Композиції та способи, призначені для спрямованого впливу антитіл на білок с5 системи комплементу

Реферат: Винахід належить до галузі медицини і стосується виділеного моноклонального антитіла або його антигензв'язуючого фрагмента, що включає: (і) CDR1 важкого ланцюга, яка має послідовність SEQ ID NО: 1, CDR2 важкого ланцюга, яка має послідовність SEQ ID NO: 2, та CDR3 важкого ланцюга, яка має послідовність SEQ ID NO: 3; i (іі) CDR1 легкого ланцюга, яка має послідовність SEQ ID NО: 4, CDR2 легкого ланцюга, яка має послідовність SЕQ ID NO: 5, та CDR3 легкого ланцюга, яка має послідовність SEQ ID NО: 6, яке/який зв'язується з білком С5 UA 105009 C2 (12) UA 105009 C2 -10 людини з KD, що становить 10 М або менше. Винахід також стосується застосування вказаного антитіла, фармацевтичних композицій, виділеної нуклеїнової кислоти, вектора, клітини-хазяїна та способів лікування. UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 1. Введення Цей винахід відноситься до антитіл, що чинять спрямований вплив на білок С5 системи комплементу, і до композицій, що їх містять, і способів їх застосування. 2. Передумови створення винаходу Основна роль комплементу, який являє собою частину вродженої імунної системи, полягає в захисті хазяїна. Система комплементу забезпечує захист від бактеріальної інфекції, обумовлює адаптивний і вроджений імунітет і усуває імунні комплекси та продукти, що утворюються при запальному ушкодженні. Захисні функції здійснюються біологічно активними продуктами, що утворюються в процесі активації комплементу, вони виявляють опсонізуючу дію на збудників інфекції, підсилюють запалення або лізують чутливі мішені (Marzari та ін. Eur J Immunol 32, 2002, сс. 2773-2782). Система комплементу складається приблизно з 25-30 плазмових білків, які важливі для імунної системи. Каскад комплементу активується щонайменше трьома основними шляхами. Класичний шлях, як правило, активується імунними комплексами, альтернативний шлях може активуватися незахищеними агентами клітинної поверхні, а шлях, заснований на пектині, що зв'язує манозу (MBL) (лектиновий шлях), ініціюється зв'язуванням MBL з вуглеводами клітинної поверхні (Trendelenburg, Swiss Med Wkly 137, 2007, сс. 413-417). Усі три шляхи приводять до розщеплення C5 за допомогою C5-конвертази. Результатом цього розщеплення є вивільнення C5a-фрагменту, який являє собою молекулу, що має високу протизапальну активність, і C5b, який ініціює мембраноатакуючий комплекс (MAC). Після вивільнення продукти комплементу не диференціюють "чужі" і "свої" мішені і при відсутності точної регуляції часто викликають значне ушкодження нецільових клітин і тканин у клінічних умовах, пов'язане з необмеженою активацією комплементу (Marzari та ін., 2002). C5 експресується всередині клітин у вигляді одного пептиду, що складається з 1676 амінокислот, про-C5, який включає сигнальну послідовність, що складається з 18 залишків, і багату Arg лінкерну послідовність (RPRR), розташовану між зрілим N-кінцевим β-ланцюгом і Cкінцевим α-ланцюгом. Зрілий C5 має молекулярну масу приблизно 190 кДа і складається з двох поліпептидних ланцюгів (α, 115 кДа і β, 75 кДа), які зв'язані дисульфідними містками. C5конвертаза здійснює розщеплення C5 між залишками 74 і 75 альфа-ланцюга і приводить до вивільнення пептиду, що складається з 74 амінокислот, C5a і C5b-фрагменту, який потім включається в мембраноатакуючий комплекс (MAC). Дегенерація жовтої плями являє собою медичний стан, який зустрічається головним чином у старих людей, при якому центральна частина вистілки ока, відома як область жовтої плями сітківки, товщає, атрофується, і який в деяких випадках приводить до крововиливу. Це може приводити до втрати центрального зору, що викликає нездатність розрізняти дрібні деталі, читати або розрізняти обличчя. Патогенез формування нових хороїдальних судин вивчений недостатньо, але, імовірно, при цьому важливу роль відіграють такі фактори, як запалення, ішемія і локальне вироблення ангіогенних факторів. Незважаючи на наявність сучасних шляхів лікування захворювань і порушень, асоційованих з класичним або альтернативним шляхами активації комплементу, зокрема вікової дегенерації жовтої плями (AMD), усе ще зберігається необхідність у виявленні специфічних мішеней, які дозволяють розробляти варіанти ефективного і легко стерпного лікування. 