Спосіб введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети у клітину, що містить клітинну стінку

Є ще 26 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, у клітину рослини, що має клітинну стінку, причому спосіб включає в себе:

надання рослинної клітини, що має клітинну стінку;

покривання наночастинки на основі квантової точки молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, де наночастинка на основі квантової точки містить функціональну групу, яка взаємодіє з молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес;

здійснення контакту між рослинною клітиною, що має клітинну стінку, і покритою наночастинкою на основі квантової точки; і

забезпечення можливості поглинання наночастинки на основі квантової точки і молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, рослинною клітиною, що містить клітинну стінку.

2. Спосіб за п. 1, у якому наночастинкою на основі квантової точки є кон'югована наночастинка стрептавідин-QD.

3. Спосіб за п. 1, який додатково включає в себе забезпечення можливості поглинання наночастинки на основі квантової точки компартментом рослинної клітини, що містить клітинну стінку.

4. Спосіб за п. 3, який додатково включає в себе покривання наночастинки на основі квантової точки білком, що направляє в субклітинний компартмент.

5. Спосіб за п. 4, у якому компартмент вибраний із групи, що складається з цитозолю, ядра, тонопластів, пластиди, етіопласта, хромопласта, лейкопласта, елайопласта, протеопласта, амілопласта, хлоропласта і просвіту подвійної мембрани.

6. Спосіб за п. 1, у якому рослинною клітиною, що має клітинну стінку, є рослинна клітина з видів комерційних сільськогосподарських рослин.

7. Спосіб за п. 6, у якому рослинна клітина вибрана з групи, що складається з клітин тютюну, моркви, кукурудзи, каноли, рапсу, бавовнику, пальми, арахісу, сої, Oryza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp. і цукрової тростини.

8. Спосіб за п. 6, у якому рослинна клітина належить до тканини, вибраної з групи, що складається з зародка, меристеми, калюсу, пилку, листів, пиляків, коренів, кінчиків коренів, квіток, насіння, стручків і стебел.

9. Спосіб за п. 1, у якому рослинною клітиною, що має клітинну стінку, є культивована клітина.

10. Спосіб за п. 1, у якому наночастинкою на основі квантової точки є напівпровідникова наночастинка.

11. Спосіб за п. 1, який додатково включає в себе модифікацію поверхні наночастинки на основі квантової точки.

12. Спосіб за п. 1, у якому молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з молекул ДНК, РНК, РНКі і генів.

13. Спосіб за п. 12, у якому молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, містить ген.

14. Спосіб за п. 13, у якому геном є ген чужорідного білка, агротехнічний ген або маркерний ген.

15. Спосіб за п. 1, у якому молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, одержана за допомогою ПЛР-ампліфікації нуклеотидної послідовності.

16. Спосіб за п. 15, у якому нуклеотидна послідовність одержана з молекули нуклеїнової кислоти, вибраної з групи, що складається з плазмід, космід, штучних хромосом, дріжджових штучних хромосом і бактеріальних штучних хромосом.

17. Спосіб за п. 12, який додатково включає в себе відбір клітин, що мають стабільно інтегровану молекулу функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес.

18. Спосіб за п. 17, у якому вибрані клітини є регенерованими клітинами.

19. Спосіб за п. 18, який додатково включає в себе регенерацію рослини з регенерованих клітин.

20. Спосіб введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, у рослинний матеріал, причому спосіб включає в себе:

надання рослинного матеріалу, причому рослинний матеріал вибраний із групи, що складається з рослинних клітин, рослинних тканин і рослин;

надання наночастинки на основі квантової точки;

покривання наночастинки на основі квантової точки молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес;

забезпечення контакту між клітиною, що має клітинну стінку, і покритою наночастинкою на основі квантової точки; і

забезпечення можливості поглинання наночастинки на основі квантової точки і молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, рослинним матеріалом.

21. Спосіб за п. 20, у якому рослинний матеріал є рослинною тканиною, вибраною з групи, що складається з зародка, меристемної тканини, калюсу, пилку, листів, пиляків, коренів, кінчиків коренів, квіток, насіння, стручків і стебел.

