у порівнянні з білком дикого типу) генів DELLA. Такі мутантні алелі (названі алелями della) можуть створюватись та/або ідентифікуватись з використанням різних відомих методів, таких як докладно описані далі, і пропонуються як в ендогенній формі, так і у виділеній формі. В одному варіанті здійснення пропонуються мутантні алелі карликовості DELLA (наприклад, мутантні алелі RGA1) від Brassicaceae, зокрема від видів Brassica, особливо від Brassica napus, але також від інших агрокультур Brassica. Наприклад, види Brassica, що містять А та/або С геном, можуть містити різні алелі генів DELLA, які можна ідентифікувати і перенести в іншу рослину за цим винаходом. Крім цього, можна скористатись методами мутагенезу, щоб генерувати мутації в алелях DELLA дикого типу, тим самим створюючи мутантні алелі карликовості DELLA для застосування за цим винаходом. Оскільки специфічні алелі DELLA можна переносити від однієї рослини іншій шляхом схрещування і селекції, в одному варіанті здійснення пропонуються алелі DELLA в рослині (тобто, ендогенно), наприклад рослині Brassica, переважно рослині Brassica, яка може бути схрещеною з Brassica napus або яка може бути використана для одержання "синтетичної" рослини Brassica napus. Гібридизація між різними видами Brassica є описаною в спеціальній літературі, наприклад дивись посилання в Snowdon (2007, Chromosome research 15: 85-95). Міжвидовою гібридизацією можна скористатись, наприклад, для перенесення генів від, наприклад, С геному в B. napus (AACC) до C геному у B. carinata (BBCC), або навіть від, наприклад, C геному в B. napus (AACC) до B геному в B. juncea (AABB) (шляхом спорадичного явища незаконної рекомбінації між їх C і B геномами). "Ресинтезовані" або "синтетичні" лінії Brassica napus можуть бути одержані шляхом схрещування первинних предків, B. oleracea (CC) і B. rapa (AA). Міжвидові, а також міжродові, бар'єри несумісності можуть бути успішно подолані в кросах між культурними видами Brassica та їх родичами, наприклад методами ембріонального спасіння або злиттям протопластів (дивись, наприклад, Snowdon, вище). Отже, молекули нуклеїнової кислоти, які представляють мутантні алелі карликовості DELLA, можуть містити одну або більше мутацій, таких як мутації міссенс або мутації вставки або делеції, як вже докладно описувалось вище. В основному, будь-яка мутація, що має своїм результатом білок, який містить щонайменше одну амінокислотну вставку, делецію та/або заміщення в послідовності SEQ ID №: 1 відносно білка дикого типу, яка приводить до утворення білка DELLA, який, коли експресується в рослині, забезпечує зменшену висоту цієї рослини та/або підвищену стійкість до полягання цієї рослини (наприклад, шляхом створення білка DELLA, що діє як конститутивний репресор індукованого GA росту) і відповідає алелю карликовості DELLA. Відповідно, в одному варіанті здійснення пропонуються послідовності нуклеїнових кислот, які містять одну або більше з будь-яких типів мутацій, описаних вище. Будь-яка з описаних мутантних послідовностей нуклеїнових кислот пропонується per se (у виділеній формі), як і рослини і частини рослини, що містять такі послідовності ендогенно. Мутантні алелі DELLA можуть бути генеровані (наприклад, індуковані мутагенезом) та/або ідентифіковані за допомогою широкого кола методів, які є звичайними в цій галузі, наприклад з використанням методів на основі ПЛР для ампліфікації всієї DELLA геномної або цДНК. Після мутагенезу рослини вирощуються з обробленого насіння або регенерується з оброблених клітин з використанням відомих методів. Наприклад, мутагенізоване насіння може висіватись у відповідності до звичайних методик вирощування і після самозапилення на таких рослинах формується насіння. Як варіант, подвійні гаплоїдні ростки можуть бути екстраговані з оброблених мікроспор або клітин пилку, щоб негайно одержати гомозиготні рослини, наприклад як описано у Coventry et al. (1988, Manual for Microspore Culture Technique for Brassica napus. Dep. Crop Sci. Techn. Bull. OAC Publication 0489. Univ. of Guelph, Guelph, Ontario, Канада). 