3. Короткий виклад суті винаходу Цей винахід відноситься до виділених молекул, що зв'язують білок C5 системи комплементу (наприклад, до C5-зв'язувальних антитіл або їх антигензв'язувальних фрагментів), фармацевтичних композицій, які містять зазначеним молекули, способів одержання зазначених молекул і композицій і способів їх застосування. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіло 7 -1 відрізняється тим, що для нього константа афінності (KA) становить щонайменше 1 × 10 M , 8 -1 9 -1 10 -1 11 -1 10 M , 10 M , 10 M або 10 M . Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5 та інгібують альтернативний шлях системи комплементу, при цьому значення IC 50 за даними аналізу на гемолітичну активність in vitro становить від приблизно 20 до приблизно 200пМ. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5 і перехресно конкурують з антитілом, представленим нижче в таблиці 1. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які зв'язуються з тим же самим епітопом білка C5, що й антитіло, представлене нижче в таблиці 1. 1 UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою виділені моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з білком C5. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою виділені людські або гуманізовані моноклональні антитіла, які специфічно зв'язуються з білком C5. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою виділені химерні антитіла, які специфічно зв'язуються з білком C5. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, містять константну область людського важкого ланцюга і константну область людського легкого ланцюга. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де зазначені антитіла являють собою одноланцюгові антитіла. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою Fab-фрагменти. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, являють собою scFv. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються як з людським C5, так і з C5 макакикрабоїда (яванский макак). У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла, запропоновані у винаході, відносяться до ізотипу IgG. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які містять каркасну ділянку, у якій амінокислоти замінені на амінокислоти каркасної ділянки антитіла з відповідних послідовностей VH або VL людської зародкової лінії. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять щонайменше одну послідовність гіперваріабельної ділянки (CDR), яка щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 49, 50, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 77, 78, 89, 95, 101, 107, 113, 119, 120, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 173, 174, 175, 176, 177, 178, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 209, 226, 235, 236, 237, 238, 239 або 240. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять щонайменше одну послідовність CDR важкого ланцюга, який ідентичний послідовності, представленій в SEQ ID NO: 1, 2, 3, 17, 18, 19, 33, 34, 35, 49, 61, 62, 63, 77, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 131, 133, 145, 146, 147, 159, 160, 161, 173, 174, 175, 195, 196, 197, 226, 235, 236 або 237. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять щонайменше одну послідовність CDR легкого ланцюга, який ідентичний послідовності, представленій в SEQ ID NO: 4, 5, 6, 20, 21, 22, 36, 37, 38, 50, 64, 65, 66, 78, 89, 101, 120, 134, 135, 136, 148, 149, 150, 162, 163, 164, 176, 177, 178, 198, 199, 200, 209, 238, 239 або 240. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять CDR1 важкого ланцюга, послідовність якого обрана із групи, що включає SEQ ID NO: 1, 17, 33, 61, 131, 145, 159, 173, 195 і 235; CDR2 важкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 2, 18, 34, 49, 62, 77, 95, 107, 113, 119, 132, 146, 160, 174, 196, 226 і 236; і CDR3 важкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 3, 19, 35, 63, 133, 147, 161, 175, 197 і 237. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять CDR1 легкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 і 238; CDR2 легкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 і 239; і CDR3 легкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 і 240. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять CDR1 легкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 4, 20, 36, 64, 134, 148, 162, 176, 198 і 238; CDR2 легкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 5, 21, 37, 65, 135, 149, 163, 177, 199 і 239; і CDR3 легкого ланцюга, послідовність якого обрана з групи, що включає SEQ ID NO: 6, 22, 38, 50, 66, 78, 89, 101, 120, 136, 150, 164, 178, 200, 209 і 240. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх 2 UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якої щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 або 281. У деяких варіантах здійснення винаходу зазначені антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти містять також варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якої щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 і 289. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якої щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 і 289. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять важкий ланцюг, послідовність якого щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 9, 25, 41, 53, 69, 81, 97, 109, 115, 123, 139, 153, 167, 181, 189, 203, 212, 220, 229, 243, 249, 254, 258, 274, 278 або 282. У деяких варіантах здійснення винаходу зазначений антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти містять також легкий ланцюг, послідовність якого щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 або 290. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є виділені моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти, які специфічно зв'язуються з білком C5, де антитіла містять легкий ланцюг, послідовність якого щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 10, 26, 42, 54, 70, 82, 91, 103, 124, 140, 154, 168, 182, 190, 204, 213, 221, 230, 244, 251, 262, 266, 270, 286 або 290. Цей винахід відноситься також до фармацевтичних композицій, які містять одну або декілька C5-єднальних молекул, запропонованих у винаході (наприклад, антитіл, що зв'язуються з C5, або їх антигензв'язувальних фрагментів) і фармацевтично прийнятний носій. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є нуклеїнові кислоти, які містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить варіабельну область важкого ланцюга, послідовність якої щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 7, 23, 39, 51, 67, 79, 96, 108, 114, 121, 137, 151, 165, 179, 187, 201, 210, 218, 227, 241, 253, 257, 273, 277 або 281. Деякими варіантами здійснення цього винаходу є нуклеїнові кислоти, які містять нуклеотидну послідовність, що кодує поліпептид, який містить варіабельну область легкого ланцюга, послідовність якої щонайменше на 90 %, 95 %, 97 %, 98 % або щонайменше на 99 % ідентична послідовності, представленій в SEQ ID NO: 8, 24, 40, 52, 68, 80, 90, 102, 122, 138, 152, 166, 180, 188, 202, 211, 219, 228, 242, 261, 265, 269, 285 або 289. Цей винахід відноситься також до векторів і клітин-хазяїв, які містять зазначені нуклеїнові кислоти. Одним з варіантів здійснення цього винаходу є виділені клітини-хазяї, які містять (1) сегмент рекомбінантної ДНК, що кодує важкий ланцюг антитіл, запропонованих у винаході, і (2) другий сегмент рекомбінантної ДНК, що кодує легкий ланцюг антитіл, запропонованих у винаході; де зазначені ДНК-сегменти функціонально пов'язані з першим і другим промотором відповідно і мають здатність експресуватися в зазначеній клітині-хазяїні. Іншим варіантом здійснення цього винаходу є виділені клітини-хазяї, які містять сегмент рекомбінантної ДНК, що кодує важкий ланцюг і легкий ланцюг антитіл, запропонованих у винаході, відповідно, де зазначений ДНК-сегмент функціонально пов'язаний з промотором і має здатність експресуватися в зазначеній клітині-хазяїні. У деяких варіантах здійснення винаходу клітинихазяї являють собою клітинну лінію ссавця крім людини. У деяких варіантах здійснення винаходу антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти являють собою людські моноклональні антитіла або їх антигензв'язувальні фрагменти. Цей винахід відноситься також до способів лікування або діагностики з використанням C5зв'язувальних молекул (наприклад, антитіл, що зв'язуються з C5, або їх антигензв'язувальних фрагментів), запропонованих у винаході. Одним з варіантів здійснення цього винаходу є способи лікування вікової дегенерації жовтої плями, що полягають у тому, що вводять індивідууму, який потребує цього, в ефективній кількості композицію, яка містить запропоноване/запропонований у винаході антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент. 3 UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іншим варіантом здійснення цього винаходу є способи лікування захворювання, що полягають у тому, що вводять індивідуумові, який потребує цього, в ефективній кількості композицію, яка містить запропоноване/запропонований у винаході антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент, де хвороба