Штам соматичних структур базидіального гриба amyloporia lenis ( karst.) bond. et sing. kb-92 (a-004) – продуцент протеолітичних ферментів

Завантажити PDF файл.

Текст

Штам соматичних структур базидіального гриба Amyloporia Lenis (Karst.) Bond. Et Sing. KB-92 (A-044) (зберігається в колекції чистих кльтур макроміцетів кафедри фізіології рослин Донецького державного університету (колекційний № А-044) та спеціалізованій колекції культур Інституту ботаніки ім. М. Холодного НАН України, м. Київ (ІВК) за колекційним номером 1026) – продуцент протеолітичних ферментів. (19) (21) 99063017 (22) 02.06.1999 (24) 15.02.2001 (33) UA (46) 15.02.2001, Бюл. № 1, 2001 р. (72) Бойко Михайло Іванович, Федотов Олег Валерійович, Негруцький Сергій Федорович, Стаднічук Володимир Михайлович, Агужен Яна Генадіївна (73) Донецький державний університет 34089 Найбільш близьким за технічною суттю і досяжності результату є штам базидіального гриба Coprinus domesticus (Fr.) Gray. BKMf 2459 Д – продуцент фібрінолітичних і тромболітичних ферментів. Відмічається, що ФП з гриба Coprinus domesticus має ТА - 145-2 год., ТА-636-550 од., ФА15 тис., ФгА-1:1024 од., МЗА-16,5 од/мг і КА-0,1 од. Не наводяться дані про токсичність і патогенність ФП. Застосований метод виділення тромболітичних ферментів потребує коштовний етанол і складне обладнання (аніонообмінник) [4]. В основу винаходу поставлено завдання отримання нового штаму соматичних структур базидіального дереворуйнівного гриба Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing. KB-92 (A-004)продуценту протеолітичних ферментів з порядку Aphillophorales, що здатний до біосинтезу екзоферментів широкого спектру дії на живильних середовищах, які не містять дефіцитних і коштовних компонентів (глюкоза, макро- і мікроелементи та ін.). Штам не патогенний до тварин. За рахунок цього може бути використаним у біотехнологічних виробництвах дешевих і безпечних промислових ферментних препаратів широкої протеолітичної дії, які використовуються у харчовій і фармакологічній промисловостях. Поставлене завдання вирішується тим, що інтродукований штам КВ-92 (А-004) ксилотрофа Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing – продуцент протеолітичних ферментів, виявляє значний рівень синтезу екзоферментів молокозсідальної дії у культурі на живильних середовищах, що складаються з дешевих та доступних компонентів (знехмілене пивне сусло, пептон, вода) [9]. Штам КВ-92 (А-004) базидіоміцета Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing. зберігається в колекції чистих культур макроміцетів кафедри фізіології рослин Донецького державного університету (колекційний №А-004) та спеціалізованій колекції культур Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, м. Київ (ІВК) за колекційним номером 1026. Отриманий штам КВ-92 (А-044) гриба Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing. має наступні характеристики. Культурно-морфологічні ознаки. Штам досліджували на сусло-агарі, глюкозокартопляному агарі, агарі Чапека-Докса; рідких глюкозо-пептонному, сусло-пептонному і мінеральному Чапека живильних середовищах. На сусло-агарі у чашках Петрі, 7-денна міцеліальна колонія гриба має круглу форму, повстиста з слабко вираженими концентричними колами. Гіфи гриба розростаються нерівномірно, відмічено добові зміни у рості, що викликає появу кіл. Колір колонії сніжно-білий, з віком (на25-30 добу) забарвлюється до біло-кремового. Субстрат не забарвлює. Край колонії щильно притулений до поверхні живильного середовища. Краще розвинуті субстратні гіфи. Зовнішня лінія колонії відторочина. Реверзум білий. На глюкозо-картопляному агаризованому середовищі колонія має вигляд, як і на сусло-агарі. На агарі Чапека-Докса культура гриба Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing складається головним чином з занурених субстратних гіф. Середня лінія швидкість росту міцелія на сусло-агарі у чашках Петрі при температурі 30±0,5°С становить 11,25±0,13; на глюкозо-картопляному агарі –10,76±0,15; на агарізованому середовищі Чапека-Докса –6,18±0,3 мм/добу. Температурний оптимум росту міцелію знаходиться в межах 2732°С. Утворення плодових тіл на застосованих середовищах культивування не спостерігається. Макроскопічні дослідження свідчать, що гіфи гриба гілчасті, звивисті, тісно сплітаються між собою. Гіфи мають стінки і перегородки, що добре спостерігаються. В міцелії віком до 5-ти діб пряжок немає. Повітряні гіфи тонше субстратних. Завдяки рясному, потужному розгалуженню субстратних гіф, їх щільності, міцелій має кожисту