Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата, предусматривающий по­верхностное культивирование продуцента Hirschioporus laricinus ВКПМ F-263 на глюкозо-пептонной питательной среде до достижения мак­симальной активности, отделение мицелия филь­трованием, осаждение фермента сернокислым ам­монием и очистку, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта и упро­щения процесса, фильтрат охлаждают до 4-5°С, осаждение ведут при 55-80%-ном насыщении, а очистку - сначала диализом против охлажденной дистилированной воды при 4-5°С, затем методом электрофореза в параллельных пластинах полиакриламидного геля.

Текст

Изобретение может быть использовано в пищевой промышленности для и з готовления твердых сыров. Цель изобретения - повышение активности целе вого продукта и упрощение процесса за счет использования активного продуцента штамма М-81 сапрофитного дерево разрушающего базидиального гриба Hirschioporus l a r i c i n u s ВКІШ F-263, культивируемого на глкжозопептонной среде, охлаждения ее до температуры 4-5°С, осаждения фермента сернокислым аммонием при 55-80%-ном насыщении с последующей его очисткой от низкомолекулярных веществ и белков, • не растворимых в воде, методом гтализа против охлажденной дистиллированной воды при температуре 4-5 С и дальнейшей очисткой фермента методом электрофореза в параллельных пластина ках полиакриламидного геля. Актив(О ность ферментного препарата 1700 000 ед/г. ••ч ІРПФ-К с 1 1395672 Изобретение относится к производству ферментных препаратов, в частности молокосвертывающего фермента, путем культивирования сапрофитного с дереворазрушающего базиднального гриба Hirschioporus laricinus (Karst.) RyU на жидкой питательной среде. Полученный ферментный препарат может быть использован в качестве замению теля сычужного фермента - реннина, при производстве твердых сыров. Белки, обладающие молокосвертывающей активностью, подвергают дальнейшей очистке с помощью метода электрофореза в параллельных пластинках полиакриламидного геля. Полученный водорастворимый белок вносят в количестве 0,1 мл в каждую ячейку верхнего геля. Их в приборе Д6, Для электрофоретического разделения белков используют 7,5^-гшй щелочной гель. В щелочном геле белки мигрируют к аноду, поэтому нижний электрод камеры подклюЦелью изобретения является повышечают к гнезду выпрямителя (УИП), ние активности целевого продукта и упрощение процесса. 15 имеющему знак шпос(+). Верхний электрод присоединяют к знаку минус (-). Способ состоит в следующем, В начале электрофореза, до вхождения ІЧтамм Hirschioporus laricinus ВКПМ индикаторной краски в разделяющий F-263 (М-81) культивируют на каждой гель, поддерживают ток 80 мА при напитательной среде следующего состава, пряжении 210 В. Затем повышают ток до г/л: 20 180 мА при напряжении 470 В. ЗаканчиГлюкоза • ' 10,0 вают фракционирование белков при подЛегстон ' 3,0 ходе индикаторной краски к нижнему краю разделяющего геля. "Электрофорез KH2PO4 0,6 длится примерно 3 ч. Затем сняв бокоMgSO4- 7Н г О 0,5 25 вые стекла прибора, срезают концентZnS04!'7H20 0,001 рирующий гель и вынимают из кювет 0,05 CaCU пластинки разделяющего геля. Для опДистиллированная вода до I л. ределения электрофоретической подвижПитательную среду разливают в коности молокосвертывающего фермента нические колбы и стерилизуют в авто- 30 отрезают три ячейки разделяющего геля клаве под давлением 1 атм в течение и фиксируют 7%-ным раствором трихлорАО мин. Кислотность среды после стеуксусной кислоты в течение 20 мин. рилизации составляет «4,5-5,5 рН. ЯоЗатем отмывают гель от трихлоруксуссевиой мицелий выращивают на агариной кислоты дистиллированной водой зированной глюкозокартофельнои среде, эс (трикды по 10 мин) и окрашивают в тесусло-агаре и на жидкой питательной чение ночи в 0,02%-ном растворе красреде. Инкубируют штамм М-81 в терсителя Кумасси ярко-голубой Г-250, мостате ТС-80М при 30°С. приготовленного в смеси этиловый спирт - вода - уксусная кислота Максимальная молокосвертывающая активность у ттаима М-81 на среде с 40 (10:30:1). Избыток красителя отмывают раствором, состоящим их этой ' же глюкозой наблюдается на 10-15 сут смеси растворителей. Отмытый от крароста, затем несколько снижается и к сителя гель используют для определе30 сут падает в 3 раза. ния относительной электрофоретичесОсаждение белков по фракциям из ^ кой подвижности зон молокосвертываюкультурального фильтрата осуществляют щего Фермента и служит эталоном для путем увеличения концентрации серновыявления локализации фермента в кислого аммония на 10%. Фракцию белпластинках геля, не подвергшихся фикка, выпавшую в осадок, отцентрифугисации и окраске красителем. Отмытый ровывают на рефрижераторной центригель накладывают на пластинки разде50 ляющего геля и отмечают место нахожфуге в течение 15 мин при U-5 С и подвергают первичной очистке с помодения зон молокосвертывающего ферменщью диализа против охлажденной диста, которые вырезают, объединяют^ затиллированной воды в холодильнике в мораживают и растирают в ступке. Растечение 18 ч. В качестве полупрони-" тертую массу заливают холодной дисцаемой мембраны используют целлафано- •*•* тиллированной водой для экстракции вую пленку, поры которой пропускают белков, которая длится в течение 2вещества с молекулярным весом до 3 ч. Затем гомогенат центрифугируют 7000-10000. 