Гібридні інсектицидні білки, що мають активність проти західного кукурудзяного кореневого жука або європейського кукурудзяного метелика

Номер патенту: 96187

Опубліковано: 10.10.2011

Автори: Чень Жен С., Стейсі Черіл, Харт Хоуп, Вальтерс Фредерік

Є ще 239 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Сконструйований гібридний інсектицидний білок, що включає від N-кінця до С-кінця N-кінцеву ділянку першого Bacillus thuringiensis (Bt) Cry-білка, злитого із С-кінцевою ділянкою другого Bt Cry-білка, що відрізняється від першого Bt Cry-білка, причому щонайменше одна позиція кросинговера між першим і другим Bt Cry-білками розташована в консервативному блоці 2, консервативному блоці 3, варіабельній ділянці 4 або консервативному блоці 4, і що необов'язково включає в себе:

(а) протоксинову хвостову ділянку Bt Cry-білка, розташовану на С-кінці; або

(б) N-кінцевий пептидний фрагмент, або

(в) як (а), так і (б),

причому вищезгаданий сконструйований гібридний інсектицидний білок має активність проти західного кукурудзяного кореневого жука або європейського кукурудзяного метелика.

2. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 1, який відрізняється тим, що перший Bt Cry-білок має активність проти жорсткокрилої комахи, а другий Bt Cry-білок має активність проти лускокрилої комахи.

3. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 2, що відрізняється тим, що першим Bt Cry-білком є Сrу3 А або модифікований Сrу3 А, а другим Bt Cry-білком є Cry1 A.

4. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 3, який відрізняється тим, що білком Сrу3А є Сrу3Аа або модифікованим Сrу3 А є модифікований Сrу3 Аа, а білком Cry1 А є Cry1 Аа або Cry1 Ab.

5. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 4, який відрізняється тим, що цей сконструйований гібридний інсектицидний білок включає послідовність амінокислот, щонайменше на 80 % ідентичну SEQ ID NO: 64.

6. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 5, який відрізняється тим, що

(а) Сrу3Аа включає SEQ ID NO: 68 або SEQ ID NO: 135; або

(б) модифікований Сrу3 Аа включає SEQ ID NO: 70, а білок Cry1 Ab включає SEQ ID NO: 72.

7. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 1 до 6, який відрізняється тим, що включає на С-кінці протоксинову хвостову ділянку Bt Cry-білка.

8. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 7, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка являє собою ділянку з Bt Cry-білка, активного проти лускокрилої комахи.

9. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 8, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка являє собою ділянку з білка Cry1 А.

10. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 9, який відрізняється тим, що білком Cry1 А є Cry1 Аа або Cry1 Ab.

11. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 10, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка білка Cry1 Ab містить щонайменше 38 амінокислот.

12. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 11, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка білка Cry1 Ab:

(а) включає послідовність амінокислот, що відповідає амінокислотам 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72; або

(б) включає амінокислоти 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72.

13. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-12, який відрізняється тим, що включає на N-кінці пептидний фрагмент, що складається щонайменше з 9 амінокислот.

14. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 13, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент включає послідовність амінокислот YDGRQQHRG (SEQ ID NO: 132) або послідовність амінокислот TSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 133).

15. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 14, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент вибраний із групи, що включає: SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 і SEQ ID NO: 132.

16. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 1 до 11, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент надає інсектицидну активність, підсилює інсектицидну активність або стабілізує цей сконструйований гібридний інсектицидний білок у порівнянні зі сконструйованим гібридним інсектицидним білком без пептидного фрагмента.

17. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 3 до 16, який відрізняється тим, що позиція кросинговера між Сrу3 А і Cry1 А або модифікованим Сrу3 А і Сrу1 А розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Ser450, Phe454 або Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70.

18. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 17, який відрізняється тим, що позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за Ser450, Phe454 або Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70.

19. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-18, який відрізняється тим, що включає щонайменше дві позиції кросинговера між амінокислотною послідовністю з першого Bt Cry-білка й амінокислотною послідовністю із другого Bt Cry-білка.

20. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 19, який відрізняється тим, що

(а) перша позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 2, а друга позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 3; або

(б) перша позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 3, а друга позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 4.

21. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 20, який відрізняється тим, що

(а) перша позиція кросинговера між Сrу3 А і Cry1 А або модифікованим Cry 3 А і Cry1 А розташована в консервативному блоці 2 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Asp232 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 А і Сrу3А або Cry1 А і модифікованим Сrу3 А розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Leu476 послідовності SEQ ID NO: 72; або

(б) перша позиція кросинговера між Сrу3 А і Cry1 А або модифікованим Сrу3 А і Cry1 А розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 А і Сrу3 А або Cry1 А і модифікованим Сrу3 А розташована в консервативному блоці 4 відразу ж за амінокислотою, що відповідає І1е527 послідовності SEQ ID NO: 72.

22. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 21, який відрізняється тим, що

(а) перша позиція кросинговера між Сrу3 Аа і Cry1 Ab або модифікованим Сrу3Аа і Cry1 Ab розташована в консервативному блоці 2 відразу ж за Asp232 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 Ab і Сrу3 Аа або Cry1 Ab і модифікованим Сrу3 Аа розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за Leu476 послідовності SEQ ID NO: 72; або

(б) перша позиція кросинговера між Сrу3 Аа і Cry1 Ab або модифікованим Сrу3 Аа і Cry1 Ab розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 Ab і Сrу3 Аа або Cry1 Ab і модифікованим Сrу3 Аа розташована в консервативному блоці 4 відразу ж за І1е527 послідовності SEQ ID NO: 72.

23. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 1 до 22, який відрізняється тим, що включає послідовність амінокислот, вибрану із групи, що складається з: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 і SEQ ID NO: 160.

24. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-23, який відрізняється тим, що має активність проти північного кукурудзяного кореневого жука або мексиканського кукурудзяного кореневого жука.

25. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-24.

26. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує білок за п. 24, який відрізняється тим, що включає нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що включає: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154 і SEQ ID NO: 158.

27. Експресійна касета, що містить гетерологічну промоторну послідовність, оперативно пов'язану з молекулою нуклеїнової кислоти за п. 25 або 26.

28. Рекомбінантний вектор, що містить експресійну касету за п. 27.

29. Трансгенна клітина-хазяїн, що містить експресійну касету за п. 27.

30. Трансгенна клітина-хазяїн за п. 29, що являє собою бактеріальну клітину.

31. Трансгенна клітина-хазяїн за п. 29, що являє собою рослинну клітину.

32. Трансгенна рослина, що включає трансгенну рослинну клітину за п. 31.

33. Трансгенна рослина за п. 32, що являє собою рослину кукурудзи.

34. Трансгенне насіння із трансгенної рослини за п. 32 або 33.

35. Інсектицидна композиція, що містить інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 1 до 24.

36. Спосіб одержання сконструйованого гібридного інсектицидного білка, активного проти комах, що включає

(а) одержання трансгенної клітини-хазяїна за п. 29; і

(б) вирощування трансгенної клітини-хазяїна в умовах, що дозволяють хазяїнові експресувати сконструйований гібридний інсектицидний білок, що діє проти комах.

37. Спосіб виробництва стійкої до комах трансгенної рослини, що включає введення молекули нуклеїнової кислоти за п. 25 або 26 у рослину, одержуючи в такий спосіб трансгенну рослину, причому сконструйований гібридний інсектицидний білок експресується в трансгенній рослині в кількості, ефективній для боротьби з комахами.

38. Спосіб боротьби з комахами, що включає обробку комах ефективною кількістю інсектицидного токсину за будь-яким із пунктів 1-24.

39. Спосіб одержання сконструйованого гібридного інсектицидного білка (сГІБ) за пп. 1-24, що включає:

(а) одержання першого Bacillus thuringiensis (Bt) Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка;

(б) одержання другого Bt Cry-білка, що відрізняється від першого Bt Cry-білка або модифікованого Сrу-білка;

(в) злиття в напрямку від N-кінця до С-кінця N-кінцевої ділянки першого Bt Cry-білка до С-кінцевої ділянки Bt Cry-білка, причому щонайменше одна позиція кросинговера між першим і другим Bt Cry-білком розташована в консервативному блоці 2, консервативному блоці 3, варіабельній ділянці 4 або консервативному блоці 4 для одержання сГІБ, що має активність проти щонайменше західного кукурудзяного кореневого жука; і, необов'язково

(г) введення в N-кінець пептидного фрагмента або в С-кінець - протоксинової хвостової ділянки Bt Cry-білка, або в обидва, причому пептидний фрагмент, або протоксинова ділянка, або вони обидва наділяють сГІБ активністю, або підсилюють інсектицидну активність сГІБ, або роблять сГІБ більше стабільним, ніж сГІБ без пептидного фрагмента або протоксинової хвостової ділянки, або без обох.

40. Спосіб одержання сконструйованого гібридного інсектицидного білка (сГІБ) за будь-яким із пунктів 1-24, що включає:

(а) одержання першої нуклеїнової кислоти, що кодує перший Bacillus thuringiensis (Bt) Cry-білок або модифікований Bt Cry-білок, і другої нуклеїнової кислоти, що кодує другий Bt Cry-білок, що відрізняється від першого Bt Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка;

(б) виділення з вищевказаних першої й другої нуклеїнових кислот нуклеотидної послідовності, що кодує повні або неповні варіабельні ділянки й консервативні блоки вищезгаданих першого Bt Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка й другого Bt Cry-білка;

(в) з'єднання разом отриманих у результаті виконання стадії (б) виділених нуклеїнових кислот таким чином, щоб одержати нову гібридну нуклеїнову кислоту, що кодує білок, і, необов'язково, гібридизацію нуклеїнової кислоти, що кодує пептидний фрагмент, із 5' кінцем вищезгаданої гібридної нуклеїнової кислоти, що приводить в результаті до подовження по 5' кінцю, або гібридизацію нуклеїнової кислоти, що кодує протоксинову хвостову ділянку Bt-Cry-білка, з 3' кінцем вищезгаданої гібридної нуклеїнової кислоти, що приводить в результаті до подовження по 3' кінцю, або те й інше;

(г) введення в експресивну касету гібридної нуклеїнової кислоти, що має одне з подовжень 5' або 3', або те й інше, або не має цих подовжень ;

(д) трансформацію експресивної касети в клітину-хазяїна, у результаті чого вищезгадана клітина-хазяїн виробляє сГІБ.

41. Спосіб за будь-яким із пунктів 39 або 40, який відрізняється тим, що перший Bt Cry-білок або модифікований Bt Cry-білок є білком Сrу3 А або модифікованим Сrу3 А, а другий Bt Cry-білок - білком Cry1 Aa або Cry1 Ab.

42. Спосіб за будь-яким із пунктів від 39 до 41, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент містить щонайменше 9 амінокислот.

43. Спосіб за п. 42, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент вибирають із групи, що включає: SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132 і SEQ ID NO: 133.

44. Спосіб за будь-яким із пунктів від 39 до 43, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка являє собою ділянку з білка Cry1 Аа або білка Cry1 Ab.

45. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що вищезгадана протоксинова хвостова ділянка містить щонайменше 38 амінокислот.

46. Спосіб за п. 45, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка

(а) містить амінокислотну послідовність, що відповідає амінокислотам 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72; або

(б) містить амінокислоти 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72.