12 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Додаткове насіння, яке утворюється як результат такого самозапилення в теперішньому або наступному поколінні, може бути зібране і піддане скринінгу на присутність мутантних алелів DELLA з використанням методів, що є звичайними в цій галузі, наприклад методів на основі полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) (ампліфікація алелів DELLA) або методів на основі гібридизації, наприклад аналізу саузерн блот, скринінг бібліотеки ВАС і т.п., або прямим секвенуванням алелів DELLA. Щоб здійснити скринінг на присутність точкових мутацій (так званих одиничних нуклеотидних поліморфізмів або SNP) в мутантних алелях DELLA, можна скористатись звичайними в цій галузі методами виявлення SNP, наприклад методами на основі оліголігації, методами, що базуються на видовженні ланцюга на одну основу, такими як піросеквенування, або методами на основі відмінностей в рестрикційних сайтах, таких як TILLING. Ідентифіковані мутантні алелі потім можна піддати секвенуванню, а послідовності можна порівняти з алелем дикого типу, щоб ідентифікувати мутацію (мутації). Необов'язково, проводиться тестування того, або функціонує мутантний алель як мутантний алель DELLA, що індукує карликовість. Як вже зазначалось. За допомогою цього підходу можна ідентифікувати велику кількість мутантних алелів DELLA (і рослин, що містять один або більше з них). Бажані мутантні алелі можна потім перенести в інші рослини методами схрещування і селекції, як докладніше буде описано далі. Мутантні алелі DELLA або рослини (або частини рослини), що містять мутантні алелі DELLA, можуть бути ідентифіковані або виявлені методом, відомим в цій галузі, таким як пряме секвенування, аналізи на основі ПЛР або аналізи, що базуються на гібридизації. Як варіант, можна також розробити методи з використанням запропонованої тут специфічної інформації про конкретні мутантні алелі DELLA. Такі альтернативні методи виявлення включають методи виявлення ампліфікації лінійних сигналів, які базуються на інвазивному розщепленні конкретних TM структур нуклеїнової кислоти і відомі також як технологія Invader (як описано, наприклад, в патентах США №№ 5,985,557 "Invasive Cleavage of Nucleic Acids", 6,001,567 "Detection of Nucleic Acid sequences by Invader Directed Cleavage, які включені сюди за посиланням), методи виявлення на основі ЗТ-ПЛР, такі як Taqman, або інші методи виявлення, такі як SNPlex. Має бути зрозумілим, що мутантні алелі DELLA за цим винаходом можуть також використовуватись для створення трансгенних рослин. Наприклад, мутантний алель може бути перенесений в рослину або рослинну клітину будь-яким методом, відомим в цій галузі, таким як трансформація. Мутантний алель може бути використаний в комбінації зі своїм власним ендогенним промотором або може бути використаний в химерному гені, де він може бути функціонально зв'язаним з промотором, що експресується рослиною. Такий химерний ген може також містити додаткові регуляторні елементи, такі як інтрони, послідовності термінації транскрипції і поліаденілювання і т.п. Інші види, різновиди, виведені лінії або дикі поповнення можуть бути піддані скринінгу на інші гени/алелі DELLA з такою самою або подібною нуклеотидною послідовністю або її варіантами, як вже описувалось. До того ж, зрозуміло, що нуклеотидні послідовності DELLA та їх варіанти (або фрагменти того або іншого) можуть ідентифікуватись in silico, шляхом скринінгу баз даних щодо нуклеотидних послідовностей у відношенні суттєво подібних послідовностей. Більш того, послідовність нуклеїнових кислот, кодуюча білок DELLA, може бути синтезована хімічним шляхом. Даний винахід пропонує також мутантний білок карликовості DELLA, який містить амінокислотну послідовність