Спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофії

Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофії, який включає визначення активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів шляхом інкубації зразків лейкоцитів при температурі 37°С протягом 1 години, який відрізняється тим, що додатково здійснюють інкубацію зразків лейкоцитів при температурі 0-4°С протягом 16-20 годин і отримані результати порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А.

Текст

Спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофм, який включає визначення активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів шляхом інкубації зразків лейкоцитів при температурі 37°С протягом 1 години, який відрізняється тим, що додатково здійснюють інкубацію зразків лейкоцитів при температурі 0-4°С протягом 16-20 годин і отримані результати порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А Винахід відноситься до медицини, а зокрема діагностики спадкової патологи, і може використовуватись при медико-генетичному консультуванні сімей, обтяжених по метахроматичній лейкодистрофм - спадковій хворобі, що обумовлена мутацією в гені арилсульфатази А і, як наслідок, зниженням активності цього ферменту Відомий спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофм за допомогою молекулярно-генетичних технологій (1) Для цього виділяють ДНК, напрацьовують фрагменти гену арилсульфатази А за допомогою полімеразної ланцюгової реакції та аналізують наявність мутацій в цих фрагментах Використання молекулярно-генетичних методів ускладнене в зв'язку з великою КІЛЬКІСТЮ описаних мутацій в гені арилсульфатази А, а також ймовірності нової, досі неописаної мутації в цьому гені Особливо це актуально при необхідності визначення гетерозиготного носійства при проспективному консультуванні подружніх пар з випадками непідтвердженого біохімічно діагнозу метахроматичної лейкодистрофм в родоводі, при родинному шлюбі та ш , тобто при відсутності хворої дитини Відомий спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофм шляхом демонстрації 50%-го зниження активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів при визначенні останньої за стандартним методом Baum et al (2) Для цього з 3 - 5мл венозної гепаринізованої крові виділяють лейкоцити за стандартною методикою (3) До 0,2мл гомогенату лейко цитів додають 0,2мл субстратної суміші такого складу ЮмМ п-нітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН 5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофосфата натрію Зразки шкубують при 37°С на протязі 1 години Реакцію зупиняють додаванням 2,5н гідроксиду натрію КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату оцінюють визначенням оптичної ЩІЛЬНОСТІ зразків при 515нм Калібрування проводять з використанням стандартних розчинів п-нітрокатехолу Результати висловлюють у нмоль/год/мг білку КІЛЬКІСТЬ білку в гомогенаті лейкоцитів визначають за стандартним методом Крістіана та Варбурга (4) Отримані показники порівнюють з областю нормальних значень активності арилсульфатази А, що визначається дослідним шляхом При визначенні активності арилсульфатази А в гомогенаті лейкоцитів за стандартним методом Baum et al спостерігається значне перекривання областей нормальних значень активності АСА та значень, що визначаються у гетерозиготних носив На Фіг 1 представлена діаграма розподілу нормальних значень активності арилсульфатази А (обстежено 48 здорових донорів) та значень, що визначаються у гетерозиготних носив (обстежено 26 облігатних гетерозигот) Наявність зони перекривання цих двох областей значно ускладнює інтерпретацію показників, що потрапляють в цю зону Задачею заявляемого винаходу є підвищення достовірності визначення гетерозиготних носійств метахроматичної лейкодистрофм біохімічним методом Поставлена задача вирішується тим, що, до 00 (О ю 51468 датково здійснюють інкубацію зразків лейкоцитів (облігатних гетерозигот) отримані наступні резульпри 0 - 4°С на протязі 16-20 годин і отримані покатати зники порівнюють з областю нормальних значень Інкубація зразків при 37°С активності арилсульфатази А, отриманих в цих же Мати - 40нмоль/год/мг білку умовах Батько - 27нмоль/год/мг білку На фіг 1 наданий розподіл нормальних знаПацієнтка Г - 65нмоль/год/мг білку чень активності арилсульфатази А (п=48) та знаІнкубація зразків при 0 - 4°С чень, що визначаються у гетерозиготних носив Мати - 162нмоль/18год/мг білку (п=26) при інкубації зразків при 37°С Батько - 107нмоль/18год/мг білку На Фіг 2 розподіл нормальних значень активПацієнтка Г - 136нмоль/18год/мг білку ності арилсульфатази А (п=19) та значень, що При порівнянні