Текст

Дивитися

1. Сконструйований гібридний інсектицидний білок, що включає від N-кінця до С-кінця N-кінцеву ділянку першого Bacillus thuringiensis (Bt) Cryбілка, злитого із С-кінцевою ділянкою другого Bt Cry-білка, що відрізняється від першого Bt Cryбілка, причому щонайменше одна позиція кросинговера між першим і другим Bt Cry-білками розта 2 (19) 1 3 хвостова ділянка являє собою ділянку з Bt Cryбілка, активного проти лускокрилої комахи. 9. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 8, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка являє собою ділянку з білка Cry1 А. 10. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 9, який відрізняється тим, що білком Cry1 А є Cry1 Аа або Cry1 Ab. 11. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 10, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка білка Cry1 Ab містить щонайменше 38 амінокислот. 12. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 11, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка білка Cry1 Ab: (а) включає послідовність амінокислот, що відповідає амінокислотам 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72; або (б) включає амінокислоти 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72. 13. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-12, який відрізняється тим, що включає на N-кінці пептидний фрагмент, що складається щонайменше з 9 амінокислот. 14. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 13, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент включає послідовність амінокислот YDGRQQHRG (SEQ ID NO: 132) або послідовність амінокислот TSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 133). 15. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 14, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент вибраний із групи, що включає: SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 і SEQ ID NO: 132. 16. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 1 до 11, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент надає інсектицидну активність, підсилює інсектицидну активність або стабілізує цей сконструйований гібридний інсектицидний білок у порівнянні зі сконструйованим гібридним інсектицидним білком без пептидного фрагмента. 17. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 3 до 16, який відрізняється тим, що позиція кросинговера між Сrу3 А і Cry1 А або модифікованим Сrу3 А і Сrу1 А розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Ser450, Phe454 або Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70. 18. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 17, який відрізняється тим, що позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за Ser450, Phe454 або Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70. 19. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-18, який відрізняється тим, що включає щонайменше дві позиції кросинговера між амінокислотною послідовністю з першого Bt Cry-білка й амінокислотною послідовністю із другого Bt Cry-білка. 20. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 19, який відрізняється тим, що 96187 4 (а) перша позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 2, а друга позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 3; або (б) перша позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 3, а друга позиція кросинговера розташована в консервативному блоці 4. 21. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 20, який відрізняється тим, що (а) перша позиція кросинговера між Сrу3 А і Cry1 А або модифікованим Cry 3 А і Cry1 А розташована в консервативному блоці 2 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Asp232 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 А і Сrу3А або Cry1 А і модифікованим Сrу3 А розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Leu476 послідовності SEQ ID NO: 72; або (б) перша позиція кросинговера між Сrу3 А і Cry1 А або модифікованим Сrу3 А і Cry1 А розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 А і Сrу3 А або Cry1 А і модифікованим Сrу3 А розташована в консервативному блоці 4 відразу ж за амінокислотою, що відповідає І1е527 послідовності SEQ ID NO: 72. 22. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за п. 21, який відрізняється тим, що (а) перша позиція кросинговера між Сrу3 Аа і Cry1 Ab або модифікованим Сrу3Аа і Cry1 Ab розташована в консервативному блоці 2 відразу ж за Asp232 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 Ab і Сrу3 Аа або Cry1 Ab і модифікованим Сrу3 Аа розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за Leu476 послідовності SEQ ID NO: 72; або (б) перша позиція кросинговера між Сrу3 Аа і Cry1 Ab або модифікованим Сrу3 Аа і Cry1 Ab розташована вконсервативному блоці 3 відразу ж за Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговера між Cry1 Ab і Сrу3 Аа або Cry1 Ab і модифікованим Сrу3 Аа розташована в консервативному блоці 4 відразу ж за І1е527 послідовності SEQ ID NO: 72. 23. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 1 до 22, який відрізняється тим, що включає послідовність амінокислот, вибрану із групи, що складається з: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 і SEQ ID NO: 160. 24. Сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-23, який відрізняється тим, що має активність проти північного кукурудзяного кореневого жука або мексиканського кукурудзяного кореневого жука. 25. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує сконструйований гібридний інсектицидний білок за будь-яким із пунктів 1-24. 5 26. Молекула нуклеїнової кислоти, що кодує білок за п. 24, який відрізняється тим, що включає нуклеотидну послідовність, вибрану із групи, що включає: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154 і SEQ ID NO: 158. 27. Експресійна касета, що містить гетерологічну промоторну послідовність, оперативно пов'язану з молекулою нуклеїнової кислоти за п. 25 або 26. 28. Рекомбінантний вектор, що містить експресійну касету за п. 27. 29. Трансгенна клітина-хазяїн, що містить експресійну касету за п. 27. 30. Трансгенна клітина-хазяїн за п. 29, що являє собою бактеріальну клітину. 31. Трансгенна клітина-хазяїн за п. 29, що являє собою рослинну клітину. 32. Трансгенна рослина, що включає трансгенну рослинну клітину за п. 31. 33. Трансгенна рослина за п. 32, що являє собою рослину кукурудзи. 34. Трансгенне насіння із трансгенної рослини за п. 32 або 33. 35. Інсектицидна композиція, що містить інсектицидний білок за будь-яким із пунктів від 1 до 24. 36. Спосіб одержання сконструйованого гібридного інсектицидного білка, активного проти комах, що включає (а) одержання трансгенної клітини-хазяїна за п. 29; і (б) вирощування трансгенної клітини-хазяїна в умовах, що дозволяють хазяїнові експресувати сконструйований гібридний інсектицидний білок, що діє проти комах. 37. Спосіб виробництва стійкої до комах трансгенної рослини, що включає введення молекули нуклеїнової кислоти за п. 25 або 26 у рослину, одержуючи в такий спосіб трансгенну рослину, причому сконструйований гібридний інсектицидний білок експресується в трансгенній рослині в кількості, ефективній для боротьби з комахами. 38. Спосіб боротьби з комахами, що включає обробку комах ефективною кількістю інсектицидного токсину за будь-яким із пунктів 1-24. 39. Спосіб одержання сконструйованого гібридного інсектицидного білка (сГІБ) за пп. 1-24, що включає: (а) одержання першого Bacillus thuringiensis (Bt) Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка; (б) одержання другого Bt Cry-білка, що відрізняється від першого Bt Cry-білка або модифікованого Сrу-білка; (в) злиття в напрямку від N-кінця до С-кінця Nкінцевої ділянки першого Bt Cry-білка до С-кінцевої ділянки Bt Cry-білка, причому щонайменше одна позиція кросинговера між першим і другим Bt Cryбілком розташована в консервативному блоці 2, консервативному блоці 3, варіабельній ділянці 4 або консервативному блоці 4 для одержання сГІБ, що має активність проти щонайменше західного кукурудзяного кореневого жука; і, необов'язково 96187 6 (г) введення в N-кінець пептидного фрагмента або в С-кінець - протоксинової хвостової ділянки Bt Cry-білка, або в обидва, причому пептидний фрагмент, або протоксинова ділянка, або вони обидва наділяють сГІБ активністю, або підсилюють інсектицидну активність сГІБ, або роблять сГІБ більше стабільним, ніж сГІБ без пептидного фрагмента або протоксинової хвостової ділянки, або без обох. 40. Спосіб одержання сконструйованого гібридного інсектицидного білка (сГІБ) за будь-яким із пунктів 1-24, що включає: (а) одержання першої нуклеїнової кислоти, що кодує перший Bacillus thuringiensis (Bt) Cry-білок або модифікований Bt Cry-білок, і другої нуклеїнової кислоти, що кодує другий Bt Cry-білок, що відрізняється від першого Bt Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка; (б) виділення з вищевказаних першої й другої нуклеїнових кислот нуклеотидної послідовності, що кодує повні або неповні варіабельні ділянки й консервативні блоки вищезгаданих першого Bt Cryбілка або модифікованого Bt Cry-білка й другого Bt Cry-білка; (в) з'єднання разом отриманих у результаті виконання стадії (б) виділених нуклеїнових кислот таким чином, щоб одержати новугібридну нуклеїнову кислоту, що кодує білок, і, необов'язково, гібридизацію нуклеїнової кислоти, що кодує пептидний фрагмент, із 5' кінцем вищезгаданої гібридної нуклеїнової кислоти, що приводить в результаті до подовження по 5' кінцю, або гібридизацію нуклеїнової кислоти, що кодує протоксинову хвостову ділянку Bt-Cry-білка, з 3' кінцем вищезгаданої гібридної нуклеїнової кислоти, що приводить в результаті до подовження по 3' кінцю, або те й інше; (г) введення в експресивну касету гібридної нуклеїнової кислоти, що має одне з подовжень 5' або 3', або те й інше, або не має цих подовжень ; (д) трансформацію експресивної касети в клітинухазяїна, у результаті чого вищезгадана клітинахазяїн виробляє сГІБ. 41. Спосіб за будь-яким із пунктів 39 або 40, який відрізняється тим, що перший Bt Cry-білок або модифікований Bt Cry-білок є білком Сrу3 А або модифікованим Сrу3 А, а другий Bt Cry-білок - білком Cry1 Aa або Cry1 Ab. 42. Спосіб за будь-яким із пунктів від 39 до 41, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент містить щонайменше 9 амінокислот. 43. Спосіб за п. 42, який відрізняється тим, що пептидний фрагмент вибирають із групи, що включає: SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131, SEQ ID NO: 132 і SEQ ID NO: 133. 44. Спосіб за будь-яким із пунктів від 39 до 43, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка являє собою ділянку з білка Cry1 Аа або білка Cry1 Ab. 45. Спосіб за п. 44, який відрізняється тим, що вищезгадана протоксинова хвостова ділянка містить щонайменше 38 амінокислот. 46. Спосіб за п. 45, який відрізняється тим, що протоксинова хвостова ділянка 7 96187 8 (а) містить амінокислотну послідовність, що відповідає амінокислотам 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72; або (б) містить амінокислоти 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72. Даний винахід стосується галузей білкової інженерії, молекулярної біології рослин і боротьби зі шкідниками. Більш конкретно, винахід стосується до нових сконструйованих гібридних білків, що наділені інсектицидною активністю, до нуклеїнових кислот, результатом експресії яких є ці інсектицидні білки, а також до способів одержання й способам застосування цих інсектицидних білків і відповідних нуклеїнових кислот у боротьбі з комахами. Комахи-шкідники є головною причиною втрат урожаю. Тільки в США щорічні втрати, викликані інвазією різних видів комах, становлять мільярди доларів. Крім того, що комахи-шкідники приводять до втрат урожаю польових культур, вони також заподіюють шкоди виробникам овочів і фруктів, досаждають садівникам і домовласникам. Самими шкідливими кукурудзяними шкідниками вважаються різні види кукурудзяного кореневого жука. Найбільш значними його видами в США є Diabrotica virgifera virgifera, західний кукурудзяний кореневий жук, D. longicornis barberi, північний кукурудзяний кореневий жук й D. undecimpunctata howardi, південний кукурудзяний кореневий жук. Основними кукурудзяними шкідниками в Кукурудзяному поясі США вважаються тільки західні й північний кукурудзяні кореневі жуки. Поважним виглядом кукурудзяного кореневого шкідника в південній частині США є мексиканський кукурудзяний кореневий жук, Diabrotica virgifera zeae. Найбільш істотну шкоду рослині наносять личинки кукурудзяного кореневого жука, оскільки вони харчуються винятково коріннями кукурудзи. Ця шкода виражається в збільшенні полягання рослин, зниженні врожаю зерна й рослинної маси, а також у зміні змісту живильних речовин у зерні. Здійснення харчування личинками робить також непрямий вплив на кукурудзу тим, що в його результаті в коріннях відкриваються ходи для інвазії бактерій і грибків, що приводить до хвороб, що виражається в гнитті кореня й стебла. Дорослі особини кукурудзяного кореневого жука проявляють свою активність на кукурудзяних полях пізнім летом, коли вони харчуються качанами, «шовком», а також пилком, що перешкоджає нормальному запиленню. Боротьбу з кукурудзяними кореневими жуками ведуть головним чином шляхом інтенсивного застосування хімічних пестицидів, активність яких проявляється через перешкоджання росту комах, запобігання їхнього харчування або розмноження, або ж загибель комах. Таким шляхом може бути досягнуть гарний результат у боротьбі проти кукурудзяного кореневого жука, однак, іноді ці хімікати можуть впливати й на інші, корисні організми. Іншою проблемою, що проявляється в результаті широкого застосування хімічних пестицидів, є поява видів комах, стійких до них. Ще одна проблема викликана тим, що личинки кукурудзяного кореневого жука харчуються під землею, що утрудняє їхній контакт із внесеними інсектицидами. Тому, у більшості випадків застосування інсектицидів здійснюється профілактично, під час посіву. Результатом цієї практики є велика шкода для навколишнього середовища. Частково цю шкоду вдалася знизити за рахунок застосування різних способів ведення фермерського господарства, однак потреба в альтернативних механізмах боротьби зі шкідниками постійно росте. Біологічні агенти боротьби зі шкідниками, такі як штами Bacillus thuringiensis (Bt) експресуючі пестицидні токсини, такі як δ-ендотоксини (дельтаендотоксини, які також називаються кристалічними токсинами або Cry-білками), також застосовувалися для хлібних злаків і показали задовільні результати головним чином у боротьбі із лускокрилими комахами-шкідниками. Ці δ-ендотоксини являють собою білки, поміщені в кристалічну матрицю, відомі своєю інсектицидною активністю, що проявляється при проковтуванні їх певними видами комах. Класифікація різних δ-ендотоксинів була виконана на основі їхнього спектра активності й гомології послідовностей. До 1990 р. основні класи визначалися по їхньому спектру активності, причому білки Cry1 мають активність проти чешуекрылых (молей і метеликів), білки Сrу2 мають активність як проти лускокрилих, так і проти двокрилих (мух і комарів), білки Сrу3 мають активність проти жорсткокрилих (жуків), а білки Сrу4 мають активність у боротьбі проти двокрилих (Hofte та Whitely, 1989, Microbiol. Rev. 53:242-255). В 1998 p. була розроблена нова номенклатура, що дала систематичну класифікацію Cry-білків на основі гомології послідовності амінокислот, а не на активності стосовно певних видів комах (Crickmore й ін. 1998, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:807-813). Спектр інсектицидної активності окремого δендотоксина з Bt є досить вузьким, тобто, даний δендотоксин проявляє активність тільки проти невеликого числа видів у даному ряді комах. Наприклад, відомо, що токсин Сrу3А має дуже високу токсичність стосовно колорадського картопляного жука, Leptinotarsa decemlineata, однак, має дуже слабку або нульову токсичність стосовно родинних жуків з роду Diabrotica (Johnson й ін., 1993, J. Econ. Entomol. 