SEQ ID №: 1 і який відрізняється тим, що принаймні одну амінокислоту вказаної послідовності було модифіковано. Отже, мутантні білки DELLA за цим винаходом містять одне або більше амінокислотних заміщень, вставок або делецій на ділянці, яка відповідає SEQ ID №: 1, що має своїм результатом білок, який, коли експресується в рослині, надає цій рослині карликовий фенотип. Амінокислотні послідовності мутантних білків карликовості DELLA за цим винаходом або їх варіантів є амінокислотними послідовностями, що мають щонайменше 50 %, щонайменше 60 %, щонайменше 70 %, щонайменше 75 %, щонайменше 80 %, щонайменше 85 %, щонайменше 90 %, щонайменше 95 %, 98 %, 99 % або 100 % ідентичність послідовності з послідовностями SEQ ID №: 3, SEQ ID №: 5, SEQ ID №: 7 або SEQ ID №: 9. Ці амінокислотні послідовності можуть називатись також "суттєво подібними" або "суттєво ідентичними" з послідовностями DELLA, наведеними в переліку послідовностей. В одному варіанті здійснення мутантні амінокислотні послідовності DELLA пропонуються в рослині (тобто, ендогенно). Поряд з ними, пропонуються виділені амінокислотні послідовності DELLA (наприклад, виділені з рослини або створені синтетичним шляхом), а також варіанти і фрагменти будь-якої з них. 13 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 В одному варіанті здійснення модифікація амінокислотної послідовності, представленої SEQ ID №: 1, може включати модифікацію амінокислоти Р (проліну). Амінокислота Р може бути заміщеною будь-якою іншою амінокислотою (амінокислотами) або може бути піддана делеції. В іншому варіанті здійснення амінокислота Р може бути модифікованою на L (лейцин). Інші види, різновиди, виведені лінії або дикі поповнення можуть бути піддані скринінгу на інші білки DELLA з такими ж амінокислотними послідовностями або їх варіанти, як описувалось вище. Крім того, зрозуміло, що амінокислотні послідовності DELLA та їх варіанти (або фрагменти того або іншого) можуть ідентифікуватись in silico, шляхом скринінгу баз даних щодо амінокислотних послідовностей у відношенні суттєво подібних послідовностей. В одному з варіантів здійснення цього винаходу пропонуються також рослинні клітини, що містять мутантні алелі і білки DELLA за цим винаходом. В об'єм даного винаходу включені також гамети, насіння, ембріони (зиготні або соматичні), потомство або гібриди рослин, що містять мутантні алелі DELLA за цим винаходом, які одержуються традиційними методами виведення. Цей винахід пропонує також насіння Brassica, що містить мутантний алель dwf2 RGA1, як включене насіння, депоноване в NCIMB Limited 18 лютого 2010 року під номером доступу NCIMB 41697. Також пропонуються рослина Brassica або її клітина, частина, насіння або потомство, одержані з вищеописаного насіння, тобто які містять той самий мутантний алель dwf2 RGA1, що й депоноване насіння. Даний винахід стосується також перенесення одного або більше конкретних мутантних алелів DELLA від однієї рослини до іншої рослини, рослин, що містять такі мутантні алелі DELLA, потомство, одержаного від таких рослин, а також рослинних клітин, частин рослини і насіння, одержаних від таких рослин. Відповідно, в одному варіанті здійснення цього винаходу пропонується спосіб перенесення щонайменше одного виділеного мутантного алеля карликовості DELLA від однієї рослини до іншої рослини, який включає наступні етапи: а. забезпечення першої рослини, яка містить щонайменше один мутантний алель DELLA, як описано вище, або створення першої рослини, як описано вище (де ця перша рослина є гомозиготною або гетерозиготною у відношенні одного мутантного алеля DELLA); b. схрещування першої рослини, яка містить щонайменше один мутантний алель DELLA, з другою рослиною, що не містить щонайменше одного мутантного алеля DELLA, збирання з кросу насіння (де це насіння є гетерозиготним у відношенні мутантного алеля DELLA, коли перша рослина була гомозиготною у відношенні цього