Трансгенна рослина, яка містить cry1ab та cry2aa, для регулювання європейського кукурудзяного метелика і способи боротьби зі стійкістю комах

Є ще 23 сторінки.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Трансгенна рослина, що містить ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry1Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry2Aa.

2. Трансгенна рослина за п. 1, яка додатково містить ДНК, що кодує третій інсектицидний білок, вказаний третій білок вибраний з групи, яка складається з Cry1Fa, Cry1Be, Cry1I і DIG-3.

3. Трансгенна рослина за п. 2, де вказаний третій білок вибраний з групи, яка складається з Cry1Fa і Cry1Be, вказана рослина додатково містить ДНК, що кодує четвертий і п'ятий інсектицидні білки, вибрані з групи, яка складається з Cry1Ca, Cry1Da, Cry1E і Vip3Ab.

4. Трансгенна насінина рослини за будь-яким з пп. 1-3, де вказана насінина містить вказану ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry1Ab, і ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry2Aa.

5. Множина трансгенних рослин на полі, що включає рефугійні рослини, які не містять Bt, і множину рослин за будь-яким з пп. 1-3, де вказані рефугійні рослини складають менше 40 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин.

6. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 30% від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин.

7. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 20% від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин.

8. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 10 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин.

9. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 5 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин.

10. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини розташовані в блоках або смугах.

11. Суміш насіння, що містить рефугійне насіння від рефугійних рослин, які не містять Bt, і множину трансгенного насіння за п. 4, де вказане рефугійне насіння складає менше 40 % всього насіння в суміші.

12. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 30 % всього насіння в суміші.

13. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 20 % всього насіння в суміші.

14. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 10 % всього насіння в суміші.

15. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 5 % всього насіння в суміші.

16. Спосіб керованого розвитку стійкості до Cry-білка у європейського кукурудзяного метелика, що включає посадку трансгенного насіння для виробництва множини рослин на полі за п. 5.

17. Множина рослин на полі за будь-яким з пп. 5-10, де вказані рослини займають більше 10 акрів.

18. Рослина за будь-яким з пп. 1-3, де вказана рослина вибрана з групи, яка складається з кукурудзи, сої і бавовни.

19. Рослина за п. 18, де вказана рослина являє собою рослину кукурудзи.

20. Рослинна клітина рослини за будь-яким з пп. 1-3, де вказана рослинна клітина містить вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Cry1Ab, і вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Cry2Aa, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab щонайменше на 99 % ідентичний SEQ ID NO:1, і вказаний інсектицидний білок Cry2Aa щонайменше на 99 % ідентичний SEQ ID NO:2.

21. Рослина за будь-яким з пп. 1-3, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:1, і вказаний інсектицидний білок Cry2Aa містить SEQ ID NO:2.

22. Спосіб контролювання комахи європейського кукурудзяного метелика шляхом контактування вказаної комахи з інсектицидним білком Cry1Ab і інсектицидним білком Cry2Aa.