86:330-333). Відповідно до роботи Slaney й ін. (1992, Insect Biochem. Molec. Biol. 22:9-18) токсичність токсину Сrу3А, щонайменше, в 2000 разів слабкіше стосовно личинок південного кукурудзяного кореневого жука, чим стосовно колорадського картопляного жука. Відомо також, що токсичність Сrу3А стосовно західного кукурудзяного кореневого жука або до північного кукурудзяного кореневого жука дуже слабка або зовсім відсутній. 9 Специфічність δ-ендотоксинів є результатом ефективності різних кроків, початих у процесі виробництва активного токсичного білка, і його наступної взаємодії з епітеліальними клітинами в середній кишці комахи. Для того, щоб мати інсектицидні властивості, більшість із відомих δендотоксинів повинні потрапити в організм комахи шляхом проковтування й протеолітично активуватися для утворення активного токсину. Активація інсектицидних кристалічних (Cry) білків являє собою багатоетапний процес. Після проковтування комахою кристали повинні в першу чергу розчинитися в травному каналі комахи. Після розчинення δ-ендотоксини активуються шляхом специфічного протеолітичного розщеплення. Протеази в травному каналі комахи можуть відігравати важливу роль у специфічності шляхом визначення місця, де переробляється δ-ендотоксин. Після того, як δендотоксин розчинився й переробився, він приєднується до певних рецепторів на поверхні епітелію середньої кишки комахи, а згодом інтегрується в ліпідний бішар мембрани щіткової облямівки. Потім формуються іонні канали, що порушують нормальне функціонування середньої кишки, в остаточному підсумку приводячи до загибелі комахи. У лускокрилих, рівень рН у травних каналах яких є лужним, протеази кишечника переробляють δ-ендотоксини, наприклад, Сrу1Аа, Сrу1Аb, Сrу1Ас, Сrу1В й Cry1F, із протоксинів розміром 130-140 кДа в токсичні білки розміром приблизно 60-70 кДа. Процес переробки протоксина в токсин, згідно з опублікованими даними, здійснюється шляхом переміщення як N-кінцевих, так й Скінцевих амінокислот, а точне місце розташування процесу переробки залежить від конкретного δендотоксина, і участь у ньому приймають специфічні текучі речовини травного каналу комахи (Ogiwara й ін., 1992, J. Invert. Pathol. 60:121-126). Таким чином, процес активації вимагає відщіплення всього С-кінцевої хвостової ділянки протоксина. Ця протеолітична активація δ-ендотоксина може відігравати значну роль у визначенні його специфічності. Жорсткокрилі комахи мають травні канали з рівнем кислотності від більше нейтрального до кислотного, і δ-ендотоксини, специфічні для жорсткокрилих, подібні по своєму розміру активованим токсинам, специфічним для лускокрилих. Тому, раніше вважалось, що переробка δ-ендотоксинів, специфічних для жорсткокрилих, не є необхідною для їхньої токсичності. Однак, виходячи з отриманих даних, можна припустити, що δ-ендотоксини, активні проти жорсткокрилих, розчиняються й протеолітично переробляються в токсичні поліпептиди меншого розміру. Білковий δ-ендотоксин Сrу3А розміром 73 кДа, вироблюваний бактеріями В. thuringiensis var. tenebrionis, легко піддається переробці в бактерії на N-кінці, гублячи 49-57 залишків у процесі формування кристала або після нього, утворюючи в підсумку звичайну ізольовану форму розміром 67 кДа (Carroll й ін., 1989, Biochem. J. 261:99-105). У своїй роботі McPherson й ін., (1988, Biotechnology 6:61-66) також продемонстрували, що нативна послідовність, що кодує, Сrу3А містить два функціональних кодони, що іні 96187 10 ціюють трансляцію, в одній і тій же рамці зчитування, один - для кодування білка розміром 73 кДа, а іншої - для кодування білка розміром 67 кДа, починаючи відповідно з Met-1 й Met-48 розшифрованої послідовності амінокислот. Тому обоє білка можуть уважатися повнорозмiрними білками Сrу3А природні походження. По мірі розширення знань про те, як функціонують δ-ендотоксини, збільшилася кількість спроб розробити δ-ендотоксини, що володіють новими видами активності. Розробка δ-ендотоксинів стала більше можлива в результаті визначення тривимірної структури Сrу3А в 1991р. (Li й ін., 1991, Nature 353:815-821). Li й ін. визначили, що білок Сrу3А має три структурних домена: N-кінцевий домен І, із залишків 58-290, що складає із семи α-спіралей, домен II, із залишків 291-500, що складає із трьох β-листів в упакуванні так називаним грецьким ключем, а також С-кінцевий домен III, із залишків 501644, що представляє собою β-сендвич у так називаному впакуванні рулетом. Також була визначена тривимірна структура активного проти лускокрилих токсину Сrу1Aa (Grochulski й ін., 1995, J. Моl. Віоl. 254:447-464). Токсин Сrу1Aa має три домена: Nкінцевий домен І, із залишків 33-253, домен II із залишків 265-461, а також домен III із залишків 463-609 з додатковим зовнішнім ланцюжком в одному з β-листів із залишків 254-264. Якщо структури Сrу3А й Сrу1Aa спроектувати на інші послідовності Сrу1, то до домену І відносяться амінокислотні залишки від 28 до 260, до домену II приблизно від 260 до 460, а до домену III - приблизно від 460 до 600. Див., роботи Nakamura й ін., Agric. Biol. Chem. 54(3): 715-724 (1990); Li й ін., Nature 353: 815-821 (1991); Ge й ін., J. Biol. Chem. 266(27): 17954-17958 (1991); і Ноnее й ін., Моl. Microbiol. 5(11): 2799-2806 (1991); кожна з яких включена в дану заявку шляхом посилання. Таким чином, у цей час відомо, що на основі гомології послідовності амінокислот відомі Bt δ-ендотоксини мають подібну тривимірну структуру, що складається із трьох доменів. Токсинова частина Bt Білок-Сrу-білків також характеризується наявністю п'яти консервативних блоків по їхній послідовності амінокислот, що має номери від СВ1 до СВ5, розташованих у такому порядку протягом від N-кінця до С-кінця (Hofte та Whiteley, див. вище). Консервативний блок 1 (СВ1) містить приблизно 29 амінокислот, консервативний блок 2 (СВ2) містить приблизно 67 амінокислот, консервативний блок 3 (СВ3) містить приблизно 48 амінокислот, консервативний блок 4 (СВ4) містить приблизно 10 амінокислот, а консервативний блок 5 (СВ5) містить приблизно 12 амінокислот. Послідовності, розташовані перед цими п'ятьма консервативними блоками й після них, є у високому ступені варіабельні, а тому називаються «варіабельними ділянками» V1-V6. У типовому випадку домен І Bt δ-ендотоксина складається з варіабельної ділянки 1, консервативного блоку 1, варіабельної ділянки 2 й 52-х N-кінцевих амінокислот консервативного блоку 2. Домен II у типовому випадку складається з С-кінцевих амінокислот (приблизно 15) консервативного блоку 2, варіабельної ділянки 3 й N-кінцевих амінокислот (прибли 11 зно 10) консервативного блоку 3. Домен III у типовому випадку складається з С-кінцевих амінокислот (приблизно 38) консервативного блоку 3, варіабельної ділянки 4, консервативного блоку 4, варіабельної ділянки 5 і консервативного блоку 5. Активні проти лускокрилих токсини Сrу1, як й інші дельта-токсини, мають варіабельну ділянку 6, що складається приблизно з 1-3 амінокислот, що лежить у межах домена III. Багато Bt-штамів й δ-ендотоксинів є активними стосовно різних видів комах і нематод. Однак, відносно невелике число цих штамів і токсинів мають активність проти жорсткокрилих комах. Крім того, більшість активних стосовно жорткокриилих δендотоксинів, відомих у цей час, наприклад, Сrу3А, Сrу3В, Сrу3С, Сrу7А, Сrу8А, Сrу8В, і Сrу8С, володіють недостатньою оральною токсичністю проти кукурудзяного кореневого жука, що не дозволяє забезпечити адекватні міри боротьби з ним у випадку подачі їх через мікроби й трансгенні рослини. Тому, існує необхідність розробки інших підходів для виробництва нових токсинів, активних проти кукурудзяного кореневого жука. Були розроблені активні проти лускокрилих δендотоксини в спробах поліпшення специфічної активності або розширення спектра інсектицидної активності. Наприклад, домен специфічності для шовковичного шовкопряда (Bombyx mоrі) з білка Сrу1Аа перемістили в білок Cry1Ас, у такий спосіб наділивши новою інсектицидною активністю отриманий у результаті гібридний Білок-Ві-білок (Ge й ін. 1989, PNAS 86: 4037-4041). Крім того, Bosch й ін. 1998 (Патент США 5,736,131, включений у цю заявку шляхом посилання) описує гібридні токсини Bacillus thuringiensis, що містять на своєму С-кінці домен III першого Білок-Сrу-білка, а на своєму Nкінці - домени І й II другого Білок-Сrу-білка. Такі гібридні токсини продемонстрували інсектицидну специфічність, що змінилася, проти лускокрилих комах. Наприклад, гібридний токсин Н04, описаний також у джерелі De Maagd й ін., Appl. Environ. Microbiol. 62(5): 1537-1543 (1996), містить на своєму N-кінці домени І й II білка Сrу1Ab, а на своєму С-кінці - домен III білка Cry1С. Згідно отриманим даним, Н04 має високу токсичність стосовно лускокрилої комахи Spodoptera exigua (бурячна совка) у порівнянні з батьківським токсином Сrу1Ab, а також значно більшою токсичністю в порівнянні з батьківським токсином Cry1С. Також було показано, що заміною домена III у токсинах, що не є активними проти бурячної совки, таких як Cry1E й Сrу1Ab, на домен III з Cry1С, що є активним проти бурячної совки, можна одержати гібридні токсини, що володіють активністю проти цієї комахи. У всіх гібридах, описаних у роботі Bosch й ін., використовуються домени з Білок-Сrу-білків, активних проти лускокрилих, для одержання нових токсинів з активністю проти лускокрилих. Отримані результати дають підставу припускати, що домен III білка Cry1С є важливим визначником специфічності щодо бурячної совки. Див. також: джерела Bosch й ін., FEMS Microbiology Letters 118:129-134 (1994); Bosch й ін., Bio/Technology 12: 915-918 (1994); De Maagd й ін., Appl. Environ. Microbiol. 62(8): 27532757 (1996); і De Maagd й ін., Моl. Microbiol. 31(2): 96187 12 463-471 (1999); кожний з яких включений сюди шляхом посилання. Є дані про декілька спроб розробки δендотоксинів, активних проти жорсткокрилих. Chen й Stacy (Патент США 7,030,295, включений сюди шляхом посилання) успішно створили токсин, активний проти кукурудзяного кореневого жука шляхом введення не зустрічається в природі сайту пізнавання Протеази в домен І, у домен III, або як у домен І, так й у домен III білка Сrу3А. Один з отриманих у результаті модифікованих Сrу3БілокА-білків, позначений Сrу3А055, у домен І якого ввели сайт пізнавання Протеази, виявився активним стосовно різних видів Diabrotica. Van Rie й ін., 1997, (Патент США №. 5,659,123) розробляли Сrу3А шляхом довільної заміни амінокислот, що вважаються важливими в питанні доступності розчиннику, у домені II на амінокислоту аланін. Деякі з цих довільних замін у домені II, згідно з отриманими даними, виявилися в підвищенні активності проти західного кукурудзяного кореневого жука. Однак, інші дослідники показали, що деякі заміни аланіном у домені II білка Сrу3А дали в результаті руйнування зв'язку з рецептором або нестабільність структури (Wu та Dean, 1996, J. Моl. Віоl. 255: 628-640). Згідно даних English й ін., 1999, (номер публікації міжнародної патентної заявки. WO 99/31248) у результаті заміни амінокислот в Сrу3Вb підвищилася токсичність проти південного й західного кукурудзяного кореневого жука. Однак, з отриманих даних по 35 мутантам Сrу3Вb видно, що тільки три з них, з мутаціями в основному в домені II і на стику домен І-домен II, виявилися активними проти західного кукурудзяного кореневого жука. Крім того, варіації токсичності вихідного Сrу3Вb проти західного кукурудзяного кореневого жука в тих самих пробах перевищували розходження між підданими мутаціям токсинами Сrу3Вb і вихідними токсинами Сrу3Вb. Shadenkov it ін. (1993, Моl. Віоl. 27:586-591) одержали гібридний білок шляхом злиття амінокислот 48-565 білка Сrу3А з амінокислотами 526-725 білка Сrу1Aa. Таким чином, схрещування послідовностей Сrу3А й Сrу1Aa відбулося в консервативному блоці 4, розташованому в домені III. Сrу3А є дуже активним проти колорадського картопляного жука (Leptinotarsa decemlineata). Однак, гібридний білок, описаний Shadenkov й ін. не був активним проти колорадського картопляного жука, незважаючи на те, що гібридний білок складався з послідовності Сrу3А більш, ніж на 75%. Таким чином, додавання тільки 25% послідовності Сrу1Aa знищило активність проти жорсткокрилих комах, якою володів батьківський білок Сrу3А. Це дозволяє припустити, що гібридні білки, отримані шляхом злиття частини Cry-білка, активного проти жорсткокрилих, наприклад, білка Сrу3А, з активним проти лускокрилих Cry-білком, наприклад, Сrу1А, не будуть мати активність проти жорсткокрилих комах, зокрема, проти жорсткокрилої комахи, що не має такої природної сприйнятливості до Сrу3А, як у кукурудзяного кореневого жука. Виходячи з вищеописаного, очевидно, що залишається потреба розробки нових ефективних засобів боротьби зі шкідниками, які були б еконо 13 мічно вигідними фермерам і прийнятними для навколишнього середовища. Особливо, потрібні такі білки, що володіють токсичністю проти видів Diabrotica, головного шкідника кукурудзи, спосіб дії яких відрізнявся б від існуючих засобів боротьби зі шкідниками в плані ослаблення розвитку опірності. Крім того, бажано, щоб подача таких засобів боротьби здійснювалася через продукти, мінімізуючі шкоду для навколишнього середовища, наприклад, через трансгенні рослини. У світлі цих потреб метою цього винаходу є надання нових сконструйованих гібридних інсектицидних білків (сГІБів). Такі нові сГІБи одержують шляхом злиття унікальних комбінацій варіабельних ділянок і консервативних блоків, щонайменше, двох різних Cry-білків й, на вибір, включення протоксинової хвостової ділянки з Bt Cry-білка в Скінець, або N-кінцевого пептидильного фрагмента, або того й іншого. Не обмежуючим прикладом є комбінування повних або неповних варіабельних ділянок і консервативних блоків з першого Cryбілка, що володіє активністю проти жорсткокрилих, з повними або неповними варіабельними ділянками й консервативними блоками другого Cry-білка, що володіє активністю проти лускокрилих і відрізняється від першого Cry-білка, і, на вибір, включення протоксинової хвостової області з активного проти лускокрилих Bt Cry-білка або N-кінцевого пептидильного фрагмента, або обох, у результаті чого виходять нові сконструйовані гібридні інсектицидні білки, що володіють активністю проти спектра комах, що відрізняється від спектра перших або другого батьківських Cry-білків або того й іншого. Такі нові сГІБи можуть містити повні або неповні варіабельні ділянки, консервативні блоки або домени з модифікованого білка Сrу3А, а також з Сrу-білка, що відрізняється від модифікованого білка Сrу3А. Пептидильний фрагмент може наділяти сГІБ інсектицидною активністю, або може робити інсектицидну активність сГІБа більше високою, ніж у сГІБа, що не має пептидильного фрагмента, або може робити сГІБ більше стабільним, чим сГІБ, що не має пептидильного фрагмента. Токсичність сГІБа по цьому винаходу проти кукурудзяного кореневого жука (Diabrotica sp.) зненацька виявилася дивно високою. Цей винахід також стосується нуклеїнових кислот, що кодують даний сГІБ або комплементарним до рекомбінантних гібридних нуклеїнових кислот, що гібридизуються, по цьому винаходу. Крім того, у винахід включені вектори, що містять такі рекомбінантні (або комплементарні до них) нуклеїнові кислоти, рослина або мікроорганізм, що включають у себе такі нуклеїнові кислоти й такі, що дають можливість їхньої експресії, наприклад, трансгенна кукурудза; потомство таких рослин, у якому утримуватися нуклеїнові кислоти, стійко включені в нього й наслідувані відповідно до Менделя, а також/або насіння таких рослин і такого потомства. Винахід також містить у собі