мутантного алеля DELLA, і де половина насіння є гетерозиготною, а половина – азиготною у відношенні мутантного алеля DELLA, тобто такою, що не містить його, коли перша рослина була гетерозиготною у відношенні цього мутантногоалеля DELLA); і необов'язково додаткові етапи: с. ідентифікація рослин F1, що містять один або більше виділений мутантний алель DELLA, як описано вище; d. зворотне схрещування рослин F1, що містять принаймні один виділений мутантний алель карликовості DELLA, з другою рослиною, що не містить щонайменше одного виділеного мутантного алеля DELLA, впродовж одного або більше поколінь (х), збирання насіння ВСх з кросів; і е. ідентифікація в кожному поколінні рослин ВСх, які містять щонайменше один виділений мутантний алель DELLA, як описано вище. В іншому варіанті здійснення даний винахід пропонує спосіб одержання рослини, зокрема продуктивної рослини Brassica, такої як рослина Brassica napus, яка містить щонайменше один мутантний алель карликовості DELLA, але яка переважно зберігає агрономічно прийнятний розвиток, який включає перенесення алелів DELLA за цим винаходом в одну рослину, як описано вище. В ще іншому варіанті здійснення цього винаходу пропонується спосіб одержання рослини, зокрема продуктивної рослини Brassica, такої як B. juncea, B. napus, B. rapa, B. carinata, B. oleracea і B. nigra, що є стійкою до полягання при збереженні агрономічно прийнятного розвитку, який включає перенесення алелів DELLA за цим винаходом в цю рослину, як описано вище. Також пропонуються способи підвищення стійкості до полягання рослини та/або зменшення висоти рослини, які включають перенесення щонайменше одного мутантного алеля карликовості DELLA за цим винаходом в геномну ДНК вказаної рослини. Даний винахід стосується також застосування мутантного алеля карликовості DELLA за цим винаходом для одержання рослини з підвищеною стійкістю до полягання, зокрема продуктивної рослини Brassica, такої як рослина Brassica napus. 14 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Даний винахід стосується також застосування рослини, зокрема продуктивної рослини Brassica, такої як рослина Brassica napus, для одержання насіння, що містить щонайменше один мутантний алель карликовості DELLA, або для одержання агрокультури олійного рапсу, що містить щонайменше один мутантний алель карликовості DELLA. Даний винахід додатково пропонує процес одержання карликових рослин Brassica та їх насіння, який включає етап схрещування рослини, що складається по суті з рослинних клітин, які містять варіантний алель за цим винаходом, з іншою рослиною або з самою собою, де цей процес додатково включає ідентифікацію або відбір рослин-потомків або насіння, що містять варіантний алель за цим винаходом, і збирання насіння. Ідентифікація бажаних рослин-потомків може здійснюватись з використанням описаних тут молекулярних маркерів. Також пропонується спосіб одержання олії або макухи з рослин Brassica, що містять варіантні алелі за цим винаходом, який включає етапи, відомі в цій галузі, для екстракції і обробки олії з насіння рослини олійного рапсу. Даний винахід також пропонує процес для підвищення стійкості до полягання і відповідно одержання їх насіння, який включає етапи одержання рослин Brassica, що містять мутантний алель, як описано в цій заяві, і посіву вказаних рослин Brassica у полі. Також пропонуються способи підвищення стійкості до полягання або кількості насіння, що збирається з рослин Brassica, які включають введення варіантного алеля, як його описано в цій заявці, в геном рослин Brassica. Зрозуміло, що стійкість до полягання та/або вихід врожаю рослин за цим винаходом, зокрема рослин dwf2, можна далі поліпшити (через адитивний або синергічний ефект з алелем /білком карликовості DELLA) за рахунок обробки певними регуляторами росту рослин (PGR) або їх комбінаціями. Регулятором росту рослин може бути будь-яка сполука або суміш