Текст

Дивитися

Реферат: UA 111814 C2 (12) UA 111814 C2 Даний винахід пропонує рослини та їх насіння, які містять ДНК, що кодують інсектицидний білок Cry1Ab та інсектицидний білок Cry2Аа. Рослини також можуть додатково містити ДНК, що кодує інші інсектицидні білки. Запропоновано комплектування білка Cry1Ab і білка Cry2Аа для отримання рослин (зокрема, зернових і кукурудзи), більш стійких і менш схильних до того, щоб дати можливість розвиватися комахам, які стійкі до активності якого-небудь з цих двох токсинів. Ці комплекти можна застосовувати специфічно проти європейського кукурудзяного метелика. UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Передумови винаходу Люди вирощують кукурудзу з метою отримання продуктів харчування і енергії. Комахи поїдають і ушкоджують рослини кукурудзи і тим самим підривають ці зусилля людини. Сучасний трансгенних контроль цих шкідників в рослині досягається за рахунок експресії в рослині гена кристалічного (Cry) дельта-ендотоксину, що кодує білок CryIFa Bacillus thuringiensis. Cry 1 Fa являє собою білковий токсин, в цей час присутній в трансгенному насінні кукурудзи марки Herculex™ Dow AgroSciences (Herculex, Herculex-Extra, і Herculex-RW), яке стійке до комах-шкідників FAW і ЕСВ. Цей білок діє шляхом зв'язування зі специфічним рецептором(ами), розташованим в кишечнику комах, і утворює пори в клітинах кишечнику. Формування цих пор заважає комахам регулювати осмотичний баланс, що приводить до їх загибелі. Проте, існує деяке побоювання, що комахи можуть бути в змозі виробляти стійкість до дії Cry I Fa завдяки генетичним змінам рецепторів в своєму кишечнику, які зв'язують CryIFa. Комахи, які продукують рецептори із зниженою здатністю зв'язувати CryIFa, можуть бути стійкі до активності Cry I Fa і тому виживати на рослинах, які експресують цей білок. З одним Cry-токсином, постійно присутнім в рослині в умовах її росту, існує побоювання, що комахи можуть набути стійкість до активності цього білка завдяки генетичним змінам рецептора, який зв'язується з токсином CryIFa в кишечнику комах. Зменшення зв'язування токсину через ці зміни рецептора приведе до зниження токсичності CryIFa, можливо, яка веде в кінцевому результаті до зниження ефективність білка при експресії в сільськогосподарській культурі. КОРОТКИЙ ОПИС Даний винахід стосується, зокрема, комплектування білка CrylAb і білка Сгу2Аа, щоб зробити рослини (зокрема, зернові і кукурудзу) більш стійкими і менш схильними до того, щоб дати можливість розвиватися комахам, які стійкі до активності якого-небудь з цих двох токсинів. Ці комплекти можна застосовувати специфічно проти європейського кукурудзяного метелика (ЕСВ). ДОКЛАДНИЙ ОПИС Даний винахід стосується, зокрема, комплектування інсектицидного білка CrylAb і інсектицидного білка Сгу2Аа, щоб зробити рослини (зокрема, зернові і кукурудзу) більш стійкими і менш схильними до того, щоб дати можливість розвиватися комахам, які стійкі до активності якого-небудь з цих двох токсинів. Ці комплекти можна застосовувати специфічно проти європейського кукурудзяного метелика (ЕСВ; Ostrinia nubilalis). Даний винахід також стосується, зокрема, потрійних комплектів або "пірамід" з трьох (або більше) білкових токсинів, з білком CrylAb і білком Сгу2Аа, що складає основну пару. (Під "окремими ділянками впливу" мається на увазі, що будь-який з даних білків не викликає перехресної стійкості один з одним). Додавання третього білка, який націлений проти ЕСВ, може забезпечити білок з третьою ділянкою впливу проти ЕСВ. У деяких переважних варіантах здійснення, третій білок може бути вибраний з групи, яка складається з DIG-3 (дивись US 201000269223), CryII, CrylBe, Cry2Aa і CrylFa. Дивись, наприклад, USSN 61/284278, подану 16 грудня 2009 року. Дивись також US 2008-0311096. Таким чином, в деяких переважних варіантах здійснення вибрані токсини мають три окремі ділянки впливу проти ЕСВ. Знову ж, переважні "багаторівневі" комбінації являють собою пару білків плюс третій IRM-білок за винаходом. Пари і/або потрійні комплекти (активні відносно ЕСВ) за винаходом також можна комбінувати з додатковими білками - для націлювання, наприклад, проти трав'яної совки (FAW). Такі білки можуть включати, наприклад, Vip3, Cry 1С, CrylD і/або CrylE. CryBe і/або CrylFa може також застосовувати для націлювання проти FAW і ЕСВ. Для отримання послідовностей будь-яких генів і білків, розкритих або згаданих в цьому документі, можна використовувати GENBANK. Дивись Додаток А. Даний винахід також стосується трьох інсектицидних білків (білки Cry в деяких переважних варіантах здійснення), які активні відносно окремих шкідників-мішеней, але не приводять до перехресної стійкості один проти одного. Рослини (і ділянка, засаджена цими рослинами), які продукують ці три (як мінімум) токсини, включені в сферу охоплення даного винаходу. Можна також додати додаткові токсини/гени, але ці специфічні потрійні комплекти, відповідно до даного винаходу, могли б вигідно і несподівано забезпечити три ділянки впливу проти ЕСВ. Пари або потрійні комплекти (і/або комбінації додаткових білків) за даним винаходом можуть допомогти зменшити або ліквідувати вимоги для рефугійної ділянки (наприклад, менше 40 %, менше 20 %, менше ніж 10 %, менше 5 %, або навіть 0 % рефугію). Тому засіяне таким чином поле площею більше 10 акрів включене в даний винахід. Полінуклеотид(и) за винаходом, 1 UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 переважно, знаходиться в генетичній конструкції під контролем промотору(ів), відмінного від промотору(ів) Bacillus thuringiensis. Полінуклеотиди за винаходом можуть містити кодони для збільшення