являє собою астму, артрит, аутоімунне захворювання серця, розсіяний склероз, запальне захворювання кишечника, ушкодження, викликані ішемією-реперфузією, синдром Барракера-Сімонса, гемодіаліз, системний вовчак, системний червоний вовчак, псоріаз, трансплантацію, хворобу Альцгеймера, гломерулонефрит або мембранопроліферативний гломерулонефрит (MPGN II). Цей винахід відноситься також до способів лікування пароксизмальної нічної гемоглобінурії (PNH), що полягають у тому, що вводять індивідуумові, який потребує цього, в ефективній кількості композицію, яка містить запропоноване/запропонований у винаході антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент. Цей винахід відноситься також до способів полегшення симптому, асоційованого зі штучним кровообігом, що полягає у тому, що вводять індивідуумові, який потребує цього, в ефективній кількості композицію, яка містить запропоноване/запропонований у винаході антитіло або його антигензв'язувальний фрагмент. 3.1 Визначення Якщо не зазначено інше, то всі технічні і наукові поняття, що застосовуються в контексті цього опису, мають значення, які добре відомі звичайним фахівцям в галузі, до якої відноситься винахід. Поняття "антитіло" у контексті цього опису включає повні антитіла і будь-який їх антигензв'язувальний фрагмент (тобто "антигензв'язувальна ділянка") або їх одноланцюгові варіанти. "Антитіло", що зустрічається в природних умовах, являє собою глікопротеїн, який містить щонайменше два важкі (H) ланцюги і два легкі (L) ланцюги, зв'язані між собою дисульфідними містками. Кожний важкий ланцюг складається з варіабельної області важкого ланцюга (скорочено позначена в контексті цього опису як VH) і константної галузі важкого ланцюга. Константна область важкого ланцюга складається з трьох доменів, тобто CH1, CH2 і CH3. Кожний легкий ланцюг складається з варіабельної області легкого ланцюга (скорочено позначена в контексті цього опису як VL) і константної області легкого ланцюга. Константна область легкого ланцюга складається з одного домена, тобто CL. VH- і VL-області можна додатково підрозділяти на галузі гіперваріабельності, які називають гіперваріабельними ділянками (CDR), які перемежовуються з більш консервативними ділянками, які називають каркасними ділянками (FR). Кожна VH і VL складається з трьох CDR і чотирьох FR, які розташовані в напрямку від амінокінця до карбоксильного кінця в наступному порядку: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Варіабельні області важких і легких ланцюгів містять зв'язувальний домен, який взаємодіє з антигеном. Константні галузі антитіл можуть опосередковувати зв'язування імуноглобуліну з тканинами або факторами хазяїна, у тому числі з різними клітинами імунної системи (наприклад, ефекторними клітинами) і першим компонентом (Clq) класичної системи комплементу. Поняття "антигензв'язувальна ділянка" антитіла в контексті цього опису відноситься до одного або декількох фрагментів інтактного антитіла, які зберігають здатність специфічно зв'язуватися з цим антигеном (наприклад, З5). Антигензв'язувальні функції антитіла можуть здійснюватися фрагментами інтактного антитіла. Прикладами зв'язувальних фрагментів, що підпадають під поняття "антигензв'язувальна ділянка" антитіла, є Fab-фрагмент, одновалентний фрагмент, що складається з VL-, VH-, CL- і CH1-доменів; F(ab)2-фрагмент, двовалентний фрагмент, що складається з двох Fab-фрагментів, зв'язаних дисульфідним містком в шарнірній області; Fd-фрагмент, що складається з VH- і CH1-доменів; Fv-фрагмент, що складається з VL- і VH-доменів одного плеча антитіла; dAb-фрагмент (Ward та ін., Nature 341, 1989, сс. 544-546), який складається з VH-домена; і виділена гіперваріабельна ділянка (CDR). Крім того, незважаючи на те, що два домена Fv-фрагменту, тобто VL і VH, кодуються різними генами, їх можна з'єднувати за допомогою методів рекомбінації штучним пептидним лінкером, який дозволяє створювати з них один білковий ланцюг, у якому пари VL- і VH-областей формує одновалентні молекули (відомі за назвою одноланцюговий Fv-фрагмент (scFv); див., наприклад, Bird та ін., Science 242, 1988, сс. 423-426; і Huston та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1988, сс. 58795883). Такі одноланцюгові антитіла включають одну або декілька "антигензв'язувальних ділянок" антитіла. Зазначені фрагменти антитіла одержують за допомогою загальноприйнятих методів, відомих фахівцям у цій галузі, і фрагменти піддають скринінгу відносно можливості їх застосування, аналогічного