Спосіб мікрометоду визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин

Номер патенту: 123097

Опубліковано: 12.02.2018

Автори: Рудь Олег Григорович, Кривошия Павло Юрійович

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб мікрометоду визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин, що включає отримання біомаси клітин, внесення клітин в пробірки з поживним середовищем та визначення їх придатності по формуванню моношару, який відрізняється тим, що використовують 96-лункові плашки та автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці.

Текст

Реферат: Спосіб мікрометоду визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин включає отримання біомаси клітин, внесення клітин в пробірки з поживним середовищем та визначення їх придатності по формуванню моношару. Використовуються 96-лункові плашки та автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці. UA 123097 U (12) UA 123097 U UA 123097 U 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Корисна модель належить до галузі біотехнології та ветеринарної вірусології, а саме культивування культур клітин, які необхідні як біологічний матеріал для репродукції вірусів, вивчення їх біологічних властивостей, ідентифікації, типізування та лабораторної діагностики захворювань тварин. Враховуючи значну роль вірусологічних досліджень в постановці остаточного діагнозу при тому чи іншому інфекційному захворюванні, оптимізація виробничого процесу, зменшення рівня його трудомісткості та скорочення витрат часу на вірусологічні дослідження ставить даний спосіб в ряд вагомих внесків в цій галузі ветеринарної медицини. Загальноприйнятим методом перевірки поживності середовищ (ГЛА, 199, Ігла, гемгідролізатів, лактгідролізатів) та сироватки великої рогатої худоби (ВРХ) при культивації клітин є проведення шляхом порівняння з відомими якісними зразками середовищ та сироваток. Придатність середовищ та сироваток оцінюють методом виключення, використовуючи різні схеми та комбінації, що дають можливість провести якісну оцінку їх поживності. Так середовище з 10 % сироваткою ВРХ повинно забезпечувати утворення моношару клітин в матрасах 3 впродовж 4-5 днів при посівній дозі 400-500 тис. клітин/см зі зміною середовища через добу культивування, якщо поживне середовище не відповідає даним вимогам, то воно є непридатним для подальшого використання при культивації клітин. У загальноприйнятий технологічний процес перевірки середовищ та сироваток входить отримання суспензії клітин. Так з культивованої тридобової перещеплюваної культури трахеї теляти в скляних матрацах на поживному середовищі, в склад якого входить 45 % середовище 199, 45 % середовище Ігла та 10 % сироватка крові великої рогатої худоби при температурі +37 °C з сформованим моношаром зливають поживне середовище і одночасно заливають диспергуючим розчином версену і витримують в термостаті при температурі +37 °C впродовж 15-20 хвилин до появи перших ознак відокремлення клітин від поверхні скла. Після чого версен обережно зливають з матраців і заливають таким об'ємом розчину Ерла без індикатора фенолового червоного, який би лише покрив моношар клітин, що становить 10 % від об'єму поживного середовища, що використовується при культивації культури клітин. При струшуванні матраців, клітини відокремлюються від поверхні скла і переходять в розчин Ерла. З матраців відбираються проби суспензій клітин в стерильних умовах і переносяться в кювети з робочою довжиною 5 мм, та визначається оптична густина проб проти контролю (контроль - дистильована вода) за довжини хвилі 450 нм. Після встановлення оптичної густини проб проводять визначення концентрації клітин в пробах по калібровочному графіку, де по осі абсцис відмічено різний рівень оптичної 3 густини проб, а по осі ординат відповідно оптичній густині проб - концентрація клітин в 1 см . 3 Після визначення концентрації клітин та отримання посівної дози 400-500 тис. клітин/см 3 шляхом розведення, суспензію клітин переносять у пробірки в об'ємі 0,5 см та додають в тому ж об'ємі дослідні поживні середовища та сироватки, що перевіряються, а також ставлять контроль в якому використовують середовища, ,які мають досить хороші ростові якості. Пробірки витримують в термостаті при температурі +37 °C впродовж 6-7 днів та періодично ведуться спостереження за ростом клітин. Так при формуванні моношару клітин в контрольних пробах проводиться аналіз по усіх інших. Якщо при використанні дослідних середовищ сформовано моношар впродовж того ж строку, що і контрольних, та встановлюють висновок про їх придатність до культивації клітин, або непридатність, якщо клітини взагалі не сформували моношар або формування було частковим (Лабораторные исследования в ветеринарии. Бактериальные инфекции: Справочник /Сост. Б.