експресії в рослині. Для того, щоб протидіяти здатності комах виробляти стійкість до білка Cry, автори ідентифікували Cry-токсини, які неконкурентно зв'язуються з білковими рецепторами в травній системі ЕСВ. Було виявлено, що CrylAb не витісняє Сгу2Аа, зв'язаний з рецепторами, розташованими в кишечнику личинок комахи ЕСВ. Автори виявили, що Сгу2Аа і CrylAb є токсичними для личинок ЕСВ, але все ж вони не в повній мірі взаємодіють з однією і тією ж рецепторною ділянкою(ами); це показує, що їх токсичність не буде піддаватись перехресній стійкості в ЕСВ. Таким чином, комахи з розвиненою стійкістю до CrylAb будуть як і раніше чутливі до токсичності Сгу2Аа-білків, наприклад, тих, які зв'язуються з альтернативними рецепторними ділянками. Автори отримали біохімічні дані, які підтверджують це. Комбінація цих білків, експресованих в трансгенних рослинах, забезпечує корисний і цінний механізм зниження імовірності розвитку стійкості комах в полі і, таким чином, приводить до зниження вимог для рефугій. Дані, описані в цьому документі нижче, демонструють, що Сгу2Аа-білок, взаємодіє з окремою в порівнянні з CrylAb ділянкою(ами)-мішенню в кишечнику комахи, і тому може стати відмінним партнером по комплектації. Якщо стійкість наставала завдяки змінам в афінності рецепторів кишечнику комахи, які зв'язуються з Cry-токсинами, зміни повинні були статися, принаймні, в двох різних рецепторах одночасно, щоб дати можливість комахам вижити на рослинах, які експресують декілька білків. Імовірність такої події надто мала, що збільшує, таким чином, стійкість трансгенного продукту до захисту від комах, що мають здатність розвитку толерантності до білків. Автори мітили білок CrylAb радіоактивним йодом і використовували способи аналізу радіорецепторного зв'язування для визначення їх зв'язування з передбачуваними рецепторними білками, розташованими в мембранах кишечнику комахи. Мембрани кишечнику готували як мембранні везикули щіткової облямівки (BBMV) способом Волферсбергера. Йодування токсинів проводили з використанням або Iodo-Beads або оброблених пробірок Iodogen від Pierce Chemicals. Питома активність радіоактивноміченого токсину становила приблизно 1-4 мкКі/мкг білка. Дослідження по зв'язуванню проводили, в основному, за допомогою методики Лян (1995). Дані, представлені в цьому документі, показують, що токсини впливають на окрему в порівнянні з CrylAb ділянку-мішень в кишечнику комах і, таким чином, могли б стати відмінними партнерами по комплектації. Даний винахід можна застосовувати з множиною рослин. Приклади включають зернові (кукурудзу), сою і бавовну. Гени і токсини, придатні відповідно до даного винаходу, включають не тільки розкриті повнорозмірні послідовності, але також фрагменти цих послідовностей, варіанти, мутанти і злиті білки, які зберігають характерну пестицидну активність токсинів, специфічно представлених в цьому документі. Як використовується в цьому документі, терміни "варіанти" або "варіації" генів стосуються нуклеотидних послідовностей, які кодують ті ж токсини або які кодують еквівалентні токсини, що мають пестицидну активність. Як використовується в цьому документі, термін "еквівалентні токсини" стосується токсинів, що мають таку ж або, по суті, таку ж біологічну активність відносно шкідників-мішеней, що і заявлені токсини. Як використовується в цьому документі, межі складають приблизно 95 % (наприклад, CrylAb і Сгу2Аа), 78 % (наприклад, CrylA і Сгу2А) і 45 % (Cryl і Сгу2) ідентичності послідовностей, згідно з "Revision of the Nomenclature for the Bacillus thuringiensis Pesticidal Crystal Proteins", N. Crickmore, D.R. Zeigler, J. Feitelson, E. Schnepf, J. Van Rie, D. Lereclus, J. Baum, and D.H. Dean. Microbiology and Molecular Biology Reviews (1998) Vol 62: 807-813. Ці рівні можна також застосовувати тільки для основних білків. Фрагменти і еквіваленти, які зберігають пестицидну активність типових токсинів, знаходяться в межах даного винаходу. Крім того, внаслідок виродженості генетичного коду множина послідовностей ДНК можуть кодувати амінокислотні послідовності, розкриті в цьому документі. Це знаходиться в межах компетенції фахівця в галузі створення таких альтернативних послідовностей ДНК, що кодують такі ж або, по суті, такі ж токсини. Ці варіанти послідовностей ДНК знаходяться в рамках даного винаходу. Як використовується в цьому документі, посилання на "по суті, така ж" послідовність стосується послідовностей, які мають амінокислотні заміни, делеції, додавання або вставки, які істотно не впливають на пестицидну активність. Фрагменти генів, що кодують білки, які зберегли пестицидну активність, також включені в це визначення. 2 UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 35 Ще одним способом ідентифікації генів, що кодують токсини, і частин генів, корисних відповідно до даного винаходу, є спосіб з використанням олігонуклеотидних зондів. Ці зонди є детектовими нуклеотидними послідовностями. Ці послідовності можна визначити за допомогою відповідної мітки або можна зробити флуоресцентними за своїю природою, як описано в Міжнародній заявці No. WO93/16094. Як відомо в даній галузі, якщо молекула зонда і зразок нуклеїнової кислоти гібридизуються, утворюючи міцний зв'язок між двома молекулами, можна резонно передбачити, що зонд і зразок мають значну гомологію. Переважно, гібридизація проводиться в жорстких умовах за допомогою способів, відомих в даній галузі, як описано, наприклад, в Keller, G. Η., Μ. Μ. Manak (1987) DNA Probes, Stockton Press, New York, N.Y., pp. 169-170. Далі представлені деякі приклади концентрацій солі і температурних умов (в порядку збільшення