сполук, що здатна впливати на пророщування, ріст, дозрівання або розвиток рослин, плодів або потомства. Регулятори росту рослин можна поділити на різні підкласи, як це здійснено далі: - анти-ауксин, наприклад клофібрин [2-(4-хлорфенокси)-2-метилпропанова кислота] і 2,3,5три-йод бензойна кислота; - ауксин, наприклад 4-CPA (4-хлорфенокси оцтова кислота), 2,4-D (2,4-дихлорфенокси оцтова кислота), 2,4-DB [4-(2,4-дихлорфенокси) масляна кислота], 2,4-DEP {tris[2-(2,4дихлорфенокси)етил] фосфіт}, дихлорпроп, фенопроп, IAA (β-індол оцтова кислота), IBA (4індол-3-іл масляна кислота), нафталін ацетамід, α-нафталін оцтова кислота, 1-нафтол, нафтокси оцтова кислота, калію нафтенат, натрію нафтенат, 2,4,5-T [(2,4,5-трихлорфенокси) оцтова кислота]; - цитокін, наприклад 2iP [N-(3-метил бат-2-еніл)-1H-пурин-6-амін], бензиладенін, кінетин, зеатин; - дефоліанти, наприклад кальцію ціанамід, диметіпін, ендотал, етефон, мерфос, метоксурон, пентахлорфенол, тідіазурон, трибуфос; - інгібітори етилену, наприклад авігліцин, авігліцин-гідрохлорид, 1-метил циклопропен; - генератори етилену, наприклад ACC (1-аміно циклопропан карбонова кислота), етацелазил, етефон, гліоксим; - гібереліни, наприклад гібереліни A1, A4, A7, гіберелінові кислота (= гіберелін A3); - інгібітори росту, наприклад абсцизова кислота, анцимідол, бутралін, карбарил, хлорфоній або відповідний хлорид, хлорпрофам, дікегулак, натрію дікегулак, флуметралін, флуоридамід, фосамін, гліфозин, ізопирімол, жасминова кислота, малеїнова кислота, гідразин або його калієва сіль, мепікват або відповідний хлорид, піпроктаніл або відповідний бромід, прогідрожасмон, propham, 2,3,5-три-йод бензойна кислота; морфактини, наприклад хлорфлурен, хлорфлуренол, хлорфлуренол-метил, дихлорфлуренол, флуренол; - сповільнювачі або модифікатори росту, наприклад хлормекват, хлормекват-хлорид, дамінозид, Флурпримідол, мефлуїдид, мефлуїдид-діоламін, паклобутразол, ципроконазол, тетциклаціс, уніконазол, уніконазол-P; стимулятори росту, наприклад бразиностероїди (наприклад, бразинолід), форхлорфенурон, гімексазол, 2-аміно-6-оксипурин-похідне, похідні індолінону, 3,4-дизаміщені похідні малеіміду і похідні азепінону; - некласифіковані PGR, наприклад бензофлуор, бумінафос, карвон, ціобутид, клофенцет, калію клофенс, клоксифонак, натрію клоксифонак, цикланілід, циклогексимід, епохолеон, етихлозат, етилен, фенрідазон, гептопаргіл, голосульф, інабенфід, каретазан, свинцю арсенат, метасульфокарб, прогексадіон, кальцію прогексадіон, піданон, сінтофен, триапентенол, тринексапак і тринексапак-етил; 15 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 - та інші PGR, наприклад 2,6-диізопропилнафталін, клопроп, 1-нафтил етилефір оцтової кислоти, ізопротіолан, MCPB-етил [4-(4-хлор-o-толілокси) етил ефір масляної кислоти], Nацетилтіазрлідин-4-карбонова кислота, n-деканол, пеларгонова кислота, N-фенілфталімінова кислота, текназен, триаконтанол, 2,3-дигідро-5,6-дифеніл-1,4-оксатиїн, 2-ціано-3-(2,4дихлорфеніл)акрилова кислота, 2-гідразиноетанол, алорак, амідохлор, BTS 44584 [диметил(4піперидинокарбонілокси-2,5-ксиліл)сульфоній-толуол-4-сульфонат], хлорамбен, хлорфлурен, хлорфлурен-метил, дікамба-метил, дихлорфлуренол, дихлорфлуренол-метил, димексано, етацелазил, гексафлуор ацетон-тригідрат, N-(2-етил-2H-піразол-3-іл)-N'-фенілсечовина, N-mтолілфталамінова кислота, N-піролідиносукцин-амінова кислота, 3-tert-бутил фенокси оцтової кислоти пропиловий ефір, піданон, натрію (Z)-3-хлоракрилат. Кращим вибором є хлормекват, хлормекват-хлорид, цикланілід, диметилів, етефон, флуметралін, флурпримідол, інабенфід, мепікват, мепікват хлорид, 1-метил циклопропен, панклобутразол, прогексадіон-кальцій, про-гідрожасмон, трибуфос, тридіазурон, тринексапак, тринексапак-етил або уніконазол. Особливо доцільними в якості регуляторів росту рослин є тринексапак-етил, хлормекватхлорид і панклобутразол для використання з рослинами за цим винаходом, зокрема