Текст

Дивитися

Реферат: Винахід належить до способу введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, у клітину рослини, що має клітинну стінку, причому спосіб включає в себе надання рослинної клітини, що має клітинну стінку, покривання наночастинки на основі квантової точки молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, здійснення контакту між рослинною клітиною, що має клітинну стінку, і покритою наночастинкою на основі квантової точки; і забезпечення можливості поглинання UA 112758 C2 (12) UA 112758 C2 наночастинки на основі квантової точки і молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, рослинною клітиною, що містить клітинну стінку. Наночастинка на основі квантової точки містить функціональну групу, яка взаємодіє з молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети. UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ЗАЯВКА НА ПРІОРИТЕТ Дана заявка заявляє пріоритет дати подачі попередньої патентної заявки США із серійним номером 61/362,222, поданої 7 липня 2010 р. за назвою "ОДЕРЖАННЯ ФУНКЦІОНАЛІЗОВАНОЇ ДНК-КАСЕТИ Й ОПОСЕРЕДКОВАНА КВАНТОВИМИ ТОЧКАМИ/НАНОЧАСТИНКАМИ ДОСТАВКА В РОСЛИНИ". ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується способів використання наночастинок для неінвазивної доставки молекул функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет у рослинні клітини, що мають інтактну клітинну стінку. ПЕРЕДУМОВИ СТВОРЕННЯ ВИНАХОДУ Наночастинки мають унікальні властивості, які використовуються для доставки ДНК у визначені тваринні клітини. Було знайдено, що при інкубації деяких наночастинок, покритих ДНК, із клітинами, що не мають клітинної стінки, клітини поглинали наночастинки і починали експресувати гени, кодовані ДНК. Напівпровідникові наночастинки (наприклад, квантові точки ("QD")) з розміром частинок у діапазоні 3-5 нм також використовувалися як носії для доставки молекул у клітини. ДНК і білки можна приєднати до деяких лігандів, прикріплених до поверхні QD. Див., наприклад, Patolsky et al. (2003), J. Am. Chem. Soc. 125:13918. Покриті карбоновими кислотами або амінами QD можуть бути зшиті з молекулами, що містять тіольну групу, див., наприклад, Dubertret et al. (2002), Science, 298:1759; Akerman et al. (2002), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99:12617; Mitchell et al. (1999), J. Am. Chem. Soc. 121:8122, або N-гідроксисукцинімільну ("NHS") складноефірну групу, з використанням стандартних протоколів біокон'югації. Див., наприклад, Pinaud et al. (2004), J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Bruchez et al. (1998), Science, 281:2013. Альтернативним шляхом приєднання молекул до поверхні QD є кон'югація покритих стрептавідином QD з біотинільованими білками, олігонуклеотидами або антитілами. Див., наприклад, Dahan et al. (2003), Science, 302:442; Pinaud et al. (2004), J. Am. Chem. Soc. 126:6115; Wu et al. (2003), Nature Biotechnol. 21:41; Jaiswal et al. (2003), Nature Biotechnol. 21:47; і Mansson et al. (2004), Biochem. Biophys. Res. Commun. 314:529. Доставка молекул чужорідних нуклеїнових кислот у рослини ускладнюється наявністю стінки у клітин рослин. В основі існуючих способів для генетичної трансформації рослин лежить інвазивна доставка. В клітинах рослин клітинна стінка являє собою бар'єр, який перешкоджає доставці екзогенно внесених молекул. Для доставки в покриті стінкою клітини рослин генів і низькомолекулярних сполук використовується множина інвазивних способів клітинної доставки, наприклад біолістична доставка (генна гармата), мікроін'єкція, електропорація й опосередкована агробактеріями трансформація, але доставку білків можна здійснити тільки за допомогою мікроін'єкції. Якщо необхідна доставка молекул нуклеїнових кислот за допомогою наночастинок, то клітинну стінку видаляють перед додаванням частинок до протопластів рослини. Див., наприклад, Torney et al. (2007), Nature Nanotechnol. 2:295-300. Більше того, загальноприйняті методики трансформації рослин, такі як опосередкована агробактеріями трансформація, вимагають використання рекомбінантної плазміди. Ці загальноприйняті методики, тому, приводять до небажаного вбудовування каркасної послідовності бактеріального вектора в геном хазяїна разом з приєднаними до нього екзогенними генами. Див., наприклад, Kohli et al. (1999), Plant J. 17:591-601; і Meza et al. (2002), Nucleic Acids Res. 30(20):4556-66. Присутність векторної базової послідовності в трансплантаті непотрібна в процедурах біолістичного перенесення. Крім того, векторні базові послідовності мають тенденцію стимулювати небажану рекомбінацію, забезпечуючи АТ-багаті послідовності як "гарячі точки" рекомбінації в процесі утворення вторинних структур. Muller et al. (1999), J. Mol. Biol. 291:29-46. Векторні каркасні послідовності можуть додатково забезпечувати нові послідовності "філерної" ДНК (вставок ДНК), гомологічної фланкуючій геномній ДНК рослин, що можуть виділятися в навколишнє середовище. Kohli et al. (1998), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:7203-8; Pawlowski and Somers (2000), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:12106-10; Svitashev et al. (2002), Plant J. 32:433-45. Трансформація трансгенними касетами з використанням бомбардування частинками мала обмежений успіх на культурі тканин і на рослинах рису (Oryza sativa) і картоплі (Solarium tuberosum). Fu et al. (2000), Transgenic Res. 9:11-9; Loc et al. (2002), Mol. Breeding, 9:231-44; Romano et al. (2003), Transgenic Res. 12:461-73; і Agrawal et al. (2005), Mol. Breeding 16:247-60. Передбачається, що ці біолістичні методики генерують більший відсоток трансгенних рослин рису і картоплі з простими схемами вбудовування. Дві групи лінійних генетичних конструкцій (gus і bar, і 1Ax1 і bar), у яких відсутні базові векторні послідовності, незалежно переносили в елітний сорт EM12 пшениці (Triticum aestivum L.) бомбардуванням частинками і виділяли генетично стабільні рослини з низькокопійним вбудованим трансгеном. Yao et al. (2006), J. Exp. 1 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Botany, 57(14):3737-46. Спостережувана ефективність трансформації при біолістичному бомбардуванні складала від 0,2 до 0,6. Id. Передбачається, що три потенційних елементи (а саме зниження ступеня конкатемеризації перед вбудовуванням трансгена; обмеження можливості перестановок у трансгені і попередження гомологічних взаємодій між різними трансгенами протягом подій вбудовування) діють спільно, забезпечуючи прості інтактні трансгенні локуси, представлені простими картинами гібридизації. Agrawal et al. (2005), вище. На сьогоднішній момент бомбардування частинками і Whiskers™ (див. патенти США №№ 5,464,765 і 5,302,523) разом з розщепленими ферментами рестрикції фрагментами ДНК є єдиним шляхом доставки лінійних ДНК-касет у клітини рослин, що мають інтактні клітинні стінки. ОПИС ВИНАХОДУ У даному винаході описані способи і композиції для використання наночастинок і лінеаризованих молекул нуклеїнових кислот для введення молекули, що представляє інтерес, у рослинну клітину, яка має клітинну стінку. Деякі варіанти здійснення способів за винаходом можна використовувати для одержання стабільно трансформованої генетично-модифікованої фертильної рослини. У деяких варіантах здійснення винаходу відмітні властивості молекул функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет дозволяють доставку послідовностей визначених генів, що представляють інтерес, без небажаних нуклеотидних послідовностей, наприклад, без обмеження, векторних базових послідовностей. У варіантах здійснення винаходу для трансформації рослинних клітин, що мають клітинну стінку, можна використовувати декілька різних типів наночастинок. У деяких варіантах здійснення винаходу наночастинки можуть бути ПЕГильовані (мати приєднані молекули ПЕГ) з молекулами функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет. У конкретних варіантах здійснення винаходу наночастинками можуть бути напівпровідникові наночастинки, такі як квантові точки ("QD"), або частинки золота. В інших варіантах здійснення винаходу молекулами функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет може бути лінеаризована плазмідна ДНК. В альтернативних варіантах здійснення винаходу молекули функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет можуть містити послідовності, що кодують фосфінотрицин-Nацетилтрансферазу (PAT) і/або жовтий флуоресцентний білок (YFP). Також винахід стосується способів введення цільової молекули в рослинну клітину, що має клітинну стінку, причому способи можуть включати надання рослинної клітини, що має клітинну стінку; покривання поверхні наночастинок щонайменше однією молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес; здійснення контакту між рослинною клітиною, що має клітинну стінку, і наночастинками, покритими молекулою(ами) функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес; і забезпечення можливості поглинання наночастинки і молекул(и) функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет, що представляють інтерес, рослинною клітиною, що містить клітинну стінку. У конкретних варіантах здійснення винаходу молекулою, що представляє інтерес, функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети може бути біотинільована молекула лінеаризованої дволанцюжкової ДНК, яка містить ген, що представляє інтерес. У додаткових варіантах здійснення винаходу молекулою, що представляє інтерес, функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети може бути хімічно немодифікована молекула дволанцюжкової ДНК, яка містить ген, що представляє інтерес. У конкретних варіантах здійснення винаходу наночастинкою може бути QDстрептавідинова наночастинка. Функціоналізовані молекули лінійних нуклеотидних касет можна кон'югувати з наночастинками з використанням різноманітних реагентів з різними функціональними групами. У деяких варіантах здійснення винаходу поверхня наночастинок може бути функціоналізована білками і/або іншими молекулами, наприклад пестицидами, які несуть сумісні функціональні групи. У деяких варіантах здійснення винаходу поверхня наночастинки може бути кон'югована більше ніж з одним типом молекул. Тому, у конкретних варіантах здійснення винаходу поверхня наночастинок може бути спільно функціоналізована проникаючими в клітину пестицидами і молекулами лінеаризованих нуклеотидних касет, наприклад, для полегшення спрямованої доставки біомолекул. Додатково розкриті способи інтрогресії ознаки в рослину. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб може включати надання рослинної клітини; покривання поверхні наночастинок засобом для експресії ознаки в рослині; здійснення контакту між рослинною клітиною і наночастинками, покритими засобом для експресії ознаки в рослині; забезпечення можливості поглинання наночастинки і засобу для експресії ознаки в рослині рослинною клітиною для одержання трансформованої рослинної клітини; регенерацію цілої рослини з трансформованої рослинної клітини і розмноження рослини. У деяких варіантах здійснення винаходу ознака, яку можна інтрогресувати відповідно до способів за винаходом, включає в себе ознаку, вибрану, 2 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 без обмеження, з: чоловічої стерильності, стійкості до гербіциду, стійкості до комах і стійкості до бактеріального захворювання, грибкового захворювання і/або вірусного захворювання. Також розкриті способи за винаходом, які можна використовувати для in planta трансформації рослин. У деяких варіантах здійснення винаходу рослина може бути вибрана з рослин роду Arabidopsis, наприклад A. thaliana. У конкретних варіантах здійснення винаходу рослина, трансформована за допомогою in planta трансформації, може бути вибрана з рослин A. thaliana екотипу Columbia. Додатково розкриті генетично модифіковані рослинні клітини (ГМ) і способи їх одержання, причому рослинні клітини мають одну або декілька нуклеїнових кислот, введених у них способами за даним винаходом. У деяких варіантах здійснення винаходу плазміда, яка містить щонайменше один ген, що представляє інтерес, і селектований маркер, може бути введена в клітину рослини, що має клітинну стінку, за допомогою наночастинок згідно з даним винаходом. У додаткових варіантах здійснення винаходу можна відібрати стабільні трансформанти, які мають стабільно вбудований щонайменше один ген, що представляє інтерес, і/або селектований маркер. В альтернативних варіантах здійснення винаходу рослинну клітину, яка вже містить щонайменше один ген, що представляє інтерес, можна розмножувати для одержання інших клітин, які містять молекулу, що представляє інтерес. В інших варіантах здійснення винаходу рослинною клітиною, яка містить молекулу, що представляє інтерес, може бути здатна до регенерації клітина, яку можна використовувати для регенерації цілої рослини, яка включає молекулу, що представляє інтерес. Додатково розкриті способи створення регенерованих рослинних клітин, які включають у себе молекулу, що представляє інтерес, для використання в культурі тканин. Культура тканин може мати здатність до регенерації рослин, що мають по суті однаковий генотип з регенерованими клітинами. Регенерованими клітинами в таких культурах тканин можуть бути, наприклад, зародки, протопласти, меристемні клітини, калюс, пилок, листи, пиляки, корені, кінчики коренів, квітки, насіння, стручки або стебла. Додатково, деякі варіанти здійснення винаходу стосуються рослин, регенерованих з культур тканин за винаходом. Додатково розкриті способи одержання стабілізованих ліній рослин, які включають у себе бажану ознаку або молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, причому бажана ознака або молекула нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, може бути початково введена шляхом поглинання наночастинки через рослинну клітинну стінку. Способи одержання стабілізованих ліній рослин добре відомі середньому фахівцю в даній галузі і можуть включати методики, такі як, але не обмежуючись ними: самозапилення; поворотне схрещування; одержання гібридів; схрещування з популяціями і т. п. Тому у винаході розкриті рослини і рослинні клітини, які включають у себе бажану ознаку або молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, початково введену в рослинну клітину (або її попередників) шляхом введення наночастинки через клітинну стінку. Рослинну клітину, яка включає в себе бажану ознаку або молекулу нуклеїнової кислоти, що представляє інтерес, початково введену в рослинну клітину (або її попередників) шляхом введення наночастинки через клітинну стінку, можна використовувати в схрещуванні з іншими рослинними клітинами, що відрізняються від неї, щоб одержати гібридні клітини, насіння і/або рослини першого покоління (F1) з бажаними характеристиками. Крім типових аспектів і варіантів здійснення винаходу, описаних вище, додаткові аспекти і варіанти здійснення будуть очевидні у світлі подальших описів. КОРОТКИЙ ОПИС КРЕСЛЕНЬ Фіг. 1 включає діаграму нелінеаризованої плазміди pDAB3831. Фіг. 2 включає послідовність ДНК плазміди pDAB3831. Фрагмент ДНК від 7666 і до 3870 п.