жорсткості): 2Х SSPE або SSC при кімнатній температурі; ЇХ SSPE або SSC при 42 °C; 0,1Х SSPE або SSC при 42 °C; 0,1Х SSPE або SSC при 65 °C. Детектування зонда надає засоби для визначення відомим способом, чи сталася гібридизація. Такий зондовий аналіз надає швидкий спосіб визначення генів, що кодують токсин, за даним винаходом. Нуклеотидні сегменти, які використовуються як зонди відповідно до винаходу, можуть бути синтезовані з використанням ДНК-синтезатора і стандартних процедур. Ці нуклеотидні послідовності можна також використовувати як ПЛРпраймери, щоб ампліфікувати гени за даним винаходом. Певні білки за даним винаходом детально розглянуті в даному винаході. Оскільки ці білки є просто типовими білками за винаходом, то повинно бути очевидним, що даний винахід включає варіантні або еквівалентні білки (і нуклеотидні послідовності, що кодують еквівалентні білки) з пестицидною активністю, такою ж або схожою з пестицидною активністю типового білка. Еквівалентні білки повинні мати амінокислотну гомологію з типовим білком. Ця амінокислотна ідентичність, як правило, повинна бути більшою ніж 75 %, більшою ніж 90 % і може бути більшою ніж 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99 %. Амінокислотна ідентичність буде найбільш високою в критичних областях білка, які відповідальні за біологічну активність або залучені до встановлення просторової конфігурації, яка, зрештою, відповідає за біологічну активність. При цьому деякі амінокислотні заміни є прийнятними і можна очікувати, що ці заміни знаходяться в областях, які не є критичними для активності або є консервативними амінокислотними замінами, які не впливають на тривимірну структуру молекули. Наприклад, амінокислоти можна віднести до наступних класів: неполярних, незаряджених полярних, основних і кислих амінокислот. Консервативні заміни, при яких амінокислота одного класу замінюється іншою амінокислотою того ж типу, знаходяться в межах даного винаходу, за умови, що заміна істотним чином не змінює біологічної активності сполуки. Нижче приведений список прикладів амінокислот, що належать до кожного класу. У деяких випадках, також можна робити неконсервативні заміни. Критичним фактором є те, що ці мутації не повинні істотно зменшувати біологічну активність білка. Клас амінокислот неполярні незаряджені полярні кислі основні 40 45 50 55 Приклади амінокислот Ala, Val, Leu, Не, Pro, Met, Phe, Trp Gly, Ser, Thr, Cys, Tyr, Asn, Gin Asp, Glu Lys, Arg, His Трансформація рослин. Переважним рекомбінантним хазяєм для продукування інсектицидних білків за даним винаходом є трансформована рослина. Гени, що кодують білки Bt-токсину, як розкрито в цьому документі, можуть бути вбудовані в клітини рослин з використанням різноманітних способів, які добре відомі в даній галузі. Наприклад, велика кількість векторів для клонування, що містять систему реплікації в Escherichia coli і маркер, який дозволяє проводити селекцію трансформованих клітин, доступні для підготовки до введення чужорідних генів у вищі рослини. Вектори включають, наприклад, pBR322, серії pUC, серії МІЗтр, pACYC184, зокрема. Відповідно, фрагмент ДНК, що має послідовність, яка кодує білок Bt-токсину, можна вбудовувати у вектор по відповідному сайту рестрикції. Отриману в результаті плазміду використовують для трансформації в Е. coli. Клітини Е. coli культивують у відповідному поживному середовищі, а потім збирають і лізують. Плазміду виділяють. Аналіз послідовності, рестрикційний аналіз, електрофорез і інші біохімічні, молекулярно-біологічні способи, як правило, проводять як способи аналізу. Після кожної маніпуляції, використовувану послідовність ДНК можна розщеплювати і приєднувати до наступної послідовності ДНК. Кожна плазмідна послідовність може бути клонована в ту ж або інші плазміди. Залежно від способу вбудовування потрібних генів в рослину, можуть бути необхідні інші послідовності ДНК. Якщо, 3 UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 наприклад, для трансформації рослинної клітини використовується плазміда Ті і Ri, то, принаймні, права межа, а часто, права і ліва межі Т-ДНК плазміди Ті і Ri повинна бути з'єднана як фланкуюча область генів, яку потрібно вставити. Використання Т-ДНК для трансформації рослинних клітин було інтенсивно досліджене і достатньо описане в ЕР 120 516, Lee and Gelvin (2008), Hoekema (1985), Fraley et al., (1986), and An et al., (1985), і є прийнятим в даній галузі. Після того, як вбудована ДНК була інтегрована в геном рослини, вона є відносно стабільною. Трансформаційний вектор звичайно містить селективний маркер, який додає трансформованим клітинам рослин стійкості до біоциду або антибіотику, такому як Bialaphos, канаміцин, G418, блеоміцин або гігроміцин, зокрема. Індивідуально діючий маркер, відповідно, повинен давати можливість селектувати трансформовані клітини, а не клітини, які не містять вбудованої ДНК. Для вбудовування ДНК в рослинну клітину-хазяя доступна велика кількість способів. Ці способи включають в себе трансформацію Т-ДНК, використовуючи Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes як трансформаційний агент, злиття, ін'єкції, біолістику (бомбардування мікрочастинками) або електропорацію, а також інші можливі способи. Якщо для трансформації використовуються Agrobacteria, призначену для вбудовування ДНК необхідно клонувати в спеціальні плазміди, а саме, або в проміжний вектор, або в бінарний вектор. Проміжні вектори можуть бути інтегровані в плазміду Ті або Ri за допомогою гомологічної рекомбінації завдяки послідовностям, гомологічним послідовностям в Т-ДНК. Плазміда Ті або Ri також містить vir-область, необхідну