И. Антонов, В.В. Борисова. П.М. Волкова и др.; Под. ред. Б.И. Антонова. - М: Агропромиздат, 1986. – 352 с. Посібник з медичної вірусології /за ред. В.М. Гиріна. - Київ: Здоров'я, 1995. - 367 с. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник //В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: Агропромиздат, 1991. 527 с.). Недоліком цього способу є те, що для його застосування він потребує значної кількості компонентів, посуду, що перешкоджає більш широкій перевірці середовищ для культивації клітин та ефективному проведенню вірусологічних досліджень. В основу корисної моделі поставлено задачу розробити спосіб, який досить суттєво зменшить витрати реагентів, час, трудомісткість праці та полегшить перевірку середовищ для культивації клітин. Поставлена задача вирішується таким чином, що спосіб мікрометоду визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин, що включає отримання суспензії клітин, висів їх оптимальної концентрації на пробірки та додавання дослідних поживних середовищ, який відрізняється тим, що для визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин використовують 96-лункові плашки та автоматичні дозатори зі змінними 1 UA 123097 U 5 10 15 20 наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці, а також дає змогу більш ефективно проводити вірусологічні дослідження. Спосіб постановки мікрометоду визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин, здійснюється наступним чином: клітини, вирощені в матрацах, знімають з використанням 0,02 % розчину версену, підігрітого до 37 °C впродовж 10-15 хвилин. Після 3 визначення концентрації клітин та отримання посівної дози 400-500 тис. клітин/см шляхом 3 розведення, суспензію клітин переносять у лунки 96-лункової плашки в дозі 0,1 см . Після чого в кожну лунку додають в тому ж об'ємі дослідні поживні середовища та сироватки, що перевіряються, а також контрольні середовища, які мають досить хороші ростові якості. Плашку з клітинами поміщають в пристрій для культивації клітин (Патент. № 67895 Україна, МПК G01 N33/00, № u201109473. Заявлено 28.07.2011; Опубл. 12.03.2012; Бюл. № 5), а потім в термостат при температурі +37 °C. Облік формування моношару клітин проводять щодня впродовж 7 діб, шляхом перегляду під малим збільшенням мікроскопа. Після формування моношару клітин в контрольних пробах проводиться аналіз по усім іншим, та ставлять висновок про придатність поживних середовищ для культивації клітин. Експериментальні дослідження, проведені в лабораторії дослідної станції епізоотології IBM HAAH, показали, що розроблений спосіб визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин є досить ефективним та не є трудомістким. Користуючись ним, можна проводити масові дослідження по оцінці якості середовищ із значною економією часу та реагентів. Запропонований спосіб знайде застосування у біотехнологічних лабораторіях ветеринарної медицини та науково-дослідних установах. ФОРМУЛА КОРИСНОЇ МОДЕЛІ 25 Спосіб мікрометоду визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин, що включає отримання біомаси клітин, внесення клітин в пробірки з поживним середовищем та визначення їх придатності по формуванню моношару, який відрізняється тим, що використовують 96-лункові плашки та автоматичні дозатори із змінними наконечниками для зменшення витрат реагентів, часу та праці. 30 Комп’ютерна верстка Л. Литвиненко Міністерство економічного розвитку і торгівлі України, вул. М. Грушевського, 12/2, м. Київ, 01008, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 2

Дивитися

Додаткова інформація

МПК / Мітки

МПК: C12N 5/00

Мітки: середовищ, придатності, клітин, мікрометоду, визначення, спосіб, культивації, поживних

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/4-123097-sposib-mikrometodu-viznachennya-pridatnosti-pozhivnikh-seredovishh-dlya-kultivaci-klitin.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб мікрометоду визначення придатності поживних середовищ для культивації клітин</a>

Подібні патенти