о. був ампліфікований за допомогою ПЛР і використаний для трансформації Arabidopsis, що дало рослини Т2 зі стабільно вбудованою вставкою. Фіг. 3 включає вирівнювання послідовностей між послідовністю ДНК фосфінотрицин-Nацетилтрансферази (PAT) із трансформованого за допомогою Dendrimer геному Arabidopsis і послідовністю РАТ з бази даних NCBI. Фіг. 4 включає вирівнювання послідовностей між геномом Arabidopsis, трансформованого послідовністю ДНК жовтого флуоресцентного білка (YFP), і послідовністю YFP з бази даних NCBI. СПИСОК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO:1 являє собою послідовність прямого праймера, використовуваного для ампліфікації повнорозмірної експресійної касети 4,6 т.п.о. на плазміді pDAB3831: /5Biosq/TGAAAGTGTACATCAACGAA. 3 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 SEQ ID NO:2 являє собою послідовність зворотного праймера, використовуваного для ампліфікації повнорозмірної експресійної касети 4,6 т.п.о. на плазміді pDAB3831: /5Biosq/CCGCAACTATTTCAACAC. SEQ ID NO:3 являє собою послідовність прямого праймера, використовуваного для ампліфікації гена YFP: TGTTCCACGGCAAGATCCCCTACG. SEQ ID NO:4 являє собою послідовність зворотного праймера, використовуваного для ампліфікації гена YFP: TATTCATCTGGGTGTGATCGGCCA. SEQ ID NO:5 являє собою послідовність прямого праймера, використовуваного для ампліфікації гена РАТ: GGAGAGGAGACCAGTTGAGATTAG. SEQ ID NO:6 являє собою послідовність зворотного праймера, використовуваного для ампліфікації гена РАТ: AGATCTGGGTAACTGGCCTAACTG. ВАРІАНТИ ЗДІЙСНЕННЯ ВИНАХОДУ I. Загальний опис декількох варіантів здійснення винаходу Способи за винаходом, які дозволяють неінвазивне перенесення генів, можуть бути дуже корисні для одержання генетично модифікованих рослин з бажаними ознаками. Неінвазивне перенесення генів може полегшувати спрямований вплив і редагування молекулярних сайтів у клітині для областей, таких як включення бажаних вхідних даних, вихідних даних і агрономічних ознак у сільськогосподарські рослини. Описані способи також можуть бути корисні як такої, що "не містить ГМО" можливості транзієнтної трансформації рослин, експансії технології інтрогресії ознак і стійкості до захворювань на деревні й овочеві культури, технології для яких на даний момент обмежені. У нещодавній патентній заявці (США, серійний номер 60/978,059) продемонстрований неінвазивний засіб доставки ДНК на основі наночастинок з використанням наночастинок з різним корисним навантаженням, inter alia, для доставки кільцевої плазмідної ДНК, і однозначно продемонстроване стабільне вбудовування трансгенів у насіння Т 1 рослин Arabidopsis. Одержані в ході цього трансгенні рослини, що містять кільцеву плазмідну ДНК, виявляли бажані фенотипи переносимості гербіциду і показували високий ступінь переносимості щонайменше при 4 послідовних обприскуваннях застосовуваним у сільському господарстві рівнем глуфосинату амонію. У патенті США із серійним номером 60/978,059 була продемонстрована, inter alia, генетична трансформація Arabidopsis за допомогою позитивно заряджених золотих наночастинок з використанням кільцевої плазмідної ДНК. У даному дослідженні описане, inter alia, використання молекул функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет для стабільної генетичної трансформації рослин. У патенті США із серійним номером 60/978,059 описана, inter alia, опосередкована позитивно зарядженими наночастинками доставка плазмідної ДНК. Однак до цього моменту демонстрація стабільної геномної інтеграції трансгена з використанням доставки лінійної плазміди не була опублікована. У даному винаході описане застосування опосередкованої наночастинками доставки молекул функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет для стабільної генетичної трансформації в рослинах. Молекулярний аналіз показав експресію РАТ разом з YFP у трансгенних рослинах Т 1 Arabidopsis, трансформованих геном pat і геном yfp способами за винаходом. Трансгенні рослини Т 1 є фертильними і дають насіння. Це насіння можна розмножити і можна провести сегрегаційний аналіз разом з молекулярним і чистовим аналізами. У даному документі розкриті способи, які дозволяють одержати прості події інтеграції ДНК у рослинах і, таким чином, спростити наступні спроби інтрогресії. Використання молекул функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет забезпечує переваги в генетичній трансформації в порівнянні, наприклад, із плазмідами. Наприклад, молекули функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет можуть не містити векторних каркасних послідовностей або селектованих маркерних генів. II. Терміни У нижченаведених описі і таблицях використовується ряд термінів. З метою забезпечення ясного і узгодженого розуміння опису і формули винаходу, включаючи обсяг, що дається в цих термінах, наведені наступні визначення. Поворотне схрещування: у контексті даного винаходу поворотне схрещування являє собою процес, при якому селекціонер багаторазово схрещує гібридне потомство з одним з батьків, наприклад перше покоління гібридів F1 з одним з батьківських генотипів гібриду F1. Зародок: у контексті даного винаходу "зародок" може стосуватися маленької рослини, що міститься в зрілому насінні. Наночастинка: у контексті даного винаходу "наночастинка" може стосуватися мікроскопічної частинки з розмірами в нанодіапазоні, наприклад менше 100 нм. Наночастинки, придатні для 4 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використання в даному винаході, можуть мати розмір від 1 нм до 0,84 мкм. Одним класом наночастинок є "квантові точки" (QD). Квантова точка може мати медіанний діаметр 1-10 нм, наприклад 2-4 нм. Інші варіанти наночастинок включають, без обмеження: золоті наночастинки, покриті золотом наночастинки, пористі наночастинки, мезопористі наночастинки, кремнієві наночастинки, полімерні наночастинки, такі як дендримери, вольфрамові наночастинки, желатинові наночастинки, нанооболонки, наноядра, наносфери, нанотрубочки, магнітні наночастинки і їх комбінації. З доступних наночастинок, найбільш продемонстроване застосування в біовізуалізації і біосенсорних технологіях люмінесцентних напівпровідникових нанокристалів (QD). Їх застосування основане на комбінації унікальних фотофізичних характеристик і розмірів, порівнянних з розмірами великих білків. Гідродинамічний радіус гідрофільних варіантів квантових точок CdSe-ZnS варіює від 5 нм (для нанокристалів, із групами на поверхні, заміщеними на молекулярні ліганди) до 20 нм для нанокристалів, поміщених у блокспівполімери. Одна QD може бути кон'югована з декількома біомолекулами (наприклад, антитілами, пептидами і молекулами нуклеїнових кислот), щоб забезпечити поліфункціональні біокон'югати QD з підвищеною авідністю. На доповнення, їх сильна стійкість до хімічної і фотодеградації може потенційно дозволяти тривале флуоресцентне спостереження специфічних біологічних процесів. Nie and Emory (1997), Science, 275:1102-6. Для того, щоб одержати поліфункціональні біокон'югати QD, стабільні навіть у внутрішньоклітинному оточенні, можна одночасно застосовувати на одному комплексі множину схем нековалентної кон'югації на основі металоафінного самозбирання і зв'язування біотину з авідином без необхідності додаткового очищення. Yezhelyev et al. (2008), J. Am. Chem. Soc. 130(28):9006-12. Використовуючи в середньому 10 YFP плюс номінально 50 проникаючих у клітину пептидів (СРР) на QD, можна здійснити внутрішньоклітинну доставку білків з молекулярною вагою щонайменше 300 кДа і розміром 150 ангстрем. Id. Кон'югати QD-b-PE доставляють "вантаж" у набагато більшому діапазоні розмірів і молекулярних ваг; наприклад, із середнім співвідношенням 2,5 стрептавідин-b-ПЕ на кон'югат речовини, що доставляються, мають молекулярну вагу, що перевищує 103 кДа, і загальний розмір, що наближається до 500 ангстремів. Молекулярна вага і розмір можуть значно збільшуватися при використанні кон'югатів з великими валентностями b-PE. Молекула нуклеїнової кислоти: полімерна форма нуклеотидів, яка може включати як смисловий, так і антисмисловий ланцюги РНК, кДНК, геномної ДНК, штучні хромосоми (АСІ) і синтетичні форми і змішані полімери перерахованого вище. Нуклеотид стосується рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду або модифікованої форми нуклеотиду будь-якого типу. У контексті даного винаходу "молекула нуклеїнової кислоти" є синонімом "нуклеїнової кислоти" і "полінуклеотиду". Якщо не зазначене інше, то молекула нуклеїнової кислоти звичайно має довжину щонайменше 10 основ. Термін включає одно- і дволанцюжкові форми ДНК. Молекула нуклеїнової кислоти може включати будь-які або всі природні і модифіковані нуклеотиди, з'єднані один з одним природними і/або неприродними нуклеотидними зв'язками. Функціонально зв'язаний: перша нуклеотидна послідовність функціонально зв'язана з другою нуклеотидною послідовністю, коли перша нуклеотидна послідовність функціонально взаємозв'язана з другою нуклеотидною послідовністю. Наприклад, промотор функціонально зв'язаний з кодуючою послідовністю, якщо промотор впливає на транскрипцію або експресію кодуючої послідовності. При рекомбінантному одержанні функціонально зв'язані нуклеотидні послідовності можуть бути неперервними і, при необхідності з'єднання двох кодуючих білки областей, можуть мати одну рамку зчитування. Однак нуклеїнові кислоти не повинні бути неперервними для того, щоб бути функціонально зв'язаними. ПЕГильований: у контексті даного винаходу термін "ПЕГильований" може стосуватися наночастинок (наприклад, золотих наночастинок і квантових точок), поверхня яких модифікована поліетиленгліколем (ПЕГ) для поліпшення біосумісності. ПЕГильовані наночастинки можуть бути додатково покриті різними лігандами спрямованої дії, наприклад пептидами й антитілами, для збільшення ефективності доставки у визначені клітини і тканини. ПЕГ кон'югований з наночастинками з різними лікарськими сполуками, ліпосомами і полімерними міцелами, наприклад, для того, щоб збільшити час знаходження в кровотоку наночастинок, що мають оболонку, за рахунок зниження неспецифічної адсорбції білків внаслідок ефекту стеричної стабілізації. Квантова точка: у контексті даного винаходу "квантова точка" (QD) (також іноді іменована нанокристалами) може стосуватися напівпровідникової наноструктури, яка обмежує рух електронів зони провідності, дірок валентної зони або екситонів (зв'язаних пар електронів зони провідності і дірок валентної зони) у всіх трьох вимірах. Це обмеження може бути наслідком, 5 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, електростатичних потенціалів (генерованих зовнішніми електродами, допуванням, деформацією, домішками і т. д.); присутності поверхні розділу між різними напівпровідниковими матеріалами (наприклад, у нанокристалічних системах "ядро-оболонка"); присутності напівпровідникової поверхні (наприклад, напівпровідниковий нанокристал) або їх комбінації. Квантова точка може мати дискретний (квантований) енергетичний спектр. Придатні хвильові функції можуть бути просторово локалізовані в квантовій точці, але поширюються на множину періодів кристалічної решітки. Квантова точка містить маленьке кінцеве число (наприклад, порядку 1-100) електронів зони провідності, дірок валентної зони або екситонів (тобто кінцеве число елементарних електричних зарядів). Квантові точки являють собою особливий клас напівпровідникових матеріалів, які можуть бути кристалами, що складаються з речовин, які належать до груп II-VI, III-V або IV-VI періодичної системи елементів Менделєєва. Їх розміри можуть варіювати в діапазоні, наприклад, від 2 до 10 нанометрів (10-50 атомів) у діаметрі. У деяких варіантах здійснення винаходу квантові точки можуть бути виготовлені з ядром із селеніду кадмію й оболонкою із сульфіду цинку (CdSe/ZnS) і мають спектр корисних електричних і оптичних властивостей, які відрізняються по характеристиках від властивостей вихідних речовин. Квантові точки досліджували як візуалізуючі агенти in vivo і in vitro внаслідок їх високого квантового виходу, високого молярного коефіцієнта екстинкції і високої стійкості до фотознебарвлення. Стійкий до гліфосату: стійкість до дози гліфосату стосується здатності рослини виживати (тобто рослина може не вмирати) при впливі дози гліфосату. У деяких випадках стійкі рослини можуть тимчасово набути жовтого забарвлення або як-небудь інакше виявляти викликане гліфосатом ураження (наприклад, надлишкова кількість паростків і/або інгібування росту), але відновлюватися. Стабілізований: у контексті даного винаходу термін "стабілізований" може стосуватися характеристик рослини, які відтворювано передаються від одного покоління до іншого покоління інбредних рослин одного сорту. Трансген: у контексті даного винаходу термін "трансген" може стосуватися послідовності екзогенної нуклеїнової кислоти. В одному прикладі трансгеном є послідовність гена (наприклад, гена стійкості до гербіциду); гена, що кодує промислово або фармацевтично корисну сполуку; або гена, що кодує бажану арготехнічну ознаку. У ще одному прикладі трансгеном є послідовність антисмислової нуклеїнової кислоти, причому експресія послідовності антисмислової нуклеїнової кислоти інгібує експресію послідовності нуклеїнової кислоти-мішені. Трансген може містити регуляторні послідовності, функціонально зв'язані з трансгеном (наприклад, промотор). У деяких варіантах здійснення винаходу молекула, що представляє інтерес, функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що вводиться за допомогою опосередкованої наночастинками трансформації, містить трансген. Однак в інших варіантах здійснення винаходу, коли бажані додаткові геномні копії послідовності ендогенної нуклеїнової кислоти, молекула, що представляє інтерес, функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети містить послідовність ендогенної нуклеїнової кислоти, або вона містить нуклеотидну послідовність, що знаходиться в антисмисловій орієнтації відносно молекули нуклеїнової килоти-мішені в організмі-хазяїні. Поглинання: у контексті даного винаходу термін "поглинання" може стосуватися переміщення частинки, такої як наночастинка (наприклад, квантові точки або наночастинки золота), через клітинну стінку або клітинну мембрану, причому переміщення не відбувається винятково в результаті імпульсу, наданого частинці чим-небудь крім клітини, що поглинає частинку. Необмежувальними прикладами пристроїв або способів, які викликають переміщення частинки через клітинну стінку або