застосуванню інтактних антитіл. Антигензв'язувальні ділянки можна включати також в антитіла, що містять один домен, макситіла, мінітіла, інтратіла, диантитіла (димерні) антитіла, тримерні антитіла, тетрамерні 4 UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 антитіла, v-NAR і біс-scFv (див., наприклад, Hollinger і Hudson, Nature Biotechnology, 23, 9, 2005, сс. 1126-1136). Антигензв'язувальні ділянки антитіл можна трансплантувати у каркаси, основою яких є поліпептиди, такі як фібронектин типу III (Fn3) (див. US 6703199, у якому описані моноантитіла, основою яких є поліпептид фібронектину). Антигензв'язувальні ділянки можна також включати в одноланцюгові молекули, які містять пару розташованих у формі тандема Fv-сегментів (VH-CH1-VH-CH1), які у комбінації з комплементарними поліпептидами легкого ланцюга формують пару антигензв'язувальних областей (Zapata та ін., Protein Eng. 8(10), 1995, сс. 1057-1062; і US 5641870). У контексті цього опису поняття "афінність" відноситься до сили взаємодії між антитілом і антигеном в одному з антигензв'язувальних центрів антитіла. У кожному антигензв'язувальному центрі варіабельна область "плеча" антитіла взаємодіє за допомогою слабких нековалентних сил з антигеном у численних сайтах; чим сильніше взаємодія, тим сильніше афінність. У контексті цього опису поняття "авідність" відноситься до інформативного критерію загальної стабільності або сили комплексу антитіло-антиген. Вона контролюється трьома основними факторами: афінність антитіла до епітопy; валентність і антигену, і антитіла; і структурна організація взаємодіючих ділянок. Ці три фактори визначають в остаточному підсумку специфічність антитіла, тобто ймовірність того, що конкретне антитіло буде зв'язуватися з точним антигенним епітопом. Поняття "амінокислота" відноситься до синтетичних амінокислот, що зустрічаються в природних умовах, а також до амінокислотних аналогів і амінокислотних міметиків, які функціонують аналогічно амінокислотам, що зустрічаються в природних умовах. Амінокислоти, що зустрічаються в природних умовах, являють собою амінокислоти, що кодуються генетичним кодом, а також амінокислоти, які згодом модифікують, наприклад, гідроксипролін, γкарбоксиглутамат і O-фосфосерин. Поняття "амінокислотні аналоги" відноситься до сполук, які мають таку ж основну хімічну структуру, що й амінокислота, що зустрічається в природних умовах, тобто мають зв'язаний з атомом водню атом вуглецю в альфа-положенні, карбоксильну групу, аміногрупу і R-групу, наприклад гомосерин, норлейцин, метіонінсульфоксид і метіонінметилсульфоній. Такі аналоги несуть модифіковані R-групи (наприклад, норлейцин) або модифіковані пептидні каркаси, але зберігають таку ж основну хімічну структуру, що й амінокислота, що зустрічається в природних умовах. Поняття "амінокислотні міметики" відноситься до хімічних сполук, які мають структуру, відмінну від загальної хімічної структури амінокислоти, але які функціонують аналогічно амінокислоті, що зустрічається в природних умовах. Поняття "специфічність зв'язування" у контексті цього опису відноситься до здатності індивідуального антигензв'язувального центру антитіла взаємодіяти тільки з однією антигенною детермінантою. Антигензв'язувальний центр антитіла локалізований в Fab-фрагменті молекули і складається з гіперваріабельних ділянок важкого і легкого ланцюгів. Афінність зв'язування антитіла відноситься до сили взаємодії між однією антигенною детермінантою і одним антигензв'язувальним центром антитіла. Вона являє собою суму сил притягання і відштовхування, що виникають між антигенною детермінантою та антигензв'язувальним центром антитіла. Специфічне зв'язування двох субстанцій означає, що зв'язування характеризується 7 -1 8 -1 9 -1 10 -1 константою рівноваги (KA), що становить щонайменше 1 × 10 M , 10 M , 10 M , 10 M або 11 -1 10 M . Поняття "специфічно (або вибірково) зв'язується" з антитілом (наприклад, C5зв'язувальним антитілом) відноситься до реакції зв'язування, яку можна оцінювати в присутності спорідненого антигену (наприклад, C5 людини або C5 макаки-крабоїда) у гетерогенній популяції білків та інших біологічних субстанцій. Крім зазначеної вище константи рівноваги (K A) зв'язування з C5 антитіла, запропонованого у винаході, як правило, характеризується також -2 -1 -3 -1 -4 константою швидкості дисоціації (Kd), що становить приблизно 1 × 10 с , 1 × 10 с , 1 × 10 с 1 -4 -1 , 1 × 10 с або менше, і афінністю до зв'язування з C5, що перевищує принаймні в 2 рази афінність