Спосіб отримання високої щільності життєздатних клітин в культурі клітин ссавців

Номер патенту: 106047

Опубліковано: 25.07.2014

Автори: Дорей Хайманті, Кіунг Юн Сеунг

Є ще 32 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб збільшення щільності життєздатних клітин в підживлюваних культурах еукаріотичних клітин, що включає наступні етапи:

a) культивування еукаріотичної клітинної лінії, яка експресує один або більше гетерологічних генів стійкості до апоптозу (апоптознихR) і один або більше генів, які представлять інтерес; і

b) підтримка високого вмісту глюкози в середовищі протягом експонентної і стаціонарної фаз росту клітинної культури, де апоптозніR гени являють собою гени E1B19K і AVEN, а концентрація лактату в клітинній культурі становить приблизно 1 г/л або менше після 5 днів культивування.

2. Спосіб за п. 1, в якому еукаріотична клітинна лінія являє собою клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО).

3. Спосіб за п. 2, в якому клітинна лінія СНО являє собою клітини СНО-K1.

4. Спосіб за п. 2, в якому клітинна лінія СНО являє собою клітини СНО-K1SV.

5. Спосіб за п. 1, в якому еукаріотична клітинна лінія являє собою клітини мієломи.

6. Спосіб за п. 5, в якому клітинна лінія мієломи являє собою клітини NS0.

7. Спосіб за п. 5, в якому клітинна лінія мієломи являє собою клітини Sp2/0.

8. Спосіб за п. 1, в якому еукаріотична клітинна лінія являє собою клітини гібридоми.

9. Спосіб за п. 1, в якому апоптозніR гени додатково включають ген ХІАРD.

10. Спосіб за п. 1, в якому пік щільності життєздатних клітин (VCD) збільшений.

11. Спосіб за п. 1, в якому тривалість життя клітинної культури збільшена.

12. Спосіб за п. 1, в якому титр клітинної культури збільшений.

13. Спосіб за п. 1, в якому загальне число життєздатних клітин (IVCC) клітинної культури збільшене.

14. Спосіб за п. 1, в якому потік кальцію в клітинах зменшений.

15. Спосіб за п. 1, в якому мембранний потенціал мітохондрій збільшений.

16. Спосіб за п. 1, в якому гени, які представляють інтерес, кодують важкий і легкий ланцюги антитіла.

17. Спосіб за п. 1, в якому висока концентрація глюкози в середовищі становить приблизно 60 мМ, а концентрація лактату в клітинній культурі становить приблизно 0,1 г/л або менше після 7 днів культивування.