1395672 в центриЛуге (8000 об/мин) при 4-5* С и начинают отсчет времени, который в течение 15 мин. Надосадочную жидзаканчивают при появлении в пробирках кость сливают и подвергают лиофильплотного сгустка. Бремя, затраченное ной сушке. Полученный препарат имеет на образование сгустка, условно счивид поропіка светло-кремового цвета, тают молокосвертывающей активностью, хорошо растворимого в воде. Молоковыраженной в минутах.За единицу молосвертыварнцая активность этого препакосвертывающей активности принимают рата составляет 1700000 ед/г. количес тво фермента, необходимое для П р и м е р . Выращивание штамма 10 свертывания 100 мл молока за 40 мин М-81 осуществляют в конических колпри 35 С и рассчитывают по формуле, бах на 1 л, содержащих 300 мл сте40-100«К , М С А е Д / Г ралыгой глюкозопептонной среды с рН препарата ~ t~~H » 4,5-5,5 в термостате при 30 С поверхгде К - коэффициент разведения препаностным способом в течение 10 сут. рата фермента; 15 Культуральный Лильтрат отделяют от t - время, в течение которого из мицелия путем фильтрования через бу100 мл молока при добавлении мажный фильтр (синяя лента). Затем 1 мл, 0,1%-ного раствора ферфильтрат охлаждают в холодильнике до мента образуется плотный 4 С и осаждают сЬерментный препарат сгусток, мин; сернокислым аммонием. Молокосверты- 20 40 - среднее время свертывания мовающий фермент находится во фракции ' лока при производстве сыра, белка, осаждаемой от 55 до 80%-ного мин; насыщения фильтрата сернокислым аммооб - навеска ферментного препаранием. Выпавший в осадок белок цент25 та, в г. рифугируют и диализируют против охДля осаждения молокосвертывающего лажденной дистиллированной воды в хофермента из культурального фильтрата лодильнике в течение 18 ч. Затем диаиспользуют сернокислый аммоний^ облалиэируемую смесь переносят в центридающий стабилизирующим действием на фужную пробирку и центрифугируют при 30 ферменты и все операции по выделению 8000 об/мин в течение 15 мин. Полуи очистке молокосвертывающего препаченная надосадочная жидкость содеррата не требуют отрицательных низких жит молокосвертывающий фермент, котемператур. торый подвергают дальнейшей очистке Культуральный фильтрат штамма М-81 методом электрофореза в параллельных H i r s c h i o p o r u s l a r i c i n u s патогенными пластинах полиакриламидного геля. 35 токсичными свойствами по отношению к Надосадочную жидкость сливают и подбеспородным белым мышам обоего пола вергают лиосЬильной сушке. Полученный не обладает. препарат имеет вид порошка светлокоричневого цвета, хорошо раствории з о б р е т е н и я мого в воде. Молокосвертывающая ак- 40 Ф о р м у л а Способ получения молокосвертываютивность этого препарата составляет щего ферментного препарата, предус1700000 ед/г. матривающий поверхностное культивирование продуцента H i r s c h i o p o r u s l a r i Молокосвертывающая активность ферментного препарата определяют по ме- 45 c i n u s BKITM F-263 на глюкозопептонной питательной среде до достижения мактодике, предложенной Каваи и Нукай. сима ль но й ак тив но с ти, о тделение миДля этого в 100 мл натурального молоцелия фильтрованием, осаждение ферка вносят 1 мл 15%-ного раствора мента сернокислым аммонием и очистку, СаС1 а , тщательно перемешивают и доводят кислотность субстрата с помощью S0 о т л и ч а ю щ и й с я тем, ч т о , с 10%-ного раствора НС1 до 6,0-6,1 рН. целью повышения активности целевого Затем берут по 10 мл молока в пробирпродукта и упрощения процесса, фильтки и нагревают в водяной бане до рат охлаждают до 4-5 С, осаждение в е 35 С, После этого в каждую пробирку дут при 55-80%-ном насыщении» а очидобавляют 1 мл 0,1%-ного водного 55 С Т К У ~ сначала диализом против охлажраствора сЪерментного препарата. Смесь денной дистиллированной воды при 4 в пробирках встряхивают'и снова ста5 С, затем методом электрофореза в вят в водяную баню при 35°С. В мопараллельных пластинах полиакриламидмент встряхивания пускают секундомер ного г е л я . 1395672 Редактор Т.Лазоренко Составитель И.Привалова Техред Л.Сердюкова Корректор МЛопо Заказ 2468/27 Тираж 520 Подписное В И П Государственного комитета СССР НИИ по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. А/5 Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

A process for preparation of milk-coagulant ferment

Автори англійською

Boiko Mykhailo Ivanovych, Nehrutskyi Serhii Phedorovych, Miroshnychenko Tetiana Volodymyrivna

Назва патенту російською

Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата

Автори російською

Бойко Михаил Иванович, Негруцкий Сергей Федорович, Мирошниченко Татьяна Владимировна

МПК / Мітки

МПК: C12N 9/50

Мітки: препарата, ферментного, отримання, спосіб, молокозсідального

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/4-21964-sposib-otrimannya-molokozsidalnogo-fermentnogo-preparata.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання молокозсідального ферментного препарата</a>

Подібні патенти