до зв'язування з неспецифічним антигеном (наприклад. C3, C4, БСА). Поняття "антитіло, що розпізнає антиген" і "антитіло, специфічне відносно антигену" у контексті цього опису використовують взаємозамінно з поняттям "антитіло, яке специфічно зв'язується з антигеном". "Химерне антитіло" являє собою молекулу антитіла, у якій (а) константна область або її частина змінена, замінена або рекомбінована так, що антигензв'язувальний центр (варіабельна область) пов'язаний з константною областю молекули іншого або зміненого класу, ефекторною функцією і/або різновидами, або із зовсім іншою молекулою, яка надає нові властивості химерному антитілу, наприклад, з ферментом, токсином, гормоном, фактором росту, лікарським засобом і т.д.; або (б) варіабельна область або її частина змінена, замінена або рекомбінована 5 UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 з утворенням варіабельної області, що має іншу або змінену антигенну специфічність. Наприклад, мишаче антитіло можна модифікувати, заміняючи його константну область на константну область з людського імуноглобуліну. Завдяки заміні на людську константну область химерне антитіло може зберігати свою специфічність відносно розпізнавання антигену, маючи при цьому меншу антигенність для людини у порівнянні з вихідним мишачим антитілом. Поняття "білок C5 (системи) комплементу" або "С5" застосовують взаємозамінно, і воно відноситься до білка C5 з різних видів. Наприклад, людський C5 має послідовність, яка представлена в SEQ ID NO: 296, C5 макаки-крабоїда (Macaca fascicularis) має послідовність, представлену в SEQ ID NO: 297 (див. таблицю 1). Людський C5 можна одержувати від фірми рQuidel (каталожний № A403). C5 макаки-крабоїда можна одержувати згідно з методом, проілюстрованим нижче в розділі "Приклади". Поняття "консервативний модифікований варіант" відноситься як до амінокислотних, так і до нуклеотидних послідовностей. Відносно конкретних нуклеотидних послідовностей поняття "консервативно модифіковані варіанти" відноситься до таких нуклеїнових кислот, які кодують ідентичні або практично ідентичні амінокислотні послідовності, або у випадку, коли нуклеїнова кислота не кодує амінокислотну послідовність, до практично ідентичних послідовностей. Через виродженості генетичного коду будь-який конкретний білок кодується більшою кількістю функціонально ідентичних нуклеїнових кислот. Наприклад, кодони GCA, GCC, GCG і GCU усі кодують амінокислоту аланін. Таким чином, у кожному положенні, у якому аланін кодується кодоном, кодон можна заміняти на будь-які відповідні відомі кодони без зміни поліпептиду, що кодується. Такі варіанти нуклеїнової кислоти є "мовчазними варіаціями", які являють собою один з видів консервативно модифікованих варіантів. У контексті цього опису мається на увазі, що кожна нуклеотидна послідовність, яка кодує поліпептид, включає також усі можливі мовчазні варіації нуклеїнової кислоти. Фахівцеві в цій галузі повинно бути очевидно, що кожний кодон нуклеїнової кислоти (за винятком AUG, який, як правило, є єдиним кодоном метіоніну, і TGG, який, як правило, є єдиним кодоном триптофану) можна модифікувати з одержанням функціонально ідентичної молекули. Таким чином, для кожної описаної послідовності мається на увазі кожна мовчазна варіація нуклеїнової кислоти, яка кодує поліпептид. Відносно поліпептидних послідовностей "консервативно модифіковані варіанти" включають індивідуальні заміни, делеції або додавання в поліпептидну послідовність, які приводять до заміни амінокислоти на хімічно подібну амінокислоту. Перелік консервативних замін, що забезпечують одержання функціонально подібних амінокислот, добре відомий у цій галузі. Такі консервативно модифіковані варіанти є додатковими і не виключають поліморфні варіанти, міжвидові гомологи та алелі, запропоновані у винаході. Кожна з наведених нижче 8 груп містить амінокислоти, які є консервативними замінами одна одної: 1) аланін (A), гліцин (G); 2) аспарагінова кислота (D), глутамінова кислота (E); 3)аспарагін (N), глутамін (Q); 4) аргінін (R), лізин (K); 5) ізолейцин (I), лейцин (L), метіонін (M), валін (V); 6) фенілаланін (F), тирозин (Y), триптофан (W); 7) серин (S), треонін (T); і 8) цистеїн (C), метіонін (M) (див., наприклад, Creighton, Proteins (1984)). У деяких варіантах здійснення винаходу поняття "консервативні модифікації послідовностей" застосовують для позначення амінокислотних модифікацій, які не суттєво впливають або змінюють характеристики зв'язування антитіла, що містить амінокислотну