клітинну мембрану винятково в результаті імпульсу, наданого частинці, є біолістичні пристрої, генна гармата, мікроін'єкція і/або методики імпалефекції. III. Доставка молекул нуклеїнових кислот з використанням наночастинок для стабільної трансформації рослинних клітин А. Загальний опис У цьому винаході описані, наприклад, нові способи трансформації рослин з використанням опосередкованого наночастинками перенесення молекул функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет для генетичної трансформації й одержання стабільних трансгенних рослин. У способах за деякими варіантами здійснення винаходу може бути запропоновано не тільки швидке створення трансгенного організму, але також декілька можливостей бажаних генетичних модифікацій у порівнянні з іншими способами трансформації. Варіанти здійснення даного винаходу привели в результаті до вперше опублікованої стабільно трансформованої рослини, одержаної за допомогою опосередкованої наночастинками доставки лінеаризованої 6 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 плазмідної ДНК. Розкриті способи генетичної модифікації відрізняються від традиційних способів генетичної трансформації рослин, не залежать від біолістичної доставки і можуть бути дуже корисні для створення трансгенних сільськогосподарських культур. Трансгенні рослини звичайно одержують Agrobacterium-опосередкованою трансформацією або бомбардуванням частинками. На доповнення до гена, що представляє інтерес, трансгенні рослини часто обов'язково містять послідовності векторного каркаса і гени селектованого маркера, наприклад, які надають резистентності до антибіотиків або гербіцидів. Оскільки гени селектованих маркерів і векторних каркасних послідовностей є як зайвими, так і небажаними в методиках перенесення ДНК, то одержання вільних від вектора трансгенних рослин є переважним. Видалення векторних каркасних послідовностей, що дозволяють способи за деякими варіантами здійснення, може обмежити число гомологічних рекомбінацій і вплив елементів, що викликають рекомбінацію, на процес інтеграції. У варіантах здійснення даного винаходу може бути досягнуте пряме створення трансгенних рослин за допомогою неінвазивної опосередкованої наночастинками доставки лінійних нуклеотидних касет, наприклад за допомогою способу занурення квітки. Такі способи можуть забезпечити більш простий шлях проведення бажаних трансформацій рослин відносно інших способів, доступних у даній галузі. У деяких варіантах здійснення винаходу способи можна використовувати для створення вільних як від вектора, так і від маркера трансгенних рослин. У деяких варіантах здійснення винаходу способи трансформації не залежать від культури тканин і тому можуть бути більш зручні і доцільні для рослин, відтворених статевим розмноженням. У деяких варіантах здійснення способи за винаходом можуть забезпечувати здатність неінвазивно трансформувати не сумісні з Agrobacterium рослини і/або їх клітини в суспензійній культурі. Такі способи можуть забезпечити величезні можливості. Бажані вхідні дані й агротехнічні ознаки можуть вимагати доставки множини генів в одній процедурі трансформації. У деяких варіантах здійснення способи за винаходом дозволяють доставку молекул множини нуклеїнових кислот, одночасно усуваючи необхідність конструювання великих плазмід, які містять усі гени, що представляють інтерес, що може бути обтяжливо, якщо взагалі можливо. В. Молекули нуклеїнових кислот З появою методик молекулярної біології, які дозволили виділення і характеристику генів, що кодують визначені білкові або РНК-продукти (наприклад, інтерферуючі РНК ("РНКі")), вчені в галузі біології рослин стали зацікавлені в генетичній модифікації геному клітин для включення в нього чужорідних генів і їх експресії або додаткових або модифікованих версій природних або ендогенних генів (іноді регульованих різними промоторами), наприклад, з метою зміни ознак клітини певним чином. Такі чужорідні додаткові і/або модифіковані гени узагальнено іменуються в даному документі "трансгенами". Трансгени можуть, наприклад, кодувати білок, що представляє інтерес, або можуть транскрибуватися в РНКі. За останні п'ятнадцять-двадцять років були розроблені декілька способів одержання трансгенних клітин, і в конкретних варіантах здійснення даний винахід стосується трансформованих версій клітин і способів їх одержання за допомогою введення в рослинну клітину, що має клітинну стінку, однієї або декількох молекул функціоналізованих нуклеотидних касет за допомогою поглинання наночастинки через клітинну стінку. У деяких варіантах здійснення винаходу трансген може міститися в синтезованій лінійній ДНК-касеті. Трансформація клітин може включати в себе молекулу нуклеїнової кислоти, що містить ген під контролем або функціонально зв'язаний з регуляторним елементом (наприклад, промотором, енхансером, послідовністю термінації або їх комбінацією). Таким чином, молекула нуклеїнової кислоти може містити одну або декілька таких функціонально зв'язаних комбінацій гена і регуляторного елемента. У варіантах здійснення винаходу молекулою, що представляє інтерес, нуклеїнової кислоти може бути молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети. Молекули функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет можна одержати, наприклад, розщепленням кільцевої плазміди щонайменше однією рестрикційною ендонуклеазою так, щоб вирізати експресійну касету, що міститься в ній. Рестрикційні ендонуклеази будуть розщеплювати плазміду по одному або декількох сайтах рестрикції в нуклеотидній послідовності плазміди. Тому, плазміди можна конструювати таким чином, щоб дозволяти створення однієї або декількох визначених молекул лінійних нуклеотидних касет шляхом розщеплення за допомогою щонайменше однієї конкретної рестрикційної ендонуклеази. В альтернативному варіанті, в даній нуклеотидній послідовності плазміди можна провести пошук сайтів, упізнаваних однією або декількома конкретними рестрикційними ендонуклеазами, що дозволить одержати одну або декілька визначених молекул лінійних нуклеотидних касет. Шляхом відбору сайтів рестрикції, що знаходяться у визначених місцях у кільцевий плазміді або лінійній молекулі нуклеїнової 7 UA 112758 C2 5 10 15 кислоти, можна одержати в результаті молекули лінійних нуклеотидних касет, у яких відсутні одна або декілька послідовностей з молекули нуклеїнової кислоти-попередника. Наприклад, можна одержати молекулу лінійної нуклеотидної касети, у якій відсутні сторонні нуклеотидні послідовності (наприклад, векторний каркас, селектовані маркери, такі як маркери для селекції в бактеріях, і непотрібні нуклеотидні послідовності, гомологічні геномній ДНК клітини-мішені). В альтернативному варіанті можна синтезувати молекулу лінійної нуклеотидної касети, у якій відсутні сторонні нуклеотидні послідовності. Молекули лінійних нуклеотидних касет можна синтезувати з використанням проточних термоциклічних систем. Див. міжнародну публікацію РСТ, WO 2008/045288. Замість використання маленьких пробірок, у проточних термоциклерах для ампліфікації ДНК використовують постійний або безперервний потік рідини, який багаторазово проходить через різні температурні зони. ПЛР-суміш вводять у рідину-носій, з якою вона не змішується, і потім рідина-носій проходить через множину температурних зон для здійснення ампліфікації ДНК у ПЛР-суміші. Специфічна послідовність ДНК у зразку ампліфікується в міру циклів її проходження через температурні зони. ПЛР-продукт можна очистити на гель-фільтраційній колонці. Молекули нуклеїнових кислот можна кон'югувати з наночастинками, використовуючи різні реагенти з різними функціональними групами. Різні хімічні реакції для кон'югування молекул нуклеїнових кислот з наночастинками перераховані в таблиці 1. 20 Частинка QT, функціоналізовані PDDA, 620 нм QT, функціоналізовані аміногрупами, 620 нм QT, функціоналізовані стрептавідином, 620 нм меркаптооцтова кислота, HSCH2COOH 3-меркаптопропіонімідату гідрохлорид (імінотіолан) 25 30 35 40 45 50 Таблиця 1 Поверхневі групи + N (CH3)2Cl аміногрупи стрептавідин карбоксильна і тіольна групи сульфгідрильна група У варіантах здійснення винаходу, у яких молекула, що представляє інтерес, лінійної нуклеотидної касети містить один або декілька генів, гени можуть являти собою домінантний або рецесивний алель. Наприклад, ген(и) може (можуть) надавати такі ознаки, як стійкість до гербіцидів, стійкість до комах, чоловіча фертильність, чоловіча стерильність, поліпшені живильні якості і промислове використання. Гени, що надають ці й інші ознаки, відомі в даній галузі, і відповідно до способів за винаходом будь-який ген можна ввести в рослинну клітину, що містить клітинну стінку. Експресійні вектори для лінеаризації і поглинання за допомогою наночастинок: маркерні гени Експресійні вектори для лінеаризації і поглинання за допомогою наночастинок можуть необов'язково включати щонайменше один генетичний маркер, наприклад, функціонально зв'язаний з регуляторним елементом, що дозволяє трансформованим клітинам, які містять маркер, виживати або при негативній селекції (наприклад, інгібуванні росту клітин, що не містять ген селектованого маркера), або при позитивній селекції (наприклад, скринінгу продукту, кодованого генетичним маркером). У даній галузі добре відома множина селектованих маркерних генів для трансформації, які включають, наприклад, без обмеження: гени, які кодують ферменти, метаболічно нейтралізуючі селективний хімічний агент, що може являти собою антибіотик або гербіцид; або гени, які кодують змінену мішень, що може бути нечутлива до інгібітору. У даній галузі також відомі способи специфічної позитивної селекції. Однак у деяких варіантах здійснення винаходу молекули лінеаризованих нуклеотидних касет не містять маркерних генів. Одним селектованим маркерним геном, який може бути придатний для трансформації рослин визначеними нуклеотидними молекулами, є ген неоміцинфосфотрансферази II (nptII), необов'язково, під контролем регуляторних сигналів рослин, який надає стійкості до канаміцину. Див., наприклад, Fraley et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:4803. Іншим геном селектованого маркера, який можна використовувати, є ген гігроміцинфосфотрансферази, який надає стійкості до антибіотика гігроміцину. Див., наприклад, Vanden Elzen et al. (1985), Plant Mol. Biol. 5:299. Додаткові гени селектованих маркерів, які можна використовувати в способах за винаходом, включають гени бактеріального походження, наприклад, які надають стійкості до антибіотиків, такі як гени гентаміцинацетилтрансферази, стрептоміцинфосфотрансферази, аміноглікозид-3'аденілтрансферази, і стійкості до блеоміцину. Див., Hayford et al. (1988), Plant Physiol. 86:1216; 8 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Jones et al. (1987), Mol. Gen. Genet. 210:86; Svab et al. (1990), Plant Mol. Biol. 14:197; і Hille et al. (1986), Plant Mol. Biol. 7:171. Інші гени селектованих маркерів можуть надавати стійкості до гербіцидів, таких як гліфосат, глуфосинат або бромоксиніл. Див. Comai et al. (1985), Nature, 317:741-744; Gordon-Kamm et al. (1990), Plant Cell, 2:603-618; і Stalker et al. (1988), Science, 242:419-423. Гени інших селектованих маркерів, які можна використовувати в способах за винаходом, включають гени небактеріального походження. Ці гени включають, наприклад, без обмеження, гени мишачої дигідрофолатредуктази, рослинної 5-енолпірувілшикімат-3-фосфатсинтетази і рослинної ацетолактатсинтетази. Див. Eichholtz et al. (1987), Somatic Cell Mol. Genet. 13:67; Shah et al. (1986), Science, 233:478; і Charest et al. (1990), Plant Cell Rep. 8:643. Для іншого класу маркерних генів, придатних для трансформації рослин, може знадобитися скринінг передбачувано трансформованих клітин рослини, а не пряма генетична селекція трансформованих клітин на стійкість до токсичної речовини, такої як антибіотик. Ці гени особливо корисні для кількісної оцінки або візуалізації просторової картини експресії гена у визначених тканинах і їх часто іменують "репортерними генами", тому що для дослідження експресії гена їх можна злити з геном або регуляторною послідовністю гена. Звичайно використовувані гени для скринінгу трансформованих клітин включають, без обмеження, βглюкуронідазу (GUS), β-галактозидазу, люциферазу і хлорамфеніколтрансферазу. Див. Jefferson (1987), Plant Mol. Biol. Rep. 5:387; Teeri et al. (1989), EMBO J. 8:343; Koncz et al. (1987), Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84:131; і DeBlock et al. (1984), EMBO J. 3:1681. Нещодавно стали доступні in vivo способи візуалізації активності GUS, що не вимагають руйнування тканини рослини. Публікація Molecular Probes 2908 (1993), Imagene Green™, pр. 1-4; і Naleway et al. (1991), J. Cell Biol. 115:151a. Зовсім нещодавно як маркери експресії генів у прокаріотичних і еукаріотичних клітинах стали використовувати гени, що кодують флуоресцентні білки (наприклад, GFP, EGFP, EBFP, ECFP і YFP). Див. Chalfie et al. (1994), Science, 263:802. Таким чином, флуоресцентні білки і мутації флуоресцентних білків можна використовувати як скриновані маркери у деяких варіантах здійснення винаходу. Експресійні вектори для поглинання за допомогою наночастинок: промотори Гени, включені в молекули лінійних нуклеотидних касет, можуть, необов'язково, керуватися нуклеотидною послідовністю, що містить регуляторний елемент, наприклад промотор. В галузі трансформації на сьогоднішній момент добре відомі декілька типів промоторів, а також інші регуляторні елементи, які можна використовувати індивідуально або разом із промоторами. Промотор являє собою область ДНК, яка може розташовуватися вище початку транскрипції, і може брати участь у упізнаванні і зв'язуванні РНК-полімерази і/або інших білків для ініціації транскрипції. "Рослинним промотором" може бути промотор, здатний ініціювати транскрипцію в рослинних клітинах. Приклади промоторів, які залежать від стадії розвитку рослин, включають промотори, що переважно ініціюють транскрипцію у визначених тканинах, таких як листи, корені, насіння, волокна, судини ксилеми, трахеїди або склеренхіма. Такі промотори відносять до тканинопереважних. Промотори, які ініціюють транскрипцію тільки у визначених тканинах, відносять до тканиноспецифічних. Специфічний до типу клітини промотор, у першу чергу, керує експресією у визначених типах клітин в одному або декількох органах, наприклад у судинних клітинах у коренях або листах. Індуцибельним промотором може бути промотор, який може знаходиться під контролем навколишнього середовища. Приклади умов навколишнього середовища, які можуть впливати на транскрипцію, керовану індуцибельними промоторами, включають, без обмеження, анаеробні умови або наявність освітлення. Тканиноспецифічні, тканинопереважні, специфічні до типу клітини і індуцибельні промотори складають клас "неконститутивних" промоторів. "Конститутивний" промотор є промотором, що може бути активним у більшості умов навколишнього середовища. 