Завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

Спосіб отримання активованих лімфоцитів, що включає культивування лімфоцитів з регіонарних лімфатичних вузлів онкологічних хворих в системі in vitro, який відрізняється тим, що  як активаційний стимул для лімфоцитів використовують автологічні пухлинні клітини в присутності низьких доз інтерлейкіну-2.

Текст

Спосіб отримання активованих лімфоцитів, що включає культивування лімфоцитів з регіонарних лімфатичних вузлів онкологічних хворих в системі in vitro, який відрізняється тим, що як активаційний стимул для лімфоцитів використовують автологічні пухлинні клітини в присутності низьких доз інтерлейкіну-2. (19) (21) u200605469 (22) 19.05.2006 (24) 15.11.2006 (46) 15.11.2006, Бюл. № 11, 2006 р. (72) Гріневич Юрій Якимович, Фільчаков Феодосій Вікторович, Шуміліна Катерина Станіславівна, Смоланка Іван Іванович, Процик Володимир Семенович (73) ІНСТИТУТ ОНКОЛОГІЇ АКАДЕМІЇ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ 3 18627 4 тів шляхом їх культивування з автологічними пухрі; виділена кількість лімфоцитів склала 2,8 107 линними клітинами в системі in vitro, що дасть моклітин. Для довгострокового культивування викожливість їх ефективного використання для імунористовували КС RPMI 1640 („Serva” Німеччина) з терапії онкологічних хворих з метою профілактики додаванням 2мМ L-глутаміна, 10% автологічної рецидивів та метастазів після проведення хірургісироватки, 4мкг/мл гентаміцина. чного лікування. Суспензію автологічних ПК одержували за доПоставлена задача вирішується таким чином. помогою механічної і ферментативної дезагрегації Лімфоцити отримують з регіонарних ЛВ, які тканини пухлини згідно описаного методу [6]. Після одержують під час оперативного втручання у хвоцього ПК обробляли мітоміцином С („Serva”, Німерих онкологічного профілю. ЛВ вміщують в охолоччина) у кінцевій концентрації 25мкг/мл протягом джений до 4 С розчин Хенкса і тричі промивають, 30 хвилин при 37 С з метою позбавлення їх прощоб позбутися домішок крові. Потім видаляють ліферативного потенціалу. Надалі клітини тричі жирову клітковину, капсулу і механічно дезагрегувідмивали охолодженим середовищем RPMI 1640 ють орган. Отриману суспензію клітин фільтрують шляхом центрифугування при 400g протягом 10 крізь капроновий фільтр. Клітини двічі відмивають хвилин. Виділено 9 105 клітин. Спільне культивуохолодженим розчином Хенкса за допомогою вання ПК і лімфоцитів ЛВ здійснювали в співвідцентрифугування (400g) протягом 10 хвилин. Поношенні 1:30 протягом 7 діб у 250-мілілітрових тім осад клітин ресуспендують в культуральному флаконах для культивування в термостаті при середовищі (КС) і підраховують їхню кількість у 37 С у вологій камері при вмісті в повітрі 5% СО2. гемоцитометрі. Для довгострокового культивуванУ роботі використовували препарат рекомбінантня використовують КС RPMI 1640 („Serva”, Німечного ІЛ-2 людини (Ронколейкін, „Біофарма”, Україчина) з додаванням 2мМ L-глутаміна, 10% автолона) в концентрації 200Од/мл, який вносили в КС на гічної сироватки чи плазми крові донорів групи АВ 2-у і 5-у добу культивування суспензії клітин. Кіль(інактивована, тестована на контамінацію вірусом кість лімфоцитів на 7 добу культивування склала гепатиту і ВІЛ), 40мкг/мл гентаміцина. 