для передачі Т-ДНК. Проміжні вектори не можуть самостійно реплікуватися в Agrobacteria. Проміжні вектори можна передати в Agrobacterium tumefaciens за допомогою плазміди-хелпера (кон'югація). Бінарні вектори можуть самостійно реплікуватися як в Е. соїі, так і в Agrobacteria. Вони містять ген селективного маркера і лінкер або полілінкер, який обмежений правою і лівою граничними областями Т-ДНК. Вони можуть бути трансформовані безпосередньо в Agrobacteria (Holsters et al., 1978). Agrobacterium, використані як клітини-хазяї, повинні містити плазміду, яка несе vir-область. Vir-область необхідна для передачі Т-ДНК в клітини рослин. Можуть міститися додаткові Т-ДНК. Таким чином, трансформовані бактерії використовуються для трансформації клітин рослин. Експлантати рослин можна успішно вирощувати з Agrobacterium tumefaciens або Agrobacterium rhizogenes для передачі ДНК в клітини рослин. Цілі рослини потім можна регенерувати з інфікованого рослинного матеріалу (наприклад, шматочки листя, сегменти стебла, коріння, а також протопласти або клітини, що культивуються в суспензії) у відповідному середовищі, яке може містити антибіотики або біоциди для селекції. Отримані таким чином рослини потім можна перевірити на наявність вбудованої ДНК. У разі ін'єкції і електропорації ніяких спеціальних маніпуляцій з плазмідами не здійснюють. Можна використовувати вихідні плазміди, такі як, наприклад, похідні pUC. Трансформовані клітини вирощують всередині рослини звичайним чином. Вони можуть утворювати статеві клітини і передавати трансформовану ознаку(и) рослинам-нащадкам. Такі рослини можна вирощувати звичайним чином і схрещувати з рослинами, що мають такі ж трансформовані спадкові чинники або інші спадкові чинники. Отримані в результаті гібридні особні мають відповідні фенотипічні властивості. У переважному варіанті здійснення даного винаходу, рослини трансформують генами, у яких коефіцієнт використання кодонів був оптимізований для рослин. Дивіться, наприклад, Патент США No. 5380831, що включений у даний опис за допомогою посилання. Хоча деякі укорочені токсини приведені в даному документі, в Bt-області відомо, що токсини типу 130 кДа (повнорозмірні) містять N-кінцеву половину, що являє собою основний токсин, і С-кінцеву половину, що являє собою "хвіст" протоксину. Таким чином, відповідні "хвости" можна використовувати з укороченими/основними токсинами за даним винаходом. Дивіться, наприклад, Патент США No. 6218188 і Патент США No. 6673990. Крім того, способи створення синтетичних Bt-генів для використання в рослинах відомі в даній галузі (Stewart and Burgin, 2007). Одним необмежувальним прикладом переважної трансформованої рослини є плідна рослина кукурудзи, що містить експресований у рослині ген, який кодує білок CryIDa, а також містить другий експресований у рослині ген, який кодує білок CrylBe. Перенесення (або інтрогресію) визначуваної CrylDa і CrylBe ознаки(ознак) в інбредні лінії кукурудзи можна досягти шляхом періодичного відбору, селекції, наприклад, за допомогою зворотного схрещування. У цьому випадку, необхідного рекурентного батька спочатку схрещують з донорним інбредом (нерекурентним батьком), що несе відповідний ген(и) для визначуваних CryID- і CrylС ознак. Потім проводять поворотне схрещування потомства цього схрещування з рекурентним батьком з наступною селекцією в утвореному потомстві на бажану ознаку(ознаки), що передається від нерекурентного батька. Після трьох, переважно, чотирьох, 4 UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 більш переважно, п'яти або більше поколінь зворотних схрещувань з рекурентним батьком із селекцією на бажану ознаку(ознаки), потомство буде гетерозиготним по локусу, що контролює передану ознаку(ознаки), але буде схоже на рекурентного батька по більшості або майже всіх інших генів (дивіться, наприклад, Poehlman & Sleper (1995) Breeding Field Crops, 4th Ed., 172175; Fehr (1987) Principles of Cultivar Development, Vol.l Theory and Technique, 360-376). Стратегії боротьби зі стійкістю комах (TRM). Roush et al., наприклад, описує двотоксинні стратегії, які також називаються "пірамідуванням" або "комплектуванням", для агротехніки інсектицидних трансгенних культур. (The Royal Society. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B. (1998) 353, 1777-1786). На своєму сайті Агентство по охороні навколишнього середовища США (epa.gov/oppbppd 1 /biopesticides/pips/bt_corn_refuge_2006.htm) публікує наступні вимоги для забезпечення нетрансгенних (тобто, які не містять B.t.) рефугій (розділ Bt-невмісних сільськогосподарських культур і кукурудзи) для використання з трансгенними сільськогосподарськими культурами, які продукують один Bt-білок, активний відносно шкідників-мішеней. "Специфічні структурні вимоги для продуктів з Bt(CrylAb або CrylF)-кукурудзи, захищеної від кукурудзяного метелика, являють собою наступні: Структурні рефугії: 20 % рефугію кукурудзи, який не містить Bt проти лускокрилих, у кукурудзяному поясі; 50 % рефугію, який не містить Bt проти лускокрилих, у поясі бавовнику Блоки Внутрішній (тобто, у Bt-поле) Зовнішні (тобто, окремі поля в межах 1/2 милі (1/4 милі, якщо можливо) Bt-поля для того, щоб максимізувати випадкове схрещування) Смуги в полі Смуги повинні являти собою не менше 4 борозен у ширину (переважно, 6 борозен), щоб знизити ефект від руху личинок» Крім того, Національна асоціація кукурудзівників на своєму сайті: (ncga.com/insect-resistancemanagement-fact-sheet-bt-corn) також надає аналогічні посібники відносно вимог до рефугій. Наприклад: "Вимоги для IRM від кукурудзяного метелика: - засадити, принаймні, 20 % від ваших