рослинами dwf2. Рослини за цим винаходом або їх насіння можуть оброблятись гербіцидами, такими як Клопіралід, Диклофоп, Флуазіфоп, Глуфосинат, Гліфосат, Метазахлор, Трифлуралін, Етаметсульфурон, Квінмерак, Квізалофоп, Клетодим, Тепралоксидим. Рослини за цим винаходом або їх насіння можуть оброблятись також фунгіцидами, такими як Азоксистробін, Біксафен, Боскалід, Карбендазим, Ципроконазол, Дифеноконазол, Димоксистробін, Епоксиконазол, Флуазінам, Флуопірам, Флуоксастробін, Флусілазол, Флуксапіроксад, Іпродіон, Ізопіразам, Мепікват-хлорид, Метконазол, Метоміностробін, Паклобутразол, Пентіопірад, Пікоксистробін, Прохлораз, Протіоконазол, Піраклостробін, Тебуконазол, Тіофанат-метил, Трифлоксистробін, Вінклозолін. Рослини за цим винаходом або їх насіння можуть оброблятись також інсектицидами, такими як Карбофуран, Тіаклоприд, Дельтаметрин, Імідаклоприд, Клотіанідин, Тіаметоксам, Ацетаміприд, Динетофуран, ß-Цифлутрин, гамма і лямбда Цигалотрин, тау-Флувалеріат, Етипрол, Спіносад, Спіноторам, Флубендиамід, Ринаксипір, Ціазипір, 4-[[(6-Хлорпіридин-3іл)метил](2,2-дифторетил)аміно]фуран-2(5H)-он. Даний винахід також стосується процесу нанесення гербіциду або інсектициду або фунгіциду, зокрема гербіциду або інсектициду або фунгіциду з вищенаведених переліків, на рослину або насіння рослини, що містить будь-який варіантний алель, як його описано в інших частинах цієї заявки. Наступні приклади, що не є обмежуючими, описують характеристики рослин олійного рапсу, одержаних у відповідності до даного винаходу. Коли не вказується інше, всі молекулярні методики і методики на основі рекомбінантної ДНК здійснюються згідно стандартних протоколів, як описано в Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: ALaboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbour Laboratory Press, NY та в томах 1 і 2 книги Ausubel et al. (1994) Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols, США. Стандартні матеріали і методи для молекулярної роботи з рослинами є описаними в роботі Plant Molecular Biology Labfax (1993) by R.D.D. Croy, опублікованій BIOS Scientific Publications Ltd (Велика Британія) і Blackwell Scientific Publications, Велика Британія. В описі і прикладах містяться посилання на наступні послідовності: Послідовності SEQ ID №: 1: Збережена консенсусна послідовність ділянки ІІ на основі зіставлення амінокислотних послідовностей білків RGA1 B. napus, RGA1 B. rapa, RGA і GAI A. thaliana, D8 і D9 кукурудзи, SLR1 рису, Rht пшениці і SLN1 ячменю. SEQ ID №: 2: Геномна ДНК /кодуюча послідовність гену RGA1 від Brassica napus. SEQ ID №: 3: Амінокислотна послідовність білка RGA1 від Brassica napus. SEQ ID №: 4: Геномна ДНК /кодуюча послідовність гену RGA1 від Brassica rapa. SEQ ID №: 5: Амінокислотна послідовність білка RGA1 від Brassica rapa. SEQ ID №: 6: Геномна ДНК /кодуюча послідовність гену RGA від Arabidopsis thaliana. SEQ ID №: 7: Амінокислотна послідовність білка RGA від Arabidopsis thaliana. SEQ ID №: 8: Геномна ДНК /кодуюча послідовність гену GAI від Arabidopsis thaliana. SEQ ID №: 9: Амінокислотна послідовність білка GAI від Arabidopsis thaliana. Приклади Приклад 1: Одержання карликових рослин Brassica з використанням випадкового (неспецифічного) мутагенезу 16 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Мутагенізовану популяцію Brassica napus було одержано наступним чином: - 30000 насінин від елітної лінії весняного олійного рапсу (насіння М0) були піддані набуханню впродовж двох годин на вологому фільтрувальному папері в деіонізованій або дистильованій воді. Половину насіння обробили 0,8 % EMS, а половину – 1 % EMS (Sigma: M0880) та інкубували впродовж 4 годин. - Мутагенізоване насіння (насіння М1) тричі промили і висушили під витяжкою впродовж ночі. 30000 рослин М1 були вирощені у грунті і самозапилені для одержання насіння М2. Насіння М2 було зібране з кожної індивідуальної рослини М1. - 5000 рослин