Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Способ получения изолированных гепато­цитов, включающий перфузию печени солевым раствором, содержащим ЭДТА, дезагрегацию полученной ткани в сахарозной среде с помощью вибрации и выделение целевого продукта, отли­чающийся тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособных гепатоцитов, перфузию осущест­вляют однократно, а в качестве солевого раствора, содержащего ЭДТА, используют сахарозную среду при следующем количественном соотношении компонентов, г/л:

Сахароза                                70,0-100,0

Хлористый калий                 0,300-0,400

Хлористый магний              0,100-0,200

Фосфорнокислый калий      0,030-0,080

Фосфорнокислый натрий    0,050-0,100

ЭДТА                                                1,300-1,675

Трис-HCl буфер                    До 1 л .

Текст

Дивитися

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии к экспериментальной медицине. )\елъ изобретения - повышение выхода жизнеспособных гепато цитов. Способ включает однократную перфузию печени раствором, содержа- I щим ЭДТА, с последующей дезагрегацией ткани в сахарозной среде с помощью вибрации. Перфузию органа проводят в сахарозной среде, содержащей Э Т в концентрации 3,5-4,5 мМ, ДА при этом компоненты перфузионной среды берут в следующем соотношении, г/л: сахароза 70-100; хлористый калий 0,3-0,4; хлористый магний 0 , 1 0,2; фосфорнокислый калий 0,03-0,08; фосфорнокислый натрий 0 , 0 5 - 0 , 1 ; Э Т ДА 1,3-1,675, трис-HCl буфер (50 мМ) до 1 л . Выход от 520+40 до 6ООІ6О клеток на вес печени. 3 табл. Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в клеточной биологии и экспериментальной медицине. Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных гепатоцитов. Способ включает перфузию печени раствором, содержащим ЭДТА, с последующей дезагрегацией ткани в сахарозной среде с помощью вибрации, причем перфузию органа проводят в сахарозной среде, содержащей ЭДТА в концентрации 3,5-4,5 мМ, при этом компоненты среды берут в следующем соотношении , г /л: Сахароза /0,0-100,0 Хлористый калий 0,100-0,А')0 Хлористый магний 0,100-і),2,Ю Фосфор нокислыи калий Фосфор нокислыи натрий ЭДТА Трис-HCl буфер (50 мМ) 0,030-0,080 0,050-0,100 1,300-1,675 До 1 л П р и м е р 1. Перфузию печени животных весом 200-300 г проводят in v i v o . Для этого вскрывают брюшную полость анестезироваиных животных, вводят инъекционную иглу в в о ротную вену и закрепляют лигатурой, а нижнюю полую вену надсекают в месте ответвления правой почечной вены для оттока перЛузата. Перфузию проводят через систему переливания крови с использованием перистальтического иасо* са 0,15 М сахарозным раствором, с о держащим 4 м ЭДТА при следующем соотМ т 1-655109 їуфера, рН / , 4 : Сахароза Хлористый калии Фосфорнокислый калий 85,50 0,372 ,. 0,054 4 П р и м е р 3. Способ осуществля~і ют аналогично примеру 1, но перфузию проводят растворами, одни из которых) содержат минимально допустимые, а другие - максимально допустимые количества компонентов, г/л: Фосфорнокислый натрий 0,071 Хлористый магний 0,162 10 ЭДТА 1,400 Трис-HCl буфер (50 мМ) " До 1 л Д Нагретый до 40 С и аэрированный раствор пропускают через орган со ско~5 ростью 25 мл/мин в течение 15-20 мин (объем перфузата 500 м л ) . По окончания перфузии печень и з влекают из брюшной полости, измельчают ножницами и подвергают д е з а г р е г а - ?о ции с помощью вибрационного устройств а . Полученную суспензию фильтруют ч е р е з нейлоновый фильтр. Отделение жизнеспособных гепатоцитов or поврежденных проводят путем центрифугирова-25 ния первичной суспензии гепатоцитов в течение 5 мин при 1000 об/мин. Жизнеспособные гепатоциты располагаются в нижнем темном слое осадка, разрушенные КЛеТКИ СОСТаВЛЯЮТ верХНИН СВеТЛЬЙ J0 I II 70, 0 100,0 Сахароза 30 0 Хлористый калий 0,400 Хлористый магний , 100 0,200 Фосфорнокислый 0,030 0,080 калий Фосфорнокислый 0,050 натрий 0,100 1,225 ЭДТА 1,575 Трис-HCl буфер (50 мМ) До 1 л Результаты приведены в т а б л . 