композиції й формулювання, що містять сГІБи, що мають можливісті до інгібірування здатності комах виживати, рости й розмножуватися, або що дозволяють обмежити заподіювану комахами шкоду врожаю зер 96187 14 нових, наприклад, шляхом застосування цих сГІБів або композицій або формулювань у місцях інвазії комах, або профілактичною обробкою сприйнятливих до комах площ або рослин для захисту їх від комах-шкідників. Крім того, винахід стосується до способу одержання сГІБів і до способів використання нуклеїнових кислот, наприклад, у мікроорганізмах, для боротьби з комахами або в трансгенних рослинах для додання захисту від комах. Описані тут нові сГІБи мають високу активність проти комах. Наприклад, сГІБи по цьому винаходу можна використати для боротьби із серйозними шкідниками-комахами, такими як західний кукурудзяний кореневий жук (Diabrotica virgifera virgifera), північний кукурудзяний кореневий жук (D. longicornis barberi) і мексиканський кукурудзяний кореневий жук (D. virgifera zeae). Деякі сГІБи можна також застосовувати для боротьби з європейським метеликом кукурудзяним (Ostrinia nubilalis) і іншими лускокрилими комахами. СГІБи можна застосовувати окремо або в комбінації з іншими стратегіями боротьби з комахами для одержання максимальної ефективності боротьби зі шкідниками при мінімальнійшкоді для навколишнього середовища. Інші аспекти й переваги цього винаходу стануть зрозумілими фахівцям у даній галузі в процесі вивчення наступного опису винаходу з не обмежуючими його прикладами. Подані нижче малюнки є частиною цього опису й включені з метою продемонструвати деякі аспекти цього винаходу. Розуміння винаходу може бути полегшене шляхом звертання до однієї або декількох із цих фігур у комбінації з докладним описом конкретних виконань винаходу, представленим тут. Фіг. 1А-1Е показує зіставлення послідовності в деяких виконаннях сГІБ з батьківським Cry-білками або модифікованими білками Cry3А, що застосовувалися для конструювання цих сГІБів, включаючи Сrу3А, Cry1Ab, і Сrу3А055, а також вказує відсоток ідентичності. Підкреслено N-кінцеві пептидильні фрагменти. П'ять консервативних блоків позначені ярличками СВ1-СВ5. Місця розташування з'єднань між доменами І, II й III позначені вертикальною пунктирною лінією. Послідовність AAPF пізнавання Протеази катепсин G показана жирним. На Фіг. 2А-2Е показаний набір виконань сГІБ, активних, щонайменше, проти західного кукурудзяного кореневого жука, і зазначений відсоток ідентичності в порівнянні із сГІБ 8AF. N-кінцеві пептидильні фрагменти підкреслені однією лінією. С-кінцеві протоксинові хвостові ділянки підкреслені подвійною лінією. П'ять консервативних блоків позначені ярличками СВ1-СВ5. Місця розташування з'єднань між доменами І, II й III показані значком "" і мають відповідні ярлички. Місця розташування позицій кросинговеру позначені значком "♦". Послідовність AAPF пізнавання Протеази катепсин G показана жирним. На Фіг.3 показана карта рекомбінантного вектора 12207, використовуваного для трансформації кукурудзи й що включає експресийну касету із 15 промотором убіквитина кукурудзи, операбельно пов'язаним з послідовністю, що кодує, FRCG, операбельно пов'язаної з NOS-термінатором. На Фіг. 4 показана карта рекомбінантного вектора 12161, використовуваного для трансформації кукурудзи й включає в себе експресийну касету із промотором убіквитина кукурудзи, операбельно пов'язаним з послідовністю, що кодує, FR8a, операбельно пов'язаної з NOS-термінатором. На Фіг. 5 показана карта рекомбінантного вектора 12208, використовуваного для трансформації кукурудзи й включає в себе експресийну касету із промотором, яким є вірус скручування жовтих листів цеструма (стр), операбельно пов'язаний з послідовністю, що кодує, FRCG, операбельно пов'язаної з NOS-термінатором. На Фіг. 6 показана карта рекомбінантного вектора 12274, використовуваного для трансформації кукурудзи й включає в себе експресийну касету із промотором, яким є вірус скручування жовтих листів цеструма (сmр), операбельно пов'язаний з послідовністю, що кодує, FR8a, операбельно пов'язаної з NOS-термінатором. На Фіг. 7 показана карта рекомбінантного вектора 12473, використовуваного для трансформації кукурудзи й включає в себе експресийну касету із промотором убіквитин кукурудзи (ubi), операбельно пов'язаний з послідовністю, що кодує, FRD3, операбельно пов'язаної з NOS-термінатором. На Фіг. 8 показана карта рекомбінантного вектора 12474, використовуваного для трансформації кукурудзи й включає в себе експресийну касету із промотором, яким є вірус скручування жовтих листів цеструма (сmр), операбельно пов'язаний з послідовністю, що кодує, FRD3, операбельно пов'язаної з NOS-термінатором. КОРОТКИЙ ОПИС ПОСЛІДОВНОСТЕЙ, ЩО ВТРИМУЮТЬСЯ В ПЕРЕЛІКУ ПОСЛІДОВНОСТЕЙ SEQ ID NO: 1 - нуклеотидна послідовність 2OL-8a. SEQ ID NO: 2 - послідовність 2OL-8a, кодована SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 3 - нуклеотидна послідовність FR8a. SEQ ID NO: 4 - послідовність FR8a, кодована SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 5 - нуклеотидна послідовність FRCG. SEQ ID NO: 6 - послідовність FRCG, кодована SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 7 - нуклеотидна послідовність FR8a-9F. SEQ ID NO: 8 - послідовність FR8a-9F, кодована SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 9 - нуклеотидна послідовність FR9F-catg. SEQ ID NO: 10 - послідовність FR-9F-catg, кодована SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 11 - нуклеотидна послідовність FR8a-12AA. SEQ ID NO: 12 - послідовність FR8a-12AA, кодована SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 13 - нуклеотидна послідовність WR-9mut. 96187 16 SEQ ID NO: 14 - послідовність WR-9mut, кодована SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 15 - нуклеотидна послідовність FRD3. SEQ ID NO: 16 - послідовність FRD3 кодована SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 17 - нуклеотидна послідовність FR-12-cg-dm3. SEQ ID NO: 18 - послідовність FR-12-cg-dm3, кодована SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 19 - нуклеотидна послідовність 9Fcg-del6. SEQ ID NO: 20 - послідовність 9F-cg-del6, кодована SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 21 - нуклеотидна послідовність FR-cg-dm3. SEQ ID NO: 22 - послідовність FR-cg-dm3, кодована SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 23 - нуклеотидна послідовність 9Fcg-dm3. SEQ ID NO: 24 - послідовність 9F-cg-dm3, кодована SEQ ID NO:23. SEQ ID NO: 25 - нуклеотидна послідовність В8а. SEQ ID NO: 26 - послідовність В8а, кодована SEQ ID NO: 25. SEQ ID NO: 27 - нуклеотидна послідовність 5*В8а. SEQ ID NO: 28 - послідовність 5*B8a, кодована SEQ ID NO: 27. SEQ ID NO: 29- нуклеотидна послідовність V3A. SEQ ID NO: 30 - послідовність V3A, кодована SEQ ID NO: 29. SEQ ID NO: 31 - нуклеотидна послідовність V4F. SEQ ID NO: 32 - послідовність V4F, кодована SEQ ID NO: 31. SEQ ID NO: 33 - нуклеотидна послідовність 5*V4F. SEQ ID NO: 34 - послідовність 5*V4F, кодована SEQ ID NO: 33. SEQ ID NO: 35 - нуклеотидна послідовність 2OL-7. SEQ ID NO: 36 - послідовність 2OL-7, кодована SEQ ID NO: 35. SEQ ID NO: 37 - нуклеотидна послідовність T72OL-7. SEQ ID NO: 38 - послідовність T7-2OL-7, кодована SEQ ID NO: 37. SEQ ID NO: 39 - нуклеотидна послідовність 5*2OL-7. SEQ ID NO: 40 - послідовність 5*2OL-7, кодована SEQ ID NO: 39. SEQ ID NO: 41 - нуклеотидна послідовність 2OL-10. SEQ ID NO: 42 - послідовність 2OL-10, кодована SEQ ID NO: 41. SEQ ID NO: 43 - нуклеотидна послідовність 5*2OL-10. SEQ ID NO: 44 - послідовність 5*2OL-10 кодована SEQ ID NO: 43. SEQ ID NO: 45 - нуклеотидна послідовність 2OL-12A. 17 SEQ ID NO: 46 - послідовність 2OL-12A, кодована SEQ ID NO: 45. SEQ ID NO: 47 - нуклеотидна послідовність 2OL-13. SEQ ID NO: 48 - послідовність 201-13, кодована SEQ ID NO: 47. SEQ ID NO: 49 - нуклеотидна послідовність V5i6. SEQ ID NO: 50 - послідовність V5i6, кодована SEQ ID NO: 49. SEQ ID NO: 51 - нуклеотидна послідовність 5*V5i6. SEQ ID NO: 52 - послідовність 5*V5i6, кодована SEQ ID NO: 51. SEQ ID NO: 53 - нуклеотидна послідовність 88A-dm3. SEQ ID NO: 54- послідовність 88A-dm3, кодована SEQ ID NO: 53. SEQ ID NO: 55 - нуклеотидна послідовність FR(1Fa). SEQ ID NO: 56 - послідовність FR(1Fa), кодована SEQ ID NO: 55. SEQ ID NO: 57 - нуклеотидна послідовність FR(1Ac). SEQ ID NO: 58 - послідовність FR(1Ac), кодована SEQ ID NO: 57. SEQ ID NO: 59 - нуклеотидна послідовність FR(11a). SEQ ID NO: 60 - послідовність FR(11a), кодована SEQ ID NO: 59. SEQ ID NO: 61 - нуклеотидна послідовність DM23Α. SEQ ID NO: 62 - послідовність DM23A, кодована SEQ ID NO: 61. SEQ ID NO: 63 - нуклеотидна послідовність 8AF. SEQ ID NO: 64- послідовність 8AF, кодована SEQ ID NO: 63. SEQ ID NO: 65 - нуклеотидна послідовність 5*сrу3А055. SEQ ID NO: 66 - послідовність 5*Cry3A055, кодована SEQ ID NO: 65. SEQ ID NO: 67 - оптимізована для кукурудзи нуклеотидна послідовність cry3А. SEQ ID NO: 68 - послідовність Сrу3А, кодована SEQ ID NO: 67. SEQ ID NO: 69 - нуклеотидна послідовність Сrу3А055. SEQ ID NO: 70 - послідовність Сrу3А055, кодована SEQ ID NO: 69. SEQ ID NO: 71 - оптимізована для кукурудзи нуклеотидна послідовність Сrу1Ab. SEQ ID NO: 72 - послідовність Сrу1Ab, кодована SEQ ID NO: 71. SEQ ID NO: 73 - оптимізована для кукурудзи нуклеотидна послідовність Сrу1Ba. SEQ ID NO: 74 - послідовність Сrу1Ba, кодована SEQ ID NO: 73. SEQ ID NO: 75 - оптимізована для кукурудзи нуклеотидна послідовність Сrу1Fa. SEQ ID NO: 76 - послідовність Сrу1Fa, кодована SEQ ID NO: 75. SEQ ID NO: 77 - нуклеотидна послідовність Сrу8Аа. 96187 18 SEQ ID NO: 78 - послідовність Сrу8Аа, кодована SEQ ID NO: 77. SEQ ID NO: 79 - нуклеотидна послідовність Сrу1Ac. SEQ ID NO: 80 - послідовність Сrу1Ac кодована SEQ ID NO: 79. SEQ ID NO: 81 - нуклеотидна послідовність Cry1Θα. SEQ ID NO: 82 - послідовність Сrу1la, кодована SEQ ID NO: 81. SEQ ID NO: 83-125 - праймерні послідовності, застосовувані у винаході. SEQ ID NO: 126-134 - N-кінцеві пептидильні фрагменти. SEQ ID NO: 135 - повнорозмірний білок Cry3А. SEQ ID NO: 136-143 - праймерні послідовності, застосовувані у винаході. SEQ ID NO: 144 - послідовність, що кодує, T78AF. SEQ ID NO: 145 - послідовність T7-8AF, кодована ASEQ ID NO: 144. SEQ ID NO: 146 - послідовність, що кодує, cat8AF. SEQ ID NO: 147 - послідовність -Cat8AF, кодована SEQ ID NO: 146. SEQ ID NO: 148 - послідовність, що кодує, 8AFdm3. SEQ ID NO: 149 - послідовність 8AFdm3, кодована SEQ ID NO: 148. SEQ ID NO: 150 - послідовність, що кодує, 8AFlongdm3. SEQ ID NO: 151 - послідовність 8AFlongdm3, кодована SEQ ID NO: 150. SEQ ID NO: 152 - послідовність, що кодує, cap8AFdm3. SEQ ID NO: 153 - послідовність cap8AFdm3, кодована SEQ ID NO: 152. SEQ ID NO: 154 - послідовність, що кодує, 8AFdm3T. SEQ ID NO: 155 - послідовність 8AFdm3T, кодована SEQ ID NO: 154. SEQ ID NO: 156 - послідовність, що кодує, 8AFlongdm3T. SEQ ID NO: 157 - послідовність 8AFlongdm3T, кодована SEQ ID NO: 156. SEQ ID NO: 158 - послідовність, що кодує, cap8AFdm3T. SEQ ID NO: 159 - послідовність cap8AFdm3T, кодована SEQ ID NO: 158. SEQ ID NO: 160 - FR8a+34. сГІБ ВИЗНАЧЕННЯ Для внесення ясності нижче подані визначення деяких термінів, використовуваних у дійсному описі: «Активність» сГІБів по цьому винаходу означає, що дані сГІБи функціонують як орально активні засоби боротьби з комахами, мають токсичний ефект і здатні порушити або утруднити харчування комахи, що може приводити або не приводити до загибелі комахи. Якщо сГІБ по цьому винаходу доставлений в організм комахи, то результатом у типовому випадку є загибель комахи або неможливість комахи харчуватися джерелом, з якого сГІБ попадає в його організм. 19 Термін «асоційовані з / операбельно зв'язані» відноситься до двох нуклеїнових кислот, зв'язаних один з одним фізично або функціонально. Наприклад, говорять, що промотор або регуляторна послідовність ДНК «асоційовані з» послідовністю ДНК, що кодує РНК або білком, у тому випадку, якщо ці дві послідовності зв'язані оперативно або розташовані так, що регуляторна послідовність ДНК буде впливати на рівень експресії що кодує або структурної послідовності ДНК. У контексті цього винаходу «химерний інсектицидний білок» (ХІБ) являє собою інсектицидний білок, що містить пептидильний фрагмент, що ввели шляхом злиття в N-кінцеву частину сГІБа. Цей пептидильний фрагмент може наділяти даний сГІБ інсектицидною активністю, може робити активність сГІБа вище, ніж у сГІБа, що не має такого пептидильного фрагмента, або ж може зробити сГІБ більше стабільним, чим сГІБ без пептидильного фрагмента, зокрема проти, щонайменше, західного кукурудзяного кореневого жука. Пептидильний фрагмент являє собою послідовність амінокислот, що у типовому випадку гетерологична Bt Сг-білку (не отримана з нього), але може бути й отриманої з Bt Cry-білка. Такі пептидильні фрагменти витягнуті за N-кінцеву частину інсектицидного білка й у природі не зустрічаються в Nкінцевій частині Bt Cry-білків. Одним із прикладів N-кінцевого пептидильного фрагмента є послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), що не отримана з Bt Cry-білка. «Кодуюча послідовність» - це нуклеїновокислотна послідовність, транскрибована в РНК, таку як мРНК, рРНК, тРНК, мяРНК, смислова РНК або антисмислова РНК. Бажано, щоб потім ця РНК транслювалася в організмі для виробництва білка. У контексті цього винаходу «зв'язування» нуклеїнових кислот означає, що дві або декілька нуклеїнових кислоти з'єднують разом за допомогою будь-яких способів, відомих у даній галузі. Для прикладу, що не є обмежуючим, скажемо, що нуклеїнові кислоти можна лігірувати разом за допомогою, наприклад, Днк-лігази або з'єднувати віджигом за допомогою ПЦР. Нуклеїнові кислоти також можна з'єднувати шляхом хімічного синтезу нуклеїнової кислоти, використовуючи послідовність із двох або декількох окремих нуклеїнових кислот. «Боротьба» з комахами означає перешкоджання за допомогою токсичного впливу здатності комах-шкідників виживати, рости, харчуватися та/або розмножуватися або обмеження збитку або втрати врожаю злаків, викликуваних комахами. «Боротьба» з комахами може означати або не означати знищення їх, хоча в кращому варіанті вона означає знищення комах. У контексті цього винаходу термін «відповідає» означає, що коли послідовність амінокислот певних білків (наприклад, Bt Cry-білків або модифікованих Сrу3А-білків) сполучити один з одним, то амінокислоти, які збігаються з певними пронумерованими позиціями, наприклад, у токсині Сrу3А (або SEQ ID NO: 68, або SEQ ID NO: 134); у токсині Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70); або у токсині Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), хоча не обов'язково вони повинні перебувати точно в цих пронумерованих позиціях 96187 20 щодо посилальної послідовності амінокислот, особливо стосовно ідентифікації доменів І, II and III, а також/або консервативних блоків і варіабельних ділянок, то позиції цих амінокислот «відповідають» один одному. Наприклад, у схемі домена І гібридного білка амінокислоти 11-244 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70) відповідають амінокислотам 58290 нативного білка Сrу3А (SEQ ID NO: 135) або амінокислотам 11-243 нативного білка Сrу3А (SEQ ID NO: 68) або амінокислотам 33-254 нативного білка Сrу1Ab. У контексті цього винаходу слова «Cry-білок» можуть використатися як взаємозамінні зі словами «дельта-ендотоксин» або «δ-ендотоксин». У контексті цього винаходу «сконструйований гібридний інсектицидний білок» (сГІБ) являє собою інсектицидний білок, створений шляхом злиття унікальних комбінацій варіабельних ділянок і консервативних блоків з, щонайменше, двох різних Cry-білків. Такі знову створені сГІБи можуть містити повні або неповні варіабельні ділянки, консервативні блоки або домени з модифікованого білка Сrу3А