результатів з областю нормавизначаються у гетерозиготних носив (п=20) при льних значень видно, що активність арилсульфаінкубації зразків при 0-4°С тази А пацієнтки Г при інкубації зразків при 37°С знаходиться в зоні перекривання, в той час, як Спосіб здійснюється наступним чином активність ферменту, визначена після інкубації Лейкоцити отримують з гепаринізованої кровіпри 0-4°С говорить про гетерозиготне носійство за стандартною методикою згідно прототипу В хвороби пацієнткою Г Це заключения було підякості субстрату використовують ЮмМ птверджено молекулярно-генетичними методами нітрокатехолсульфат у ацетатному буфері рН 5,0, що містить 10% хлорида натрію та 0,5мМ пірофоТаким чином, впровадження способу визнасфата натрію Реакційну суміш готують, змішуючи чення гетерозиготного носіиства метахроматичної 0,2мл гомогенату лейкоцитів та 0,2мл субстрату лейкодистрофп у близько ЗО випадках на базі каІнкубацію зразків проводять при 37°С на протязі 1 федри медичної генетики, клінічної імунологи та години та при 0 - 4°С на протязі 16-20 годин Після алергології КМАПО їм П Л Шупиката лабораторії інкубації реакцію зупиняють додаванням 0,1 мл медичної генетики УДСЛ "ОХМАТДИТ" дозволило 2,5н NaOH КІЛЬКІСТЬ звільненого субстрату визробити слідуючи висновки значають шляхом вимірювання оптичної ЩІЛЬНОСТІ 1 завдяки заявляемому способу значно підрозчину при 515нм Результати висловлюють у вищено достовірність ідентифікації гетерозиготнонмоль/год/мг білку для зразків, що шкубували при го носіиства метахроматичної лейкодистрофп, 37°С, та у нмоль/18год/мг білку для зразків, що 2 впровадження способу визначення гетерошкубували при 0 - 4°С КІЛЬКІСТЬ білку в гомогенаті зиготного носіиства метахроматичної лейкодистлейкоцитів визначають за стандартним методом рофп дозволить значно покращити медикоКрістіана та Варбурга Отримані показники порівгенетичне консультування сімей, обтяжених по цій нюють з областю нормальних значень активності патологи, проспективне консультування подружніх арилсульфатази А На Фіг 2 представлена діаграпар з випадками непідтвердженого біохімічне діагма розподілу нормальних значень активності аринозу метахроматичної лейкодистрофп в родоводі, лсульфатази А (обстежено 19 здорових донорів) при родинному шлюбі та ш та значень, що визначаються у гетерозиготних Література носив (обстежено 20 облігатних гетерозигот), 1 Coulter-Mackie MB, Applegarth DA, Toone J, отримані заявляємим способом 3 діаграми видно, Vallance H, DNA-based diagnosis of arylsulfatase A що області нормальних значень та значень, що deficiencies as a supplement to enzyme assay a визначаються у гетерозиготних носив не перекриcase in point, Clm Biochem 1997, vol 30, 1 57-61 ваються Це дозволяє з великою достовірністю 2 Baum H, Dodgson KS, Spenser B, The assay ідентифікувати гетерозиготних носив метахромаof arylsulfatases A and В in human urine Clm Chim тичної лейкодистрофп Acta, 1959, 4 453-455 Приклад 3 Цветкова И В , Бахарев В А , Кази 3 , Осипова Г Н , Розенфельд Е Л , Розовский И С «ВыяПацієнтка Г, 12 років КЛІНІЧНО здорова Має вление недостаточности арилсульфатазы А при рідну молодшу сестру, хвору на метахроматичну метахро мати чес кой лейкодистрофии и пренатальлейкодистрофію (діагноз встановлений 2 роки тоний диагноз заболевания» Вопр мед химии, му в ІНШІЙ країні) Батьки звернулись з приводу 1980, вып 4, стр 464-464 встановлення гетерозиготного носіиства метахроматичної лейкодистрофп у пацієнтки Хвора сест4 Досон Р , Эллиот Д , Эллиот У , Джонс К , ра на консультації відсутня При визначенні активСправочник биохимика, Москва, Мир, 1991,543с ності арилсульфатази А у пацієнтки та у батьків 51468 іція зразкії ДП «Український інститут промислової власності» (Укрпатент) вул Сім'ї Хохлових, 15, м Київ, 04119, Україна ( 0 4 4 ) 4 5 6 - 2 0 - 90 ТОВ "Міжнародний науковий комітет" вул Артема, 77, м Київ, 04050, Україна (044)216-32-71

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for revealing heterozygotic carriage of metachromatic leukodystrophy

Автори англійською

Horovenko Nataliia Hryhorivna

Назва патенту російською

Способ определения гетерозиготного носительства метахроматической лейкодистрофии

Автори російською

Горовенко Наталья Григорьевна

МПК / Мітки

МПК: A61B 5/157

Мітки: лейкодистрофії, метахроматичної, спосіб, гетерозиготного, носійства, визначення

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/3-51468-sposib-viznachennya-geterozigotnogo-nosijjstva-metakhromatichno-lejjkodistrofi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб визначення гетерозиготного носійства метахроматичної лейкодистрофії</a>

Подібні патенти