акрів з кукурудзою рефугійними гібридами - у регіонах, які виробляють бавовну, рефугій повинен складати 50 % - повинно бути посаджене в межах 1/2 милі рефугійних гібридів - рефугій можна висадити смугами в межах Bt-поля; рефугійні смуги повинні бути не менше 4 борозен у ширину - рефугій можна обробляти традиційними пестицидами тільки у випадку, якщо економічні границі досягають комах-мішеней - інсектициди, що піддаються розбризкуванню, на основі Bt не можуть застосовуватися на рефугійній кукурудзі - відповідний рефугій повинен бути посаджений на кожній фермі з Bt-кукурудзою» Як зазначено в Roush et al. (права колонка на сторінках 1780 і 1784, наприклад), комплектування або "пірамідування" із двох різних білків, кожний з яких ефективний проти шкідників-мішеней і з невеликою або відсутністю перехресної стійкості, може дозволити використання меншого рефугію. Ропі припускає, що для успішного комплекту рефугійний розмір менше 10 % рефугію може забезпечити агротехніку з порівнянною стійкістю для близько 50 % рефугію для однієї ("небагаторівневої") ознаки. Для доступних у даний час продуктів "багаторівневої" Bt-кукурудзи Агентство по захисту навколишнього середовища СІЛА вимагає, щоб було посаджено значно менше (звичайно 5 %) структурованого рефугію кукурудзи, яка не мімтить Bt, ніж для продуктів з однією ознакою (звичайно 20 %). Існують різні способи забезпечення IRM-ефектів рефугію, включаючи різні геометричні схеми посадки в полях (як згадувалося вище) і упаковані насінні суміші, як додатково відзначається в Roush et al. (вище) і Патенті США No. 6551962. Вказані вище відсотки, або аналогічні коефіцієнти рефугіїв, можуть бути використані для розглянутих подвійних або потрійних комплектів або пірамід. Для потрійних комплектів із трьома ділянками впливу проти одного шкідника-мішені, метою був би нульовий рефугій (або менше ніж 5 %-рефугій, наприклад). Це особливо вірно для комерційних площ - більше 10 акрів, наприклад. Усі патенти, заявки на патенти, попередні заявки і публікації, згадані або цитовані в даному описі, включені за допомогою посилання в повному обсязі в тій мірі, поки вони не є несумісними з конкретними ідеями даної специфікації. 5 UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 За винятком випадків, коли це спеціально обговорено чи випливає з контексту, граматичні форми однини варто розуміти як означаючі "принаймні один". Нижче приводяться приклади, що ілюструють процедури для практикуючих винахід. Ці приклади не слід тлумачити як обмежувальні. Усі процентні співвідношення приводяться по масі і всі пропорції сумішей розчинників - по об'єму, якщо не вказане інше. Усі температури в градусах Цельсія. ПРИКЛАДИ 125 Приклад 1. І-мічення білків Cry Йодування Cry-токсинів. Очищені зрізані Cry-токсини йодували за допомогою Iodo-Beads або Iodo-gen (Pierce). Коротко, два Iodo-Bead промивали два рази 500 мкл забуференого фосфатом сольового розчину PBS (20 мМ фосфату натрію, 0,15 Μ NaCl, pH 7,5) і поміщали в 1,5-мл центрифугальну пробірку за свинцевим захистом. До цього додавали ще 100 мкл PBS. За 125 захистом і при використанні належних прийомів поводження з радіоактивністю, 0,5 мкКі Na I (17,4 Кі/мг, Lot 0114, Amersham) додавали до розчину PBS з Iodo-Beads. Компонентам була надана можливість реагувати протягом 5 хвилин при кімнатній температурі, потім 2-25 мкг високоочищеного укороченого Cry-білка додавали до розчину і давали можливість реагувати протягом ще 3-5 хвилин. Реакцію припиняли видаленням розчину від Iodo-Beads і нанесенням його на 0,5-мл знесолювальну колонку Zeba spin (InVitrogen), урівноважену PBS. Кожний з IodoBead промивали два рази по 10 мкл PBS і промивний розчин також наносили на знесолювальну колонку. Радіоактивний розчин елюювали через знесолювальну колонку шляхом центрифугування при 1000 χ g протягом 2 хв. За допомогою цієї процедури, Cry-токсин у 100 мМ фосфатному буфері (рН 8) спочатку очищали від ліпополісахаридів (LPS) шляхом його пропускання декілька разів через невелику 0,5-мл поліміксинову колонку. До пробірки з Iodo-gen 125 (Pierce Chem. Co.) додавали 20 мкг Cry 1 Da-токсину, який не містить LPS, потім 0,5 мкКі Na I. Реакційну суміш струшували протягом 15 хв при 25 °C. Розчин видаляли з пробірки, і додавали 50 мкл 0,2 Μ нерадіоактивноміченого Nal, щоб придушити реакцію. Білок діалізували проти PBS 125 з 3 змінами буфера для повного видалення незв'язаного І. Радіочистоту йодованих Cry-білків визначали за допомогою електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE), утворення зображення у фосфоімеджері і гамма-радіометрії. Коротко, 2 мкл радіоактивні білки розділяли за допомогою SDS-PAGE. Після розділення гелі висушували за допомогою приладу BioRad для сушіння гелів відповідно до інструкцій виробника. Висушені гелі візуалізували шляхом загортання їх у плівку Mylar (12 мкм у товщину) і витримування їх під екраном Molecular Dynamics storage phosphor screen (35 см χ 43 см) протягом 1 години. Пластини проявляли за допомогою фосфоімеджера Molecular Dynamics Storm 820, і зображення аналізували з використанням програмного забезпечення ImageQuant. Радіоактивну смугу разом з областями, розташованими безпосередньо вище і нижче смуги, вирізували з гелю за допомогою леза і підраховували в гамма-лічильнику. Радіоактивність детектувалась тільки в смузі Cry-білка й в областях нижче смуги. Вище смуги ніякої радіоактивності не детектувалось, що вказує на те, що все радіоактивне забруднення складається з менших білкових компонентів, ніж укорочений Cryбілок. Ці компоненти, швидше за все, являють собою продукти деградації. Приклад 2. Протокол підготовки