Текст

Дивитися

Реферат: Винахід належить до способу збільшення щільності життєздатних клітин в підживлюваних культурах еукаріотичних клітин, за допомогою культивування еукаріотичної клітинної лінії, яка R експресує один або більше гетерологічних генів стійкості до апоптозу (апоптозних ) і один або більше генів, які представлять інтерес на середовищі з високим вмістом глюкози протягом експонентної і стаціонарної фаз росту клітинної культури, де апоптозні R гени являють собою UA 106047 C2 (12) UA 106047 C2 гени E1B19K і AVEN, а концентрація лактату в клітинній культурі становить приблизно 1 г/л або менше після 5 днів культивування. UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Галузь винаходу Даний винахід належить до способів, що дозволяють досягнути одержання високої щільності життєздатних клітин і збільшення тривалості життя підживлюваної клітинної культури за рахунок використання середовища, збагаченого глюкозою. Запропоновані способи можуть бути використані для збільшення виробництва будь-яких секретованих білків, які викликають інтерес. Передумови створення винаходу Культура клітин ссавців є переважною системою для виробництва багатьох рекомбінантних білків завдяки здатності виробляти білки з необхідними посттрансляційними модифікаціями. Внаслідок збільшення попиту на виробництво таких білків, існує сильна мотивація для поліпшення ефективності процесу за рахунок збільшення виробництва продукту. Збільшення виробництва біотерапевтичних або інших білків в процесі промислового виробництва до необхідного рівня, що обчислюється в грамах на літр, основується на оптимізації як культури клітин ссавців, так і інженерних методів. Проблема клітинної загибелі є звичайною для культури клітин ссавців високої щільності, що не містить білка, причому до 80 % клітинної загибелі в типовому біореакторі з підживлюванням доводиться на частку апоптозу, індукованого у відповідь на такі умови, як нестачу фактора росту, поживних речовин, брак кисню, накопичення токсинів і напруження зсуву (Goswami et al., Biotechnol Bioeng 62:632-640 (1999)). Апоптоз обмежує максимальну щільність життєздатних клітин, прискорює настання фази клітинної загибелі і потенційно зменшує виробництво гетерологічного білка (Chiang and Sisk, Biotechnol Bioeng 91:779-792 (2005); Figueroa et al., Biotechnol Bioeng.73:211 222 (2001), Metab Eng 5:230 245 (2003), Biotechnol Bioeng 85:589 600 (2004); Mercille and Massie, Biotechnol Bioeng 44:1140 1154 (1994)). Апоптоз є результатом складної мережі сигнальних шляхів, які активізуються як всередині, так і зовні клітини і кульмінацією яких є активація специфічних цистеїнових протеаз, що розщеплюють білки після залишків аспарагінової кислоти (Cys-Asp-протеаз, скорочено каспаз) і опосередковують фінальні стадії клітинної смерті. Див. фіг. 1. Для підтримки життєздатності клітин в культурі клітин ссавців протягом подовженого виробничого циклу використовуються різні методи (Arden and Betenbaugh, Trends Biotechnol 22:174 180 (2004); Vives et al., Metab Eng 5:124 132 (2003)). Зміна позаклітинного середовища за рахунок додавання до середовища факторів росту, гідролізатів і лімітуючих поживних компонентів звичайно призводить до збільшення виробництва білка і зниження апоптозу (Burteau et al., In Vitro Cell Dev Biol Anim. 39:291-296 (2003); Zhang and Robinson, Cytotechnology 48: 59-74 (2005)). Деякі дослідники схиляються до використання хімічних і генетичних стратегій з метою інгібування внутрішньоклітинного апоптозного сигнального каскаду (Sauerwald et al., Biotechnol Bioeng 77:704 716 (2002), Biotechnol Bioeng 81:329 340 (2003)). Вчені виявили, що надекспресія генів, які інтенсивно виготовляються в ракових клітинах, може збільшити тривалість життя у клітин, що культивуються в біореакторах, за рахунок запобігання апоптозу до моменту активації каспаз (Goswami et al., вище; Mastrangelo et al., Trends Biotechnol 16:88 95 (1998); Meents et al., Biotechnol Bioeng 80:706 716 (2002); Tey et al., J Biotechnol 79:147 159 (2000) і Biotechnol Bioeng 68:31 43 (2000). Збільшена експресія цих білків в продуктивних клітинних лініях ефективно супресує апоптозний сигнальний процес всередині клітини, зменшуючи тим самим в деяких випадках загибель клітин, підтримуючи життєздатність і збільшуючи вихід біотерапевтичної продукції. Проблема акумуляції продуктів життєдіяльності і їх негативний вплив на клітинний ріст також є звичайною для культур клітин ссавців високої щільності, вільних від білка. Лактат і аміак є двома продуктами життєдіяльності, що найчастіше зустрічаються в клітинних культурах. Для розв'язання проблеми акумуляції надмірного лактату були запропоновані численні стратегії, включаючи: 1) підтримку низької концентрації глюкози в поживному середовищі (Kurokawa et al., BiotechnolBioeng 44:95 103 (1994); Xie and Wang, Biotechnol Bioeng 43:1175 1189 (1993); Zhang et al., J Chem Technol Biotechnol 79:171 181 (2004); Zhou et al., Biotechnol Bioeng 46:579 587 (1995)); 2) використання альтернативних цукрів, включаючи фруктозу (Martinelle et al., Biotechnol Bioeng 60:508-517 (1998), Altamirano et al., J Biotechnol 110:171-179 (2004) і J Biotechnol 125:547556 (2006), Walschin and Wu, J Biotechnol 131:168-176 (2007); 3) часткове придушення експресії лактатдегідрогенази (LDH) за рахунок гомологічної рекомбінації або siRNA-технології; 4) надекспресія піруваткарбоксилази; 5) використання дихлорацетату (DCA), що є активатором піруватдегідрогенази (PDH) (за рахунок інгібування PDH-кінази); 6) використання оксамінової кислоти, що є конкуруючим інгібітором LDH і 7) видалення з допомогою перфузії (заявка на патент США № 2009/0042253 A1). 1 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Спочатку передбачалося, що винятковою функцією багатьох білків, які беруть участь в процесі апоптозу, є зв'язування з мембраною мітохондрій і регулювання апоптозу за рахунок зміни проникності мітохондрій. Нещодавні відкриття показали, що ключові білки, залучені до апоптозного сигнального процесу, впливають на ті білки і взаємодіють з тими білками, які контролюють метаболізм і енергетичний гомеостаз клітини. З оглядом можна ознайомитися в роботах Majors et al., Metab Eng 9:317-326 (2007) і White et al., Nat Cell Biol 7:1021 1028 (2005). Мікроматричний аналіз надекспресуючих білок Bcl-XL клітин культури CHO, проведений в одному з нещодавніх досліджень, показав, що лактатдегідрогеназа, яка є ключовим ферментом глюконеогенезу, має підвищену експресію. Деякі клітини і віруси виробляють антиапоптозні білки, що беруть участь в мітохондріальному апоптозному шляху. Вони можуть бути розділені на три групи: 1) білки, які діють на початку апоптозного шляху, такі як білки сімейства Bcl-2; 2) білки, які діють в середині шляху, руйнуючи або інгібуючи апоптосомний комплекс, наприклад, Aven і 3) білки, які діють на пізніх етапах апоптозного шляху, наприклад, інгібітори каспази, такі як XIAP. Дія більшості названих генів була вивчена з допомогою надекспресії в експресійній системі ссавців, і в деяких випадках був визначений ефект одночасної надекспресії двох або більшого числа генів, що належать до різних періодів апоптозного шляху. Приклади включають: 1) адитивний ефект гена Bcl-XL і делеційної мутації XIAP (XIAPΔ) в клітинах CHO (Figueroa et al., Metab. Eng. 5:230 245 (2003)); 2) гени E1B-19K і Aven в клітинах BHK (Nivitchanyong et al., Biotechnol Bioeng 98:825-841 (2007)) і 3) гени Bcl-XL, Aven і XIAPΔ (Sauerwald et al., вище, (2003); Sauerwald et al, Biotechnol Bioeng 94:362-369 (2006)). Однак ні в одній з вказаних робіт не був досліджений ефект антиапоптозних генів на стан клітинного метаболізму. Отже, існує необхідність оптимізації умов споживання поживних речовин і акумуляції метаболітів в культурі клітин ссавців з метою збільшення щільності життєздатних клітин, тривалість життя і продуктивності. Короткий опис фігур На фіг. 1 показані компоненти мітохондріального апоптозного шляху. R На фіг. 2A-2C показані характеристики клітинних ліній в стані апоптозу . R На фіг. 3, з використанням методу потокової цитометрії показане підтвердження апоптозу в культурах EA167 і EAX197. R На фіг. 4A-4C показані криві зростання апоптозних клітинних ліній, отриманих в результаті трансфекції генами E1B-19K, E1B-19K+Aven і E1B-19K+Aven+XIAP∆. Щільність життєздатних клітин і життєздатність вивчалися в контрольних (●) напівбезперервних культурах, що культивуються в струшуваних колбах, а також в лініях E64 (♦), EA167 ( ) і EAX197 (▼). R На фіг. 5A-5C показані криві, що характеризують метаболізм в апоптозних клітинних лініях, отриманих в результаті трансфекції генами E1B-19K+AVEN ± XIAP∆. Наявність різних метаболітів досліджувалася в напівбезперервних контрольних (●) культурах, що культивуються в струшуваних колбах, а також в клітинних лініях EA167 ( ) і EAX197 (▼). R На фіг. 6A і 6B показане щоденне збільшення лактату в апоптозних клітинних лініях. A) (●), контроль, EA167: □, без підживлювання, і , підживлювання лактатом, і В) EAX197 (Δ - без підживлювання, і ▼ - підживлювання лактатом). R На фіг. 7A-7G показані криві зростання і метаболізму контрольних і апоптозних клітинних ліній EA167 і EAX197, при застосуванні і без застосування підживлювання лактатом. Контроль (●), EA167 (□, без підживлювання, і , підживлювання лактатом), EAX197 (▲ - без підживлювання і ▼ - підживлювання лактатом). R На фіг. 8A-8G показані криві зменшення концентрації амінокислот в апоптозних клітинних лініях при підживлюванні лактатом. Контроль (●), EA167 (□ - без підживлювання і підживлювання лактатом), EAX197 (▲ - без підживлювання і ▼- підживлювання лактатом). На фіг. 9A-9D показані криві зростання і криві накопичення лактату в контрольних і R апоптозних клітинних лініях EAX 197, культивованих при високій концентрації глюкози в R адаптованому середовищі. апоптозні клітинні лінії EAX197 ( ); контрольні клітинні лінії (♦). Нафіг. 