і з Сrу-білка, що відрізняється від модифікованого білка Сrу3А. СГІБи по цьому винаходу можуть, на вибір, містити в собі протоксинну хвостову ділянку з Bt Cry-білка, або N-кінцевий пептидильний фрагмент, або й те й інше. У не обмежуючому прикладі сГІБ створений шляхом комбінування (у напрямку від N-кінця до С-кінця) амінокислотами 1-468 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), що включає варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислотами 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить у собі С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6, а також ділянкою з 38 амінокислот хвостової ділянки протоксина Сrу1Ab. Сконструйований ГІБ, що містить Nкінцевий пептидильний фрагмент можна також називати «химерним інсектицидним білком» (ХІБ). «Доставити» сГІБ означає, що даний сГІБ вступає в контакт із комахою, результатом чого є токсичний вплив і боротьба з комахою. Доставка сГІБ може здійснюватися різними шляхами, наприклад, шляхом експресії сГІБ трансгенною рослиною, за допомогою складеної білкової композиції (композицій), що розпорошують білковими композиціями (композицією), за допомогою приманної матриці або за допомогою будь-яких інших, відомих у галузі систем доставки токсинів. «Кількість, ефективна для боротьби з комахами» означає таку концентрацію сГІБа, що шляхом токсичного впливу перешкоджає здатності комах виживати, рости, харчуватися та/або розмножуватися, або обмежує заподіювані комахами збиток або втрату врожаю злаків. «Кількість, ефективна для боротьби з комахами» може означати або не означати знищення комах, хоча переважно, щоб воно означало знищення комах. Термін «експресійна касета» тут використається в значенні послідовності нуклеїнових кислот, здатної направляти експресію конкретної нуклео 21 тидної послідовності у відповідний клітина-хазяїн, що містить промотор, операбельно зв'язаний зі значимої нуклеотидної послідовністю, операбельно пов'язаної із сигналами термінації. У типовому випадку вона також містить послідовності, необхідні для належної трансляції значимої нуклеотидної послідовності. Щонайменше, один з компонентів експресійної касети, що містить значиму нуклеотидную послідовність, може бути гетеро логічним стосовно, щонайменше, одному з інших її компонентів. Ця експресійна касета може бути такою, котра зустрічається в природі, але була отримана в рекомбінантній формі, корисної для гетерологічної експресії. Однак, у типовому випадку експресійна касета є гетерологічною стосовно хазяїна, тобто, конкретна послідовність нуклеїнових кислот цієї експресійної касети не зустрічається в природі в клітині-хазяїні, і повинна вводитися в клітину-хазяїн або в попередник клітини-хазяїна шляхом трансформації. Експресія нуклеотидної послідовності може перебувати під керуванням конституїтивного промотору або індукованого промотору, що ініціює транскрипцію тільки тоді, коли клітина-хазяїн відкрита для певного зовнішнього стимулу. У випадку багатоклітинного організму, наприклад, рослини, промотор може також мати специфічність до конкретної тканини, або органу, або до стадії розвитку. «Ген» - це певна область, розташована усередині генома, що, крім вищезгаданої кодувальної послідовності нуклеїнових кислот, містить також інші, головним чином регуляторні, нуклеїнові кислоти, відповідальні за керування експресією, тобто, так сказати за транскрипцію й трансляцію частини, що кодує. Ген може також містити інші 5' й 3' нетрансльовані послідовності й термінуючі послідовності. Іншими присутніми елементами можуть бути, наприклад, інтрони. Регуляторна послідовність нуклеїнових кислот у гені може не бути нормально оперативно пов'язаною з асоційованою послідовністю нуклеїнових кислот, як це зустрічається в природі, і в такому випадку цей ген буде химерним геном. Термін «значимий ген» стосується до будьякого гена, що при переміщенні в рослину наділяє цю рослину бажаними характеристиками, такими як стійкість до антибіотиків, опірність вірусам, опірність комахою, опірність хворобам або опірність іншим шкідникам, толерантність до гербіцидів, підвищення живильного значення, поліпшення промислово значимих якостей або змінена репродуктивна здатність. «Значимим геном» може також бути ген, що пересаджують у рослини для вироблення комерційно коштовних ензимів і метаболітів у такій рослині. «Гетерологічна» нуклеїново-кислотна послідовність являє собою нуклеїново-кислотну послідовність, що не є натурально асоційованою із клітиною-хазяїном, у яку її ввели, включаючи штучні множинні копії природної нуклеїново-кислотної послідовності. Гетерологічна послідовність амінокислот - це така, що не є натурально асоційованою з нативной послідовністю амінокислот, наприклад, з послідовністю амінокислот Сrу-білка. 96187 22 «Гомологічна» нуклеїново-кислотна послідовність - це нуклеїново-кислотна послідовність, натурально асоційована із клітиною-хазяїном, у яку її ввели. «Гомологічна рекомбінація» - це взаємний обмін фрагментами нуклеїнових кислот між гомологічними молекулами нуклеїнових кислот. Термін «ідентичність» або «відсоток ідентичності» стосується до ступеня подоби між двома нуклеїново-кислотними або білковими послідовностями. Для порівняння послідовностей у типовому випадку одна послідовність служить посилальною (еталонною), з якої рівняються послідовності, що тестуються. При використанні алгоритму порівняння послідовностей тестова й посилальна послідовності вводяться в комп'ютер, при необхідності задаються координати підпослідовності, а також задаються параметри програми алгоритму. Потім алгоритм порівняння послідовностей обчислює відсоток ідентичності тестової послідовності (послідовностей) стосовно посилальної послідовності на основі заданих параметрів програми. Оптимальне сполучення послідовностей для порівняння може вироблятися, наприклад, за допомогою алгоритму локальної гомології, представленого в роботі Smith та Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), алгоритму сполучення гомології, представленого в роботі Needleman & Wunsch, J. Моl. Biol. 48: 443 (1970), способом пошуку подібності, представленим у роботі Pearson та Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), комп'ютерним втіленням цих алгоритмів (GAP, BESTFIT, FASTA, і TFASTA у пакеті програмного забезпечення Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wl), або шляхом візуальної перевірки (див. у цілому, Ausubel й ін., нижче). Одним із прикладів алгоритму, придатного для визначення відсотка ідентичності послідовності й подібності послідовностей є алгоритм BLAST, описаний у роботі Altschul й ін., J. Моl. Biol. 215: 403410 (1990). Програмне забезпечення для виконання аналізів по BLAST можна одержати через національний центр інформації з біотехнології (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Цей алгоритм містить у собі, насамперед знаходження пар з найбільш високим ступенем ідентичності (ПВІ) шляхом ідентифікації коротких слів довжиною W у послідовності, що тестується, які або повністю збігаються або задовольняють деякому граничному позитивному значенню Τ при сполученні зі словом такої ж довжини з послідовності, отриманої в базі. Τ - це граничне значення близькості слова (Altschul й ін., 1990). Ці первісні знаходження близькості слів (збігів) служать запалом для ініціації пошуку більше довгих ПВІ, що містять ці слова. Потім ці збіги слів розширюються в обох напрямках уздовж кожної послідовності настільки далеко, наскільки може збільшуватися сукупне значення балів за збіги. Сукупні значення обчислюються за допомогою (для нуклеотидних послідовностей) параметрів Μ (преміальний бал, що нараховує за пару співпадаючих залишків; він завжди > 0) і N (штрафний бал за розбіжність залишків; він завжди < 0). Для обчислення сукупного значення по послідовностях 23 амінокислот застосовується матриця нарахування балів. Розширення збігів слів у кожному напрямку зупиняється тоді, коли сукупне значення балів за збіги падає від максимального досягнутого значення на величину X, коли сукупне значення рахунку падає до нуля або нижче нуля внаслідок нагромадження одного або декількох негативних результатів збігу, або ж при досягненні кінця кожної з послідовностей. Параметри W, Т, і X алгоритму BLAST визначають чутливість і швидкість сполучення. У програмі BLASTN (для нуклеотидних послідовностей) за замовчуванням довжина слова (W) приймається рівної 11, очікуване значення (Е) рівним 10, падіння (відсічення) рівним 100, М=5, N=-4, і порівняння виконується по обох ланцюжках. Для послідовностей амінокислот програма BLASTP за замовчуванням приймає довжину слова (W) рівної 3, очікуване значення (Е) рівним 10, а також використає матрицю нарахування балів BLOSUM62 (див. Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad Sci. USA 89: 10915 (1989)). Кромі обчислення відсотка ідентичності послідовності алгоритм BLAST також виконує статистичний аналіз подібності між двома послідовностями (див. напр., Karlin та Altschul, Proc. Natl Acad. Sci. USA 90: 5873- 5787 (1993)). Однієї з величин визначення подібності, надаваної алгоритмом BLAST є найменша сумарна ймовірність (P(N)), що показує ймовірність, з якої збіг між двома нуклеотидними або амінокислотними послідовностями може відбутися випадково. Наприклад, послідовність нуклеїнових кислот, що тестується, вважається подібною посилальної послідовності, якщо найменша сумарна ймовірність при порівнянні тестової послідовності нуклеїнових кислот з посилальною послідовністю нуклеїнових кислот менше 0,1, більш переважно, менше ніж 0,01, а найбільше переважно, менше, ніж 0,001. Іншою широко використовуваною й загальноприйнятою комп'ютерною програмою порівняння послідовностей є CLUSTALW v1.6 (Thompson, і ін. Nuc. Acids Res., 22: 4673-4680, 1994). Число співпадаючих підстав або амінокислот ділиться на загальне число підстав або амінокислот і множиться на 100 для одержання відсотка ідентичності. Наприклад, якщо у двох послідовностей з 580 пар основ збігаються 145 основ, те ці послідовності будуть ідентичними на 25 відсотків. Якщо дві порівнювані послідовності мають різну довжину, то число збігів ділиться на менше із двох значень довжини. Наприклад, якщо при порівнянні білків з 200 й 400 амінокислот збіглися 100 амінокислот, то ідентичність їх становить 50 відсотків стосовно більше короткої послідовності. Якщо більше коротка послідовність містить менше, ніж 150 основ або 50 амінокислот, то число збігів ділиться на 150 (для основ нуклеїнових кислот) або на 50 (для амінокислот) і множиться на 100 для одержання відсотка ідентичності. Іншим показником того, що дві нуклеїнових кислоти є в цілому ідентичними, служить те, що ці дві молекули гібридизуються друг до друга в жорстких умовах. Фраза «гібридизується специфічно до» стосується до зв'язування, дуплексируванню або гібридизації молекули тільки до конкретної 96187 24 нуклеотидної послідовності в жорстких умовах, коли ця послідовність присутня в складній суміші (напр., повністю клітинної) ДНК або РНК. Фраза «зв'язується в цілому» стосується до комплементарної гібридизації між нуклеїнової кислотоюзондом і нуклеїнової кислотою-мішенню й охоплює дрібні розбіжності, з якими можна впоратися шляхом зниження твердості середовища гібридизації для того, щоб досягти необхідного виявлення нуклеїново-кислотної послідовності-мішені. «Жорсткі умови гібридизації» й «жорсткі умови гібридизоційного відмивання» у контексті експериментів по гібридизації нуклеїнових кислот, таких як Південна й Північна гібридизація, є залежними від послідовності й відрізняються при різних параметрах навколишнього середовища. Довгі послідовності гібридизуються специфічно при підвищених температурах. Багата інформація з гібридизації нуклеїнових кислот міститься в роботі Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes частина І розділ 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays" Elsevier, Н'ю Йорк. У цілому, температура для гібридизації й відмивання в умовах високої твердості вибирається приблизно на 5°С нижче температури плавлення (Тпл) для конкретної послідовності при певних іонній силі й рівні р. У типовому випадку, при «жорстких умовах» зонд буде гібридизуватися до своєї послідовності-мішені, але ні до яких інших послідовностей. Температура Тпл являє собою температуру (при певних значеннях іонної сили й р) при якій 50% послідовності-мішені гібридизується до ідеально співпадаючого зонда. Для дуже жорстких умов температура вибирається рівної Тпл для конкретного зонда. Приклад жорстких умов гібридизації для гібридизації комплементарних нуклеїнових кислот, що містять більше 100 комплементарних залишків, на фільтрі в Південному або північному блотинзі являє собою: 50% формамид з 1 мг гепарина при 42°С, гібридизація виконується протягом ночі. Приклад відмивання в умовах високої твердості: 0,1 5Μ NaCl при 72°С приблизно протягом 15 хвилин. Приклад жорстких умов відмивання: дворазове відмивання в стандартному розчині SSC при 65°С протягом 15 хв. (опис буфера SSC див., Sambrook, нижче). Часто відмиванню в умовах високої твердості передує відмивання в умовах низької твердості для видалення вихідного зондового сигналу. Приклад відмивання в умовах середньої твердості для дуплекса, що містить, наприклад, більше 100 нуклеотидів: 1х SSC при 45°С протягом 15 хвилин. Приклад відмивання в умовах низької твердості для дуплекса, що містить, наприклад, більше 100 нуклеотидів: 4-6х SSC при 40°С протягом 15 хвилин. Для коротких зондів (напр. приблизно від 10 до 50 нуклеотидів) жорсткі умови в типовому випадку означають, що концентрації солі становлять менш 1,0 Μ іонів Na, у типовому випадку приблизно від 0,01 до 1,0 Μ іонів Na (або інших солей) при рівні р від 7,0 до 8,3, і типовому значенні температури, щонайменше, приблизно 30°С. Жорсткі умови також можуть бути досягнуті шляхом додавання дестабілізуючих агентів, 25 наприклад, формамида. У загальному випадку, відношення сигналу до шуму, що перевищує в 2 (або більше число) разу значення, отримане для невизначеного зонда в даному конкретному зразку для гібридизації, свідчить про виявлення специфічної гібридизації. Нуклеїнові кислоти, що не гібридизуються друг до друга в жорстких умовах, проте є в цілому ідентичними, якщо в цілому ідентичні білки, що кодуються ними. Таке відбувається, наприклад, якщо копія нуклеїнової кислоти створюється з використанням максимальної дегенерації кодонів, припустимої даним генетичним кодом. Нижче наведено приклади наборів умов гібридизації/відмивання, які можуть використатися для клонування гомологічних нуклеотидних послідовностей, що є в цілому ідентичними посилальними нуклеотидними послідовностями по цьому винаходу: посилальна нуклеотидна послідовність в оптимальному варіанті гібридизується до посилальної н уклеотидної послідовності в 7% додецил сульфату натрію (ДСН), 0,5 Μ NaPO4, 1 м ЕДТА при 50°С з відмиванням: 2Х SSC, 0,1% ДСН при 50°С, більш переважно в 7% додецил сульфату натрію (ДСН), 0,5 Μ NaPO4, 1 м ЕДТА при 50°С з відмиванням: 1Х SSC, 0,1% ДСН при 50°С, ще більш переважно в 7% додецил сульфату натрію (ДСН), 0,5 Μ NaPO4, 1 м ЕДТА при 50°С з відмиванням: 0,5Х SSC, 0,1% ДСН при 50°С, переважно в 7% додецил сульфату натрію (ДСН), 0,5 Μ NaPO4, 1 м ЕДТА при 50°С з відмиванням: 0,1Х SSC, 0,1% ДСН при 50°С, ще більш переважно в 7% додецил сульфату натрію (ДСН), 0,5 Μ NaPO4, 1 м ЕДТА при 50°С з відмиванням: 0,1Х SSC, 0,1% ДСН при 65°С. Подальшим свідченням того, що дві нуклеїнові кислоти або два білки є істотно ідентичними, служить те, що білок, кодований першою нуклеїновою кислотою, є імунологічно крос-реактивним з білком, кодованим другою нуклеїновою кислотою, або специфічно зв'язується з ним. Таким чином, у типовому випадку один білок є істотно ідентичним іншому білку, якщо ці два білки відрізняються тільки