послідовність. Поняття "перехресно блокує" "перехресно блокований" або "перехресна блокада" у контексті цього опису використовують взаємозамінно для позначення здатності антитіла або іншого зв'язувального агента виявляти інтерферуючий вплив на зв'язування інших антитіл або зв'язувальних агентів з С5 при оцінці за допомогою стандартного аналізу конкурентного зв'язування. Здатність або ступінь, з якою антитіло або інший зв'язувальний агент може виявляти інтерферуючий вплив на зв'язування іншого антитіла або зв'язувальної молекули з С5, і отже, чи можуть вони розглядатися як перехресно блокувальні згідно з винаходом, можна визначати за допомогою стандартних аналізів конкурентного зв'язування. В одному з прийнятних аналізів застосовують Biacore-технологію (наприклад, з використанням обладнання BIAcore 3000 (фірма Biacore, Уппсала, Швеція)), за допомогою якого можна визначати ступінь взаємодій з використанням технології на основі резонансу поверхневого плазмону. Іншим аналізом, який можна застосовувати для оцінки перехресної блокади, є підхід на основі ELISA. Поняття "епітоп" означає білкову детермінанту, яка має здатність специфічно зв'язується з антитілом. Епітопи, як правило, складаються з хімічно активних поверхневих груп молекул, таких як амінокислоти або бічні ланцюги цукрів, і, як правило, мають специфічні характеристики тривимірної структури, а також специфічні характеристики заряду. Конформаційні епітопи відрізняються від неконформаційних епітопів тим, що зв'язування з першими, на відміну від 6 UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 зв'язування з останніми, припиняється в присутності денатуруючих розчинників. У контексті цього опису поняття "висока афінність" відносно антитіла ізотипу IgG відноситься -8 -9 до антитіла, для якого значення KD відносно антигену-мішені становить 10 M або менше, 10 M -10 -11 або менше, або 10 M, або 10 M або менше. Однак поняття "висока афінність" зв'язування може варіюватися залежно від ізотипів антитіл. Наприклад, "висока афінність" зв'язування для -7 IgM-ізотипу відноситься до антитіла, для якого значення KD становить 10 M або менше або 10 8 M або менше. Поняття "людське антитіло" у контексті цього опису відноситься до антитіл, що несуть варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки виводять із послідовностей, що мають людське походження. Крім того, якщо антитіло містить константну область, то константну область також виводять із таких людських послідовностей, наприклад, послідовностей людської зародкової лінії, або мутантних версій послідовностей людської зародкової лінії. Людські антитіла, запропоновані у винаході, можуть включати також амінокислотні залишки, які не кодуються людськими послідовностями (наприклад, у результаті мутацій, інтродуційованих шляхом випадкового або сайтспрямованого мутагенезу in vitro або соматичної мутації in vivo). Поняття "людське моноклональне антитіло" відноситься до антитіл, що мають одну специфічність зв'язування, які мають варіабельні області, у яких як каркасні, так і CDR-ділянки виводять із людських послідовностей. В одному з варіантів здійснення винаходу людські моноклональні антитіла одержують за допомогою гібридоми, яка включає B-клітину, отриману з трансгенної тварини крім людини, наприклад, трансгенної миші, у геномі якої міститься трансген людського важкого ланцюга і трансген людського легкого ланцюга, злиту з імморталізованою клітиною. "Гуманізоване" антитіло являє собою антитіло, яке зберігає реактивність нелюдського антитіла, але яке має меншу імунногенність для людини. Для досягнення цього, наприклад, можна зберігати нелюдські CDR-ділянки і заміняти частини антитіла, що залишилися, людськими копіями (тобто, константну область, а також каркасні ділянки варіабельної області) (див., наприклад, Morrison та ін., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 1984, сс. 6851-6855; Morrison і Oi, Adv. Immunol., 44, 1988, сс. 65-92; Verhoeyen та ін., Science, 239, 1988, сс. 1534-1536; Padlan, Molec. Immun., 28, 1991, сс. 489-498; і Padlan, Molec. Immun., 31(3), 1994, сс. 169-217). Іншими прикладами технологій, що застосовуються для створення гуманізованих (людських) антитіл, є (але не обмежуючись тільки ними) технологія Xoma, описана в US 5766886. Поняття "ідентичний" або відсоток "ідентичності" у відношенні двох або більшої кількості нуклеотидних або поліпептидних послідовностей відноситься до двох або більшої кількості послідовностей або підпослідовностей, які є однаковими. Дві