3 . Анализ данных т а б л . 3 с в и д е т е л ь ствует о том, что перфузия печени растворами, содержащими минимальные и максимальные количества компонент о в , обеспечивают возможность получения большого количества клеток с высокой морфо-функциональной а к т и в ностью. с л о й . После отделения и промывки жизнеспособных клеток нижнего слоя их переводят в среду хранения и подвергают морфо-функциональному анализу. Клетки характеризуются четким контуром плазматической мембраны, плотным 35 внутриклеточным матриксом желто-зеленоватого ц в е т а , характерным для живых клеток. В т а б л . 1 представлены морфо-функциональные характеристики гепатоцитов, „выделенных предлагаемым и известными способами. П р и м е р 2. Способ осуществляют аналогично примеру 1, но варьируют 45 концентрацию ЭДТА в перфузионной среде. Результаты представлены в табл. I Из табл. 2 видно, что оптимальная концентрация ЭДГА 3,5-4,5 мм, при жении концентрации ЗДТА в перфузионном растворе резко снижается количество получаемых клеток. Способ получения изолированных гепатоцитов, включающий перфузию п е ч е ни солевым раствором, содержащим ЭДТА, дезагрегацию полученной ткани в сахарозной среде с-помощью вибрации и выделение целевого продукта, о т л и ч а ю щ и й с я тем, ч т о , с ц е лью повышения выхода жизнеспособных гепатоцитов, перфузию осуществляют однократно, а в качестве солевого раствора, содержащего ЭДТА, используют сахарозную среду при следующем количественном соотношении компонентов, г/л: 70,0-100,0 Сахароза 0,300-0,400 Хлористый калий 0,100-0,200 Хлористый магний Фосфорнокислый 0,030-0,080 калий Фосфорнокислый 0,050-0,100 натрий 1,300-1,675 ЭДТА До 1 л Трис-HCl буфер Ф о р м у л а и з о б р е т е н и я 1655ГЇ9 Способ Показатель I предлагаемый Вес животного, г 200-300 Количество клеток на вес печени„ млн.кл. 553±60 Количество клеток на г печени, млн.кл. /3+8 Исключение трипанового синего, % 90+5 Уровень внеклеточной активности ЛДГ, % 10+3 Скорость эндогенного дыхания, н 0^/мин млн. кл. М 1/,3+0,3 Коэффициент стимуляции эндогенного дыхания сукцинатом 1»?5 Содержание АТФ, нМ/млн. клеток 25+5 известный РОО-300 26,3+4 91+2 15±2 17»1±->»2 U 33 22 Т а б л и ц а 2 Концентрация ЭДТА, мМ Показатель 3,5 Количество клеток на вес печени Mil И . КЛ . Исключение трипанового синего, % Уровень внеклеточной активности ЛДТ, % Скорость эндогенного дыхания, н О^/мин млн. кл. М Содержание АТФ, нМ/млн.кл. 52O±4O 9413 600±60 91** 10±2 12±3 17,3+0,3 25+5 • 17,1+0, 30+5 Т а б л и ц а З Показатель Соотношение компонентов минимальное Количество клеток на вес печени 520+40 Исключение трипанового синего, % 90+2 Уровень внеклеточной активности ЛДТ, X 11±2,0 Скорость эндогенного дыхания, н 02/мин М млн.кл. 16,8+2,1 Содержание АТФ, нМ/млн.кл. . 20,1+3,0 Редактор Л.Волкова | максимальное 600+60 91+3 12+2,4 17,'Н?,3 18,4+2,1 Составитель А.Маныкин Техред Л.Олийньос- Корректор С.Шекмар Заказ 2196/ДСП Тираж 221 Подписное Р И П Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ПСНТ СССР ЧИИ 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д . 4/5 Производственно-издательский комбинат "Патент", г.Ужгород, ул. Гагарина,101

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for preparation of isolated hepatocytes

Автори англійською

Kravchenko Lidia Petrivna, Andriienko Alla Mykolaivna, Semenchenko Olha Anatoliivna

Назва патенту російською

Способ получения изолированных гепатоцитов

Автори російською

Кравченко Лидия Петровна, Андриенко Алла Николаевна, Семенченко Ольга Анатолиевна

МПК / Мітки

МПК: C12N 5/00

Мітки: спосіб, здобуття, гепатоцитів, ізольованих

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/4-14080-sposib-zdobuttya-izolovanikh-gepatocitiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб здобуття ізольованих гепатоцитів</a>

Подібні патенти