консервативними замінами. Термін «інсектицидний» означає токсичну біологічну активність, здатну здійснювати боротьбу з комахами, переважно, знищуючи їх. Послідовність нуклеїнових кислот є «ізокодувальною з» посилальною послідовністю в тому випадку, якщо ця послідовність нуклеїнових кислот кодує поліпептид, що має таку ж послідовність амінокислот, як і поліпептид, кодований посилальною послідовністю нуклеїнових кислот. «Ізольована» молекула нуклеїнової кислоти або ізольований токсин являють собою молекулу нуклеїнової кислоти або токсин, які внаслідок дій людини існують окремо від свого природного середовища, а тому не є продуктом природи. Ізольована молекула нуклеїнової кислоти або ізольований токсин можуть існувати в очищеній формі або можуть існувати в не природному середовищі, наприклад (що не означає обмежень) такий, як рекомбінантна мікробна клітина, рослинна клітина, рослинна тканина або рослина. «Модифікований токсин Сrу3А» або «Сrу3А055» по цьому винаходу стосується до ток 96187 26 сину, отриманому з Сrу3А і що має, щонайменше один додатковий сайт пізнавання Протеази, що розпізнається протеазою кишечнику комахи-мішені й не зустрічається в природі в токсині Сrу3А, як описано в патенті США 7,030,295, включеному сюди шляхом посилання. «Модифікована послідовність, що кодує, Сrу3А» згідно цього винаходу може бути отримана з нативної послідовності, що кодує, Сrу3А або синтетичної послідовності Сrу3А і містить послідовність, що кодує, щонайменше, одного додаткового сайту пізнавання Протеази, що не зустрічається натурально в немодифікованому гені Сrу3А. «Молекула нуклеїнової кислоти» або «нуклеїново-кислотна послідовність» являє собою сегмент одне- або дволанцюгової ДНК або РНК, що може бути ізольований з будь-якого джерела. У контексті цього винаходу молекула нуклеїнової кислоти в типовому випадку є сегментом ДНК. Термін «рослина» стосується до будь-якої рослини на будь-якій стадії розвитку, особливо, до насінної рослини. «Рослинна клітина» являє собою структурну й фізіологічну одиницю рослини, що складає із протопласта й клітинної стінки. Рослинна клітина може бути у формі ізольованої одиничної клітини або культивованої клітини, або бути частиною більше високоорганізованої одиниці, наприклад, рослинної тканини, органа рослини або цілої рослини. «Культура рослинної клітини» означає культури структурних одиниць рослини, таких як, наприклад, протопласти, клітини клітинних культур, клітини в рослинних тканинах, пилок, пилкові трубки, яйцеклітини, зародкові мішки, зиготи й зародки на різних стадіях розвитку. «Рослинний матеріал» стосується до листів, стеблам, корінням, квітам або частинам квітів, фруктам, пилку, яйцевим клітинам, зиготам, насінням, зрізам, клітинним культура або культурам тканини або до будь-якої частини або продукту рослини. «Рослинний орган» - це помітна й візуально структурована й диференційована частина рослини, така як корінь, стебло, лист, бутон квітки або зародок. Термін «рослинна тканина» тут означає групу рослинних клітин, організовану в структурну й функціональну одиницю. Сюди включається будь-яка тканина рослини in planta або в культурі. Цей термін містить у собі (не обмежуючи) цілі рослини, органи рослин, насіння рослин, культури тканини й будь-які групи рослинних клітин, організовані в структурні та/або функціональні одиниці. Використання цього терміна в сукупності з (або у відсутності) яким-небудь конкретним типом рослинної тканини, перерахованої вище або іншим способом підпадаючим під це визначення, не має своєю метою виключення будь-якого іншого типу рослинної тканини. «Промотор» - нетрансльована послідовність ДНК, що перебуває до області, що кодує, і містить місце для зв'язування РНК-полімерази, а також ініціюючу транскрипцію ДНК. Область промотору може також містити в собі інші елементи, що працюють регуляторами експресії генів. 27 Термін «регуляторні елементи» стосується до послідовностей, включених у керування експресією нуклеотидної послідовності. Регуляторні елементи містять у собі промотор, операбельно зв'язаний зі значимою нуклеотидною послідовністю, і термінувальні сигнали. У типовому випадку вони також охоплюють послідовності, необхідні для належної трансляції нуклеотидної послідовності. «Трансформація» - це процес для введення гетерологічної нуклеїнової кислоти в клітину-хазяїн або в організм. Зокрема, «трансформація» означає стійку інтеграцію молекули ДНК у геном організму, що цікавить. «Трансформований/трансгенний/рекомбінантний» стосується до організму-хазяїна, такому як бактерія або рослина, у який увели гетерологічну молекулу нуклеїнової кислоти. Ця молекула нуклеїнової кислоти може бути стійко інтегрована в геном хазяїна, або ж ця молекула нуклеїнової кислоти також може бути присутнім як позахромосомна молекула. Така позахромосомна молекула може бути здатна до самореплікації. Варто розуміти, що до трансформованих клітин, тканинам або рослинам ставляться не тільки кінцеві продукти процесу трансформації, але також й їх трансгенне потомство. Терміни «не трансформований», «не трансгенний» або «не рекомбінантний» ставляться до природного організму-хазяїна, наприклад, до бактерії або рослини, що не містить гетерологічі молекули нуклеїнової кислоти. Нуклеотиди позначаються по їхніх основах наступними стандартними скороченими позначеннями: аденін (А), цитозін (С), тимін (Т) і гуанін (G). Аналогічним образом амінокислоти позначаються наступними стандартними скороченими позначеннями: аланін (Ala; А), аргінін (Arg; R), аспарагін (Asn; N), аспарагінова кислота (Asp; D), цистеїн (Cys; С), глутамін (Gln; Q), глутамінова кислота (Glu; Ε), гліцин (Gly; G), гістидін (His; Η), ізолейцин (llе; 1), лейцин (Leu; L), лізин (Lys; K), метіонін (Met; Μ), фенілаланін (Phe; F), пролін (Pro; Ρ), серін (Ser; S), треонін (Thr; Τ), триптофан (Тrр; W), тирозин (Туr; Υ), і валин (Val; V). Даний винахід стосується нових сконструйованих гібридних інсектицидних білків (сГІБів), створених для того, щоб мати активність, щонайменше, проти західного кукурудзяного кореневого жука, а також можуть бути активними проти північного кукурудзяного кореневого жука, мексиканського кукурудзяного кореневого жука та/або колорадського картопляного жука. Деякі сГІБи мають активність проти лускокрилих шкідників, європейського кукурудзяного метелика. Такі нові сГІБи виробляються шляхом злиття унікальних комбінацій повних або неповних варіабельних ділянок і консервативних блоків, щонайменше, двох різних Cry-білків й, на вибір, містять у собі протоксинну хвостову область із Bt Cry-білка на С-кінцевій частині, або N-кінцевий пептидильний фрагмент, або й те й інше. Не обмежуючим прикладом може служити комбінування повних або неповних варіабельних ділянок і консервативних блоків з першого Cry-білка, що володіє активністю проти жорсткокрилих, з повними або неповними варіабельними 96187 28 ділянками й консервативними блоками із другого Cry-білка, що володіє активністю проти лускокрилих і відрізняється від першого Bt Cry-білка, а також включення, на вибір, протоксинової хвостової ділянки з Bt Cry-білка на С-кінцевій частині, або Nкінцевого пептидильного фрагмента, або того й іншого, у результаті чого створюється новий сконструйований гібридний інсектицидний білок, що володіє активністю проти цілого спектра комах й відрізняється від перших або другого батьківських Cry-білків, або від обох. Такі нові сГІБи можуть також містити повні або неповні варіабельні ділянки, консервативні блоки або домени з модифікованого Сrу3А-білка й Cry-білка, що відрізняється від модифікованого Сrу3А-білки. N-кінцевий пептидильний фрагмент або протоксинна хвостова ділянка можуть наділяти сГІБ інсектицидною активністю, можуть робити інсектицидну активність сГІБа більше високою, ніж у сГІБа, що не містить пептидильного фрагмента або протоксинової хвостової ділянки, і/або може робити сГІБ більше стабільним, ніж сГІБ, що не містить пептидильного фрагмента або протоксинової хвостової ділянки, особливо проти, щонайменше, західного кукурудзяного кореневого жука. Послідовність амінокислот пептидильного фрагмента в типовому випадку є гетерологічною до Bt Cry-білка (тобто, не отриманою з нього). Однак, на основі викладеного тут матеріалу кваліфікований фахівець побачить, що Nкінцевий пептидильний фрагмент може бути створений із застосуванням послідовності амінокислот, отриманої з Bt Cry-білка. Виявилося, що сГІБи по цьому винаходу мають зненацька дивну токсичність стосовно кукурудзяного кореневого жука, особливо до західних, північних і мексиканському кукурудзяних жуків. Даний винахід також стосується до нуклеїнових кислот, результатом експресії яких є сГІБи, а також до виробництва й застосування сГІБів для боротьби з комахами-шкідниками. Результатом експресії цих нуклеїнових кислот є сГІБи, які можна застосовувати для боротьби з жорсткокрилими комахами, такими як західні, північні або мексиканський кукурудзяні кореневі жуки, або застосовувати для боротьби із лускокрилими комахами, такими як європейський кукурудзяний метелик, особливо, коли вони експресовані в транс генну рослина, таку як трансгенна кукурудза. В одному виконанні даний винахід охоплює сконструйований гібридний інсектицидний білок, що містить послідовність амінокислот з першого Bacillus thuringiensis (Bt) Cry-білка, що включає повні або неповні варіабельні ділянки й консервативні блоки першого Cry-білка, злиту з послідовністю амінокислот із другого Bt Cry-білка, що відрізняється від першого Bt Cry-білка, що включає повні або неповні варіабельні ділянки й консервативні блоки другого Cry-білка, і, на вибір, що містить: (а) протоксинну хвостову ділянку Bt Cryбілка, розташовану на С-кінці; або (б) N-кінцевий пептидильний фрагмент, або як (а) так й (б), причому цей сГІБ має активність проти, щонайменше, західного кукурудзяного кореневого жука. В іншому виконанні даний винахід охоплює сГІБ, що містить N-кінцеву частину першого Bt Білок-Сrу-білка, злиту з С-кінцевою областю друго 29 го Bt Білок-Сrу-білка, що відрізняється від першого Bt Білок-Сrу-білка, причому, щонайменше, одна позиція кросинговеру між першими й другим Bt Білок-Сrу-білками розташована в консервативному блоці 2, консервативному блоці 3, варіабельній ділянці 4 або консервативному блоці 4, а також, на вибір, що містить: (а) протоксинну хвостову ділянку Bt Білок-Сrу-білка, розташовануа на С-кінці; або (б) N-кінцевий пептидильний фрагмент, або як (а) так й (б), причому цей сГІБ має активність проти, щонайменше, західного кукурудзяного кореневого жука. В іншому виконанні сГІБ по винаходу містить (у напрямку від N-кінця до С-кінця) варіабельну ділянку 1 або С-кінцеву частину варіабельної ділянки 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеву частину консервативного блоку 3 першого Bt Білок-Сrу-білки, зрощені з С-кінцевою частиною консервативного блоку 3, варіабельною ділянкою 4, консервативним блоком 4, варіабельною ділянкою 5, консервативним блоком 5 і варіабельною ділянкою 6 другого Bt Білок-Сrу-білка. В іншому виконанні сГІБ за винаходом містить, щонайменше, дві позиції кросинговеру між послідовністю амінокислот першого Bt Білок-Сrу-білка й послідовністю амінокислот другого Bt Білок-Сrубілка. В одному виконанні перша позиція кросинговеру розташована в консервативному блоці 2, а друга позиція кросинговеру розташована в консервативному блоці 3. В іншому виконанні перше з'єднання кросинговеру розташовано в консервативному блоці 3, а друга позиція кросинговеру розташована в консервативному блоці 4. В іншому виконанні сГІБ за винаходом містить у С-кінцевій частині хвостова ділянка Bt Білок-Сrубілка. Протоксинна хвостова ділянка може наділяти сГІБ інсектицидною активністю (це означає, що такий сГІБ без протоксинового хвостової ділянки не був би активним), може робити активність сГІБа більш високою, чим у сГІБа без протоксинової хвостової ділянки, або може робити сГІБ більше стабільним, чим сГІБ без протоксинової хвостової ділянки. В одному виконанні винаходу протоксинна хвостова ділянка береться з Bt Білок-Сrу-білка, що володіє активністю проти лускокрилих. В іншому виконанні протоксинна хвостова ділянка береться з Cry1Білок-Α-білка. Ще в одному виконанні протоксинна хвостова ділянка береться з білка Сrу1Aa або Cry1Ab. Протоксинна хвостова ділянка по цьому винаходу може містити в собі цілий протоксинний хвіст Bt Cry-білка або будь-який його фрагмент. В одному аспекті цього виконання протоксинна хвостова ділянка сГІБа містить, щонайменше, 38 амінокислот з N-кінця протоксинового хвоста Cry1 Білок-Аb-білка. В іншому аспекті цього виконання протоксинна хвостова ділянка містить послідовність амінокислот, що відповідає амінокислотам 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72. Ще в одному аспекті цього виконання протоксинна хвостова ділянка містить амінокислоти 611648 послідовності SEQ ID NO: 72. Ще в одному виконанні сГІБ містить Nкінцевий пептидильний фрагмент. Цей N-кінцевий пептидильний фрагмент може наділяти даний сГІБ 96187 30 інсектицидною активністю (це значить, що без Nкінцевого пептидильного фрагмента цей білок не буде мати інсектицидну активність), або ж Nкінцевий пептидильний фрагмент може робити інсектицидну активність сГІБа більш високою, чим у сГІБа без N-кінцевого пептидильного фрагмента, або ж N-кінцевий пептидильний фрагмент може робити сГІБ більш стабільним, чим сГІБ без Nкінцевого пептидильного фрагмента. В одному аспекті цього виконання пептидильний фрагмент містить послідовність амінокислот, гетеро логічну Bt Cry-білку (тобто, не отриману з нього). В іншому аспекті цього виконання N-кінцевий пертидильний фрагмент містить, принаймні, 9 амінокислот. В іншому аспекті цього виконання пептидильний фрагмент містить, щонайменше, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23,24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40,41, 42,43, 44, 45, 46, 47,48,49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 70, 80, 90 або 100 амінокислот. В іншому аспекті цього виконання пептидильний фрагмент містить більше 100 амінокислот. Ще в іншому аспекті цього виконання N-кінцевий пептидильний фрагмент містить послідовність амінокислот YDGRQQHRG (SEQ ID NO: 133) або TSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 134). Ще в іншому аспекті цього виконання N-кінцевий пептидильний фрагмент містить послідовність амінокислот, обрану із групи, що складається з послідовностей SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 й SEQ ID NO: 132. Ще в одному виконанні варіабельні ділянки й консервативні блоки першого Білок-Сrу-білка, активного проти жорсткокрилих комах, для одержання сГІБа по винаходу використаються в комбінації з варіабельними ділянками й консервативними блоками другого Білок-Сrу-білка, активного проти лускокрилого комахи. Перелік Білок-Сrу-білків, активних проти жорсткокрилих комах, містить у собі (не обмежуючи) білки Сrу3, Сrу7, Сrу8 й Сrу34/Сrу35. Перелік Білок-Сrу-білків, активних проти лускокрилих комах, містить у собі (не обмежуючи) білки Cry1 and Сrу9. В одному аспекті цього виконання перший Білок-Сrу-білок являє собою білок Сrу3А, а другий Білок-Сrу-білок - білок Cry1А. В іншому аспекті білок Сrу3А може бути замінений модифікованим Сrу3А, наприклад, білком Сrу3А055, описаним у патенті США 5,659,123, включеному сюди шляхом посилання. Ще в одному аспекті цього виконання білком Сrу3А є білок Сrу3Аа, а білком Сrу1A - білок Сrу1Aa або Сrу1Аb. В іншому аспекті цього виконання білок Сrу3Аа вибирається з наступної групи й має зазначений номер доступу в базі даних GenBank: Сrу3Аа1 (М22472), Сrу3Аа2 (J02978), Сrу3Аа3 (Y00420), Сrу3Аа4 (М30503), Сrу3Аа5 (М37207), Сrу3Аа6 (U10985), Сrу3Аа7 (AJ237900), Cry3Aa8 (AAS79487), Сrу3Аа9 (AAW05659), Сrу3Аа10 (AAU29411) і Сrу3Аа11 (AY882576). В іншому аспекті цього виконання