консистенцію. Гіфи інструктовані кристалами. Мінеральне середовище Чапека. Грибниця білого кольору, обрідна, павутиновидна. Повітря гіфи відсутні, субстратні – гілчасті, з перегородками. Середня лінійна швидкість росту міцелію при температурі 30±0,5°С становить 10,51±0,15 мм/добу. Колонія і субстрат не забарвлені. Спороносності не спостерігається. Ріст міцелію відмічали в інтервалі температур від 2° до 50°С. Температурний оптимум росту гриба Amyloporia lenis на агаризованих середовищах знаходиться в межах 27-32°С найбільш придатна для синтезу протеїназ. При 45°С. Температура культивування 30-32°С найбільш придатна для синтезу протеїназ. При 45°С ріст гриба різко зменшується до 0,25±0,1 мм/добу, а при 50°С-припиняється. На рідких глюкозо-пептонному і сусло-пептонному живильних середовищах штам КВ-92 (А044), при поверхневому способі культивування, утворює рівно розвинуті усі типи міцелію. Культуральний фільтрат не забарвлює. Фізіолого-біохімічні ознаки. Вивчався вплив різних джерел вуглецевого та азотного живлення на біосинтетичну і протеолітичну активність штаму. Встановлено, що утилізація моно-, ді- та полісахаридів протікає з різною швидкістю. Найвище накопичення біомаси спостерігається при вирощуванні гриба на ксилозі, крохмалі, щавлевій кислоті, фруктозі і глюкозі; дуже слабке на рамнозі, рафінозі і яблуневій кислоті. Ферментативна активність КФ не пов’язана з накопиченням штамом вегетивної маси. Високі рівні МЗА, ФА, ТА і КА відмічаються при вирощуванні гриба на ксилозі, мальтозі, крохмалі і фруктозі в віці культури 11-15 діб. При вирощуванні гриба Amyloporia lenis на живильних середовищах, що містили рамнозу, дульцит, рафінозу, сорбіт, яблуневу кислоту та інозит, протеолітична активність КФ не зареєстрована. Вивчення придатності неорганічного (амонійного і нітратного) та органічного (ферментативний пептон, сечовина, амінокислоти) азоту засвідчило, що тільки на середовищах з пептоном йде швидке ферментоутворення і накопичення біомаси. Приклад 1. Штам КВ-92 (А-004) Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing. отримано за методом, що звичайно застосовуються для одержання чистих культур макроміцетів, а саме вилученням “тканинних” ізолятів з свіжезібраних плодових тіл [7]. Плодові тіла гриба зібрані з куща вишні (Cerasus 2 34089 Штам цього таксону, в якості продуцента протеолітичних ферментів широкого спектру дії подається вперше. Штам та ферментний препарат, за проведеними попередніми дослідженнями не є токсичні що до тварин. Спороносності у культурі не спостерігається, що гарантує чистоту довкілля. За рахунок цього та встановленої здатності до синтезу протеолітичних ферментів, продуцент може бути використаним у біотехнологічних виробництвах ферментних препаратів широкого спектру дії. Джерела інформації. 1. А.с. 907070 СССР. Способ получения фибринолитического фермента / Фалина Н.Н., Денисова H-П, Петрищев Н.Н., Псурцева Н.В. Заявка N 2945300/28-13 от 24.06.80. М. кл. С 12 N 9/50, БИ N 7. 1982. 2. А.с. 1374778 СССР. Штамм соматических структур макромицета Муcеnа pura (Fr.) Кumm. продуцент молокосвертывающего фермента / Федорова Л.Н., Дроздова Т.Н., Низковская О.П., Чеботарев А.И- Заявка №39066/31 13 от 22.04.85. М. кл. С 12 № 9/54, А 23 С 19/02. БИ № 6. 1985. 3. А.с. І 395672 СССР. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата / Бойко М.И., Негруцкий С.Ф., Мирошниченко Т.В. Заявка №2945300/28-1З от 24.06.80, М.кл. С 12 №9/50, БИ № 18, 1988. 4. А.с. 1137762, А1 СССР. Штамм базидиального гриба Coprins domesticus (Fr.) Gray. BKMf 2459 D - продуцент фибринолитических и тромболитических ферментов / Денисова Н.П., Псурцева Н.В., Фалина Н.Н.Летрищев Н.Н.Киянов В.И. Заявка № 3642122/13 от 29.07.83, М.кл. С 12 № 15/00,9/50// (С 12 № 15/00,C 12 R 1:645), БИ № 29, 1991. (прототип). 5. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов / Под ред. О.П.Низковской. - Л.: Наука, 1979. - 72 с. 6. Белова Н.В., Ефремова И.Я. Препараты из высших грибов - объект патентно-правовой охраны // Микология и фитопатология. - 1992. - 26, вып. 4. - С. 321-324. 7. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. – К.: Наук. думка, 1988. – С. 144. 8. Патент № 6228 України. Штам Hirschioporus laricinus (Karst.) Ryv. М-81 -продуцент молокозсідального фермента / Бойко M.I., Негруцький С.Ф., Мірошніченко Т.В., Соболь М.А., Варенко Ю.С. Заявка № 3787001 від 18.05.84, М.кл. С 12 № 9/54. 9. Патент № 25528 А України. Штам соматичних структур макроміцету Amyloporia lenis (Karst-) Bond. et Sing. KB-92 (A-004) - продуцент молокозсідального фермента / Федотов О-В., Бойко M.