BBMV Підготовка і фракціонування розчинних BBMV. Личинки Spodoptera frugiperda, Ostrinia nubilalis або Heleothis zea пізньої вікової стадії піддавали голодуванню протягом ночі, а потім ранком розсікали після охолодження на льоду протягом 15 хвилин. Тканину середньої кишки видаляли з порожнини тіла, залишаючи позаду задню кишку, прикріплену до шкірних покривів. Середню кишку поміщали в 9Х об'єм охолодженого в льоді буфера для гомогенізації (300 мМ манітол, 5 мМ EGTA, 17 мМ Тріс-основа, рН 7,5) з додаванням Protease Inhibitor Cocktail (кінцева концентрація компонентів коктейлю (у мкМ) складає AEBSF (500), EDTA (250 мМ), Бестатин (32), Е-64 (0,35), лейпептин (0,25), апротинін (0,075)) (Sigma P-2714) у розведенні, рекомендованому постачальником. Тканину гомогенізували за 15 ходів скляного гомогенізатора для тканини. BBMV підготовляли способом MgCl2-npe4HniTa4i'i Wolfersberger (1993). Коротко, однаковий об'єм 24 мМ розчину MgCl2 у 300 мМ манітолі змішували з гомогенатом середнього кишечнику, перемішували протягом 5 хвилин і залишали на льоду протягом 15 хв. Розчин центрифугували при 2500 χ g протягом 15 хв при 4 °C. Супернатант зберігали й осад суспендували у вихідному об'ємі 0,5-х розведеного буфера для гомогенізації і центрифугували знову. Два супернатанти об'єднували, центрифугували при 27000 χ g протягом 30 хв при 4 °C для утворення фракції BBMV. Осад суспендували в 10 мл буфери для гомогенізації з додаванням інгібіторів протеаз і центрифугували знову при 27000 χ g протягом 30 хв при 4 °C для промивання BBMV. Отриманий у результаті осад суспендували в буфері для збереження 6 UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 BBMV (10 мм HEPES, 130 мм КС1, 10 % гліцерин, рН 7,4) до концентрації приблизно 3 мг/мл білка. Концентрацію білка визначали за допомогою способу Бредфорда (1976) з бичачим сироватковим альбуміном (BSA) як стандартом. Визначення лужної фосфатази проводили перед заморожуванням зразків за допомогою тесту від Sigma, слідуючи інструкціям виробника. Питома активність цього маркерного ферменту у фракції BBMV, як правило, збільшується в 7 разів у порівнянні з тим, що виявляється для фракції гомогенату середнього кишечнику. Фракцію BBMV розподіляли по аліквотах у зразки 250 мкл, швидко заморожували в рідкому азоті і зберігали при -80 °C. 125 125 Приклад 3. Спосіб визначення зв'язування І-білків Cry з білків BBMV Зв'язування І-білків Cry з BBMV. Для визначення оптимальної кількості білка BBMV для використання в аналізах по 125 зв'язуванню була побудована крива насичення. Радіоактивно мічений І білок Cry (0,5 нМ) інкубували протягом 1 години при 28 °C з різними кількостями білка BBMV у діапазоні від 0 до 500 мкг/гл у буфері для зв'язування (8 мМ NaHPO4, 2 мМ Н2РО4, 150 мМ NaCl, 0,1 % бичачого 125 сироваткового альбуміну, рН 7,4). Загальний об'єм складав 0,5 мл. Зв'язаний з І Cry-білок відділяли від незв'язаного шляхом відбору 150 мкл реакційної суміші в трьох повторностях з 1,5мл центрифугальної пробірки в 500-мкл центрифугальну пробірку і центрифугування зразків при 14000 χ g протягом 6 хвилин при кімнатній температурі. Супернатант акуратно відбирали, і осад акуратно промивали три рази охолодженим у льоді буфером для зв'язування. Нижню частину центрифугальної пробірки, що містить осад, відділяли і поміщали в скляну пробірку для культивування розміром 13 × 75 мм. Кожен зразок обраховували протягом 5 хвилин у гаммалічильнику. Дані, що містяться у вибірці, віднімали з фонових значень (реакція без якого-небудь білка) і будували графіка залежно від концентрації білка BBMV. Оптимальна кількість білка для використання, як було визначено, складало 0,15 мг білка BBMV на мл. Для визначення кінетики зв'язування була побудована крива насичення. Коротко, BBMV (150 125 мкг/гл) інкубували протягом 1 години при 28 °C з І Сгу-токсинів у зростаючій концентрації в діапазоні від 0,01 до 10 нМ. Загальне зв'язування визначали шляхом відбору по 150 мкл для кожної концентрації в трьох повторностях, центрифугування зразка і підрахунку, як описано вище. Неспецифічне зв'язування визначали в такий же спосіб, з додаванням 1000 нМ гомологічного трипсинізованого нерадіоактивного Cry-токсину, доданого в реакційну суміш, для насичення всіх ділянок неспецифічного зв'язування з рецепторами. Специфічне зв'язування розраховували як різницю між загальним зв'язуванням і неспецифічним зв'язуванням. Гомологічні і гетерологічні тести по конкурентному зв'язуванню проводили з використанням 125 150 мкг/гл білка BBMV і 0,5 нМ радіоактивно міченого І білка Cry. Концентрація конкурентного, не міченого радіоактивно Cry-токсину, доданого до реакційної суміші, варіювала від 0,045 до 1000 нМ, і його додавали в той же час, що і радіоактивний ліганд, щоб забезпечити справжню 125 конкуренцію зв'язування. Інкубації проводили протягом 1 години при 28 °C і кількість І білка Cry, зв'язаного з його рецептором токсину, визначали, як описано вище, з вирахуванням неспецифічного зв'язування. Сто відсотків загального зв'язування визначалося під час відсутності якого-небудь конкурентного ліганду. Результати були представлені на напівлогарифмічному графіку у вигляді залежності відсотка загального специфічного зв'язування від концентрації доданого конкурентного ліганду. Приклад 4. Короткий опис результатів 125 Фігура 1 показує відсоток специфічного зв'язування І СгуАЬ (0,5 нМ) у BBMV ECB проти конкуренції неміченого гомологічного СгуіАЬ(Ф) і гетерологічного Cry2Aa (d). Зміщення кривої для гомологічної конкуренції на CrylAb приводить до сигмоїдальної кривої, що демонструє 50 % зміщення радіоліганду при близько 3 нМ CrylAb. Сгу2Аа при концентрації 1000 нМ (у 2000 разів 125 більше, ніж витиснутий І CrylAb) приводить до менше ніж 50 %-зміщення. Планки погрішностей представляють діапазон значень, отриманих з визначення трьох повторностей. ПОСИЛАННЯ Wolfersberger, M.G., (1993), Preparation and Partial Characterization of Amino Acid Transporting Brush Border Membrane Vesicles from the Larval Midgut of the Gypsy Moth (Lymantria Dispar). Arch. Insect Biochem. Physiol. 