5,2 107 клітин. Суспензію життєздатних автологічних свіжоВизначення цитотоксичної активності лімфовиділених пухлинних клітин (ПК) одержують за цитів по відношенню до клітин-мішеней (клітини Кдопомогою механічної і ферментативної дезагре562, чутливі до цитотоксичної дії природних кілегації тканини пухлини згідно описаного методу [6]. рів, та клітини Daudi, резистентні до цитотоксичної Після цього ПК обробляють мітоміцином С дії природних кілерів) за методом [7] показало, що („Serva”, Німеччина) у кінцевій концентрації низький вихідний індекс цитотоксичності (1% та 0% 25мкг/мл протягом 30 хвилин при 37 С з метою відповідно) до 7-ї доби збільшився до 24,4% та позбавлення їх проліферативного потенціалу. На13,1% відповідно. далі клітини тричі відмивають охолодженим сереII. У хворої О-вої (45 років, рак лівої молочної довищем RPMI 1640 шляхом центрифугування при залози, ст. IIIб, кл. гр.II, історія хвороби №3129) 400g протягом 10 хвилин. Спільне культивування лімфоцити виділені з регіонарних ЛВ, які одержані ПК і лімфоцитів ЛВ здійснюють в співвідношенні під час оперативного втручання. ЛВ вміщували в 1:30 протягом 6-8 діб у 250 - мілілітрових флакоохолоджений до 4 С розчин Хенкса і тричі проминах для культивування в термостаті при 37 С у вали, щоб позбутися домішок крові. Потім видалявологій камері при вмісті в повітрі 5% СО2. У роболи жирову клітковину, капсулу і механічно дезагреті використовують препарат рекомбінантного ІЛ-2 гували орган. Отриману суспензію клітин людини (Ронколейкін, „Біофарма”, Україна) в конфільтрували крізь капроновий фільтр. Клітини двічі центрації 200Од/мл, який вносять в КС на 2-у і 5-у відмивали охолодженим розчином Хенкса за додобу культивування суспензії клітин. помогою центрифугування (400g) протягом 10 Приготування суспензії лімфоцитів та ПК здійхвилин. Потім осад клітин ресуспендували в КС і снюють при суворому дотриманні правил асептипідраховували їхню кількість у гемоцитометрі; вики. Усі реагенти для культури клітин стерилізують ділена кількість лімфоцитів склала 4 107 клітин. за допомогою мікрофільтрації (мембрани з розміДля довгострокового культивування використовуром пор 0,22мкм, «Millipor», США). вали КС RPMI 1640 („Serva”, Німеччина) з додаПрикладами реалізації заявленої корисної мованням 2мМ L-глутаміна, 10% автологічної сироделі можуть вважатися результати отримання акватки, 40мкг/мл гентаміцина. тивованих лімфоїдних клітин в автологічній систеСуспензію автологічних ПК одержували за домі in vitro. помогою механічної і ферментативної дезагрегації І. У хворої Ш-к (21 рік, рак язика з проростантканини пухлини згідно описаного методу [6]. Після ням в нижню щелепу, T3N0M0, історія хвороби цього ПК обробляли мітоміцином С („Serva”, Німе№964) лімфоцити виділені з регіонарних ЛВ, які ччина) у кінцевій концентрації 25мкг/мл протягом одержані під час оперативного втручання. ЛВ вмі30 хвилин при 37 С з метою позбавлення їх прощували в охолоджений до 4 С розчин Хенкса і ліферативного потенціалу. Надалі клітини тричі тричі промивали, щоб позбутися домішок крові. відмивали охолодженим середовищем RPMI 1640 Потім видаляли жирову клітковину, капсулу і мешляхом центрифугування при 400g протягом 10 ханічно дезагрегували орган. Отриману суспензію хвилин. Виділено 3 106 клітин. Спільне культивуклітин фільтрували крізь капроновий фільтр. Клівання ПК і лімфоцитів ЛВ здійснювали в співвідтини двічі відмивали охолодженим розчином Хенкношенні 1:30 протягом 7 діб у 250-мілілітрових са за допомогою центрифугування (400g) протяфлаконах для культивування в термостаті при гом 10 хвилин. Потім осад клітин ресуспендували 37 С у вологій камері при вмісті в повітрі 5% СО2. в КС і підраховували їхню кількість у гемоцитомет 5 18627 6 У роботі використовували препарат рекомбінантго лікування. ного ІЛ-2 людини (Ронколейкін, „Біофарма”, УкраїДжерела інформації: на) в концентрації 200Од/мл, який вносили в КС на 1. Rosenberg S.A. The immunotherapy and gene 2-у і 5-у добу культивування суспензії клітин. Кільtherapy of cancer //J. Clin. Oncol. -1992. -Vol.10, №2. кість лімфоцитів на 7 добу культивування склала -P.180-200. 