10A і 10B показані титри антитіл в лінії EAX197 і в контрольних лініях клітин-хазяїв; R культивованих в адаптованому середовищі, що містить 30 мМ або 60 мМ глюкози. апоптозні клітинні лінії EAX197 ( ); контрольні клітинні лінії (□). R На фіг. 11A і 11B показані VCD і титри клітинних ліній, що містять апоптозний ген Bcl-2, при умовах високої і низької щільності посіву, а також при вмісті глюкози 30 мМ і 60 мМ. Короткий опис винаходу Перший аспект даного винаходу полягає в способі досягнення високої щільності життєздатних клітин в підживлюваних еукаріотичних культурах клітин, що включає наступні етапи: 2 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 a) культивування еукаріотичної клітинної лінії, яка експресує один або більше гетерологічних R генів стійкості до апоптозу (апоптозний ), а також один або більше генів, які представляють інтерес; і b) підтримка високого рівня глюкози в середовищі протягом експонентної і стаціонарної фаз зростання клітинної культури. Інший аспект винаходу полягає в способі збільшення виробництва секретованих білків в підживлюваній культурі клітин еукаріот, що включає наступні етапи: a) культивування еукаріотичних клітинних ліній, які експресують один або більше R гетерологічних генів стійкості до апоптозу (апоптозний ), а також один або більше генів, які представлять інтерес; і b) підтримка високого рівня глюкози в середовищі протягом експонентної і стаціонарної фаз зростання клітинної культури. Докладний опис винаходу Всі публікації, які згадуються в даному описі, включаючи патенти і патентні заявки, але не обмежуючись ними, включені шляхом посилань, є частиною цього документа, як якби вони були викладені безпосередньо в цьому документі. Термін "підживлювана клітинна культура", що використовується в цьому документі, належить до процесу культивування клітин, основаного на додаванні лімітуючого поживного субстрату в культуру. Стратегія підживлюваної культури звичайно використовується в біопромислових процесах для досягнення високої клітинної щільності в біореакторі. Однак додавання такої поживної речовини, як глюкоза, приводить до утворення лактату і аміаку як продуктів метаболізму. Згідно з опублікованими даними, концентрації лактату 18 мМ (Kurano et al., 1990) і аміаку 8 мМ (Hansen and Emborg, 1994) є інгібіторами зростання еукаріотичних клітин. Для розв'язання проблеми акумуляції надмірного лактату в напівбезперервних клітинних культурах були запропоновані різні стратегії, описані вище. У даному винаході представлений альтернативний підхід до зменшення концентрації лактату і збільшення щільності життєздатних клітин і життєздатності. Запропонований спосіб використовує надекспресію одного або більше антиапоптозних генів в лінії клітин-хазяїв. Стійкі до апоптозу клітинні лінії, що отримуються при цьому, стимулюють дихання мітохондрій і акумулюють менше лактату. Тому дані клітинні лінії добре розвиваються при утримуванні в середовищах з високим вмістом глюкози. Отже, культури стійких до апоптозу клітинних ліній можуть досягати високої щільності життєздатних клітин. Завдяки стійкості до апоптозу, ці клітинні лінії також мають продовжену тривалість життя. Запропоновані у винаході способи можуть бути корисні для збільшення щільності життєздатних клітин і життєздатності в підживлюваних клітинних лініях, таких як культура клітин яєчника китайського хом'ячка (CHO), культури клітин мієломи і гібридоми. Зокрема, запропоновані в даному винаході способи можуть використовуватися для збільшення загального числа життєздатних клітин (IVCC) в культурах клітин CHO. Запропонований у винаході спосіб складається з певних етапів: культивування клітинної лінії, яка експресує один R або більше гетерологічних генів стійкості до апоптозу (апоптозний ) і один або більше генів, які представлять інтерес, а також підтримку високого вмісту глюкози в поживному середовищі протягом експонентної і стаціонарної фаз зростання клітинної культури. Ці культури є чудовими хазяями для створення виробничих клітинних ліній, які експресують білки, які представляють інтерес, такі як пептиди, пептиди злиття, фактори росту, гормони, антитіла, сконструйовані білки з анкіриновими повторами (DARPin) і іншими поліпептиди, що використовуються в терапевтичних, діагностичних або дослідницьких цілях. Клітинні лінії CHO, які можуть бути використані в запропонованому у винаході способі, включають лінії CHO-K1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) і CHOK1SV (Lonza Biologics, Slough, UK). Клітинні лінії мієломи, що використовуються в даному способі, включають лінії NS0 і Sp2/0. Всі клітинні лінії, які можуть бути використані в запропонованому у винаході способі, експресують один або більше гетерологічних антиапоптозних генів. Зокрема, можуть бути використані гени, що кодують білки E1B19K (SEQ ID №: 1 і 2) і Aven (SEQ ID №: 3 і 4). Також може бути використаний ген, що кодує XIAP∆ (SEQ ID №: 5 і 6). Ці антиапоптозні гени являють собою гени, які діють на ранніх, середніх і пізніх стадіях апоптозного сигнального шляху відповідно. Крім того, також може бути використаний ген, що кодує Bcl-2Δ (SEQ ID №: 7 і 8). Експресія антиапоптозних генів може бути досягнута за допомогою методик трансфекції, добре знайомих фахівцям, які працюють в цій галузі. Передбачається, що в запропонованих способах можливе також використання інших антиапоптозних генів, які беруть участь у вказаних вище стадіях апоптозного сигнального шляху, таких як MDM2 (SEQ ID №: 9 і 10) і Bcl-XL (SEQ ID №: 11 і 12). 3 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Використання в даному винаході клітинних ліній, які експресують гетерологічні антиапоптозні гени, дозволяє забезпечити зменшення секреції лактату або, як варіант, споживання акумульованого лактату і досягнути практично в два рази більшого загального числа життєздатних клітин (IVCC), ніж в контрольних клітинних лініях, при збереженні високого вмісту глюкози в поживному середовищі. При збільшенні щільності життєздатних клітин в культурі продуктивних клітинних ліній збільшується також вихід продукту, що отримується в результаті одного циклу роботи біореактора. В результаті збільшення продуктивності може бути досягнуте зниження вартості складних біологічних продуктів, крім того, відсутність лізису нежиттєздатних клітин дозволяє зробити продукт кращої якості, оскільки в результаті лізису звільняються протеази, які приводять до деградації продукту. Відповідно до вищесказаного, дані лінії є чудовими хазяями для створення продуктивних клітинних ліній, які експресують один або більше білків, які представляють інтерес. Запропонований у винаході спосіб пропонує стратегію культивування клітинних культур, що дозволяє забезпечити зростання культури як при високому вмісті глюкози, так і при зниженні її R концентрації, на основі здатності апоптозних клітинних ліній споживати лактат або виробляти меншу кількість лактату, який в інших лініях накопичується як продукт метаболізму. У різноманітних прикладах здійснення запропонований у винаході спосіб забезпечує збільшення пікової щільності життєздатних клітин, тривалість життя культури, збільшення титру секретованих білків, загального числа життєздатних клітин, а також зменшення потоку кальцію і збільшення мембранного потенціалу мітохондрій в напівбезперервних клітинних культурах. Крім того, для високої продуктивності клітинних ліній немає необхідності в стратегіях підживлюваного культивування, які раніше використовувалися для обмеження високого вмісту токсичних речовин, таких як лактат і аміак. При трансфекції місце хромосомної інтеграції антиапоптозного трансгена може визначати рівень його експресії. Більше того, при трансфекції декількох антиапоптозних генів рівень експресії окремого антиапоптозного трансгена може впливати на активність інших антиапоптозних білків, що знаходяться в клітині, оскільки багато які з них прямо або непрямо взаємодіють один з одним, виробляючи фізіологічні зміни в клітині. Таким чином, визначення R кількісного внеску кожного окремого антиапоптозного гена в загальні апоптозні характеристики клітинної лінії, що містить множину генів, може бути утруднене в рузультаті синергічного ефекту R R апоптозних генів. Крім цього, має місце значне варіювання між клонами відносно апоптозних характеристик, навіть якщо всі клони були отримані при трансфекції ідентичним набором трансгенів. З результатів, приведених в прикладах нижче, ясно, що кожний тестований R антиапоптозний ген додає деякого поліпшення до апоптозних характеристик клітинної лініїхазяя, підданої трансфекції. У межах вказаних обмежень, потрійні трансфектанти звичайно перевершували подвійні трансфектанти, які, в свою чергу, були кращими за трансфектантів, які надекспресують тільки один антиапоптозний трансген. Внаслідок трансфекції відповідними векторами експресії були отримані клони з варіюючим рівнем експресії E1B-19K, Aven і XIAP∆. Рівень експресії білка E1B-19K був відносно низький, і рідкі клони, що мали високий рівень експресії цього білка, були або нестабільні, або мали слабку здатність до зростання (дані не приводяться). У приведених нижче прикладах, в клітинах CHO, які експресують тільки білок E1B-19K спостерігався лише обмежений захист від клітинної загибелі (фіг. 4). На противагу результатам, отриманим при спостереженні клітинних ліній, які експресують тільки E1B-19K, дані, представлені в приведених нижче прикладах, показують, що клітинні лінії CHO K1, які експресують спільно Aven (EA167) або Aven і XIAP∆ (EAX197), виявили поліпшення в життєздатності, клітинній щільності і IVCC. Результати, представлені в приведених нижче прикладах, демонструють, що експресія двох антиапоптозних генів в клітинах лінії CHO K1 приводить до значного зменшення активності каспази і поліпшення мембранного потенціалу мітохондрій при ушкоджуючих впливах, таких