1. Індуцибельні промотори Індуцибельний промотор може бути функціонально зв'язаний з геном, призначеним для експресії в клітині. Необов'язково, індуцибельний промотор може бути функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує сигнальну послідовність, яка може бути функціонально зв'язана з геном, призначеним для експресії в клітині. З індуцибельним промотором швидкість транскрипції збільшується у відповідь на дію індукуючого агента. У даному винаході можна використовувати будь-який індуцибельний промотор. Див. Ward et al. (1993), Plant Mol. Biol. 22:361-366. Типові індуцибельні промотори включають, без обмеження, промотори, одержані з ACEI-системи, що відповідають на присутність іонів міді (Mett et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4567-71); промотор гена In2 з маїсу, що відповідає за переносимість бензолсульфамідного гербіциду (Hershey et al. (1991), Mol. Gen 9 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Genetics, 227:229-237; і Gatz et al. (1994), Mol. Gen. Genetics, 243:32-38); і промотор Tetрепресора з Tn10 (Gatz et al. (1991), Mol. Gen. Genetics, 227:229-237). Особливо придатним індуцибельним промотором може бути промотор, що відповідає на індукуючий агент, на який рослини звичайно не відповідають. Таким типовим індуцибельним промотором є індуцибельний промотор з гена стероїдного гормону, транскрипційна активність якого може індукуватися глюкокортикостероїдним гормоном. Schena et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:0421. 2. Конститутивні промотори Конститутивний промотор може бути функціонально зв'язаний з геном, призначеним для експресії в клітині, або конститутивний промотор може бути функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує сигнальну послідовність, яка може бути функціонально зв'язана з геном, призначеним для експресії в клітині. У варіантах здійснення даного винаходу можна використовувати різні конститутивні промотори. Типові конститутивні промотори включають без обмеження: промотори з вірусів рослин, такі як, але не обмежені ними, промотор 35S з CaMV (Odell et al. (1985), Nature, 313:810812); промотори генів актину з рису (McElroy et al. (1990), Plant Cell, 2:163-171); промотор убіквітину (Christensen et al. (1989), Plant Mol. Biol. 12:619-632; і Christensen et al. (1992), Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991), Theor. Appl. Genet. 81:581-588); MAS (Velten et al. (1984), EMBO J. 3:2723-2730); промотор гістону Н3 кукурудзи (Lepetit et al. (1992), Mol. Gen. Genetics, 231:276-285; і Atanassova et al. (1992), Plant Journal 2 (3):291-300); і ALS-промотор, XbaI/NcoI-фрагмент у 5'-напрямку від структурного гена ALS3 Brassica napus (або нуклеотидна послідовність, аналогічна зазначеному XbaI/NcoI-фрагменту). Див. міжнародну публікацію РСТ WO 96/30530. 3. Тканиноспецифічні або тканинопереважні промотори Тканиноспецифічний промотор може бути функціонально зв'язаний з геном, призначеним для експресії в клітині. Необов'язково, тканиноспецифічний промотор може бути функціонально зв'язаний з нуклеотидною послідовністю, що кодує сигнальну послідовність, яка може бути функціонально зв'язана з геном, призначеним для експресії в клітині. Рослини, трансформовані геном, що представляє інтерес, функціонально зв'язаним із тканиноспецифічним промотором, можуть продукувати білковий продукт трансгена виключно або переважно у визначеній тканині. У варіантах здійснення даного винаходу можна використовувати будь-який тканиноспецифічний або тканинопереважний промотор. Типові тканиноспецифічні або тканинопереважні промотори включають, без обмеження, переважно функціонуючий в коренях промотор, наприклад промотор гена фазеоліну (Murai et al. (1983), Science, 23:476-82; і Sengupta-Gopalan et al. (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82:3320-4); специфічно функціонуючий у листах і індукований освітленням промотор, наприклад промотори генів cab або rubisco (Simpson et al. (1985), EMBO J. 4(11):2723-2729; і Timko et al. (1985), Nature, 318:57982); специфічно функціонуючий у пиляках промотор, наприклад промотор гена LAT52 (Twell et al. (1989), Mol. Gen. Genetics, 217:240-5); специфічно функціонуючий у пилку промотор, наприклад промотор гена Zml3 (Guerrero et al. (1993), Mol. Gen. Genetics, 244:161-8); або переважно функціонуючий у мікроспорах промотор, наприклад промотор гена apg (Twell et al. (1993), Sex. Plant Reprod. 6:217-24). Транспорт білка, продукованого трансгенами, у субклітинний компартмент, такий як хлоропласт, вакуоль, пероксисома, гліоксисома, клітинна стінка або мітохондрія, або з метою секреції в апопласт, можна здійснити за допомогою функціонального зв'язування нуклеотидної послідовності, що кодує сигнальну послідовність, з 5' і/або 3'-областю гена, який кодує білок, що представляє інтерес. Такі "направляючі" послідовності на 5'- і/або 3'-кінці гена можуть визначати, наприклад, під час синтезу і процесингу білка, клітинний компартмент, у який в результаті надійде кодований білок. В альтернативному варіанті такі направляючі в субклітинний компартмент білки можуть бути прямо зв'язані з наночастинкою для того, щоб направити наночастинку, покриту молекулами, що представляють інтерес, нуклеїнових кислот, у бажаний субклітинний компартмент. Присутність сигнальної послідовності направляє поліпептид або у внутрішньоклітинну органелу, або в субклітинний компартмент, або на секрецію в апопласт. У даній галузі відома множина сигнальних послідовностей. Див., наприклад, Becker et al. (1992), Plant Mol. Biol. 20:49; Close P.S., Master's Thesis, Iowa State University (1993); Knox et al. (1987), Plant Mol. Biol. 9:3-17; Lerner et al. (1989), Plant Physiol. 91:124-9; Fontes et al. (1991), Plant Cell, 3:483-96; Matsuoka et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88:834; Gould et al. (1989), J. Cell. Biol. 108:1657; Creissen et al. (1991), Plant J. 2:129; Kalderon et al. (1984), Cell, 39:499-509; Steifel et al. (1990), Plant Cell. 2:785-93. Гени чужорідних білків і агротехнічні гени 10 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Трансгенні рослини по варіантах здійснення даного винаходу можуть продукувати чужорідний білок у комерційних кількостях. Таким чином, методики селекції і розведення трансформованих рослин дають множину трансгенних рослин, які збирають загальноприйнятим чином. Чужорідний білок потім можна екстрагувати з тканини, що представляє інтерес, або з загальної біомаси. Екстракцію білка з рослинної біомаси можна виконати відомими способами, які обговорюються, наприклад, у Heney and Orr (1981), Anal. Biochem. 114:92-6. У деяких аспектах винаходу рослинним матеріалом, призначеним для комерційного одержання чужорідного білка, може бути рослина, тканина рослини або клітина рослини. У деяких аспектах біомасою, що представляє інтерес, може бути насіння рослини. Для трансгенних рослин, що показують більш високі рівні експресії, може бути створена генетична карта, наприклад, за допомогою загальноприйнятих RFLP-, ПЛР- і SSR-аналізів, які ідентифікують приблизне місце розташування на хромосомі вбудованої молекули ДНК. Приклади методик у цій галузі див. у Glick and Thompson, Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology CRC Press, Boca Raton, 269:284 (1993). Інформація про картування місця розташування на хромосомі може бути корисною, наприклад, для захисту патентованого об'єкта - трансгенної рослини, або для оцінки біологічної безпеки. При проведенні неправомочного розведення і здійснення схрещування з іншою зародковою плазмою, можна провести порівняння карти області інтеграції з аналогічними картами для підозрілих рослин для того, щоб визначити, чи мають останні загальне походження з рослиною - об'єктом захисту. Порівняння карт може включати в себе гібридизацію, RFLP, ПЛР, SSR і секвенування, які усі є загальноприйнятими методиками. Аналогічним чином, агротехнічні гени можна експресувати у трансформованих клітинах або їх потомстві. Більш конкретно, рослини можна генетично модифікувати за допомогою способів за винаходом для експресії різних фенотипів, що представляють агротехнічний інтерес. Типові гени, які можна використовувати в цьому відношенні, включають, але не обмежені цим, гени, упорядковані по категоріях нижче. 1. Гени, що надають стійкості до шкідників або захворювань: А) Гени стійкості до захворювань. Захисні властивості рослини часто активуються специфічною взаємодією між продуктом гена стійкості до захворювання (R) у рослині і продуктом відповідного гена авірулентності (Avr) у патогені. Сорт рослини можна трансформувати клонованими генами стійкості, щоб створити рослини, стійкі до визначених штамів патогену. Див., наприклад, Jones et al. (1994), Science, 266:789 (клонування гена томата Cf-9 для стійкості до Cladosporium fulvum); Martin et al. (1993), Science, 262:1432 (ген томата Pto для стійкості до Pseudomonas syringae pv. tomato кодує протеїнкіназу); Mindrinos et al. (1994), Cell, 78:1089 (ген RSP2 для стійкості до Pseudomonas syringae). B) Ген, що надає стійкості до шкідників, наприклад цистоутворювальної нематоди сої. Див., наприклад, міжнародну публікацію PCT WO 96/30517 і міжнародну публікацію PCT WO 93/19181. C) Білок Bacillus thuringiensis, його похідне або синтетичний поліпептид, змодельований на його основі. Див., наприклад, Geiser et al. (1986), Gene, 48:109 (клонування і нуклеотидна послідовність гена Bt δ-ендотоксину). Більше того, молекули ДНК, що кодують гени δендотоксину, можна придбати в Американській Колекції Типових Культур (Manassas, VA), наприклад, під номерами доступу ATCC-40098, 67136, 31995 і 31998. D) Лектин. Див., наприклад, Van Damme et al. (1994), Plant Molec. Biol. 24:25 (нуклеотидні послідовності декількох генів манозозв'язувального лектину з Clivia miniata). E) Вітамінзв'язувальний білок, наприклад авідин. Див. міжнародну публікацію PCT US93/06487 (застосування авідину і гомологів авідину як ларвіцидів проти комах-шкідників). F) Інгібітор ферменту, наприклад інгібітор протеази або протеїнази або інгібітор амілази. Див., наприклад, Abe et al. (1987), J. Biol. Chem. 262:16793 (нуклеотидна послідовність інгібітору цистеїнової протеїнази рису), Huub et al. (1993), Plant Molec. Biol. 21:985 (нуклеотидна послідовність кДНК, що кодує інгібітор I тютюнової протеїнази), Sumitani et al. (1993), Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (нуклеотидна послідовність інгібітору альфа-амілази з Streptomyces nitrosporeus); і патент США № 5,494,813. G) Специфічний для комах гормон або феромон, наприклад екдистероїд і ювенільний гормон, їх варіант, міметик на їх основі або їх антагоніст або агоніст. Див., наприклад, Hammock et al. (1990), Nature, 344:458 (бакуловірусна експресія клонованої естерази ювенільного гормону, інактиватора ювенільного гормону). H) Специфічний для комах білок або нейропептид, який при експресії порушує фізіологію обробленого шкідника. Див., наприклад, Regan (1994), J. Biol. Chem. 269:9 (експресійне клонування дає ДНК, що кодує рецептор діуретичного гормону комахи); і Pratt et al. (1989), 11 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Biochem. Biophys. Res. Comm. 163:1243 (алостатин може бути ідентифікований у Diploptera puntata). Див. також патент США № 5,266,317 (гени, що кодують специфічні для комах паралітичні нейротоксини). I) Специфічна для комах отрута, вироблювана в природі зміями, осами або будь-яким іншим організмом. Див., наприклад, Pang et al. (1992), Gene, 116:165 (гетерологічна експресія в рослинах гена, що кодує токсичний для комах пептид скорпіона). J) Фермент, відповідальний за гіперакумуляцію монотерпену, сесквітерпену, стероїду, гідроксамової кислоти, похідного фенілпропаноїду або іншої небілкової молекули з інсектицидною дією. K) Фермент, що бере участь у модифікаційних процесах, включаючи посттрансляційну модифікацію біологічно активних молекул, наприклад гліколітичний фермент, протеолітичний фермент, ліполітичний фермент, нуклеаза, циклаза, трансаміназа, естераза, гідролаза, фосфатаза, кіназа, фосфорилаза, полімераза, еластаза, хітиназа або глюканаза, або природні, або синтетичні. Див. міжнародну публікацію PCT WO 93/02197 (нуклеотидна послідовність гена калази). Молекули ДНК, що містять кодуючі хітиназу послідовності, можна одержати, наприклад, з ATCC під номерами доступу 39637 і 67152. Див. також Kramer et al. (1993), Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (нуклеотидна послідовність кДНК, що кодує хітиназу бражника тютюнового); і Kawalleck et al. (1993), Plant Molec. Biol. 21:673 (нуклеотидна послідовність гена ubi4-2 поліубіквітину петрушки). L) Молекула, що стимулює сигнальну трансдукцію. Див., наприклад, Botella et al. (1994), Plant Molec. Biol. 24:757 (нуклеотидні послідовності для кДНК-клонів кальмодуліну золотистої квасолі); і Griess et al. (1994), Plant Physiol. 104:1467 (нуклеотидна послідовність кДНК-клону кальмодуліну кукурудзи). M) Пептид з гідрофобним моментом. Див., наприклад, міжнародну публікацію PCT WO 95/16776 (пептидні похідні тахіплезину, що інгібують грибкові патогени рослин); і міжнародну публікацію PCT WO 95/18855 (синтетичні антимікробні пептиди, що надають стійкості до захворювань). N) Мембранна пермеаза, білок, що формує або блокує канали. Див. наприклад, Jaynes et al. (1993), Plant Sci, 89:43 (гетерологічна експресія аналога літичного пептиду цекропіну-β для надання трансгенним рослинам тютюну стійкості до Pseudomonas solanacearum). O) Вірусний інвазивний білок або одержуваний з нього комплексний токсин. Наприклад, акумуляція білків оболонки вірусу в трансформованих клітинах рослини надає стійкості до вірусної інфекції і/або розвитку захворювання, що викликається вірусом, з якого одержаний ген білка оболонки, а також спорідненими вірусами. Див. Beachy et al. (1990), Ann. rev. Phytopathol. 