білок Сrу1Aa вибирається з наступної групи й має зазначений номер доступу в базі даних GenBank: Сrу1Aa1 (M11250), Сrу1Aa2 (Ml0917), Сrу1Аа3 (D00348), Сrу1Aa4 (X13535), Сrу1Aa5 (D17518), Сrу1Аа6 (U43605), Сrу1Aa7 31 (AF081790), Сrу1Aa8 (126149), Сrу1Aa9 (AB026261), Сrу1Aa10 (AF154676), Сrу1Aa11 (Y09663), Сrу1Aa12 (AF384211), Сrу1Аа13 (AF510713), Сrу1Aa14(AY197341) і Сrу1Aa15 (DQ062690). Ще в одному аспекті цього виконання білок Cry1Ab вибирається з наступної групи й має зазначений номер доступу в базі даних GenBank: Сrу1Ab1 (Μ 13 898), Сrу1Ab2 (M12661), Сrу1Аb3 (М15271), Сrу1Аb4 (D00117), Сrу1Аb5 (Х04698), Сrу1Аb6 (М37263), Сrу1Аb7 (Х13233), Сrу1Аb8 (М16463), Сrу1Аb9 (Х54939), Сrу1Ab10 (A29125), Сrу1Ab11 (112419), Сrу1Ab12 (AF059670), Сrу1Аb13 (AF254640), Сrу1Аb14 (U94191), Сrу1Аb15 (AF358861), Сrу1Аb16 (AF37560), Сrу1Ab17 (AAT46415), Сrу1Ab18 (AAQ88259), Сrу1Ab19 (AY847289), Сrу1Ab20 (DQ241675), Сrу1Ab21 (EF683163) і Сrу1Ab22 (ABW87320). Ще в одному аспекті цього виконання перший БілокСrу-білок містить послідовність амінокислот, обрану із групи в складі: SEQ ID NO: 68, SEQ ID NO: 70 й SEQ ID NO: 135, а другий Білок-Сrу-білок містить послідовність амінокислот, записану в SEQ ID NO: 72. В одному виконанні даний винахід охоплює сГІБ, у якому є, щонайменше, одна позиція кросинговеру між N-кінцевою ділянкою першого БілокСrу-білка й С-кінцевою ділянкою другого Білок-Сrубілка, розташована в консервативному блоці 3, варіабельній ділянці 4 або в консервативному блоці 4. В одному аспекті цього виконання ця позиція кросинговеру в консервативному блоці 3 розташована відразу ж за амінокислотою, що відповідає Ser451, Phe454, або Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70. В іншому аспекті цього виконання ця позиція кросинговеру розташована в консервативному блоці 3 відразу ж після Ser451, Phe454 або Leu468 послідовності SEQ ID: 70, або після Ser450, Phe453, або Leu467 послідовності SEQ ID NO: 68; або Ser497, PhelOO, Leull4 послідовності SEQ ID NO: 135. Позиції кросинговеру в деяких виконаннях сГІБів з Сrу3А/Cry1Ab або з модифікованим Сrу3А/Cry1Ab виконання сГІБів по цьому винаходу показані на Фігурі 2, що вказує відсоток ідентичності. В іншому виконанні сГІБ по цьому винаходу містить, щонайменше, дві позиції кросинговеру між послідовністю амінокислот з першого Bt Білок-Сrубілка й послідовністю амінокислот із другого Bt Білок-Сrу-білка. В одному аспекті цього виконання одна позиція кросинговеру між Сrу3А або модифікованим Сrу3А й Сrу1Ab або Сrу1Аа розташована в консервативному блоці 2 відразу ж після амінокислоти, що відповідає Asp232 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговеру між Сrу1Ab й Сrу3А або модифікованим Сrу3А розташована в консервативному блоці З відразу ж після амінокислоти, що відповідає Leu476 послідовності SEQ ID NO: 72. В іншому аспекті цього виконання позиція кросинговеру між Сrу3А або модифікованим Сrу3А й Сrу1Ab або Сrу1Аа розташована в консервативному блоці 2 відразу ж після амінокислоти, що відповідає Asp232 послідовності SEQ ID NO: 70, або Asp231 послідовності SEQ ID NO: 68, або Asp278 послідовності SEQ ID NO: 135, а друга позиція кросинговеру між Сrу1Ab й Сrу3А або мо 96187 32 дифікованим Сrу3А розташована у консервативному блоці 3 відразу ж після амінокислоти, що відповідає Leu476 послідовності SEQ ID NO: 72. Ще в одному аспекті цього виконання перша позиція кросинговеру між білками Сrу3А або модифікованим Сrу3А й Сrу1Ab розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70, а друга позиція кросинговеру між Сrу1Ab й Сrу3А або модифікованим Сrу3А розташована в консервативному блоці 4 відразу ж після амінокислоти, що відповідає Ие527 послідовності SEQ ID NO: 72. В іншому аспекті цього виконання перша позиція кросинговеру між білками Сrу3А або модифікованим Сrу3А й Сrу1Ab розташована в консервативному блоці 3 відразу ж за амінокислотою, що відповідає Leu468 послідовності SEQ ID NO: 70 або Leu467 послідовності SEQ ID NO: 68, або Leu114 послідовності SEQ ID NO: 135, а друга позиція кросинговеру між Сrу1Ab й Сrу3А або модифікованим Сrу3А розташована в консервативному блоці 4 відразу ж після амінокислоти, що відповідає І1е527 послідовності SEQ ID NO: 72. Ще в одному аспекті цього виконання сГІБ містить послідовність амінокислот SEQ ID NO: 28 або SEQ ID NO: 34. В одному виконанні даний винахід охоплює сГІБ, у якому перший Білок-Сrу-білок представлен білком Сrу3А або модифікованим Сrу3А, а другий Білок-Сrу-білок представлен білком Сrу1Аа або Сrу1Ab, причому цей сГІБ містить послідовність амінокислот, щонайменше, на 80% ідентичну SEQ OD NO: 64. В іншому виконанні сГІБ містить амінокислотну послідовність, щонайменше, на 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99% ідентичну SEQ ID NO: 64. Сполучення деяких виконань цього винаходу з послідовністю SEQ ID NO: 64 представлено на Фігурі 2, що показує відсоток ідентичності. В іншому виконанні даний винахід охоплює сГІБ, у якому перший Білок-Cry-білок представлен білком Сrу3А або модифікованим Сrу3А, а другий Білок-Сrу-білок представлен білком Сrу1 Аа або Сrу1Аb, причому цей сГІБ містить послідовність амінокислот, щонайменше, на 75% ідентичну SEQ lD NO: 70. В іншому виконанні сГІБ містить амінокислотну послідовність, щонайменше, на 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99% ідентичну SEQ ID NO: 70. Сполучення деяких виконань цього винаходу з послідовністю SEQ ID NO: 70 представлено на Фігурі 1, що показує відсоток ідентичності. В іншому виконанні даний винахід охоплює сГІБ, у якому є перша позиція кросинговеру між Сrу3А або модифікованим Сrу3А й Сrу1Аа або Сrу1Аb у консервативному блоці 2 і друга позиція кросинговеру між Сrу1Аа або Сrу1Аb й Сrу3А або модифікованим Сrу3А у консервативному блоці 3, і який містить послідовність амінокислот, щонайменше, на 56% ідентичну SEQ OD NO: 64. В одному аспекті цього виконання сГІБ має, щонайменше, 60, 70 або 80% ідентичності з послідовністю SEQ ID NO: 64. В іншому аспекті цього виконання сГІБ має, щонайменше, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 33 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 або 99% ідентичності з SEQ ID NO: 64. Ще в іншому виконанні даний винахід охоплює сГІБ, що містить послідовність амінокислот, обрану із групи в складі: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 62; SEQ ID NO: 64, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 159 й SEQ ID NO: 160. В одному виконанні сГІБ по цьому винаходу має активність проти інших комах-шкідників, включаючи (але не обмежуючись) північного кукурудзяного кореневого жука, мексиканського кукурудзяного кореневого жука, колорадського картопляного жука та/або європейського кукурудзяного метелика. В іншому виконанні даний винахід охоплює молекулу нуклеїнової кислоти, що містить нуклеотидну послідовність, що кодує сГІБ по цьому винаходу. В одному аспекті цього виконання ця молекула нуклеїнової кислоти містить нуклеотидну послідовність, обрану із групи в складі: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 61; SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 146, SEQ ID NO: 152, SEQ ID NO: 154 й SEQ ID NO: 158. Роз'яснення на конкретних прикладах способів створення молекули нуклеїнової кислоти, що кодує сГІБ, можна знайти в Прикладах 1-41. Фахівці в даній галузі побачать, які модифікації можна внести в наведені в прикладах способи для створення сГІБів по цьому винаходу. Даний винахід також охоплює експресійні касети, що містять молекули нуклеїнової кислоти, а також рекомбінантні вектори й трансгенні клітинихазяїни, не з організму людини, такі як бактеріальні клітини або рослинні клітини, які містять експресійні касети по винаходу. Даний винахід також охоплює рекомбінантні вектори, що містять нуклеїнові кислоти по цьому винаходу. У таких векторах нуклеїнові кислоти в оптимальному варіанті втримуються в експресійних касетах, що включають у себе регуляторні елементи для експресії нуклеотидних послідовностей у клітині-хазяїні, придатної для експресії таких нуклеотидних послідовностей. Такі регуляторні елементи звичайно містять у собі промотор і сигнали термінації, а в оптимальному варіанті також містять елементи, що дозволяють виконувати ефективну трансляцію поліпептидів, кодованих нуклеїновими кислотами цього винаходу. Вектори, що містять ці нуклеїнові кислоти, можуть бути здатні до реплікації в особливих клітинах-хазяїнах, переважно, як позахромосомні молекули, і в такий спосіб використаються для збільшення нуклеїнових кислот по цьому винаходу в клітинах-хазяїнах. В одному виконанні клітинами-хазяїнами для таких векторів є мікроорганізми, такі як бактерії, зокрема, Bacillus thuringiensis або Ε. coli. В іншому виконанні клітинами-хазяїнами для таких рекомбинантных векторів є ендофіти або епіфіти. Ще в одному ви 96187 34 конанні такі вектори є вірусними векторами й використаються для реплікації нуклеотидних послідовностей у конкретних клітинах-хазяїнах, наприклад, у клітинах комах або рослинних клітин. Рекомбінантні вектори також використаються для трансформації нуклеотидних послідовностей по цьому винаходу в клітині-хазяїні, за допомогою чого ці нуклеотидні послідовності стійко інтегруються в ДНК трансгенного хазяїна. В одному виконанні таким трансгенним хазяїном є рослина, наприклад, кукурудза. Випробування сГІБів по цьому винаходу в біопробах показали наявність у них активності проти комах. В одному виконанні сГІБи по винаходу активні проти жорсткокрилих комах, або проти лускокрилих комах, або проти й тих й інших. В одному аспекті цього виконання сГІБи по винаходу активні проти західного кукурудзяного кореневого жука, північного кукурудзяного кореневого жука, мексиканського кукурудзяного кореневого жука та/або колорадського картопляного жука. В іншому аспекті цього виконання сГІБи по винаходу активні проти європейського кукурудзяного метелика. Властивості сГІБів по боротьбі з комахами проілюстровані далі в Прикладах 43,45 й 46. Даний винахід також охоплює композиції, що містять сГІБ у кількості, ефективному для боротьби з комахами. В іншому виконанні винахід охоплює спосіб виробництва сГІБа, активного проти комах, що складається в тім, що: (а) одержують клітинухазяїн, що містить ген, що сам містить гетерологічну послідовність-промотор, оперативно пов'язану з молекулою нуклеїнової кислоти по винаходу; і (б) вирощують трансгенну клітину-хазяїн таким чином, щоб експресувати сГІБ, активний проти комах. Ще в одному виконанні винахід охоплює спосіб виробництва трансгенної рослини, стійкої проти комах, що складає у введенні молекули нуклеїнової кислоти по винаходу в трансгенну рослину, причому молекула нуклеїнової кислоти викликає експресію сГІБа в цієї трансгенної рослині в кількості, ефективної для боротьби з комахами. В одному аспекті цього виконання такими комахами є Жорсткокрилі або лускокрилі комахи. В іншому аспекті цього виконання такими жорсткокрилими комахами є західний кукурудзяний кореневий жук, північний кукурудзяний кореневий жук, мексиканський кукурудзяний кореневий жук та/або колорадський картопляний жук. Ще в одному аспекті цього виконання такою лускокрилою комахою є європейський кукурудзяний метелик. Ще в одному виконанні винахід охоплює спосіб боротьби з комахами, що включає в себе подачу комахам ефективної кількості сГІБа по винаходу. В одному аспекті цього виконання такими комахами є Жорсткокрилі або лускокрилі комахи. В іншому аспекті цього виконання такими жорсткокрилими комахами є західний кукурудзяний кореневий жук, північний кукурудзяний кореневий жук, мексиканський кукурудзяний кореневий жук та/або колорадський картопляний жук. Ще в одному аспекті цього виконання такою лускокрилою комахою є європейський кукурудзяний метелик. У типовому випадку подача сГІБа комахою здійснюється орально. В 35 одному аспекті сГІБ подається орально через трансгенну рослину, що містить послідовність амінокислот, що експерсує сГІБ по цьому винаходу. Даний винахід також охоплює спосіб боротьби з комахами, у якому трансгенна рослина також містить другу молекулу нуклеїнової кислоти або групи молекул нуклеїнової кислоти, що кодують другий пестицидний елемент. Прикладами такої другої нуклеїнової кислоти можуть бути нуклеїнові кислоти, що кодують Bt Cry-білок, а також кодують вегетативний інсектицидний білок, описаний у патентах США 5,849,870 й 5,877,012, включених сюди шляхом посилання, або ж ті, які кодують канал для виробництва небілкових інсектицидних елементів. Даний винахід також охоплює спосіб одержання сконструйованого гібридного інсектицидного білка (сГІБа), що складається в тім, що: (а) одержують перший Bt Cry-білок або модифікований Bt Cry-білок; (б) одержують другий Bt Cry-білок, що відрізняється від першого Bt Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка; (в) комбінують повні або неповні варіабельні ділянки й консервативні блоки першого Bt Cry-білка або модифікованого Bt Cryбілка з повними або неповними варіабельними ділянками й консервативними блоками другого Bt Cry-білка для утворення сГІБа, що володіє активністю проти, щонайменше, західного кукурудзяного кореневого жука; і, на вибір, (г) уводять пептидильний фрагмент в N-кінцеву частину сГІБа, або протоксинну хвостову ділянку Bt Cry-білка в Скінцеву частину сГІБа, або обох, причому ці Nкінцевий пептидильний фрагмент, або С-кінцевий протоксинна ділянка, або обоє надають сГІБу інсектицидну активність, або підвищують інсектицидну активність сГІБа, або роблять сГІБ більше стабільним, чим сГІБ, що не має пептидильного фрагмента, або протоксинової хвостової ділянки, або обох. В іншому виконанні даний винахід охоплює спосіб виготовлення сконструйованого гібридного інсектицидного білка (сГІБа), що складає в тім, що: (а) одержують першу нуклеїнову кислоту, що кодує перший Bt Cry-білок або модифікований Bt Cryбілок, і другу нуклеїнову кислоту, що кодує другий Сrу-білок, що відрізняється від першого Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка; (б) виділяють із першої й другий нуклеїнових кислот нуклеотидну послідовність, що кодує повні або неповні варіабельні ділянки й консервативні блоки першого Bt Cry-білка або модифікованого Bt Cry-білка й другого Bt Cry-білка; (в) з'єднують отримані на етапі (б) нуклеїнові кислоти таким чином, щоб одержати нову гібридну нуклеїнову кислоту, що кодує білок, а також, виконують гібридизацію нуклеїнової кислоти, що кодує пептидильний фрагмент, з 5' кінцем вищезгаданої гібридної нуклеїнової кислоти, у результаті чого виходить подовження 5' кінця, або виконують гібридизацію нуклеїнової кислоти, що кодує протоксинну хвостову ділянку Bt Cry-білка з 3' кінцем вищезгаданої гібридної нуклеїнової кисі лоти, у результаті чого виходить подовження 3 кінці, або те й інше; (г) в експресийну касету вводять гібридну нуклеїнову кислоту, що має або не має одне або обоє подовження кінців 5' або 3'; (д) 96187 36 трансформують цю експресийну касету в клітиніхазяїні, у результаті чого вищезгадана клітинахазяїн робить сГІБ; і (e) виконують біоіспити сГІБа проти, щонайменше, західного кукурудзяного кореневого жука, результатом чого є інсектицидна активність проти західного кукурудзяного кореневого жука. У наступних виконаннях способів по винаходу перший Bt Cry-білок або модифікований Bt Cryбілок представлен білком Сrу3А або модифікованим Сrу3А, а другий Bt Cry-білок представлен білком А Сrу1 Аа або Cry1 Ab. В іншому виконанні способів по винаходу Nкінцевий пептидильний фрагмент містить 9 амінокислот. В одному аспекті цього виконання Nкінцевий пептидильний фрагмент містить послідовність амінокислот YDGRQQHRG (SEQ ID NO: 132) або послідовність амінокислот TSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 133). В іншому аспекті цього виконання N-кінцевий пептидильний фрагмент вибирається із групи