як вплив стауроспорину або продовжене культивування. У приведених нижче прикладах досліджується вплив експресії гена E1B-19K, функціонального гомолога Bcl-XL, в комбінації з генами Aven і XIAP∆ на сповільнення клітинної загибелі. Рівень експресії білка XIAP∆ в трансфікованих клітинах був невисокий по відношенню до ендогенного білка XIAP дикого типу, вже присутнього в клітині, ймовірно, внаслідок використання в цій системі двох введених плазмід. Проте, введення гена XIAP∆ в клітинну лінію EAX197 (додатково до генів Aven і E1B-19K) забезпечило стабільне збільшення максимальної щільності життєздатних клітин в обох культурах, як в культурі без додавання лактату, (фіг. 5 і 7), так і в культурі з підживлюванням лактатом (фіг. 7). Дійсно, клітинна лінія EAX197, що культивується в середовищі з додаванням лактату, була здатна підтримувати високу 4 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 життєздатність на приблизно 60 % або трохи більше, протягом 14 днів, що виявилося на два дні більше, ніж в лінії EA167, і на чотири дні більше, ніж в контрольній культурі. Включення в клітину гена XIAP∆ приводить до збільшення стійкість клітини до активації каспази, це також підтверджується дуже низькою активністю каспази в лінії EAX197, показаній на фіг. 3, навіть після обробки стауроспорином. Крім того, використання мутантного гена XIAP (XIAP∆) приводить до посилення апоптозної стійкості в порівнянні з геном XIAP дикого типу. Таким чином, захищаюча здатність делеційного мутанта XIAP (XIAP∆) може бути значною, навіть якщо експресія білка в лінії CHO невисока. У приведених нижче прикладах була досліджена роль одного або більше антиапоптозних R генів в клітинному метаболізмі. У апоптозних клітинних лініях, які експресують білок E1B-19K в комбінації з білками Aven і/або XIAP∆, було визначене споживання поживних речовин і виробництво продуктів метаболізму. Зокрема, накопичення двох самих звичайних продуктів R життєдіяльності в клітинних культурах (а саме, лактату і амонію) порівняли в апоптозних і контрольної клітинних лініях. У даних, представлених нижче, показано, що при напівбезперервному культивуванні в струшуваних колбах в середовищі CD-CHO, на 6-7-й день після посіву контрольна культура акумулювала лактат в кількості 2,8 г/л (31 мМ) і амоній - 12 мМ (фіг. 5), що значно вище за концентрацію лактату 18 мМ (Kurano et al., вище) і амонію 8 мМ (Hansen and Emborg, вище), що є лімітуючими для клітинного зростання, згідно з опублікованими даними. Високий рівень лактату і амонію частково пояснюють втрату життєздатності, відмічену в контрольній лінії CHO на 8-й день після інокуляції (фіг. 4). R Незважаючи на те, що представлені нижче дані демонструють, що апоптозні клітинні лінії нагромаджують деяку кількість лактату на початку процесу культивації, ці лінії починали споживати лактат протягом експонентної фази і продовжували нарощувати VCD, значно перевершуючи по цьому показнику контрольні культури. Або здатність споживати лактат після зникнення в середовищі глюкози, або посилене інгібування апоптозу, або обидва фактори R одночасно внесли внесок в продовження клітинного зростання. Більш того, апоптозні клітини вступають в стаціонарну фазу зростання тільки після вичерпання усього ендогенного лактату. З метою визначити, чи є споживання лактату загальною характеристикою сконструйованих R клітинних ліній, для заповнення спожитого лактату до апоптозних культур був доданий екзогенний лактат (фіг. 6). Результати, представлені в приведених нижче прикладах, показують, R що апоптозні культури споживали доданий лактат і зберігали високі показники VCD і життєздатність на 4-7 днів довше, ніж контрольні культури (без додавання лактату і при підживлюванні лактатом відповідно; фіг. 7A і В). Додатковою перевагою процесу є те, що R низький рівень лактату в апоптозних клітинних лініях приводить до низької осмолярності і високого значення pH, а обидва цих показники є вкрай бажаними для поліпшення якості продукту. Деякі дослідники вже відмічали споживання лактату в клітинних лініях гібридоми, мієломи NS0 і культурах CHO (deZengotita et al., 2000; Zhou et al., 1995 і 1997; Burky et al., 2007; Pascoe et al., 2007). Однак для цих клітин типове виробництво лактату під час експонентної фази зростання і перехід до споживання цієї сполуки під час стаціонарної фази, що дозволяє передбачити, що лактат може являти собою як проміжний продукт метаболізму, так і вуглеводне джерело (Burky et al., 2007; Brooks et al., 1985). У результатах, представлених нижче, контрольні культури CHO споживали деяку кількість лактату під час стаціонарної фази зростання, особливо в середовищі з високим вмістом глюкози (фіг. 9), як вже було відмічено в R попередніх дослідженнях. апоптозні клітини, навпаки, поводилися абсолютно інакше: в цих клітинах лактат споживався протягом експонентної фази, і клітини вступали в стаціонарну фазу, тільки коли екзогенний лактат був вичерпаний. Перетворення пірувату в лактат, яке каталізується лактатдегідрогеназою (LDH), є оборотним, але рівновага значно зсунена у бік формування лактату з константою рівноваги, яка дорівнює 3,6104/M. Проте, коли гліколіз не встигає задовольняти потребу в трикарбонових кислотах (TCA), лактат може бути знову перетворений в піруват одним з ізоензимів LDH, що R каталізує цю реакцію. Споживаний в апоптозних клітинних лініях лактат, ймовірно, використовується в циклі трикарбонових кислот, беручи тим самим участь в клітинній енергетиці R і виробництві амінокислот. Цікаво, що апоптозні культури відрізняються від контрольних культур відносно концентрації аміаку: в них відмічається періодичне скороминуще зниження виробництва аміаку, як без додавання, так і при додаванні лактату в клітинну культуру, а також загальне зменшення виробництва аміаку. Використання амінокислот як джерела енергії в циклі TCA сприяє накопиченню аміаку. Зменшення виробництва аміаку, отже, дозволяє передбачити, R що апоптозні клітинні лінії отримують меншу кількість енергії з розщеплення амінокислот, ніж R контрольні лінії, що здається повністю обґрунтованим, оскільки апоптозні клітини також 5 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 споживають більшу кількість лактату як джерела енергії. Потрібно відмітити, проте, що R зниження вмісту аміаку є тимчасовим і що апоптозні клітини все ж можуть використати амінокислоти як джерело енергії. Дійсно, три амінокислоти, ізолейцин, лейцин і валін, що є R амінокислотами з розгалуженим ланцюгом, споживалися швидше в апоптозних клітинних лініях, і їх споживання було особливо виражене при підживлюванні лактатом (фіг. 8A-C). R Оскільки в апоптозних клітинних лініях період зростання був продовжений в порівнянні з контрольними клітинними лініями, ці три амінокислоти можуть бути використані як блоки в R формуванні жирних кислот і інших білків, необхідних апоптозним клітинам, а також можуть розщеплюватися в циклі TCA як джерело енергії. Схожа динаміка споживання спостерігається також відносно метіоніну (фіг. 8D). На противагу названим амінокислотам, концентрація яких в середовищі зменшувалася, деякі амінокислоти, такі як аланін і аспартат, тимчасово секретувались в контрольній культурі. Деяка частина пірувату може бути перетворена в аланін при сприянні аланінамінотрансферази. R Цілком ймовірно, що даний шлях є більш активним в апоптозних клітинах, що приводить до збільшення концентрації аланіну в порівнянні з контрольними клітинними лініями (фіг. 8B). Аспартат, крім того, належить до амінокислот сімейства аспарагінової кислоти і утворюється разом з альфа-кетоглутаровою кислотою в результаті перетворення оксалоацетату і глутамату, проміжних сполук, які утворюються в циклі TCA за участю аспартатамінотрансмінази. Рівень аспартату збільшується тільки в контрольних клітинах протягом перших шести днів, в R апоптозних клітинних лініях він постійно знижується. Оскільки вказана реакція є оборотною, R зменшення концентрації аспартату в апоптозних клітинних лініях на самому початку фази зростання вказує, можливо, на присутність обмеження кількості оборотного оксалоацетату, що R утворюється в результаті циклу TCA в апоптозних клітинних лініях. Враховуючи, що оксалоацетат в початковій стадії циклу TCA також взаємодіє з ацетил-СоА, збільшення перетворення пірувату, що забирається з оборотної рівноваги з лактатом, в ацетил-СоА, може R посилювати потребу в оксалоацетаті в апоптозних клітинних лініях. Контрольні клітинні лінії, навпаки, потребують меншої кількості ацетил-СоА, оскільки вони не засвоюють лактат і, отже, проводять аспартат з оксалоацетату. Дійсно, відсутність потреби в ацетил-СоА могла б приводити до збільшення концентрації лактату, що є альтернативним побічним продуктом при утворенні ацетил-СоА, в контрольних клітинах протягом перших семи днів культивування. З іншого боку, відсутність споживання лактату в контрольних клітинних лініях може призвести до обмеження запасу ацетил-СоА і супутнього збільшення виробництва аспартату. Дані результати вказують на підвищену енергетичну ефективність циклу TCA в клітинних лініях, які експресують антиапоптозні гени, незважаючи на те, що для точної інтерпретації реакцій, що відбуваються в клітині, необхідний детальний аналіз метаболічних шляхів. Незалежно від подальшої долі спожитого лактату, в даному винаході продемонстровано, що R апоптозні клітинні лінії споживають накопичений лактат, що, в свою чергу, сприяє збільшенню тривалості життя і збільшенню IVCC. R Якщо апоптозні клітинні лінії унікальні в тому, що вони можуть збільшувати тривалість свого життя, споживаючи накопичений лактат, тоді існує можливість для культивування цих ліній в середовищі, що містить лактат, або в середовищі, що містить глюкозу в концентрації, що перевищує норму. Незважаючи на те, що при використанні лактату як єдиного джерела вуглецю клітинна лінія будь-якого типу навряд чи мала хороші