28:451. Стійкість, опосередкована білком оболонки, була надана трансформованим рослинам проти вірусу мозаїки люцерни, вірусу мозаїки огірка, вірусу тютюнової смужки, X-вірусу картоплі, Y-вірусу картоплі, вірусу гравірування тютюну, вірусу погремковості тютюну і вірусу тютюнової мозаїки. Id. P) Специфічне до комах антитіло або одержуваний з нього імунотоксин. Таким чином, антитіло, мішенню якого є критична метаболічна функція в комасі, може інактивувати ферментмішень, убиваючи комаху. Див. Taylor et al., Abstract #497, Seventh Int'l Symposium on Molecular Plant-Microbe Interactions (Edinburgh, Scotland) (1994) (інактивація ферменту в трансгенному тютюні за допомогою продукції одноланцюжкових фрагментів антитіла). Q) Специфічне до вірусу антитіло. Див., наприклад, Tavladoraki et al. (1993), Nature, 366:469 (трансгенні рослини, експресуючі гени рекомбінантного антитіла, захищені від зараження вірусом). R) Зупиняючий розвиток білок, продукований у природі патогеном або паразитом. Наприклад, грибкові ендо-α-1,4-D-полігалактуронази сприяють колонізації грибків і вивільненню живильних речовин з рослини шляхом розчинення клітинної стінки гомо-α-1,4-Dгалактуроназою. Див. Lamb et al. (1992), Bio/Technology, 10:1436. Див. також Toubart et al. (1992), Plant J. 2:367 (клонування і характеристика гена, що кодує білок-інгібітор ендополігалактуронази з квасолі). S) Зупиняючий розвиток білок, продукований у природі рослиною. Див., наприклад, Logemann et al. (1992), Bio/Technology, 10:305 (трансгенні рослини, експресуючі ген інактивації рибосом з ячменю, мають підвищену стійкість до грибкових захворювань). 2. Гени, що надають стійкості до гербіциду: A) Гербіцид, що інгібує точку росту або меристему, такий як імідазолінон або сульфонілсечовина. Типові гени в цій категорії кодують мутантний фермент ALS і AHAS, як описано, наприклад, Lee et al. (1988), EMBO J. 7:1241; і Miki et al. (1990), Theor. Appl. Genet. 80:449, відповідно. 12 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 B) Стійкість до гліфосату, що надається, наприклад, генами мутантної 5-енолпірувілшикімат3-фосфатсинтетази (EPSP) (за допомогою введення рекомбінантних нуклеїнових кислот і/або різних форм in vivo мутагенезу нативних генів EPSP, генів aroА і генів гліфосатацетилтрансферази (GAT), відповідно); стійкість до інших фосфоносполук, що надається такими генами, як гени глюфосинатфосфінотрицинацетилтрансферази (PAT) з видів Streptomyces, включаючи Streptomyces hygroscopicus і Streptomyces viridichromogenes; і стійкість до піридинокси- або феноксипропіонових кислот і циклогексонів (надається генами, що кодують інгібітор ACCази). Див., наприклад, патент США № 4,940,835 і патент США № 6,248,876 (нуклеотидні послідовності форм EPSP, що надають рослині стійкості до гліфосату). Молекулу ДНК, що кодує мутантний ген аrоА, можна одержати в ATCC під номером доступу 39256. Див. також патент США № 4,769,061 (нуклеотидна послідовність мутантного гена аrоА). У європейській патентній заявці № 0333033 і патенті США № 4,975,374 описані нуклеотидні послідовності генів глутамінсинтетази, що можуть надавати стійкості до гербіцидів, таких як Lфосфінотрицин. Нуклеотидні послідовності типових генів фосфінотрицинацетилтрансферази наводяться в Європейській патентній заявці № 0242246 і в DeGreef et al. (1989), Bio/Technology, 7:61 (одержання трансгенних рослин, які експресують химерні гени bar, що кодують білки з РАТактивністю). Приклади генів, які надають стійкості до феноксипропіонових кислот і циклогексонів, таких як сетоксидим і галоксифоп, включають гени Acc1-S1, Acc1-S2 і Acc1-S3, описані Marshall et al. (1992), Theor. Appl. Genet. 83:435. Гени GAT, здатні надавати стійкості до гліфосату, описані, наприклад, у WO 2005012515. Гени, що надають стійкості до 2,4-Dфеноксипропіонової кислоті і піридилоксиауксинових гербіцидів, описані, наприклад, у WO 2005107437. C) Гербіцид, інгібуючий фотосинтез, такий як триазин (psbA і gs+) або бензонітрил (ген нітрилази). Див., наприклад, Przibila et al. (1991), Plant Cell, 3:169 (трансформація Chlamydomonas плазмідами, що кодують мутантні гени psbA). Нуклеотидні послідовності генів нітрилаз описані в патенті США № 4,810,648, і молекули ДНК, що містять ці гени, доступні під номерами доступу ATCC-53435, 67441 і 67442. Див. також Hayes et al. (1992), Biochem. J. 285:173 (клонування й експресія ДНК, що кодує глутатіон-S-трансферазу). 3. Гени, які надають ознаку, що збільшує прибуток, або додають у неї внесок, такі як: A) Модифікований метаболізм жирних кислот, наприклад, шляхом трансформації рослини антисмисловим геном стеарил-ACP десатурази для збільшення вмісту стеаринової кислоти в рослині. Див. Knultzon et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624. B) Знижений вміст фітату. Введення гена, що кодує фитазу, може підсилити розщеплення фітату, додаючи більше вільного фосфату в трансформовану рослину. Див., наприклад, Van Hartingsveldt et al. (1993), Gene, 127:87 (нуклеотидна послідовність гена фитази з Aspergillus niger). Можна ввести ген для зменшення вмісту фітату. У кукурудзі, наприклад, це можна виконати клонуванням і повторним введенням ДНК, асоційованої з одним алелем, що може відповідати за мутанти кукурудзи, які відрізняються низьким вмістом фітинової кислоти. Див. Raboy et al. (1990), Maydica 35:383. C) Модифікований вуглеводний склад рослин, обумовлений, наприклад, трансформуванням рослин геном, який кодує фермент, що змінює схему розгалуження крохмалю. Див. Shiroza et al. (1988), J. Bacteol. 170:810 (нуклеотидна послідовність гена мутантної фруктозилтрансферази з Streptococcus); Steinmetz et al. (1985), Mol. Gen. Genet. 20:220 (ген левансукрази); Pen et al. (1992), Bio/Technology. 10:292 (α-амілаза); Elliot et al. (1993), Plant Molec. Biol. 21:515 (нуклеотидні послідовності генів інвертази томата); Sogaard et al. (1993), J. Biol. Chem. 268:22480 (ген α-амілази ячменю); і Fisher et al. (1993), Plant Physiol. 102:1045 (фермент II розгалуження крохмалю ендосперму кукурудзи). С. Наночастинки Деякі варіанти здійснення винаходу стосуються способів введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, у рослинну клітину, яка містить клітинну стінку. У деяких варіантах здійснення винаходу спосіб може включати здійснення контакту між наночастинками, покритими молекулою, що представляє інтерес, функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, і рослинною клітиною; і забезпечення можливості поглинання наночастинки через клітинну стінку. У конкретних варіантах здійснення винаходу наночастинка може оборотно або необоротно містити, бути покрита або як-небудь інакше зв'язана з молекулою, що представляє інтерес, функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети і/або нести її. У цих і додаткових варіантах здійснення винаходу наночастинка може бути функціоналізована групою, яка вступає в реакцію з групою на молекулі функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, для того, щоб одержати наночастинку, кон'юговану з молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє 13 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інтерес. У деяких варіантах здійснення винаходу молекулу функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, можна ввести в наночастинки до контакту з рослинною клітиною, що має клітинну стінку, або одночасно з введенням наночастинки в рослинну клітину, що має клітинну стінку. Приклади наночастинок, які можна використовувати у варіантах здійснення даного винаходу, включають, без обмеження, квантові точки, інші напівпровідникові наночастинки, позитивно заряджені наночастинки, золоті наночастинки, покриті золотом наночастинки, пористі наночастинки, мезопористі наночастинки, кремнієві наночастинки, полімерні наночастинки, такі як дендримери, вольфрамові наночастинки, желатинові наночастинки, нанооболонки, наноядра, наносфери, нанотрубочки і магнітні наночастинки. У конкретних варіантах здійснення винаходу поверхня наночастинки може бути функціоналізована, що може, наприклад, дозволяти спрямоване поглинання або може дозволяти оборотне або необоротне зв'язування інших речовин з поверхнею наночастинки. Як необмежуючий обсяг винаходу приклад, поверхня наночастинки (наприклад, квантової точки) могла б бути функціоналізована самозбираним моношаром, наприклад, алкантіолятів, які можна додатково функціоналізувати або одержати їх похідні. У додатковому необмежуючому обсяг винаходу прикладі, поверхню наночастинок можна модифікувати лінкерами, які самі можна додатково функціоналізувати або модифікувати, наприклад стрептавідином. В одному варіанті здійснення винаходу наночастинка може бути ПЕГильована. В інших варіантах здійснення винаходу наночастинка може містити або може бути поліфункціоналізована одним або декількома з ядра (активного або неактивного), стеричної оболонки (активної або інертної), розщеплюваної сполуки і/або направляючої молекули або ліганду. У деяких варіантах здійснення винаходу наночастинкою може бути кон'югат стрептавідинQD. Кон'югат стрептавідин-QD виготовлений з нанометрового кристала напівпровідникового матеріалу (CdSe), що покритий додатковою напівпровідниковою оболонкою (ZnS) для поліпшення оптичних властивостей матеріалу. Він має вузький симетричний спектр емісії з максимумом близько 605 нм. Ядро й оболонка додатково покриті полімерною оболонкою, яка дозволяє кон'югувати їх з біомолекулами і зберігати їх оптичні властивості. Ця полімерна оболонка прямо зв'язана зі стрептавідином. Кон'югат стрептавідину і QD має розмір великої макромолекули або білка (приблизно 15-20 нм). Поверхню підготовляли, щоб вона мала низький неспецифічний сигнал при інкубації зі зразками в різних водних буферах. Квантові точки можна з'єднати зі стрептавідином прямо за допомогою реакції зв'язування активованих складних ефірів. У результаті утворюється матеріал зі стрептавідином, ковалентно приєднаним до поверхні (звичайно 5-10 молекул стрептавідину на квантову точку в кон'югаті), що дає в результаті кон'югати стрептавідину і квантових точок з високоспецифічною біологічною активністю. Відповідно до варіантів здійснення даного винаходу рослинною клітиною, що має клітинну стінку, може бути будь-яка рослинна клітина, що містить інтактну і цілу клітинну стінку. Приклади клітин, що мають клітинну стінку, включають, без обмеження: водорості, тютюн, моркву, кукурудзу, канолу, рапс, бавовник, пальму, арахіс, сою, цукрову тростину, Otyza sp., Arabidopsis sp. і Ricinus sp. Варіанти здійснення винаходу можуть включати клітини, що містять клітинну стінку, з будь-якої тканини або будь-якого місця, де вони були знайдені, включаючи, без обмеження: зародки, меристемні клітини, калюс, пилок, включаючи гаплоїдні і подвійні гаплоїдні мікроспори, листи, пиляки, корені, кінчики коренів, квітки, насіння, стручки, стебла і культуру тканини. У конкретних варіантах здійснення винаходу молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, може бути будь-яка молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, яку можна доставити в рослинну клітину, що має клітинну стінку, за даним винаходом. Молекули функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет, що представляють інтерес, можуть містити нуклеотидні послідовності, без обмеження: молекули ДНК, РНК, РНКі, гени, плазміди, косміди, YAC (дріжджові штучні хромосоми) і BAC (бактеріальні штучні хромосоми). Молекули функціоналізованих лінійних нуклеїнових кислот, що представляють інтерес, можуть бути введені в рослинну клітину, що має клітинну стіну, одночасно, наприклад, з наступними сполуками, без обмеження: поліпептидами, ферментами, гормонами, глікопептидами, цукрами, жирами, сигнальними пептидами, антитілами, вітамінами, месенджерами, вторинними месенджерами, амінокислотами, цАМФ, лікарськими сполуками, гербіцидами, фунгіцидами, антибіотиками і/або їх комбінаціями. Наночастинки, такі як квантові точки, можна функціоналізувати з використанням ПЕГ, використовуючи протокол згідно з Dubertret et al. (2002), Science, 298:1759, або за вищевказаним протоколом, модифікованим відповідно до рішення досвідченого фахівця. 14 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Наприклад, покриті TOPO (триоктилфосфіноксидом) CdSe/ZnS-квантові точки можна ресуспендувати з ПЕГ-ПЕ в хлороформі з наступним випарюванням розчинника і солюбілізацією одержаних ПЕГильованих квантових точок у воді. В аспектах винаходу наночастинки можуть бути поглинені різними частинами клітини. Приклади місць, які можуть поглинати наночастинки, включають без обмеження: цитозоль, ядро, тонопласти, пластиди, етіопласти, хромопласти, лейкопласти, елайопласти, протеїнопласти, амілопласти, хлоропласти і просвіт подвійної мембрани. В інших варіантах здійснення винаходу поглинання наночастинок рослинною клітиною, що містить клітинну стінку, може відбутися по симпластичному або апопластичному шляху. D. Стабільно трансформовані рослинні клітини Стабільно трансформованою рослинною клітиною за винаходом може бути будь-яка рослинна клітина, здатна трансформуватися з використанням молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, шляхом опосередкованої наночастинками трансформації. Відповідно, рослинна клітина може бути виділена або культивована з дводольної або однодольної рослини. Рослинна клітина також може бути присутньою у тканині рослини або в цілій рослині. Необмежувальні приклади стабільно трансформованих рослинних клітин із дводольних рослин за винаходом включають: люцерну, квасолю, броколі, капусту, моркву, цвітну капусту, селеру, китайську капусту, бавовник, огірок, баклажан, латук, диню, горох, перець, арахіс, картоплю, оранжевий гарбуз, редис, рапс, шпинат, сою, зелений гарбуз, цукровий буряк, соняшник, тютюн, томат і кавун. Необмежувальні приклади стабільно трансформованих рослинних клітин з однодольних рослин за винаходом включають: кукурудзу, цибулю, рис, сорго, пшеницю, жито, сочевицю, цукрову тростину, овес, тритикале, просо і газонну траву. Для скринінгу трансгенних рослин, що експресують ген стійкості до глуфосинату, їх можна обприскувати використовуваним у сільському господарстві рівнем гербіциду, глуфосинату амонію (GLA). Сходи Т1 Arabidopsis, одержані з використанням способів за винаходом, показували стійкість до гербіциду при п'яти послідовних застосуваннях використовуваного в сільському господарстві дозування глуфосинату, наприклад через день, починаючи з 7-го дня після проростання. Геномну ДНК із цих трансгенних рослин аналізували на присутність pat і yfp за допомогою ПЛР, і результати показали присутність послідовностей ДНК pat і yfp. Секвенування ПЛР-продуктів в результаті виявило коректні послідовності трансгенів pat і yfp в Т1-рослинах Arabidopsis, одержаних з використанням способів за винаходом. Трансгенні рослини за винаходом можна регенерувати зі стабільно трансформованих рослинних клітин, одержаних способами за винаходом. Такі рослини можна використовувати або культивувати будь-яким чином, причому присутність молекул, що представляють інтерес, нуклеїнових кислот є бажаною. Відповідно, трансгенні рослини можуть бути генетично модифіковані, inter alia, для того, щоб вони мали одну або декілька бажаних ознак, шляхом трансформування їх молекулами функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет за допомогою опосередкованої наночастинками трансформації, і оброблені і культивовані будьяким способом, відомим досвідченим фахівцям у даній галузі. Наступні приклади наведені для ілюстрації деяких конкретних ознак і/або варіантів здійснення. Приклади не