послідовності є "практично ідентичними", якщо дві послідовності мають певний відсоток однакових амінокислотних залишків або нуклеотидів (тобто ідентичність на рівні 60 %, необов'язково ідентичність на рівні 65, 70, 75, 80, 85, 90 або 95 % у певній галузі або, якщо вона не зазначена конкретно, у повній послідовності) при зіставленні і вирівнюванні з метою виявлення максимальної відповідності у вікні порівняння або в призначеній для цього галузі, що встановлюють з використанням одного з перерахованих нижче алгоритмів порівняння або шляхом порівняння вручну і візуального аналізу. Необов'язково ідентичність має місце в галузі довжиною приблизно 50 нуклеотидів (або 10 амінокислот) або ще краще в галузі довжиною від 100 до 500 або 1000 або більше нуклеотидів (або 20, 50, 200 або більше амінокислот). При порівнянні послідовностей, як правило, одна послідовність являє собою послідовність, з якою проводять порівняння (референс-послідовність), з якою порівнюють послідовності, що тестуються. При використанні алгоритму порівняння послідовностей дані про послідовність, що тестується, і референс-послідовність вводять у комп'ютер, при необхідності задають координати підпослідовності і параметри алгоритму, що використовується в програмі порівняння послідовностей. Можна використовувати параметри програми, що задаються за замовчуванням, або альтернативні параметри. Після цього за допомогою алгоритму порівняння послідовностей розраховують з використанням заданих параметрів програми відсоток ідентичності для послідовностей, що тестуються, і референс-послідовності. У контексті цього опису поняття "вікно порівняння" відноситься до фрагменту, що містить будь-яку кількість положень, що безперервно йдуть одне за одним, обраних із групи, що містить від 20 до 600, краще від приблизно 50 до приблизно 200, ще краще від приблизно 100 до приблизно 150 положень, у яких можна порівнювати послідовність з референс-послідовністю, що має таку ж кількість безперервних положень, після оптимального вирівнювання двох послідовностей. Методи порівняльного аналізу первинної структури послідовностей, придатні для порівняння, добре відомі в цій галузі. Оптимальний порівняльний аналіз послідовностей можна здійснювати, наприклад, з використанням алгоритму локальної гомології Smith і 7 UA 105009 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Waterman, Adv. Appl. Math. 2, 1970, с. 482, алгоритму порівняльного аналізу гомології Needleman і Wunsch., J. Mol. Biol. 48, 1970, с. 443, методу пошуку подібності Pearson і Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85, 1988, с. 2444, з використанням комп'ютерних реалізацій цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA і TFASTA програм, що входять у пакет, фірми Wisconsin Genetics, фірма Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Медісон, Вісконсин, США) або шляхом порівняння вручну і візуального аналізу (див., наприклад, Brent та ін., Current Protocols in Molecular Biology, за ред. Ringbou, вид-во John Wiley & Sons, Inc., доповнене і перероблене вид., 2003 р.). Двома прикладами алгоритмів, які можна застосовувати для визначення відсотка ідентичності послідовностей і подібності послідовностей, можуть служити алгоритми BLAST і BLAST 2.0, описані в Altschul та ін., Nuc. Acid Res. 25, 1977, сс. 3389-3402 і в Altschul та ін., J. Mol. Biol. 215, 1990, сс. 403-410, відповідно. Програмне забезпечення для здійснення аналізів за допомогою BLAST може бути надане Національним центром біотехнологічної інформації (National Center for Biotechnology Information). У цьому алгоритмі спочатку проводиться виявлення пар послідовностей з високими балами (HSP) шляхом ідентифікації коротких "слів" довжини W у розглянутій послідовності, які або збігаються, або задовольняють певній позитивній граничній оцінці (балу) Т при порівнянні зі "словом" такої ж довжини у послідовності з бази даних.Т називається граничною оцінкою (балом) близького "слова" (Altschul та ін., вище). Ці вихідні вибірки близького "слова" використовуються як "запал" для ініціації пошуку, призначеного для знаходження більш довгих HSP, що включають їх. Потім вибірки "слова" подовжуються в обох напрямках уздовж кожної послідовності доти доки відбувається збільшення кумулятивного (накопичувального) бала при порівняльному аналізі. Кумулятивні бали для нуклеотидних послідовностей обчислюють з використанням параметрів M (призовий бал за пару співпадаючих залишків; завжди >0) і N (штрафний бал за незбіжні залишки; завжди