показники зростання і життєздатності, в R апоптозних клітинних лініях спостерігалося споживання лактату, коли він додавався як один з компонентів, в доповнення до глюкози (дані не приводяться), або коли лактат накопичувався в культурі в результаті життєдіяльності. Ці спостереження дозволяють передбачити, що R апоптозні клітини не можуть здійснювати глюконеогенез з пірувату або отримувати достатньо енергії з лактату, але, якщо глюкоза присутня разом з лактатом, клітини можуть споживати як глюкозу, так і накопичений або доданий в культуру лактат. Крім того, в середовищі з високим R вмістом глюкози (60 мМ) IVCC (а також VCD і життєздатність, фіг. 9A-C) апоптозних клітинних ліній значно перевищували відповідні показники контрольних клітинних ліній. Це було наслідком того, що в середовищі з високим вмістом глюкози контрольні клітинні лінії накопичували лактат R в кількості, що перевищує 20 мМ, яка могла бути токсичною. Навпаки, апоптозні клітинні лінії споживали лактат на початку фази зростання і тому містили більше число життєздатних клітин, яке, в перерахунку на приріст IVCC, перевищувало контроль на 170 % (фіг. 9C). R Оскільки апоптозні клітинні лінії споживали лактат і досягали вищого показника IVCC, виробничі клітинні лінії, які експресують білки, які представляють інтерес, наприклад, R терапевтичні антитіла, отримані з апоптозних ліній-хазяїв, досягали значно вищого титру продукту, який виробляється, ніж контрольні клітинні лінії. Вищі титри білків, що виробляються, ілюструють потенційні комерційні переваги використання антиапоптозних генів в клітинних 6 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 лініях ссавців, що виробляють терапевтичні або які-небудь інші білки, які представляють інтерес. Даний винахід далі буде розглянутий з посиланням на конкретні, але не лімітуючі приклади. Приклади У наступних прикладах переміщуваних культур клітин CHO, які містяться в струшуваних колбах і характеризується надекспресією антиапоптозних генів, були проаналізовані пік щільності життєздатних клітин, тривалість життя, активація каспази 3, а також мембранний потенціал мітохондрій (MMP). Крім того, щоб зрозуміти, чи впливає експресія антиапоптозних генів яким-небудь чином на споживання поживних речовин і акумуляцію метаболітів в системі культури клітин ссавців, споживання поживних речовин і виробництво метаболітів порівняли в клітинних лініях, що містять антиапоптозні гени, з відповідними показниками в контрольних клітинних лініях. Матеріали і способи: Клітинні культури: Клітинна лінія CHOK1SV (Lonza Biologics, Slough, UK), позначена як контрольна клітинна лінія C1013A, культивувалася в середовищі CD-CHO (Cat. No. 10743-011, Invitrogen, Carlsbad, CA), яке містить 30 мМ глюкози при додаванні 6 мМ L-глутаміну (Invitrogen Cat. No. 10313-021). В деяких прикладах було використане інше середовище, вільне від тваринного білка, і що містить різні концентрації глюкози, включаючи також концентрацію 60 мМ (позначене як середовище з високим вмістом глюкози). Ембріональна бичача сироватка була придбана у Hyclone Labs, Logan, UT (Cat. No. SH30071.03). Спостереження клітинних культур проводилося за допомогою автоматичного лічильника клітин Cedex (Innovatis, Germany). Загальне число життєздатних клітин (IVCC, клітин-днів/мл) визначалося згідно з наступною формулою: IVCC (d1) = [VCD (d0) + VCD (d1)]/2+VCD (d0), де VCD = щільність життєздатних клітин Конструкція плазмід: Вектор pBUDCE4.1 призначався для конститутивної експресії E1B-19K (EF-1a промотор), або поодинці, або разом з Aven (CMV промотор), і був охарактеризований в інших роботах (Nivitchanyong et. al., 2007). Вектор, який експресує XIAP∆ (CMV промотор), був сконструйований згідно з Sauerwald et al., 2002. Назва "пустий вектор" належить до оригінального вектора pBUDCE4.1. Експресуючий вектор для модельних антитіл (Ab №1) був сконструйований за рахунок клонування кДНК, що кодує важкий і легкий ланцюги, в експресуючий вектор, що містить глутамінсинтетазу (GS) (отриманий від Lonza Biologics, Slough, UK, по дослідницькій ліцензії). R Створення апоптозних клітинних ліній: Клітинна лінія CHOK1SV, що знаходиться в експонентній фазі зростання, була трансфікована векторами: 1) pBUDCE4.1; 2) pBUDCE4.1-E1B-19K; 3) pBUDCE4.1-E1B-19K-Aven; і 4) pBUDCE4.1-E1B-19K-Aven і pCMV-XIAP∆. Трансфекція була виконана за допомогою реагенту Fugene (Roche, Cat. № 1815075, Basel, Switzerland) відповідно до рекомендацій виробника. Через два дні клітини були вміщені для зростання в 96-ямкові планшети, поживне середовище, що містить 300 мкг/мл зеоцину (для перерахованих вище трансфекцій 1, 2 і 3); 300 мкг/мл зеоцину і 400 мкг/мл гідроміцину (для трансфекції № 4), див. таблицю 1. Приблизно 200 стійких до антибіотика клонів були розмножені; активність каспаз 3 і 7 була проаналізована, як описано далі. Клони, які представляють інтерес, були перевірені на стабільність протягом 10 етапів за відсутності антибіотика. Таблиця 1 Клітинна лінія Контрольний зразок Пустий E64 EA63 EA112 EA167 EA190 EAX64 EAX99 Використані вектори Надекспресовані гени Клони критерії відбору Відсутній Відсутній Відсутній pBUDCE4.1 pBUDCE4.1-E1B-19K pBUDCE4.1-E1B-19K-Aven Відсутній E1B19K E1B-19K, Aven Zeo Zeo Zeo pBUDCE4.1-E1B-19K-Aven і pCMV-XIAP∆ E1B-19K, Aven, XIAP∆ Zeo, Hygro 7 UA 106047 C2 Продовження таблиці 1 Клітинна лінія Використані вектори Надекспресовані гени Клони критерії відбору EAX148 EAX197 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Насамперед були створені контрольні клітинні лінії за рахунок трансфекції пустого вектора в клітини лінії CHOK1SV і відбору стійких до зеоцину клонів. Показник IVCC в цих клітинних лініях був в середньому на 20 % нижчим, ніж в нетрансфікованих контрольних лініях CHOK1SV, тому R лінії CHOK1SV були використані у всіх подальших експериментах як контрольні. Апоптозна клітинна лінія EAX197, що представляє найбільший інтерес, а також контрольна клітинна лінія були згодом використані для створення продуктивної лінії, яка експресує модельні антитіла, за допомогою експресуючого вектора, що містить GS, відповідно до рекомендацій виробника. Вміст антитіл в клітинній культурі вимірювався за допомогою нефелометрії (Beckman Array System). R Культивування апоптозних клітинних ліній в струшуваних колбах: R Відібрані апоптозні клітинні лінії культивувалися підживлюваним способом в середовищі CD-CHO з додаванням 6 мМ глутамінової кислоти і необхідного для відбору антибіотика. У R деяких експериментах, в напівбезперервні культури апоптозних клітинних ліній додавали лактат для заповнення його вмісту в середовищі. Крім того, відібрані клітинні лінії, які експресують Ab, культивувалися в адаптованому середовищі, вільному від тваринного білка, з додаванням 6 мМ глутамінової кислоти і 60 мМ глюкози. Аналіз активності каспаз 3 і 7: 5 Клітини кожного клону, приблизно 310 , були висіяні в 1 мл поживного середовища на 245 ямковий планшет. На четвертий день (d4) після посіву, клітини, приблизно 110 , перенесли на 96-ямковий планшет, зробивши три копії. До початку аналізу активності каспаз 3 і 7 клітини інкубувались в середовищі з додаванням стауроспорину (2 мкМ fc) протягом 16 год.; оцінка проводилася за допомогою набору реагентів APO-ONE (BD Labs). Процедуру повторили на 10-й день, без стауроспорину. Клони, що виявили значно нижчу активність каспаз 3 і 7 в обидва R вказаних дні, були пересіяні на безсироваткове середовище (SF). Апоптозні властивості вибраних клонів були підтверджені за допомогою потокової цитометрії (див. далі) і в окремих випадках вимірюванням мембранного потенціалу мітохондрій. R Аналіз апоптозних клонів в системі потокової цитометрії: Клітини були взяті з ліній, які культивуються в струшуваних колбах і знаходяться на 6 експонентній фазі зростання, приблизно 110 з кожної культури, і перенесені на 24-ямковий планшет; клітини інкубувались протягом 16 годин в середовищі зі стауроспорином (2 мкМ fc), потім були зібрані і відмиті в фосфатно-сольовому буферному розчині. Після цього клітини були піддані інкубації з CytoPerm (Cat. No. 2075KK, BD BioScience) для фіксації і досягнення проникності. Після промивання в фосфатно-сольовому буферному розчині і до аналізу в системі потокової цитометрії, клітини інкубувались з антитілами до каспази 3, міченими FITC (Cat. No. 68654, BD BioScience). Аналіз мембранного потенціалу мітохондрій (MMP): Клітини, що культивуються в струшуваних колбах, були взяті на 6-й день після посіву і інкубувались в присутності стауроспорину (5 мкМ fc) протягом 2 годин. Потім клітини були промиті і оброблені ліпофільним катіонним барвником JC-1 (Cayman Labs, Ann Arbor, MI) відповідно до рекомендацій виробника. Сканування спектра емісії планшетів проводилося на каналах, які відповідають довжинам хвиль 535 нм і 595 нм; було розраховане співвідношення отриманих величин. Вестерн-блотинг: 7 Клітини з вказаних культур, приблизно 1 × 10 , були зібрані, промиті в фосфатно-сольовому буферному розчині і піддані лізису в буфері RIPA, що містить 1 % NP-40, 120 мМ Tris-HСl, 150 мМ NaCl, 0,2 мМ PMSF і 1 мМ EDTA. 50 мікрограм цитозольного білка з кожного зразка вмістили в градієнтний гель NuPAGE 4-12 % і розділили за допомогою методу SDS-PAGE в системі Novex (Invitrogen). Розділені білкові смуги були перенесені на нітроцелюлозу і проаналізовані з використанням: 1) антимишачих антитіл до людського білка E1B-19K, розведення 1:40 (Cat No. DP-17, CalBiochem, Gibbstown, MD); 2) антикролячих антитіл до людського білка Aven, розведення 1:1000 (Cat No. 612521, BD BioScience, San Jose, CA); і 3) антимишачих антитіл до людського білка XIAP (Cat No. 616713, BD BioScience). Вищевикладений протокол, включаючи 8 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використані антитіла, був оптимізований і стандартизований з використанням відомих кількостей (~10 нг кожного) очищених білків