І., Негруцький С.Ф. Заявка № 97010031 від 03.01.97. кл. С 12 № 9/58. A 23 С 19/032. 10. Соломко Э.Ф., Дудка И.А. Перспективы использования высших базидиомицетов в микробиологической промышленности // ВНИИСЭНТИ: Обзорная информация. сер.3. - М., 1985. - 48 с. 11. Фалина Н.Н. Выращивание зимнего опенка Flammulina velutipes (Fr.) Sing. для получения мицелия и протеолитических ферментов. В сб.: Производство высших съедобных грибов в СССР. – К.: Наук. думка, 1978. - С. 111-114. vulgaris L), мертвої гілки, у рекреаційній лісосмузі шахти ім. Засядько м. Донецьк. Чисту міцеліальну культуру штама підтримують шляхом пересівів через 5-6 місяців на агаризоване знехмілене пивне сусло (4° по Баллінгу), чи інші агаризоввані живильні середовища. Для визначення протеолітичної активності КФ, штам КВ-92 (А-004) вирощують на рідкому знехміленому пивному суслі (4° по Баллінгу), що містить 3 г/л ферментативного пептону. Кислотність середовища після стерилізації становить 4,4-4,6 рН. Культуру вирощують в колбах Ерленмейєра міткістю 250 мл з об’ємом середовища-50 мл, поверхнево, при температурі 30±0,5°С. Посівним матеріалом є 7-10 денна культура гриба, яка зростала на агаризованому живильному середовищу. Термін культиввування-30 діб, протеолітичну активність визначали на 5, 10, 15, 20, 25, 30 день росту. Виділення ферментного білку з культурального фільтрату ведуть фракціонуванням (NH4)2SO4 при 85% насиченні. Після повного осадження білку на протязі 24 годин при температурі 5-10°, осад видділяють рефрежераторними центрифугуванням при 5000 об/хв на протязі 10-15 хв. Осад діалізують проти дистильованої води при 5°С. Розчин фермента ліофільно сушать [3]. Вказану протеолітичну активність визначають за загальноприйнятими методами: ТА( в год) – за методом Імшенецького і Броцької, розрахунок в умовних одиницях – за Псурцевою і Денісовою; ФА – за методом Аструпа і Мюллертца; МЗА – методом Каваї і Мукаї, КА – за Нізковською [5,11,13]. Отримані результати свідчать, що штам КВ-92 (А-004) афілофорального дереворуйнівного гриба Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing. продукує в навколишне живильне середовище протеолітичні ферменти широкого спектру дії. Максимальні значення протеолітичної активності КФ в віці культури гриба 15-20 діб: МЗА-16000±496,1 од/мл, КА100од., ФА-878±17мм2, ТА-100од. І ГА-30од. Ферментний препарат, що був виділенний з КФ дослідженого штама після 15 діб культивування, мав МЗА-близько 1000000 од/г, КА-100од., ФА-96895 од/мг, ГА-30 од., ТА-100од. Приклад 2. Проведено дослідження токсичності штаму КВ-92 (А-004) і ферментного препарату гриба Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing. При одноразовому введенні білим мишам в шлунок у дозі 5000 мг/кг та внутрішньочеревно у дозі 950 мг/кг ФП, загальний стан тварин був задовільний, поведінка активна, апетит не змінювався. На протязі 30 діб після введення ні загибель, ні якихось ознак інтоксикації не спостерігалося. Отже, згідно класифікації гідролітичних ферментних препаратів мікробіологічного синтезу за ступенем безпеки, штам КВ-92 (А-044) гриба Amyloporia lenis (Karst.) Bond. еt Sing. та отриманий ФП можно віднести до безпечних ферментних препаратів (4 клас небезпеки). Таким чином, штам КВ-92 (А-004) афілофорального дереворуйнівного гриба Amyloporia lenis (Karst.) Bond. Et Sing. у порівнянні з прототипом – штамом ВКМf 2459 Д базидіального гриба Coprinus domesticus (Fr.) Gray. здатний до синтезу протеолітичних ферментів широкого спектру дії при культивуванні на доступних компонентах живильного середовища. 3 34089 12. Хайдарова Н.В., Егоров Н.С. Фибринолитические ферменты микроорганизмов. В кн.: Функциональная активность ферментов и пути ее регуляции. - M., 1981. - С. 155-166. 13. Kawai М., Mukai N. Studies of milk clotting enzimes prodused by Bsidiomysetes. 1. Screening test of Basidiomcetes for production of milk clottng enzimes // Argic. Biiol. Chem –1970. - 34. № 2. - Р. 159-163. __________________________________________________________ ДП "Український інститут промислової власності" (Укрпатент) Україна, 01133, Київ-133, бульв. Лесі Українки, 26 (044) 295-81-42, 295-61-97 __________________________________________________________ Підписано до друку ________ 2001 р. Формат 60х84 1/8. Обсяг ______ обл.-вид. арк. Тираж 50 прим. Зам._______ ____________________________________________________________ УкрІНТЕІ, 03680, Київ-39 МСП, вул. Горького, 180. (044) 268-25-22 ___________________________________________________________ 4