24: 139-147. Liang, Y., Patel, S.S., and Dean, D.H., (1995), Irreversible Binding Kinetics of Bacillus thuringiensis Cryl A Delta-Endotoxins to Gypsy Moth Brush Border Membrane Vesicles is Directly Correlated to Toxicity. J. Biol. Chem., 270, 24719-24724. 7 UA 111814 C2 8 UA 111814 C2 9 UA 111814 C2 10 UA 111814 C2 11 UA 111814 C2 12 UA 111814 C2 13 UA 111814 C2 14 UA 111814 C2 15 UA 111814 C2 16 UA 111814 C2 17 UA 111814 C2 18 UA 111814 C2 19 UA 111814 C2 20 UA 111814 C2 21 UA 111814 C2 22 UA 111814 C2 23 UA 111814 C2 24 UA 111814 C2 25 UA 111814 C2 26 UA 111814 C2 ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 1. Трансгенна рослина, що містить ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry1Ab, і ДНК, що кодує інсектицидний білок Cry2Aa. 2. Трансгенна рослина за п. 1, яка додатково містить ДНК, що кодує третій інсектицидний білок, вказаний третій білок вибраний з групи, яка складається з Cry1Fa, Cry1Be, Cry1I і DIG-3. 3. Трансгенна рослина за п. 2, де вказаний третій білок вибраний з групи, яка складається з Cry1Fa і Cry1Be, вказана рослина додатково містить ДНК, що кодує четвертий і п'ятий інсектицидні білки, вибрані з групи, яка складається з Cry1Ca, Cry1Da, Cry1E і Vip3Ab. 4. Трансгенна насінина рослини за будь-яким з пп. 1-3, де вказана насінина містить вказану ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry1Ab, і ДНК, яка кодує інсектицидний білок Cry2Aa . 5. Множина трансгенних рослин на полі, що включає рефугійні рослини, які не містять Bt, і множину рослин за будь-яким з пп. 1-3, де вказані рефугійні рослини складають менше 40 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин. 6. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 30 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин. 7. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 20 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин. 27 UA 111814 C2 5 10 15 20 25 30 8. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 10 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин. 9. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини складають менше 5 % від всіх сільськогосподарських культур у вказаній множині рослин. 10. Множина рослин на полі за п. 5, де вказані рефугійні рослини розташовані в блоках або смугах. 11. Суміш насіння, що містить рефугійне насіння від рефугійних рослин, які не містять Bt, і множину трансгенного насіння за п. 4, де вказане рефугійне насіння складає менше 40 % всього насіння в суміші. 12. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 30 % всього насіння в суміші. 13. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 20 % всього насіння в суміші. 14. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 10 % всього насіння в суміші. 15. Суміш насіння за п. 11, де вказане рефугійне насіння складає менше 5 % всього насіння в суміші. 16. Спосіб керованого розвитку стійкості до Cry-білка у європейського кукурудзяного метелика, що включає посадку трансгенного насіння для виробництва множини рослин на полі за п. 5. 17. Множина рослин на полі за будь-яким з пп. 5-10, де вказані рослини займають більше 10 акрів. 18. Рослина за будь-яким з пп. 1-3, де вказана рослина вибрана з групи, яка складається з кукурудзи, сої і бавовни. 19. Рослина за п. 18, де вказана рослина являє собою рослину кукурудзи. 20. Рослинна клітина рослини за будь-яким з пп. 1-3, де вказана рослинна клітина містить вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Cry1Ab, і вказану ДНК, що кодує вказаний інсектицидний білок Cry2Aa, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab щонайменше на 99 % ідентичний SEQ ID NO:1, і вказаний інсектицидний білок Cry2Aa щонайменше на 99 % ідентичний SEQ ID NO:2. 21. Рослина за будь-яким з пп. 1-3, де вказаний інсектицидний білок Cry1Ab містить SEQ ID NO:1, і вказаний інсектицидний білок Cry2Aa містить SEQ ID NO:2. 22. Спосіб контролювання комахи європейського кукурудзяного метелика шляхом контактування вказаної комахи з інсектицидним білком Cry1Ab і інсектицидним білком Cry2Aa. 28

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Insecticidal protein combination comprising cry1ab and cry2aa for controlling european corn borer, and methods for insect resistance management

Автори англійською

Meade, Thomas, Narva, Kenneth, Storer, Nicholas, P., Sheets, Joel, J., Woosley, Aaron, T., Burton, Stephanie, L.

Автори російською

Мид Томас, Нарва Кеннет, Сторер Николас П., Шитс Джоел Дж., Вусли Аарон Т., Бертон Стэфани Л.

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/82, A01H 5/10, C07K 14/325, A01H 5/00, A01N 63/02

Мітки: кукурудзяного, стійкістю, комах, cry2aa, містить, cry1ab, метелика, боротьби, європейського, трансгенна, рослина, яка, способи, регулювання

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/31-111814-transgenna-roslina-yaka-mistit-cry1ab-ta-cry2aa-dlya-regulyuvannya-ehvropejjskogo-kukurudzyanogo-metelika-i-sposobi-borotbi-zi-stijjkistyu-komakh.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Трансгенна рослина, яка містить cry1ab та cry2aa, для регулювання європейського кукурудзяного метелика і способи боротьби зі стійкістю комах</a>

Подібні патенти