E1B-19K, Aven і XIAP, придбаних в комерційних фірмах. Для візуалізації білкових зон був використаний набір ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Визначення концентрації метаболітів в середовищі: Концентрації ключових метаболітів і продуктів життєдіяльності були визначені в автоматичному аналізаторі YSI 2700. Концентрація іонів амонію визначалася за допомогою проточно-інжекційного аналізу (Campmajo et al, 1994). Амінокислоти вимірювалися за допомогою ВЕРХ (Waters, Milford, MA), використовуючи колонку зі зворотною фазою (Waters). Приклад 1 Створення стійких до апоптозу клітинних ліній і дослідження їх властивостей Список клітинних ліній, використаних в даному дослідженні, експресійні плазміди, які були використані для трансфекції при створенні кожної клітинної лінії, і селективні агенти, використані для ізоляції трансфектом, перераховані в приведеній вище таблиці 1. Указані в таблиці клітинні лінії являють собою множинні клони, створені в результаті кожної трансфекції. Назва кожної клітинної лінії є похідною від антиапоптозних генів, трансфікованих в клітинну лінії-хазяя. Наприклад, EAX197 - це клітинна лінія, яка була трансфікована генами E1B-19K (Е), R" Aven (А) і XIAP∆ (X). Назва "апоптозна буде надалі використовуватися для позначення клітинних ліній, трансфікованих одним або більше вказаними антиапоптозними генами. R Оцінка властивостей апоптозних клітинних ліній, використаних в даній роботі, була зроблена з допомогою вестерн-блотингу, аналізу активності каспаз 3 і 7, а також за допомогою аналізу мембранного потенціалу мітохондрій (дані не приводяться). Як одиничні E64, так і подвійні трансфектанти EA63, EA112, EA167 і EA190 експресували більше, ніж фонову, що спостерігається в нетрансфікованих контрольних лініях C1013A, кількість білка E1B-91K. З чотирьох клітинних ліній, що є подвійними трансфектантами, EA112 і EA167 експресували як білок E1B-19K (~19 кДа), так і білок Aven (~55 кДа). Клітинні лінії EA63 і EA190 експресували білок E1B-19K в досить великій кількості, тоді як виробництво білка Aven було дуже низьким. З чотирьох клітинних ліній, створених при трансфекції подвійними векторами pBUDCE4.1-E1B19K-Aven і pCMV-XIAP∆, а саме ліній EAX64, EAX99, EAX148 і EAX197, тільки лінія EAX197 експресувала всі три білка в детектованих кількостях. Смуга, відповідна білку з масою ~55 кДа, спостерігалася у всіх лунках планшета, включаючи лунку, яка відповідає нетрансфікованій контрольній лінії C1013A; вище рекомбінантного білка Aven ймовірно розташовувалася смуга, яка відповідає ендогенному білку Aven, як підтверджувалося пост-імунною, але не преімунною сироваткою (Sauerwald et al., 2002, Chau et al., 2000). У трансфікованого гена Aven відсутні перші шість амінокислот, які, як виявляється, не порушують біологічну активність білка. Отже, трансфікований Aven дещо менший, ніж його ендогенний аналог. Смуга, яка відповідає масі 40 кДа, яка, ймовірно, являє собою частково зруйнований білок Aven, була присутньою у всіх клітинних лініях, які надекспресують цей білок одночасно з E1B-19K. Деградовані продукти схожих розмірів спостерігалися і раніше при одночасній надекспресії Aven з Bcl-XL (Sauerwald et al., 2005) або з Bcl-2 (Figueroa, неопубліковані дані). Крім того, експресія Aven була значно нижча в потрійних трансфектантах, включаючи лінію EAX197, яка надекспресує E1B-19K, Aven і XIAP∆. Цікаво, що рівень експресії трансфікованого XIAP∆ був значно нижчим, ніж ендогенний рівень оригінального білка XIAP. Відмітимо, що значні відмінності між XIAP і XIAP∆ в рівнях експресії частково можуть бути пояснені відмінністю в ефективності зв'язування антитіл цими різними формами антиапоптозного білка. Так явні відмінності в експресії між ендогенним XIAP і трансгенним XIAP∆ ставлять під сумнів внесок останнього в запобігання апоптозу. Дійсно, дане дослідження дозволяє передбачити, що пряма кореляція між рівнем експресії даного антиапоптозного гена і рівнем захисту від апоптозу, який відповідний білок забезпечує клітинній лінії, існує не завжди. R Активність каспаз 3 і 7 аналізувалася в кожній апоптозній клітинній лінії за допомогою APOONE, оскільки активність каспази служить індикатором міри стійкості клітинної лінії до апоптозу. Коротко кажучи, цей аналіз полягає в тому, що профлюоресцентний субстрат Z-DEVD-R110 розщеплюється каспазами 3 і 7, причому ефективність руйнування залежить від кількості каспаз. Культури EA167 і EAX197, що знаходяться в експонентній фазі зростання, також як і контрольна клітинна лінія, інкубувались в присутності стауроспорину протягом 16 годин з метою індукції апоптозу, після чого вимірювалася активність каспаз 3 і 7. Активність каспаз 3 і 7 в оброблених стауроспорином контрольних клітинних лініях була прийнята за 100 %. У цьому випадку активність каспази в клітинах ліній EA167 і EAX197 склала відповідно 30 % і 35 % від контролю, дозволяючи передбачити, що ці клітинні лінії мали принаймні часткову стійкість до 9 UA 106047 C2 R 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 індукції апоптозу (фіг. 2A). Для подальшого з'ясування апоптозних властивостей EA167 і EAX197 оброблені стауроспорином культури цих двох клітинних ліній, також як і контрольної клітинної лінії, інкубувались з антитілами проти каспази 3, міченими FITC, і потім були проаналізовані в системі потокової цитометрії. На фіг. 3 можна побачити, що всі три клітинні лінії, незалежно від того, чи піддавались вони обробці речовиною-носієм (в цьому випадку був використаний DMSO), мали 1 % або меншу кількість клітин, позитивних відносно каспази 3. Однак 91 % популяції контрольних клітин після обробки стауроспорином були позитивними відносно каспази 3. Навпаки, тільки 9 % всієї популяції, отриманої з клітинної лінії EAX197, і 30 % клітин, отриманих з клітинної лінії EA167, були позитивні до каспази 3, підтверджуючи R апоптозний фенотип цих двох клітинних ліній. Щоб перевірити, чи приводить стійкість до апоптозу до збільшення тривалості життя, в досить великому числі клітинних ліній EA, що культивуються в струшуваних колбах (продовжене культивування), вимірювали щільність життєздатних клітин (VCD) і загальне число життєздатних клітин (IVCC). Збільшення загального числа життєздатних клітин поліпшує продуктивність культури в заданому об'ємі, при допущенні, що продуктивність кожної конкретної клітини залишається незмінною. Таким чином, показник IVCC може бути використаний як параметр для R відбору кращих апоптозних клітинних ліній, які можуть бути використані як хазяї при створенні продуктивних клітинних ліній. Як показано на фіг. 2B, клітинні лінії з відносно низькою активністю каспаз 3 і 7, як правило, дозволяли створювати клітинні лінії з вищим показником IVCC. Незважаючи на те, що будь-яка клітинна лінія EA мала зменшену в порівнянні з контролем активність каспаз 3 і 7, показник IVCC не мав чіткої кореляції з рівнем активності R каспаз 3 і 7, присутніх в кожній клітинній лінії. Крім того, деякі апоптозні клітинні лінії виявляли більшу стабільність, ніж їх клони, відносно вираженості антиапоптозного фенотипу. Клітинна лінія EA167 була використана для подальшого вивчення, тому що вона мала значну антиапоптозну активність і стійке зростання при культивуванні в струшуваних колбах. Крім того, EA167 була найбільш стабільною зі всіх використаних клітинних ліній і інтенсивно експресувала Aven, що було підтверджено з допомогою вестерн-блотингу. Багато які сигнальні молекули, що беруть участь в апоптозному шляху, або взаємодіють з мітохондріями, або знаходяться всередині них. Ці білки взаємодіють з мітохондріальною мембраною і регулюють апоптоз за рахунок зміни проникності мітохондрій. Тому мембранний потенціал мітохондрій (MMP) служить додатковим показником фізіології клітини, по якому R можна порівнювати апоптозні властивості ліній EA167 і EAX197 відносно контролю. Як можна прослідити за результатами аналізу, представленими на фіг. 2C, обидві клітинні лінії EA167 і EAX197 мали вищий MMP, ніж контрольні лінії. Приклад 2 Вплив E1B-19K на щільність життєздатних клітин в клітинній лінії CHOK1SV На фіг. 4 порівнюється динаміка зростання подвійних трансфектантів, які надекспресують білок E1B-19K разом з Aven (EA167), потрійні трансфектантів, які надекспресують E1B-19K разом з Aven і XIAP∆ (EAX197), а також трансфектантів, які надекспресують тільки E1B-19K (E64), з динамікою зростання контрольної лінії (лінії-хазяя). Тоді як пік VCD контрольної 6 6 клітинної лінії становив 7,7×10 клітин/мл, а лінії E64 (яка експресує тільки E1B-19K) - 8,9×10 7 клітин/мл, той же показник в лінії EA167 досяг 1,4×10 клітин/мл, а в лінії EAX197 більш ніж 7 1,5×10 клітин/мл, що склало збільшення до 190 % відносно контрольної лінії. Життєздатність ліній EA167 і EAX197 різко знизилася на 8-й або 9-й день після посіву, що приблизно було наслідком зниження вмісту поживних речовин в середовищі, при цьому в контрольній лінії і в клітинних лініях E64 життєздатність знижувалася значно повільніше (за фіг. 4B). Сумарний 7 вплив на IVCC показаний на фіг. 4C. Показник IVCC контрольної лінії становив 4,9×10 клітин7 днів/мл, за нею йшла лінія E64 (5,2×10 клітин-днів/мл). Очевидно, що показники IVCC двох R 7 7 апоптозних клітинних ліній, EA167 (6,3×10 клітин-днів/мл) і EAX197 (6,6×10 клітин-днів/мл) були значно вищими, ніж в контролі (136 % і 140 % в EA167 і EAX197 відповідно). R Також, як EA167 і EAX197, дещо інших апоптозних ліній виявили схожий фенотип, проводячи низьку кількість лактату (дані не приводяться). Крім того, було відмічено існування рідких клітинних ліній дикого типу, які виробляють мало лактату (Pascoe et al, 2007). Приклад 3 R Динаміка метаболізму в апоптозних клітинних лініях R З метою порівняння фізіологічних характеристик апоптозних клітинних ліній EA167 і EAX197, приблизно захищених від апоптозу, і контрольної лінії в напівбезперервних культурах, досліджувалися