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

The strain of somatic structures of basidiomycete amyloporia lenis ( karst.) bond. et sing. kb-92 (a-004) the producer of proteolytic enzymes

Автори англійською

Boiko Mykhailo Ivanovych, Fedotov Oleh Valeriiovych, Nehrutskyi Serhii Fedorovych, Stadnichuk Volodymyr Mykhailovych, Anhuzhen Yana Hennadiivna

Назва патенту російською

Штамм соматических структур базидиального гриба amyloporia lenis ( karst.) bond. et sing. kb-92 (a-004) - продуцент протеолитических ферментов

Автори російською

Бойко Михаил Иванович, Федотов Олег Валериевич, Негруцкий Сергей Федорович, Стадничук Владимир Михайлович, Агужен Яна Геннадиевна

МПК / Мітки

МПК: A23C 19/032, C12N 9/50

Мітки: amyloporia, karst, протеолітичних, структур, базидіального, штам, kb-92, соматичних, sing, bond, lenis, продуцент, a-004, гриба, ферментів

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/4-34089-shtam-somatichnikh-struktur-bazidialnogo-griba-amyloporia-lenis-karst-bond-et-sing-kb-92-a-004-producent-proteolitichnikh-fermentiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Штам соматичних структур базидіального гриба amyloporia lenis ( karst.) bond. et sing. kb-92 (a-004) – продуцент протеолітичних ферментів</a>

Подібні патенти