7 2. Use of human leukocyte antigen-mismatched 5,16 10 клітин. allogeneic lymphokine-activatedkiller cells and Визначення цитотоксичної активності лімфоinterleukin-2 in the adoptive immunotherapy of цитів по відношенню до клітин-мішеней (клітини Кpatients with malignancies /Y. Kimoto, T. Tanaka, Y. 562, чутливі до цитотоксичної дії природних кілеTanji et al. //Biotherapy. -1994. - Vol.8, №1.- P.41-50. рів, та клітини Daudi, резистентні до цитотоксичної 3. Successful engraftment after autologous дії природних кілерів) за методом [7] показало, що transplantation of 10-day cultured bone marrow низький вихідний індекс цитотоксичності (2,7% та activated by interleukin-2 in patients with acute 0% відповідно) до 7-ї доби збільшився до 21,8% та lymphoblastic leukemia /F. Beaujean, F. Bemaudin, 16,4% відповідно. M. Kuentz et al. //Bone Marrow Transplantation. Таким чином, у описаному способі показана 1995. -Vol.15, №5. -P.691-696. можливість генерації цитотоксичної активності 4. Whiteside Т. Tumor-infiltrating lymphocytes as лімфоїдних клітин з регіонарних ЛВ онкологічних antitumor effector cells //Biother. -1992. -Vol.5. -P.47хворих в системі in vitro з метою їх використання 61. для проведення АІТ. Перспективність використан5. Development of a new culture system for ня такого підходу обумовлена не просто активаціhuman lymphokine-activated killer cells /M. Murata, T. єю лімфоцитів ІЛ, як це має місце при генерації Yano, M. Togami et al. //J. Immunological Methods. ЛАК, а індукцією специфічної протипухлинної ак1990. -Vol.129, №1. -P.89-95 (прототип) тивності у попередників цитотоксичних лімфоцитів, 6. Сергеева Н.С., Свиридова И.К., Мороз И.А. які накопичуються в регіонарному лімфоїдному Получение опухолевых клеток из тканей рака легколекторі, що дренує пухлину. Крім того, експансія кого человека с целью клонирования. //Лаб. дело. активованих лімфоїдних клітин в системі in vivo не -1991. -№2. -С.28-30. має потреби у введенні високих доз екзогенного 7. Микроскопический вариант метода опредеІЛ-2, тому що стимулом для їхньої проліферації є ления цитотоксической активности лимфоцитов ПК. Вищенаведене обумовлює ефективність і дос/Ф.В. Фильчаков, Т.П. Малиновская, Ю.А. Гринетупність цього засобу не тільки для імунотерапії вич, И.А. Близнюк. //Лаб. Диагностика. -1998. -№1. онкологічних хворих, але й для профілактики ре-С.28-30. цидивів та метастазів після проведення хірургічно Комп’ютерна верстка Л.Литвиненко Підписне Тираж 26 прим. Міністерство освіти і науки України Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Method for obtaining activated lymphocytes

Автори англійською

Hrynevych Yurii Yakymovych, Filchakov Feodosii Viktorovych, Shumilina Kateryna Stanislavivna, Smolanka Ivan Ivanovych, Protsyk Volodymyr Semenovych

Назва патенту російською

Способ получения активированных лимфоцитов

Автори російською

Гриневич Юрий Акимович, Фильчаков Феодосий Викторович, Шумилина Екатерина Станиславовна, Смоланка Иван Иванович, Процик Владимир Семенович

МПК / Мітки

МПК: A61K 35/26

Мітки: спосіб, активованих, лімфоцитів, отримання

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/3-18627-sposib-otrimannya-aktivovanikh-limfocitiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання активованих лімфоцитів</a>

Подібні патенти