концентрації основних поживних речовин і амінокислот: глюкози, глутамату і глутаміну, доданої в напівбезперервну культуру на самому початку процесу культивації. Крім того, також відбувалося спостереження за накопиченням відходів життєдіяльності, таких як 10 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 аміак і лактат. На фіг. 5 показані кількості названих метаболітів в лініях EAX197 і EA167, а також в контрольній лінії при культивуванні в струшуваних колбах в напівбезперервному режимі на середовищі, що серійно випускається CD-CHO. Як показано на фіг. 5A, концентрація глюкози в середовищі швидко зменшується у всіх трьох клітинних лініях на 6-7-й день після посіву. Не було помічено скільки-небудь значущих відмінностей в зниженні концентрації глутаміну між R апоптозними і контрольними клітинними лініями; рівень глутамату також не варіював - ні між культурами, ні по днях культивування (дані не приводяться). Всі три клітинні лінії накопичували лактат протягом перших чотирьох днів культивування, що відповідали початковій фазі зростання культури (фіг. 5B). Контрольна клітинна лінія продовжувала накопичувати лактат аж до 6-го дня (до цього часу його концентрація досягала 2,8 г/л), потім спостерігалося невелике зменшення концентрації лактату до 1,8 г/л. Вважається, що така кількість лактату знижує pH в культурі, а оскільки в біореакторі pH контролюється додаванням бікарбонату, то це може приводити до збільшення осмолярності. Ці чинники, нарівні з іншими стресовими чинниками, можуть приводити до формування токсичного для тваринних клітин середовища. Навпаки, R концентрація лактату в апоптозних клітинних лініях зростала протягом меншого проміжку часу, а потім, починаючи з 5-го дня, різко знижувалася, так що лактат повністю зникав на 7-й (в лінії EA167) - 8-й (в лінії EAX197) день життя культури. Цікаво, що в останніх двох лініях, услід за моментом, коли концентрація лактату опускалася до нуля, відразу ж наступав період різкого зниження VCD, як це можна прослідити по фіг. 5A, дозволяючи передбачити, що втрата життєздатності клітин була наслідком відсутності глюкози або лактату в середовищі. R Динаміка концентрації аміаку в середовищі виявила ще одну відмінність між апоптозною і контрольною клітинними лініями (фіг. 5C). Концентрація аміаку злегка зменшувалася на 6-й день в лініях EA167 і EAX197 (з цим періодом також співпадав початок зменшення концентрації R лактату), а потім знов збільшувалася. Проте, підсумковий рівень аміаку в апоптозних лініях був R нижчим, ніж в контрольних, що дивно, якщо мати на увазі, що апоптозні лінії досягали вищого показника IVCC і, отже, більшого підсумкового зростання в порівнянні з контрольними клітинними лініями (фіг. 4C). R Приведені дані свідчать про те, що характеристики апоптозних клітинних ліній істотно R відрізняються від властивостей контрольних ліній. Проте, серед апоптозних трансфектантів можна зустріти широкий спектр фенотипів при спостереженні великого числа клонів в злегка відмінних експериментальних умовах. Оскільки в різних ізольованих клонах контрольної лінії також спостерігається фенотипова різноманітність, то при застосуванні відповідних режимів R відбору можна виділити рідкі апоптозні клони з контрольної клітинної лінії. З цією метою Mattanovich і Borth (2006) проаналізували використання методів сортування клітин для ізоляції рідких варіантів з бажаними характеристиками безпосередньо з клітинної лінії дикого типу (контрольної лінії). Приклад 4 Вплив додавання лактату в культуру Кількість лактату, присутнього в клітинній культурі в деякий момент часу, залежить від кількості секретованого клітинами лактату, а також від кількості спожитої ними лактату. З метою R визначити, чи дійсно апоптозні клітинні лінії споживали лактат, або ж підсумкова продукція лактату в цих лініях була нижчою, проводили щоденне спостереження за всіма трьома лініями, і R будь-яку відмінність, яка фіксується, в концентрації лактату між апоптозними і контрольними клітинними лініями усувалася за рахунок додавання екзогенного лактату. Як указано вище, R рівень лактату в апоптозних лініях EA167 і EAX197 в умовах культивування без підживлювання починав знижуватися на 5-й день (фіг. 6A і 6B), повне зникнення відбувалося на 7-й день (в лінії EA67, без підживлювання) або 8-й день (в лінії EAX197, без підживлювання). Вміст лактату в контрольній клітинній лінії продовжував збільшуватися аж до 6-го дня, потім злегка зменшувалася протягом наступних трьох днів, але ніколи не падало до нуля. Лактат додавали в R окремі підживлювані апоптозні культури, доводячи його кількість до 2,5 г/л на 7-й день культивування (для лінії EA167, фіг. 6A) і до 2 г/л на 8-й день культивування (для лінії EAX197, фіг. 6B), так щоб кількість лактату була схожа з контрольними культурами; при цьому спостереження за культурами велося щодня. Навіть при додаванні додаткового лактату, в R апоптозних культурах його кількість зменшувалася значно швидше, ніж в контрольних, в проміжок між 6-м і 12-м днями культивування. Дійсно, в той час як в культурі EA167 з підживлюванням кількість лактату знижувалося з 2,5 до 0,2 г/л з 6-го на 7-й день, в контрольній R культурі відбувалося усього лише зниження з 2,7 до 2,4 г/л. Таким чином, в апоптозних клітинних лініях лактат споживався швидше, ніж в контрольних, протягом, принаймні, 7 днів після додавання лактату. 11 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Вплив додавання лактату на VCD і життєздатність клітин ілюструється на фіг. 7A і 7B, R відповідно. Як вже відмічалося (фіг. 5A), показник VCD апоптозних культур без підживлювання швидко зменшувався, починаючи з 8-го (в лінії EA167) і 9-го (в лінії EAX197) днів. Ймовірно, це відбувалося в результаті повного виснаження одного або більше істотних компонентів середовища, включаючи глюкозу і (або) лактат. Контрольні клітинні лінії виявляли легке зниження, починаючи з 7-го дня. Однак додавання лактату в культури (EA167, підживлювання лактатом, і EAX197, підживлювання лактатом) приводило до значно більш повільного зниження VCD, а в одній клітинній лінії (EAX197, підживлювання лактатом) показник VCD стабілізувався 6 6 між 8 × 10 і 10×10 клітин/мл і підтримувався аж до 14-го дня, коли ця лінія загинула. R Аналогічно, життєздатність клітин в двох апоптозних культурах, показана на фіг. 7B, виявила більш плавне зниження при додаванні лактату в середовище. Ці результати дозволяють R передбачити, що апоптозні клітинні лінії здатні ефективно засвоювати як ендогенний, так і доданий в середовище лактат, відновлюючи щільність життєздатних клітин і життєздатність, тоді як контрольні клітинні лінії нездатні використовувати так ефективну стратегію споживання R лактату. Вказана відмінність знаходить відображення в IVCC: апоптозні культури при підживлюванні лактатом мали показник IVCC, який приблизно дорівнює 180-220 %, якщо R порівнювати з апоптозними культурами без підживлювання, і майже 235 %-250 %, якщо порівнювати з контрольними культурами. Динаміка більшості інших поживних речовин і метаболітів, показана на фіг. 7D-F, була аналогічна динаміці відповідних компонентів, характерній для розглянутих культур без підживлювання (див. фіг. 5). Глюкоза і глутамін активно споживалися вже на ранніх етапах R життя культури. Крива, що характеризує концентрацію аміаку в апоптозних культурах, виявляла легке зниження в той момент, коли починалося споживання лактату, як в культурах підживлюванням, так і в культурах без підживлювання лактатом. Як і в попередніх R експериментах, кінцевий рівень аміаку в апоптозних клітинних лініях був нижчим, ніж в контролі, навіть незважаючи на те, що показник IVCC був значно вище у всіх чотирьох R апоптозних культурах. Культури, як з підживлюванням, так і без підживлювання лактатом відрізнялися за вмістом глутамату в середовищі, причому зниження рівня глутамату було більш виражене в культурах з підживлюванням, чому в культурах без підживлювання і контрольних культурах. Приклад 5 R Зміна концентрації амінокислот в апоптозних і контрольних клітинних лініях Концентрація кожної з двадцяти амінокислот досліджувалася в контрольних клітинних лініях, R а так само в апоптозних культурах з підживлюванням і без підживлювання лактатом (таблиця II і фіг. 8). Розглядаючи споживання або виробництво амінокислот, крім глутаміну і глутамату, насамперед потрібно зазначити, що жодна з дев'яти незамінних амінокислот (фенілаланін, треонін, метіонін, лізин, триптофан, лейцин, ізолейцин, валін і гістидин) не була повністю R вичерпана, згідно з таблицею II. У апоптозних культурах (без підживлювання) і в культурах контрольних клітинних ліній аспарагін, серин, триптофан і цистеїн (виділені курсивом) були вичерпані практично повністю. Цікаво, що концентрація всіх трьох амінокислот з розгалуженим ланцюгом: ізолейцину, лейцину і валіну (виділених в таблиці II світло-сірим кольором) в R апоптозних культурах зменшувалася швидше, ніж в контролі, і була більш виражена в культурах з підживлюванням лактатом (фіг. 8A-D). Як і у випадку глутамату, фінальний рівень трьох названих амінокислот був значно нижчим, ніж в культурах з підживлюванням лактатом. Амінокислоти, спожиті у великій кількості (фінальна концентрація склала менше 50 % від початкової концентрації) включали тирозин, фенілаланін, метіонін (фіг. 8D) і аспарагінову кислоту (фіг. 8E). Цікаво також порівняти амінокислоти, секретовані в середовище, в культурі контрольних і R апоптозних клітинних ліній. На фіг. 8E показано, що контрольні клітинні лінії накопичували R аспарагінову кислоту протягом перших шести днів, тоді як у всіх чотирьох апоптозних культурах протягом того ж періоду відбувалося зменшення концентрації аспарагінової кислоти. R Крім того, апоптозні клітинні лінії секретували значно більше аланіну (фіг. 8F) протягом перших шести днів, ніж контрольні клітинні лінії, причому всі