слід витлумачувати як такі, що обмежують винахід конкретними наведеними ознаками або варіантами здійснення. ПРИКЛАДИ Приклад 1: Одержання наночастинок для трансформації рослинних клітин Одержання ДНК; плазмідна ДНК ДНК плазміди pDAB383 (фігура 1) була виділена і підготовлена для трансформації рослини лінійною ДНК, опосередкованою покритими стрептавідином квантовими точками. Ця плазміда містить ген селектованого маркера, РАТ, керований промотором убіквітину 10 з Arabidopsis (AtUbi10), і ген жовтого флуоресцентного білка з Philadium (PhiYFP), керований промотором вірусу мозаїки прожилок маніоки (CsVMV). Експерименти по трансформації досліджували з використанням лінеаризованої ДНК. Для лінеаризації pDAB3831 виконували ПЛР. Плазміду pDAB3831 ампліфікували за допомогою ПЛР, використовуючи проточну термоциклічну систему. Міжнародна публікація РСТ WO 2008/045288. Приготовляли зразок, що містить: 12 % MgCl2 (25 мМ), 0,33 % Taq ДНКполімерази (5 од./мкл), 2,0 % суміші чотирьох дезоксинуклеотидів (дезоксіаденозину трифосфату (dATP), дезоксицитидину трифосфату (dCTP), дезоксигуанозину трифосфату (dGTP) і дезокситимідину трифосфату (dTTP)), 8,0 % матриці (мкг/мл), 61,66 % розчину Pluronic F108 (1,5 % розчину), 4 % прямого праймера, 4 % зворотного праймера і 8 % реакційного буфера (10 концентрації). Сполучені сектори системи встановлювали на температуру 95 °C, 15 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 59 °C і 72 °C для реакцій дисоціації, відпалювання і подовження, відповідно. ПЛР-суміш прокачували через систему, використовуючи посудину під тиском 20 PSI. Після надходження реакційної суміші в термоконтрольований відсік, використовували мінеральну олію для проштовхування зразка по всій довжині каналів. Швидкість потоку реакційної суміші підтримували за допомогою регулятора потоку на 0,25 мл/хв. Специфічну ДНК, присутню у зразку, ампліфікували в міру його циклічного проходження через температурні зони. Після тридцятого циклу збирали вміст. ПЛР-продукт очищали на гель-фільтраційній колонці з наступним осадженням етанолом. Зразок очищеного продукту аналізували на Agilent Bioanalyzer™, а також електрофорезом в агарозному гелі, щоб підтвердити розмір і концентрацію ПЛР-продукту. Матрицею, використовуваною для описаної вище ПЛР, була DAS-плазміда pDAB3831. Прямий праймер SEQ ID NO:1 і зворотний праймер синтезували для ампліфікації повної експресійної касети 4,6 т.п.о. (тобто лінеаризованої ДНК), що містить обидва гени і їх промотори. На доповнення, для забезпечення кон'югації лінійної дцДНК із поверхнею наночастинок, молекули біотину хімічно приєднували до фосфатної групи праймерів, використовуючи біотин-TEG-CE-фосфорамідит. Даний фосфорамідит має подовжене 15-атомне спейсерне плече зі змішаною полярністю на основі триетиленгліколевого лінкера. Вигодою подовженого спейсерного плеча, що відділяє функцію біотину від іншого олігонуклеотиду, є зниження будь-яких ефектів стеричних утруднень при зв'язуванні молекули стрептавідину. При міченні прямого праймера біотин знаходиться на початку ДНК. При міченні зворотного праймера біотин знаходиться вкінці фрагмента ДНК. Біотинільований (в обох орієнтаціях) фрагмент ДНК, таким чином, може бути приєднаний до покритих стрептавідином наночастинок. З використанням біотинільованих олігонуклеотидів і проточної термоциклічної системи було одержано приблизно 20 мг лінійного фрагмента ДНК. Утворення комплексів лінійної ДНК і наночастинок Покриті стрептавідином квантові точки були одержані від Evident Technology (Troy, NY). 1 мл покритих стрептавідином квантових точок (4 нмоль) інкубували 30 хвилин з 0,5 мг біотинільованої лінеаризованої плазмідної ДНК при кімнатній температурі з утворенням комплексу лінійна ДНК/QD. Приклад 2: Трансформація бутонів квіток Arabidopsis Рослинний матеріал для трансформації in planta Синхронне проростання насіння важливе для гарантії однорідності розвитку квіток у рослин Т0. Насіння A. thaliana екотипу Columbia суспендували в 0,1 % (вага/об'єм) розчині агару і інкубували 48 годин при 4 °C для завершення стратифікації. 60 мг насіння зважували і переносили в 15 мл пробірку. Додавали 13 мл 0,1 % (вага/об'єм) розчину агару і струшували на вортексі до рівномірного розподілу насіння. Це давало концентрацію розчину насіння, що складає 4,6 мг насінин/мл 0,1 % (вага/об'єм) розчину агару (або приблизно 230 насінин/мл). Приготовляли 6 пробірок (72 мл розчину) для посіву на 4 піддони, що містили 18 (31/2дюймових) горщиків в кожному лотку. Розчин насіння інкубували 48 годин при 4 °C для завершення стратифікації. У кожен горщик висівали індивідуально по 1,0 мл стратифікованого розчину насіння. Після посіву на всі горщики, для підтримання вологості ґрунту на лотки поміщали ковпаки для розмноження. Ковпаки забирали через 5 днів після дати посіву. Насіння сходило, і рослини вирощували в Conviron® (моделі CMP4030 і CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) в умовах довгого світлового дня (16 годин 2 світла/8 годин темряви) при інтенсивності освітлення 120-150 мкмоль/м с, при постійній температурі (22 °C) і вологості (40-50 %). Рослини поливали через 10-14 днів після висаджування розчином Хоагланда і згодом дистильованою водою для підтримання ґрунту вологим, але не мокрим. Через 4 тижні після посіву зрізали квітки, щоб одержати ще більш однорідний ріст вторинних квіток. На 5-му тижні після посіву рослини підготовляли для процесу трансформації. Трансформація in planta Трансформацію A. thaliana екотипу Columbia лінійною ДНК/квантовими точками виконували, використовуючи модифікований протокол від Clough і Bent. Clough and Bent (1998), Plant J. 16:735-43. 20 мл суспензії з розчином комплексу лінійної ДНК/QD з концентрацією 0,5 мг лінійної ДНК і 4 нМ PQD приготовляли і використовували для обробки рослин Arabidopsis (в основному незрілих суцвіть з декількома заплідненими стручками). Перед зануренням рослин до розчину лінійної ДНК/QD додавали Silwet L-77 до концентрації 0,05 % (об'єм/об'єм) (250 мкл/500 мл) 0,005 % і добре перемішували. Наземні частини рослини занурювали в розчин лінійної ДНК/PQD на 30 секунд при м'якому погойдуванні. Оброблені рослини поміщали на бік на 30 16 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 хвилин у тінь при 22-24 °C. Рослини переносили в Conviron в описані вище умови, залишали рости до зрілості, після чого збирали насіння. Для скринінгу маси зібраного насіння від рослин Т 0 використовували лотки для селекції (лотки 10,5"21"1"), приблизно 10000 насінин на кожен лоток. Для гарантії того, що селекційне обприскування було проведене правильно, використовували два контролі: негативний контроль трансформації, Col-0; і Columbia Col-0 дикого типу з внесеним гомозиготним насінням із селектованим маркером РАТ (фосфінотрицинацетилтрансферазою) як позитивним контролем трансформації. Для досягнення синхронізації насіння стратифікували в 0,1 % (вага/об'єм) розчині агару протягом 48 годин перед посівом. Щоб забезпечити 10000 насінин на лоток для відбору, 200 мг насіння додавали до 0,1 % (вага/об'єм) розчину агару і струшували на вортексі до рівномірного суспендування насіння. Стратифіковане насіння потім висівали на лотки для відбору, заповнені Sunshine mix LP5, і поливали через піддон розчином Хоагланда. Для ефективності обприскування для селекції важливо, щоб 40 мл суспендованого насіння були посіяні рівномірно на лоток для селекції. Після посіву на кожен лоток для селекції поміщали куполи для розмноження, і рослини вирощували для проведення селекції. Куполи для розмноження забирали приблизно через 5 днів після посіву. Приклад 3: Аналіз трансформованих рослин Arabidopsis Відбір трансформованих рослин Свіжозібране насіння Т1 залишали сушитися на 7 днів при кімнатній температурі. Насіння Т 1 висівали в лотки для пророщення (26,551 см), у кожен лоток висівали аліквоту 200 мг стратифікованого насіння Т1 (приблизно 10000 насінин), яке попередньо ресуспендували в 40 мл 0,1 % (вага/об'єм) розчину агарози і залишали на 2 дні при 4 °C для завершення періоду спокою і гарантії одночасного проростання насіння. Sunshine Mix LP5 покривали дрібнозернистим вермикулітом і поливали через піддон розчином Хоагланда доти, поки ґрунт не ставав вологим, надлишок вологи видаляли самопливом. Кожну аліквоту (40 мл) стратифікованого насіння висівали рівномірно на вермикуліт за допомогою піпетки і закривали куполами для зволоження на 4-5 днів. Куполи видаляли за 1 день до першої селекції трансформантів з використанням післясходового обприскування глуфосинатом. Через сім днів після посадки (DAP) рослини Т 1 (сім'ядоля і стадія 2-4 листів, відповідно) обприскували послідовно п'ять разів протягом п'яти днів 0,2 % (вага/об'єм) розчином гербіциду Liberty (200 г кислотних еквівалентів (к.е.)/л глуфосинату, Bayer Crop Sciences, Kansas City, MO) у кількості 10 мл розчину для обприскування на лоток (703 л/га), використовуючи наконечник пневматичного обприскувача DeVilbiss для досягнення ефективної концентрації 280 г к.е./га глуфосинату на одну обробку. Через 4-7 днів після останнього обприскування ідентифікували рослини, що вижили (активно зростаючі), і пересаджували їх індивідуально в 3-дюймові горщики, підготовлені з горщиковим середовищем (Metro Mix 360). Пересаджені рослини закривали ковпаками для вологості на 3-4 дні і поміщали в ростову камеру на 22 °C як раніше або переносили відразу в теплицю. Ковпаки згодом забирали, і рослини вирощували в теплиці (при 22±5 °C, 50±30 % відносній вологості, 14 годин світла/10 годин темряви і мінімум 500 2 1 мкЕрг/м с природного + штучного світла). Молекулярний аналіз і доказ геномної інтеграції трансгенів Геномну ДНК із трансгенних рослин A. thaliana виділяли з листового матеріалу 6-тижневих рослин, використовуючи Plant DNAZOL™ (Invitrogen) відповідно до інструкцій виготовлювача. ПЛР-праймери підбирали для детекції трансгенів YFP і PAT. YFP-праймери представлені як SEQ ID NO:3 і SEQ ID NO:4. РАТ-праймери представлені як SEQ ID NO:5 і SEQ ID NO:6. ПЛР-ампліфікація трансгенів на геномній ДНК ПЛР-ампліфікацію РАТ і YFP виконували, використовуючи набір TaKaRa ExTaq™ (Takara, Otsu, Shiga, Japan). Гени ампліфікували в загальному об'ємі реакційної суміші 50 мкл. ПЛРсуміш містила 100 нг геномної ДНК-матриці, 1 реакційний буфер ExTaq, 0,2 мМ суміш dNTP (чотирьох дезоксинуклетидів), 10 пмоль кожного праймера і 0,025 од./мкл ExTaq-полімерази. Використовували наступні умови проведення ПЛР: 1 цикл при 96 °C протягом 5 хв.; і 31 цикл при наступних умовах: 15 сек. при 94 °C, 30 сек. при 65 °C, 1 хв. при 72 °C; і кінцеве подовження протягом 7 хв. при 72 °C. Продукт ПЛР-ампліфікації аналізували електрофорезом у 0,8 % ТАЕагарозному гелі і візуалізували забарвленням бромистим етидієм. Фрагменти ДНК очищали з агарозного гелю, використовуючи набір для очищення з гелю QIAEX™ II (Qiagen, Valencia, CA). ПЛР-фрагменти секвенували, використовуючи прямий праймер для РАТ (SEQ ID NO:5) і прямий праймер для YFP (SEQ ID NO:3), з використанням удосконаленої методики секвенування по Сенгеру (MWG Biotech, Huntsville, AL). Дані, одержані в результаті секвенування, аналізували, використовуючи програму Sequencher. 17 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Результати секвенування ПЛР-ампліконів РАТ і YFP збігалися з очікуваною нуклеотидною послідовністю для цих генів. Ці результати ясно вказують на те, що послідовності РАТ і YFP з pDAB3831 були стабільно інтегровані в геномну ДНК Arabidopsis з використанням протоколу трансформації ДНК наночастинками і лінійною ДНК-касетою. Ці результати вказують на те, що послідовності РАТ і YFP були введені в геном за допомогою опосередкованої наночастинками доставки лінеаризованої ДНК у прикладі 1 і, таким чином, забезпечують доказ стабільної інтеграції трансгенів у геномну ДНК рослин Arabidopsis. Приклад 4: Опосередкована наночастинками доставка молекул функціоналізованих лінійних нуклеотидних касет у культивовані рослинні клітини Одержання матеріалу одиночних рослинних клітин Використовували як клітини BY2, так і клітини NT1. Клітини BY2 являють собою швидкоростучу лінію клітин рослин тютюну, в яких відсутній зелений пігмент. Клітини NT1 являють собою фотоаутотрофні клітини, виділені з тютюну. За 3-4 дні до трансформації однотижневу суспензійну культуру пересівали у свіже середовище, переносячи 2 мл культури NT1 або BY2 у 40 мл середовища NT1B або LSBY2, що містить 50 нМ DAS-PMTI-1 (інгібітор мікротрубочок) і 0,5-0,1 % (об'єм/об'єм) DMSO у 250-мл колбі. Одиночні клітини збирали або через чотири, або через сім днів після обробки інгібітором мікротрубочок. Використовувані одиночні клітини BY2 пропускали через проточний цитометр Beckman для підрахунку живих клітин. Клітини досліджували, використовуючи диференціальний інтерференційно-контрастний (DIC) мікроскоп, з'єднаний з конфокальною системою візуалізації, щоб визначити, що одиночні клітини містять велике число пластид (амілопластів), розподілених по цитоплазмі клітини. Клітини пересівали один раз у 14 днів, переносячи 1 мл суспензії при 3,0 OD600. Культивовані клітини використовували як клітини-мішені для трансформації. Одержання наночастинок і обробка клітин Для трансформації рослин лінійною ДНК/квантовими точками (QD) виділяли і підготовляли плазмідну ДНК. Плазміда містить ген селектованого маркера, РАТ, керований промотором убіквітину 10 з Arabidopsis (AtUbi10), і ген жовтого флуоресцентного білка з Philadium (PhiYFP), керований промотором вірусу мозаїки прожилок маніоки (CsVMV). Штам Escherichia coli, що містить плазміду, висівали і ростили до помутніння середовища Луреа-Бертані, що містить ампіцилін, при 37 °C. ДНК виділяли, використовуючи набір Qiagen Plasmid Midi-Prep (Qiagen, Valencia, CA). Для лінеаризації плазмідної ДНК виконували ПЛР, використовуючи проточну термоциклічну систему. Міжнародна публікація РСТ WO 2008/045288. Приготовляли зразок, що містить: 12 % MgCl2 (25 мМ), 0,33 % Taq ДНК-полімерази (5 од./мкл), 2,0 % суміші dNTP (дезоксіаденозину трифосфату (dATP), дезоксицитидину трифосфату (dCTP), дезоксигуанозину трифосфату (dGTP) і дезокситимідину трифосфату (dTTP)), 8,0 % матриці (мкг/мл), 61,66 % розчину Pluronic F108 (1,5 % розчину), 4 % прямого праймера, 4 % зворотного праймера і 8 % реакційного буфера (10 концентрації). Сполучені сектори системи встановлювали на температуру 95 °C, 59 °C і 72 °C для реакцій дисоціації, відпалювання і подовження, відповідно. ПЛР-суміш прокачували через систему, використовуючи посудину під тиском 20 PSI. Після надходження реакційної суміші в термоконтрольований відсік, використовували мінеральну олія для проштовхування зразка по всій довжині каналів. Швидкість потоку реакційної суміші підтримували за допомогою регулятора потоку на 0,25 мл/хв. Специфічну ДНК, присутню у зразку, ампліфікували у міру його циклічного проходження через температурні зони. Після тридцятого циклу збирали вміст. ПЛР-продукт очищали на гель-фільтраційній колонці з наступним осадженням етанолом. Зразок очищеного продукту аналізували на Agilent Bioanalyzer™, а також електрофорезом в агарозному гелі, щоб підтвердити розмір і концентрацію ПЛР-продукту. Прямий і зворотний праймери синтезували для ампліфікації повної експресійної касети (тобто лінеаризованої ДНК), що містить обидва гени і їх промотори. На доповнення, для забезпечення кон'югації лінійної дцДНК із поверхнею наночастинок молекули біотину хімічно приєднували до фосфатної групи праймерів, використовуючи біотин-TEG-CE-фосфорамідит. Біотинільований (в обох орієнтаціях) фрагмент ДНК, таким чином, може бути приєднаний до покритих стрептавідином наночастинок. З використанням біотинільованих олігонуклеотидів і проточної термоциклічної системи лінійний фрагмент ДНК був одержаний у міліграмових кількостях. Утворення комплексів лінійної ДНК і наночастинок Покриті стрептавідином квантові точки були одержані від Evident Technology (Troy, NY). 