М2, одержаних від різних рослин М1, були вирощені і піддані аналізу на присутність рослин з карликовим фенотипом (тобто, зменшеної висоти). - Карликові рослини були ідентифіковані в мутантній популяції з подібним фенотипом як рослини B. napus, у яких алель Brrga1-d був зворотно схрещеним, але дещо сильнішим (тобто, більш зменшеної висоти). Карликовий фенотип ідентифікованих рослин є напів-домінантним, тобто ці гетерозиготи демонструють проміжний карликовий фенотип у порівнянні з гомозиготними мутантами і сегрегантами дикого типу. Приклад 2: Ідентифікація карликових мутантних алелів - З ідентифікованих карликових рослин були приготовлені зразки ДНК з листяного матеріалу кожної індивідуальної рослини М2 за методикою CTAB (Doyle and Doyle, 1987, Phytochemistry Bulletin 19:11-15). - Щоб ідентифікувати геномну позицію мутацій EMS, зв'язаних з карликовим фенотипом, було здійснено аналіз генетичного картування BSA. Карликова мутація, названа dwf2, виявилась локалізованою на хромосомі N06, в 109.99 cM, що близько до повідомлюваної позиції (R6) гену Brrga1 (Muangprom and Osborn., Theor Appl Genet 108, p 1378–1384, 2004; Muangprom et al., 2005 supra). - Для підтвердження того, що RGA1 дійсно є причинним геном мутації dwf2, ген RGA1 мутанта dwf2 було піддано скринінгу прямим секвенуванням з використанням стандартних методів секвенування (Agowa), і послідовності аналізувались у відношенні присутності точкових мутацій з використанням програмного забезпечення NovoSNP (VIB Antwerp). - Було встановлено, що алель RGA1 мутанта dwf2 містить мутацію С на Т в позиції 272 геномної/кодуючої послідовності у порівнянні з послідовностями RGA1 дикого типу (SEQ ID №: 2), кодуючу амінокислотну послідовність, що включає заміщення Pro на Leu в позиції 91, у порівнянні з амінокислотною послідовністю RGA1 дикого типу (SEQ ID №: 3). - Насіння, що містить алель dwf2 (позначене 07MBBN000265), було депоновано в NCIMB Limited (Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn, Aberdeen, Scotland, AB21 9YA, Велика Британія) 18 лютого 2010 року, під номером доступу NCIMB 41697. В якості висновку можна зазначити, що вищенаведені приклади показують, як можуть бути створені карликові рослини Brassica і як можуть бути ідентифіковані відповідні мутантні алелі. Крім того, рослинний матеріал, який містить такі мутантні алелі, може бути використаний для перенесення вибраних мутантних алелів в іншу рослину, як описано в наступних прикладах. Приклад 3: Ідентифікація рослини Brassica, що містить мутантний алель RGA1 - Рослини Brassica, що містять мутацію в гені RGA1, ідентифіковану в Прикладах 1 і 2, були ідентифіковані наступним чином: - Для кожного мутантного алеля RGA1, ідентифікованого в зразку ДНК рослини М2, було вирощено щонайменше 48 рослин М2, одержаних від тієї ж рослини М1, що й рослина М2, яка містить мутацію RGA1, і зі зразків листя були приготовлені зразки ДНК кожної індивідуальної рослини М2. - Зразки ДНК були піддані скринінгу на присутність ідентифікованих точкових мутацій RGA1, як описано вище в Прикладі 2. - Гетерозиготні і гомозиготні (як визначено на основі електроферограм) рослини М2, що містять одну й ту саму мутацію, були піддані самозапиленню і зворотному схрещуванню, після чого було зібране насіння ВС1. Приклад 4: Виявлення та/або перенесення мутантних алелів RGA1 в (елітні) лінії Brassica - Ідентифікований мутант dwf2 алеля RGA1 було перенесено в (елітну) селекційну лінію Brassica napus за наступною методикою: Рослину, що містить алель мутанта dwf2 (донорська рослина), було схрещено з (елітною) лінією Brassica (елітний батько / рекурентний батько) або різновидом, у якого відсутній мутантний алель RGA1. Було використано наступну схему інтрогресії (+ = алель дикого типу, – = мутантний алель): Початковий крос: - / - (донорська рослина) X + / + (елітний батько) Рослина F1: + / Крос BC1: + / - X + / + (рекурентний батько) 17 UA 110111 