клітинні лінії починали споживати аланін R пізніше. Крім того, за весь період культивування загалом, апоптозні клітинні лінії виробляли більше гомоцистеїну, ніж контрольні культури (фіг. 8G). Приклад 6 Характеристики напівбезперервних культур при високій концентрації глюкози R Якщо апоптозні клітинні лінії можуть засвоювати лактат, то існує імовірність, що ці лінії будуть добре розвиватися при концентраціях глюкози, що звичайно є лімітуючими для зростання контрольних клітинних ліній через накопичення токсичних рівнів лактату. Крім того, 12 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 можливо, що ці лінії будуть мати кращі показники зростання в середовищі, що містить лактат як єдине джерело вуглецю. Середовище CD-CHO, використане в попередніх експериментах, виявилося непридатним в цьому випадку, оскільки така висока концентрація глюкози призвела б до непереносимого підвищення осмолярності, таким чином, виникла необхідність в новому середовищі. Тому ми порівняли кінетику зростання клітинної лінії EAX197, що показала найбільше стійке зростання в попередніх експериментах, і контрольних ліній при культивуванні на адаптованому середовищі, що не містить тваринного білка, в присутності 60 мМ глюкози R (високий рівень глюкози) або 30 мМ лактату. Ні апоптозні , ні контрольні клітинні лінії не мали стійкого зростання при повній відсутності глюкози, наприклад, тільки в присутності лактату (дані не приводяться). Коли обидва типи клітинних ліній культивували в однаковому адаптованому середовищі, що містить "високу" (60 мМ) концентрацію глюкози, клітинні лінії EAX197 мали вищі показники VCD, життєздатність і IVCC (фіг. 9A-C), ніж контрольні лінії, особливо на більш пізніх етапах культивування. Клітинні лінії EAX197 показали менше в порівнянні з контролем збільшення IVCC (130 %), ніж це було відмічене в середовищі CD-CHO, використаному в попередніх експериментах, але відмінність все ж була значущою внаслідок збільшення життєздатності на більш пізніх етапах. Криві концентрації лактату в середовищі цих двох клітинних ліній при культивуванні в умовах "високого" вмісту глюкози, показані на фіг. 9D. Так само, як і у випадку з IVCC, динаміка зміни лактату в культурах обох клітинних ліній відрізнялася від динаміки, що спостерігається в середовищі CD-CHO (фіг. 5D). Відповідно до результатів, R отриманих в середовищі CD-CHO, при утримуванні в адаптованому середовищі, апоптозні клітинні лінії почали споживання лактату раніше (на 2-й день, як показано на фіг. 9D), ніж контрольні культури, і максимальний вміст лактату, досягнутий в цих культурах, був нижчим (1,2 г/л проти 2,4 г/л в контрольних клітинних лініях). Контрольні клітини виробляли лактат до п'ятого дня, після чого перейшли до споживання лактату. Оскільки середовище CD-CHO - це комерційно реалізовний продукт, формула якого не розголошується, не представлялося можливим детальне порівняння компонентів середовищ, щоб зрозуміти, по якій причині клітинні лінії демонструють відмінності в споживанні лактату. Приклад 7 R Продуктивність апоптозних клітинних ліній в середовищі, що містить високу концентрацію глюкози R Апоптозна клітинна лінія EAX197, також як і контрольна лінія, згодом були використані як лінії-хазяї для створення продуктивних клітинних ліній, які експресують модельні антитіла. Для кожної клітинної лінії була досліджена однакова кількість клонів; в умовах напівбезперервного культивування в струшуваних колбах порівнювалася продуктивність по Ab між кращими клонами, що походили від різних ліній-хазяїв. Для порівняння поведінки клітинних ліній в умовах високої концентрації глюкози використовувалося адаптоване середовище, що містить 60 мМ ("високий" вміст) глюкози як джерело вуглецю. На стандартному середовищі (фіг. 10A), титр продукції клітинних ліній, які походять від лінії EAX197, становив 489 мг/л, що являє собою 145 % збільшення в порівнянні з контролем, в якому титр становив 337 мг/л. Ті ж лінії в середовищі з високим вмістом глюкози (фіг. 10B) мали титр 687 мг/л, що означало збільшення на 178 % в порівнянні з контрольними лініями (384 мг/л). Збільшення продуктивності сталося, принаймні частково, завдяки збільшенню на 188 % показника IVCC в лініях EAX197 в порівнянні з контрольними клітинними лініями (дані не приводяться). Приклад 8 Вплив надекспресії генів E1B19K+AVEN +/- XIAP∆ на запобігання апоптозу Основні активатори апоптозного каскаду в мітохондріях показані на фіг. 1. З метою створення стійких проти апоптозу клітинних ліній CHO ми зупинили свій вибір на трьох антиапоптозних генах, які діють на ранній, середній і пізній стадіях апоптозного процесу. Це були гени E1B19K (Е), AVEN (А) і XIAP∆ (X). Клітинна лінія CHOK1SV, що найчастіше використовується як клітинна лінія-хазяїн, була трансфікована генами E1B19K+AVEN з/без XIAP∆. Дослідженню піддали велике число трансфектом, і декілька клонів від кожної трансфекції було відібрано для подальшого вивчення. Ці лінії характеризувалися дуже високим показником VCD загалом, показник IVCC в цих лініях був майже в два рази вищі, ніж в контролі. R Життєздатність в апоптозних клітинних лініях зменшувалася на 8-й день після посіву, однак R відновлювалася на 10-й день, за рахунок споживання лактату. Середа апоптозних ліній, які експресують білки E1B19K+AVEN±XIAP∆ мала слідові або такі, що не виявляються кількості аміаку і лактату, а також характеризувалася виснаженням запасів глутамату. Приклад 9 Використання Bcl-2d для збільшення титру антитіл 13 UA 106047 C2 R 5 10 15 Приведені вище результати показують, що апоптозні клітинні лінії нагромаджують менше R лактату, ніж контрольні лінії, а також, що життєздатність апоптозних культур може підтримуватися в середовищі з високим вмістом глюкози. Експеримент полягав в тому, що посів R апоптозних ліній, які експресують Bcl-2d, а також важкий і легкий ланцюги антитіла (C2088B), виробили при різній щільності при умовах нормальної (4,8 г/л) і високої концентрації глюкози (9,5 г/л); напівбезперервне культивування здійснювалося в струшуваних колбах. Результати R показують, що апоптозні клітинні лінії, посіяні при щільності 1×6 клітин/мл в середовище, що містить 9,5 г/л глюкози, досягли піка VCD, який дорівнює рівного 14×6 клітин/мл на 7-й день після посіву (фіг. 11A), а титр антитіл становив 2 г/л. Для порівняння, в лінії C2088B, культивованій в стандартних умовах (інокуляція при 0,3×5 клітин/мл і 4,8 г/л), спостерігався пік VCD, що становив 7×6 клітин/мл, а титр антитіл становив 1 г/л (фіг. 11B). Це рівнозначно 200 % збільшенню титру антитіл при високому вмісті глюкози в порівнянні зі стандартними умовами (а саме, щільність посіву 0,3×6 клітин/мл в середовищі, яке містить 4,8 г/л глюкози). На завершення повного опису даного винаходу, мається на увазі, як відомо фахівцеві в даній галузі, що в об'єкти, які описуються, може бути внесена множина змін і модифікацій, що не виходять за межі суті і об'єму формули винаходу, що пропонується. 14 UA 106047 C2 15 UA 106047 C2 16 UA 106047 C2 17 UA 106047 C2 18 UA 106047 C2 19 UA 106047 C2 20 UA 106047 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 1. Спосіб збільшення щільності життєздатних клітин в підживлюваних культурах еукаріотичних клітин, що включає наступні етапи: 21 UA 106047 C2 5 10 15 20 25 a) культивування еукаріотичної клітинної лінії, яка експресує один або більше гетерологічних R генів стійкості до апоптозу (апоптозних ) і один або більше генів, які представлять інтерес; і b) підтримка високого вмісту глюкози в середовищі протягом експонентної і стаціонарної фаз R росту клітинної культури, де апоптозні гени являють собою гени E1B19K і AVEN, а концентрація лактату в клітинній культурі становить приблизно 1 г/л або менше після 5 днів культивування. 2. Спосіб за п. 1, в якому еукаріотична клітинна лінія являє собою клітини яєчника китайського хом'ячка (СНО). 3. Спосіб за п. 2, в якому клітинна лінія СНО являє собою клітини СНО-K1. 4. Спосіб за п. 2, в якому клітинна лінія СНО являє собою клітини СНО-K1SV. 5. Спосіб за п. 1, в якому еукаріотична клітинна лінія являє собою клітини мієломи. 6. Спосіб за п. 5, в якому клітинна лінія мієломи являє собою клітини NS0. 7. Спосіб за п. 5, в якому клітинна лінія мієломи являє собою клітини Sp2/0. 8. Спосіб за п. 1, в якому еукаріотична клітинна лінія являє собою клітини гібридоми. R 9. Спосіб за п. 1, в якому апоптозні гени додатково включають ген ХІАР. 10. Спосіб за п. 1, в якому пік щільності життєздатних клітин (VCD) збільшений. 11. Спосіб за п. 1, в якому тривалість життя клітинної культури збільшена. 12. Спосіб за п. 1, в якому титр клітинної культури збільшений. 13. Спосіб за п. 1, в якому загальне число життєздатних клітин (IVCC) клітинної культури збільшене. 14. Спосіб за п. 1, в якому потік кальцію в клітинах зменшений. 15. Спосіб за п. 1, в якому мембранний потенціал мітохондрій збільшений. 16. Спосіб за п. 1, в якому гени, які представляють інтерес, кодують важкий і легкий ланцюги антитіла. 17. Спосіб за п. 1, в якому висока концентрація глюкози в середовищі становить приблизно 60 мМ, а концентрація лактату в клітинній культурі становить приблизно 0,1 г/л або менше після 7 днів культивування. 22 UA 106047 C2 23 UA 106047 C2 24 UA 106047 C2 25 UA 106047 C2 26 UA 106047 C2 27 UA 106047 C2 28

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Methods for obtaining high viable cell density in mammalian cell culture

Автори російською

Dorai, Haimanti, Kyung, Yun, Seung

МПК / Мітки

МПК: C12N 5/10

Мітки: ссавців, клітин, високої, життєздатних, культури, отримання, щільності, спосіб

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/40-106047-sposib-otrimannya-visoko-shhilnosti-zhittehzdatnikh-klitin-v-kulturi-klitin-ssavciv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання високої щільності життєздатних клітин в культурі клітин ссавців</a>

Подібні патенти