1 мл покритих стрептавідином квантових точок (4 нмоль) інкубували 30 хвилин з 0,5 мг 18 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 біотинільованої лінеаризованої плазмідної ДНК при кімнатній температурі з утворенням комплексу лінійна ДНК/QD. Наночастинки, кон'юговані з лінійною ДНК, додавали в кількості 1-3 мкл/мл до 500 мкл клітин у 24-ямковому планшеті і м'яко обертали на гойдалці протягом 20 хвилин у темряві. У цей час наночастинки переносяться через клітинну стінку. Приклад 5: Опосередкована поліфункціоналізованими наночастинками трансформація in planta рослин Arabidopsis Трансформацію in planta рослин Arabidopsis можна провести, використовуючи модифікований протокол від Clough і Bent, 1998. Для підвищення ефективності трансформації оптимізували концентрацію ДНК на поліфункціоналізованій наночастинці разом з молекулами направляючих доменів білкової трансдукції (PTD) і NLS-одиниць (одиниць сигналу ядерної локалізації). Рослинний матеріал: здорові рослини Arabidopsis вирощували в умовах довгого світлового дня в горщиках у ґрунті до цвітіння. Перші суцвіття видаляли для посилення проліферації множини вторинних суцвіть. Рослини готові приблизно через 4-6 днів після видалення суцвіть. Рослини A. thaliana екотипу Columbia (Col-0) були вибрані як вихідні (рослини Т 0) для трансформації in planta квіток. Синхронізоване проростання насіння важливе для гарантії однорідності розвитку квіток у рослин Т 0. Насіння рослин дикого типу суспендували в 0,1 % розчині агару і інкубували 48 годин при 4 °C для завершення стратифікації. 60 мг насіння зважували на папері для зважування і переносили в 15 мл пробірку. Додавали 13 мл 0,1 % розчину агару і струшували на вортексі до рівномірного розподілу насіння. Це давало концентрацію розчину насіння, що складає 4,6 мг насінин/мл розчину (або приблизно 230 насінин/мл). Приготовляли 6 пробірок (72 мл розчину) для посіву на 4 піддони, що містили 18 (31/2 дюймових) горщиків в кожному лотку, і висівали в загальному 2 горщики. Розчин інкубували 48 годин при 4 °C для завершення стратифікації. У кожен горщик висівали індивідуально по 1,0 мл стратифікованого розчину насіння на горщик. Після посіву на всі горщики, для підтримання вологості ґрунту на лотки поміщали ковпаки для розмноження. Ковпаки забирали через 5 днів після дати посіву. Насіння сходило, і рослини вирощували в Conviron® (моделі CMP4030 і CMP3244, Controlled Environments Limited, Winnipeg, Manitoba, Canada) в умовах довгого світлового дня (16 годин світла/8 годин темряви) при інтенсивності 2 освітлення 120-150 мкмоль/м с, при постійній температурі (22 °C) і вологості (40-50 %). Рослини поливали через 10-14 днів після висаджування рослин розчином Хоагланда і згодом дистильованою водою для підтримання ґрунту вологим, але не мокрим. Через 4 тижні після посіву зрізали квітки, щоб одержати ще більш однорідний ріст вторинних квіток. На 5-му тижні після посіву рослини підготовляли для процесу трансформації. Одержання нанокон'югатів для обробки квіток: для обробки були вибрані наночастинки з діапазоном розмірів 2-120 нм і поліфункціоналізовані лінійною ДНК-касетою і направляючими пептидами згідно з Derufus et. al. (2007). Були одержані квантові точки з максимумом емісії 655 або 705 нм і модифіковані стрептавідином і аміногрупами. Концентрації QD вимірювали за допомогою оптичного поглинання при 595 нм, використовуючи коефіцієнти екстинкції, надані постачальником. Використовуваними зшивальними агентами були сульфо-LC-SPDP (сульфосукцинімідил-6-(3'-[2-піридилдитіо]-пропіонамідо)гексаноат) (Pierce) і сульфо-SMCC (сульфосукцинімідил-4-(N-малеімідометил)циклогексан-1-карбоксилат) (Sigma). Аміномодифіковані стрептавідин-QD кон'югували з кон'югованими з біотином лінійними ДНКкасетами і направляючими пептидами, використовуючи зшивальні агенти. QD ресуспендували в розчині, що містить 50 мМ фосфат натрію, 150 мМ хлорид натрію, pН 7,2, використовуючи фільтри Amicon Ultra-4 (поріг 100 кДа). До QD додавали зшивальний агент (у 1000-кратному надлишку) і залишали для проходження реакції на 1 годину. Зразки фільтрували самопливом на колонку NAP-5 (для видалення надлишку зшивального агента) в аналогічному буфері з доданою 10 мМ EDTA. Пептиди звичайно використовували з ліофілізованого порошку. Пептиди і лінійні ДНК-касети додавали до фільтрованих QD і залишали для проходження реакції на ніч при 4 °C. З використанням трьох фільтрів Amicon продукт двічі фільтрували з фосфатносольовим буфером по Дульбекко (PBS), двічі з високосольовим буфером (1,0М хлорид натрію, 100 мМ цитрат натрію, рН 7,2) і знову двічі з PBS. Промивання високою сіллю вимагаються для видалення електростатично зв'язаних молекул ДНК і пептидів, що не видаляються тільки промиваннями PBS. Сульфо-SMCC має N-гідроксисукцинімідний (NHS) складний ефір на одному кінці, що вступає в реакцію з аміномодифікованими QD з утворенням амідного зв'язку. Сульфо-SPDP також містить N-гідроксисукцинімідний (NHS) складний ефір, що вступає у реакцію з аміногрупами, який швидко вступає в реакцію з будь-якою молекулою, що містить первинний амін, таким чином утворюючи стабільний амідний зв'язок. 19 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Трансформація in planta і скринінг стійких рослин Т 1: приготовляли кінцевий об'єм 250-500 мл суспензії з розчину кон'югата наночастинок, направляючого пептиду і лінійної ДНК-касети, і потім рослини Arabidopsis (в основному незрілі суцвіття з декількома заплідненими стручками) використовували для обробки. Перед зануренням рослин до розчину NHpD-кон'югата додавали Silwet L-77 до концентрації 0,05 % (250 мкл/500 мл) - 0,005 % і добре перемішували. Наземні частини рослини занурювали в розчин NHpD-кон'югата на 2-30 секунд при м'якому погойдуванні. Оброблені рослини поміщали під ковпак або закривали на 16-24 години при 2224 °C. Рослини переносили в Conviron і залишали рости до зрілості, після чого збирали насіння. Для скринінгу маси зібраного насіння від рослин Т 0 використовували лотки для селекції (лотки 10,5"21"1") і приблизно 10000 насінин на кожен лоток. Для гарантії того, що селекційне обприскування було проведене правильно, використовували два контролі: негативний контроль трансформації, Col-0; і Columbia Col-0 дикого типу з внесеним гомозиготним насінням із селектованим маркером РАТ (фосфінотрицинацетилтрансферазою) як позитивним контролем трансформації. Для досягнення синхронізації насіння стратифікували в 0,1 % (вага/об'єм) розчині агару протягом 48 годин перед посівом. Щоб забезпечити 10000 насінин на лоток для відбору, 200 мг насіння додавали до 0,1 % розчину агару і струшували на вортексі до рівномірного суспендування насіння. Стратифіковане насіння потім висівали на лотки для відбору, заповнені Sunshine mix LP5, і поливали через піддон розчином Хоагланда. Для ефективності обприскування для селекції важливо, щоб 40 мл суспендованого насіння були посіяні рівномірно на лоток для селекції. Після посіву на кожен лоток для селекції поміщали куполи для розмноження, і рослини вирощували для проведення селекції, використовуючи умови, зазначені раніше. Куполи для розмноження забирали приблизно через 5 днів після посіву. Сходи обприскували через п'ять днів після посіву і повторно через 10 днів після посіву, використовуючи 0,2 % (об'єм/об'єм) розчин (20 мкл/10 мл дистильованої води) глуфосинату амонію (гербіцид LIBERTY® від Bayer CropSciences) у кількості 10 мл розчину для обприскування на лоток (703 л/га) і наконечник пневматичного обприскувача DeVilbiss для досягнення ефективної концентрації 280 г/га глуфосинату на одну обробку. Кількість приготовлюваного гербіциду Liberty® обчислювали наступним чином: (703 л/га об'єму обприскування = 280 GPA). (280 г активного інгредієнта (а.і.)/га)  (1 га/703 л)  (1 л/200 г а.і. глуфосинату) = 0,20 % розчин (або 20 мкл/10 мл). 10 мл розчину переносили за допомогою піпетки в 20 мл сцинтиляційну пробірку для кожного обприскуваного лотка. Обприскування проводили горизонтально і вертикально. Через 4-7 днів після другого обприскування ідентифікували стійкі до гербіциду рослини. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, у клітину рослини, що має клітинну стінку, причому спосіб включає в себе: надання рослинної клітини, що має клітинну стінку; покривання наночастинки на основі квантової точки молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, де наночастинка на основі квантової точки містить функціональну групу, яка взаємодіє з молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес; здійснення контакту між рослинною клітиною, що має клітинну стінку, і покритою наночастинкою на основі квантової точки; і забезпечення можливості поглинання наночастинки на основі квантової точки і молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, рослинною клітиною, що містить клітинну стінку. 2. Спосіб за п. 1, у якому наночастинкою на основі квантової точки є кон'югована наночастинка стрептавідин-QD. 3. Спосіб за п. 1, який додатково включає в себе забезпечення можливості поглинання наночастинки на основі квантової точки компартментом рослинної клітини, що містить клітинну стінку. 4. Спосіб за п. 3, який додатково включає в себе покривання наночастинки на основі квантової точки білком, що направляє в субклітинний компартмент. 5. Спосіб за п. 4, у якому компартмент вибраний із групи, що складається з цитозолю, ядра, тонопластів, пластиди, етіопласта, хромопласта, лейкопласта, елайопласта, протеопласта, амілопласта, хлоропласта і просвіту подвійної мембрани. 6. Спосіб за п. 1, у якому рослинною клітиною, що має клітинну стінку, є рослинна клітина з видів комерційних сільськогосподарських рослин. 20 UA 112758 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 7. Спосіб за п. 6, у якому рослинна клітина вибрана з групи, що складається з клітин тютюну, моркви, кукурудзи, каноли, рапсу, бавовнику, пальми, арахісу, сої, Oryza sp., Arabidopsis sp., Ricinus sp. і цукрової тростини. 8. Спосіб за п. 6, у якому рослинна клітина належить до тканини, вибраної з групи, що складається з зародка, меристеми, калюсу, пилку, листів, пиляків, коренів, кінчиків коренів, квіток, насіння, стручків і стебел. 9. Спосіб за п. 1, у якому рослинною клітиною, що має клітинну стінку, є культивована клітина. 10. Спосіб за п. 1, у якому наночастинкою на основі квантової точки є напівпровідникова наночастинка. 11. Спосіб за п. 1, який додатково включає в себе модифікацію поверхні наночастинки на основі квантової точки. 12. Спосіб за п. 1, у якому молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, містить нуклеотидну послідовність, вибрану з групи, що складається з молекул ДНК, РНК, РНКі і генів. 13. Спосіб за п. 12, у якому молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, містить ген. 14. Спосіб за п. 13, у якому геном є ген чужорідного білка, агротехнічний ген або маркерний ген. 15. Спосіб за п. 1, у якому молекула функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, одержана за допомогою ПЛР-ампліфікації нуклеотидної послідовності. 16. Спосіб за п. 15, у якому нуклеотидна послідовність одержана з молекули нуклеїнової кислоти, вибраної з групи, що складається з плазмід, космід, штучних хромосом, дріжджових штучних хромосом і бактеріальних штучних хромосом. 17. Спосіб за п. 12, який додатково включає в себе відбір клітин, що мають стабільно інтегровану молекулу функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес. 18. Спосіб за п. 17, у якому вибрані клітини є регенерованими клітинами. 19. Спосіб за п. 18, який додатково включає в себе регенерацію рослини з регенерованих клітин. 20. Спосіб введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, у рослинний матеріал, причому спосіб включає в себе: надання рослинного матеріалу, причому рослинний матеріал вибраний із групи, що складається з рослинних клітин, рослинних тканин і рослин; надання наночастинки на основі квантової точки; покривання наночастинки на основі квантової точки молекулою функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес; забезпечення контакту між клітиною, що має клітинну стінку, і покритою наночастинкою на основі квантової точки; і забезпечення можливості поглинання наночастинки на основі квантової точки і молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети, що представляє інтерес, рослинним матеріалом. 21. Спосіб за п. 20, у якому рослинний матеріал є рослинною тканиною, вибраною з групи, що складається з зародка, меристемної тканини, калюсу, пилку, листів, пиляків, коренів, кінчиків коренів, квіток, насіння, стручків і стебел. 21 UA 112758 C2 22 UA 112758 C2 23 UA 112758 C2 24 UA 112758 C2 25 UA 112758 C2 26 UA 112758 C2 27 UA 112758 C2 28

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Production of functionalized linear dna cassette and quantum dot/nanoparticle mediated delivery in plants

Автори англійською

Yau, Kerrm Y., Samuel, Jayakumar Pon, Burroughs, Frank G., Samboju, Narasimha Chary, Webb, Steven R.

Автори російською

Йо Керрм Й., Сэмьюел Джаякумар Пон, Берроуз Фрэнк Дж., Самбоджу Нарасимха Чари, Уэбб Стивен Р.

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/87, C12N 15/82, B82B 3/00

Мітки: касеті, нуклеотидної, спосіб, клітину, клітинну, введення, лінійної, функціоналізованої, містить, молекули, стінку

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/34-112758-sposib-vvedennya-molekuli-funkcionalizovano-linijjno-nukleotidno-kaseti-u-klitinu-shho-mistit-klitinnu-stinku.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб введення молекули функціоналізованої лінійної нуклеотидної касети у клітину, що містить клітинну стінку</a>

Подібні патенти