C2 5 10 15 20 25 Рослини BC1: 50 % + / - і 50 % + / + Були відібрані 50 % + / -. Крос BC2: + / - (рослина BC1) X + / + (рекурентний батько) Рослини BC2: 50 % + / - і 50 % + / + Були відібрані 50 % + / -. Зворотне схрещування повторюється, доки BC3 до BC5 Рослини BC3-5: 50 % + / - і 50 % + / + Були відібрані 50 % + / -. Крос BC3-5 S1: + / - X + / Рослини BC3-5 S1: 25 % + / +, 50 % + / - і 25 % - / Були відібрані індивідуальні рослини BC3-5 S1 або BC3-5 S2 + / +, + /- і - / - рослини. Подібно до цього, мутантний алель RGA1 Brrga1-d B. rapa (Muangprom et al., 2005 supra) було перенесено в ту саму (елітну) селекційну лінію B. napus. Для відбору рослин зі специфічним генотипом RGA1 (+/+, +/- або -/-) може бути використане пряме секвенування стандартними методами секвенування, відомими в цій галузі, такими як ті, що описані в Прикладі 2. Як варіант, такий відбір можна здійснити за допомогою молекулярних TM маркерів (наприклад, AFLP, PCR, Invader , TaqMan® і т.п.) у відношенні мутантного алеля RGA1 і алеля RGA1 дикого типу. Приклад 5: Оцінка мутантних фенотипів dwf2 і Brrga1 Рослини BC5-S2 Dwf2, одержані в Прикладі 4, були вирощені у полі в трьох місцях А, В і С в Бельгії і Канаді (по три ділянки в кожному місці) і потім проаналізовані у відношенні висоти, стійкості до полягання і виходу врожаю. Полягання оцінювалось за візуальною шкалою від 1 до 9, де бал 9 означає відсутність полягання (всі рослини прямостоячі), а бал 1 означає сильне полягання (всі рослини полеглі). Більш того, вміст глюкозинолатів в шроті з насіння цих рослин, з якого видалена олія, визначався з використанням спектрофотометра NIRSystems 6500 для ближньої частини інфрачервоного діапазону від 1098 до 2492 нм. Усереднені результати представлені в Таблиці 2. Таблиця 2 Результати польових випробувань рослин BC5S2 dwf2 Бельгія -/+/+/+ контроль CV LSD 35 C 64 91 126 127 4,0 4,0 -/+/+/+ контроль CV LSD 30 A 65 92 128 131 5,0 6,0 Висота B 63 91 124 123 3,0 4,0 A 65 91 101 101 5,6 5,8 Висота B 64 84 105 110 4,5 4,6 C 60 73 105 100 4,7 4,4 Полягання A B C 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 6,0 8,0 7,0 5,5 7,5 6,5 16,8 6,6 13,7 1,6 0,7 0,9 A nd nd nd nd Полягання B C nd nd nd nd nd nd nd nd A 2680 2645 2673 2755 21,0 730 Канада A 2471 3132 3103 2970 7,2 232 Вихід B 2707 2806 2570 2654 6,0 214 C 2693 2725 2622 2704 15,0 335 Глюкозинолати A B C 15,1 16,2 15,6 15,2 16,0 15,6 14,3 16,1 15,2 14,8 15,8 15,3 4,8 4,3 4,5 0,9 0,9 0,6 Вихід B 2384 3307 3239 3306 4,8 162 C 4169 4083 3659 3883 8,9 420 Глюкозинолати A B C 8,4 9,5 nd 9,3 10,9 nd 11,0 13,5 nd 11,7 12,5 nd 20,5 3,0 2,5 0,0 Висота: висота рослини в кінці цвітіння (см); Полягання: полягання при дозріванні (1 = полегле, 9 = прямостояче); Вихід: вихід насіння на ділянку (г): Глюкозинолати: загальний вміст глюкозинолатів в сухому насінні: CV: коефіцієнт варіації; LSD: найменша суттєва відстань (p

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for raising lodging resistance while maintaining yields and low glucosinolate content of a brassica plant

Автори англійською

Bots, Marc, Laga, Benjamin, Den Boer, Bart

Назва патенту російською

Способ повышения устойчивости к полеганию при сохранении урожайности и низкого содержания глюкозинолатов растения brassica

Автори російською

Ботс Марк, Лага Бенджамин, Ден Боэр Барт

МПК / Мітки

МПК: A01H 5/00, A01H 5/10, C12N 15/82, A01H 1/06, C07K 14/415

Мітки: полягання, вмісту, врожайності, рослини, глюкозинолату, підвищення, стійкості, низького, збереженні, brassica, спосіб

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/43-110111-sposib-pidvishhennya-stijjkosti-do-polyagannya-pri-zberezhenni-vrozhajjnosti-ta-nizkogo-vmistu-glyukozinolatu-roslini-brassica.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб підвищення стійкості до полягання при збереженні врожайності та низького вмісту глюкозинолату рослини brassica</a>

Подібні патенти