послідовностей у складі: SEQ ID NO: 126, SEQ ID NO: 127, SEQ ID NO: 128, SEQ ID NO: 129, SEQ ID NO: 130, SEQ ID NO: 131 й SEQ ID NO: 132. Ще в одному виконанні способів винаходу протоксинна хвостова ділянка береться з Сrу1Aa або Сrу1Ab. В одному аспекті цього виконання ця протоксиння ділянка містить, щонайменше, 38 амінокислот. В іншому аспекті цього виконання протоксинна хвостова ділянка містить послідовність амінокислот, що відповідає амінокислотам 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72. Ще в іншому аспекті цього виконання протоксинна хвостова ділянка містить амінокислоти 611-648 послідовності SEQ ID NO: 72. Роз'яснення на конкретних прикладах способів створення гібридної нуклеїнової кислоти й сГІБів можна знайти в Прикладах 1-41. У наступних виконаннях нуклеотидні послідовності по винаходу, особливо, послідовність, що кодує пептидильний фрагмент, протоксинний хвіст та/або консервативні блоки 2, 3 й 4, може бути ще модифікована шляхом включення випадкових мутацій за технологією, відомої як in vitro рекомбінація або перетасування ДНК. Ця технологія описана в роботі Stemmer й ін., Nature 370:389-391 (1994) і в патенті США 5,605,793, включеним сюди шляхом посилання. Мільйони мутантних копій нуклеотидної послідовності виробляються на основі оригінальної нуклеотидної послідовності по цьому винаходу, і відбираються ті варіанти, які мають поліпшені властивості, такі як підвищена інсектицидна активність, підвищена стабільність або різні специфічність або діапазон мішеней-шкідників. Спосіб містить у собі формування мутагенізованого дволанцюгового полінуклеотида із шаблонового дволанцюгового полінуклеотиду, що містить нуклеотидну послідовність по цьому винаходу, причому шаблоновий дволанцюговий полінуклеотид був розщеплений на випадкові дволанцюгові фрагменти необхідної довжини, крім того, спосіб містить у собі етапи: додавання до отриманої популяції дволанцюгових випадкових фрагментів одного або декількох одне- або дволанцюгових олігонуклеотидів, причому, вищезгадані олігонук 37 леотиди містять область ідентичності й область гетерології до шаблонового дволанцбгового полінуклеотиду; денатурації отриманої суміші дволанцюгових випадкових фрагментів й олигонуклеотидів в одноланцюгові фрагменти; інкубацію отриманої популяції одноланцюгових фрагментів з полімеразой в умовах, результатом яких є віджиг вищезгаданих одноланцюгових фрагментів у вищевказаних областях ідентичності для формування пар відпалених фрагментів, причому ці області ідентичності достатні для того, щоб з одного члена пари виконати точну реплікацію другого, у такий спосіб формуючи мутагенізований дволанцюговий полінуклеотид; а також, щонайменше, два цикли повтору другого й третього етапів, причому отримана суміш на другому етапі наступного циклу містить у собі мутагенізований дволанцюговий полінуклеотид із третього етапу попереднього циклу, а наступний цикл формує наступний мутагенізований дволанцюговий полінуклеотид. У кращому варіанті виконання винаходу концентрація одноланцюгових видів дволанцюгових випадкових фрагментів у популяції дволанцюгових випадкових фрагментів становить менш 1% від ваги всієї ДНК. У ще більш кращому варіанті виконання шаблонний дволанцюговий полінуклеотид містить, щонайменше, близько 100 видів полинуклеотидів. В іншому кращому виконанні розмір дволанцюгових випадкових фрагментів становить приблизно від 5 п.о. до 5 кб. В іншому переважному виконанні чертвертьш етап способу містить повторення другого та третього етапів принаймні для 10 циклів. У якості біологічних інсектицидних контролюючих засобів сГІБи виробляються шляхом експресії нуклеїнових кислот у гетерологічних клітинаххазяїнах, придатних для експресії цих нуклеїнових кислот. В одному виконанні виходять клітини В. thuringiensis, що містять модифікації нуклеїнової кислоти по цьому винаходу. Такі модифікації охоплюють мутації або усунення існуючих регуляторних елементів, що приводять до зміненої експресії даної нуклеїнової кислоти, або включення нових регуляторних елементів, що контролюють експресію цієї нуклеїнової кислоти. В іншому виконанні до клітин Bacillus thuringiensis додаються копії однієї або декількох нуклеїнових кислот шляхом або інсерції в хромосому, або введенням утримуючих нуклеїнові кислоти молекул, які репликуються позахромосомно. В іншому виконанні, щонайменше, одна з нуклеїнових кислот по винаходу вводиться в прийнятну експресійну касету, що містить промотор і сигнал термінації. Експресія нуклеїнової кислоти є конститивною, або ж використається промотор, що індукується, що реагує на різні типи стимулів для ініціації транскрипції. В іншому виконанні клітина, у якій експресується сГІБ, являє собою мікроорганізм, наприклад, вірус, бактерію або грибок. Ще в одному виконанні вірус, наприклад, бакуловірус містить нуклеїнову кислоту по винаходу у своєму геномі й експресує більші кількості відповідного інсектицидного білка після інфікування відповідних еукаріотичних клітин, придатних для реплікації вірусу й експресії нуклеїнової кислоти. Отриманий у такий спосіб білок використається як інсектицид 96187 38 ний агент. В альтернативному варіанті сконструйовані бакуловіруси, що містять нуклеїнову кислоту, використаються для інфікування комах in vivo й убивають їх або шляхом експресії інсектицидного токсину, або комбінацією вірусної інфекції й експресії інсектицидного токсину. Клітини бактерій також є клітинами-хазяями для експресії нуклеїнових кислот по винаходу. В одному виконанні застосовуються непатогенні симбіозні бактерії, здатні жити й розмножуватися усередині рослинної тканини, так називані ендофіти, або непатогенні симбіозні бактерії, здатні колонізувати філосферу або ризосферу, так називані епіфіти. До таких бактерій відносяться бактерії видів Agrobacterium, Alcaligenes, Azospirillum, Azotobacter, Bacillus, Clavibacter, Enterobacter, Erwinia, Flavobacter, Klebsiella, Pseudomonas, Rhizobium, Serratia, Streptomyces й Xanthomonas. Симбіотичні грибки, такі як Trichoderma Gliocladium також здатні бути хазяями для експресії винайдених нуклеїнових кислот з тією же самою метою. Технології цих генетичних маніпуляцій є специфічними для різних наявних хазяїв, і добре відомі в галузі. Наприклад, експресуючі вектори рKK223-3 й рKK223-2 можуть застосовуватися для експресії гетерологічних генів в Е. соїі або транскрипційним, або трансляційним злиттям за tacпромотором або trc-промотором. Для експресії оперонів, що кодують множинні білки ORF найпростіша процедура являє собою введення оперона у вектор, такий як рKK223-3, трансляційним злиттям, що дозволяє використати місце зв'язування родинної рибосоми гетерологічних генів. Технології надекспресії в грам-позитивних видах, таких як Bacillus, також відомі в галузі й можуть використатися в контексті цього винаходу (Quax й ін. у роботі: Industrial Microorganisms: Basic and Applied Molecular Genetics, Eds. Baltz й ін., American Society for Microbiology, Washington (1993)). Альтернативні системи для надекспресії ґрунтуються, наприклад, на дріжджових векторах і включають використання Pichia, Saccharomyces й Kluyveromyces (Sreekrishna, у роботі: Industrial microorganisms: basic and applied molecular genetics, автори Baltz, Hegeman, та Skatrud, American Society for Microbiology, Washington (1993); Dequin та Barre, Biotechnology L2:173-177 (1994); van den Berg й ін., Biotechnology 8:135-139 (1990)). В одному виконанні, щонайменше, один сГІБ по винаходу експресований у вищому організмі, такому як рослина. У цьому випадку трансгенні рослини, експресуючі ефективні кількості сГІБа, захищають самі себе від комах-шкідників. Коли комаха починає їсти таку трансгенну рослину, вона також поглинає експресований сГІБ. Це удержить комаху від подальшого поїдання в цієї рослини, а може навіть привести до ушкодження або загибелі комахи. Нуклеїнова кислота по цьому винаходу вводиться в експресійну касету, що потім може бути стійко інтегрована в геном рослини. В іншому виконанні така нуклеїнова кислота включається в непатогенний вірус, що самореплікується. Рослини, трансформовані по цьому винаходу, можуть бути однодольними або дводольними й включа 39 ють, але не обмежуючись ними, кукурудзу, пшеницю, ячмінь, жито, солодку картоплю, квасолю, горох, цикорій, салат-латук, капусту, кольорову капусту, брокколі, турнепс, редис, шпинат, спаржу, цибулю, часник, перець, селеру, кабачки, гарбуз, коноплі, цуккіні, яблуко, грушу, айву, диню, сливу, черешню, персик, нектарин, абрикос, полуницю, виноград, малину, чорну смородину, ананас, авокадо, папайю, манго, банан, сою, помідор, сорго, цукровий очерет, цукровий буряк, соняшник, рапс, конюшина, тютюн, морква, люцерну, рис, картоплю, баклажан, огірок, резушку Таля, а також хвойні й листяні дерева. Після переміщення необхідної нуклеїнової кислоти в конкретний вид рослини вона може за допомогою традиційних технологій розведення поширюватися в цьому виді або переходити в інші сорти цього ж виду, особливо, включаючи комерційно важливі сорти. Переважно, щоб експресія нуклеїнової кислоти по цьому винаходу здійснювалася в трансгенних рослинах, викликаючи в такий спосіб біосинтез відповідного сГІБа в цих трансгенних рослинах. Таким шляхом виходять транс генні рослини з підвищеною опірністю до комах, зокрема, кукурудзяному кореневому жуку. Для експресії в трансгенних рослинах нуклеиновым кислотам по винаходу можуть знадобитися інші модифікації й оптимізація. Хоча в багатьох випадках гени з мікробних організмів можуть експресуватися в рослинах на високих рівнях і без модифікації, але в трансгенних рослинах може відбуватися й слабка експресія мікробних нуклеїнових кислот, що мають кодони, що не є кращими в рослинах. У даній галузі відомо, що у всіх організмів є специфічні преференції по використанню кодонів, і кодони нуклеїнових кислот, описаних у цьому винаходу, можуть бути змінені для відповідності преференціям рослин, у той же час, підтримуючи кодуємі ними амінокислоти. Більше того, висока експресія в рослинах досягається з послідовностей, що кодують, GC-зміст у які становить, щонайменше, 35%, переважно більше 45%, ще більш переважно понад 50%, а найбільше переважно понад 60%. Мікробні нуклеїнові кислоти з низьким GC-змістом можуть слабко експресуватися в рослинах внаслідок існування мотивів АТТТА, які можуть дестабілізувати повідомлення, і мотивів ААТААА, які можуть викликати неналежне поліаденілування. Хоча кращі генні послідовності можуть бути адекватно експресовані як в однодольні так й у двочасткових видах рослин, послідовності можуть бути й модифіковані з обліком специфічних преференцій по кодонах й GC-змісту в однодольної й двочасткових, оскільки ці преференції відрізняються (Murray й ін. Nucl. Acids Res. 17:477-498 (1989)). Крім того, здійснюється скрінінг нуклеїнових кислот на наявність нестандартних місць сплайсинга, які можуть викликати усікання повідомлень. Всі зміни, які потрібно виконати усередині нуклеїнових кислот, такі як описані вище, виконуються із застосуванням добре відомих технологій сайт-сайт-спрямованого мутагенезу, ПЦР і конструювання синтетичних генів із застосуванням способів, описаних в опуб 96187 40 лікованих патентних заявках ЕР 0 385 962, ЕР 0 359 472, і WO 93/07278. В одному виконанні винаходу послідовність, що кодує, сГІБа та/або послідовність, що кодує, батьківського Bt Cr-білка виходить/виходять відповідно до процедури, описаної в патенті США 5,625,136, включеному сюди шляхом посилання. У цій процедурі використаються кодони, що є кращими для кукурудзи, тобто, єдиний ко дон, що найбільше часто кодує амінокислоту в кукурудзі. Кращий для кукурудзи кодон для конкретної амінокислоти може бути отриманий, наприклад, з відомої генної послідовності для кукурудзи. Застосування кодона кукурудзи для 28 генів з рослин кукурудзи зустрічається в роботі Murray й ін., Nucleic Acids Research 17:477-498 (1989), опис якої включено сюди шляхом посилання. Таким способом нуклеотидна послідовність може бути оптимізована для експресії в будь-якій рослині. Визнано, що вся генна послідовність або будь-яка її частина можуть бути оптимізованими або синтетичними. Тобто, можуть також використатися синтетичні або частково оптимізовані послідовності. Для ефективної ініціації трансляції послідовностям, пов'язаним з ініціюючим метіоніном, може знадобитися модифікація. Наприклад, вони можуть бути модифіковані шляхом включення послідовностей, відомих своєю ефективністю в рослинах. Joshi запропонував відповідну типову послідовність для рослин (NAR 15:6643-6653 (1987)), a Clonetech пропонує подальший загальний ініціатор трансляції (1993/1994 католог, сторінка 210). Ці консенсуси придатні для використання з нуклеїновими кислотами по цьому винаходу. Ці послідовності включені в конструкції, що містять нуклеїнові кислоти до ATG включно (залишаючи немодифікованої другу амінокислоту) або в альтернативному варіанті - до й включаючи GTC, що випливає за ATG (з можливістю модифікування другої амінокислоти даного трансгена). Експресію нуклеїнових кислот у трансгенних рослинах ведуть промотори, що функціонують у рослинах. Вибір промотору буде варіювати залежно від просторово-тимчасових вимог до експресії, а також залежно від видів-мішеней. Тому кращої є експресія нуклеїнових кислот по цьому винаходу в листах, стеблах або стовбурах, у качанах, у суцвіттях (наприклад, у шипах, мітелках, кісточках і т.п.), у коріннях та/або саджанцях. Однак, у багатьох випадках шукають захист від більш ніж одного типу комах-шкідників, а тому бажано експресію в багатьох тканинах. Хоча багато промоторів із двочасткових продемонстрували свою дієвість в однодольні й навпаки, в ідеальному випадку для експресії у двочасткові вибираються промотори двочасткових, а промотори однодольних - для експресії в однодольні. Однак, не існує ніяких обмежень щодо походження обраних промоторів; досить, щоб вони ефективно вели експресію нуклеїнових кислот у необхідній клітині. В одному виконанні застосовуються промотори з конститутивною експресією, включаючи актин, або убіквитин, або промотори сmр, або промотори CaMV 35S й 19S. Нуклеїнові кислоти по цьому ви 41 находу також можуть експресуватися під керуванням промоторів з хімічною регуляцією. Це дає можливість сГІБам синтезуватися тільки тоді, коли насінні рослини обробляються хімікатами, що індукують. Оптимальна технологія хімічної індукції генної експресії докладно описана в опублікованій заявці ЕР 0 332 104 (Ciba-Geigy) і в патенті США 5,614,395. Оптимальним промотором для хімічної індукції є тютюновий PR-1a. В іншому виконанні може застосовуватися категорія промоторів, що індукуються ушкодженням. Описано багато промоторів, що експресуються в місцях ушкоджень або в місцях інфікування фітопатогенами. В ідеальному випадку такий промотор повинен активуватися локально в місцях інфекції, і таким шляхом сГІБ акумулюється тільки в тих клітинах, яким потрібно синтезувати сГІБ, щоб убити комахи-шкідника, що вторгається. До оптимальних промоторів цього виду ставляться описані в роботах Stanford й ін. Моl. Gen. Genet. 215:200-208 (1989), Xu й ін. Plant Molec. Biol. 22:573-588 (1993), Logemann й ін. Plant Cell 1:151-158 (1989), Rohrmeier & Lehle, Plant Molec. Biol. 22:783-792 (1993), Firek й ін. Plant Molec. Biol. 22:129-142 (1993), і Warner й ін. Plant J. 3:191-201 (1993). Кращими для тканини або преферентними для тканини промоторами, застосовними для експресії генів, що кодують сГІБи в рослинах, особливо, у кукурудзі, є промотори, що виконують пряму експресію в корені, серцевині, листі або пилку, особливо в корені. Такими промоторами є, наприклад, виділені з РЕРС або Ігр,описані в патенті США №. 5,625,136, або з MTL, описані в патенті США № 5,466,785. Обоє ці патенту включені сюди повністю шляхом посилання. Наступними виконаннями є трансгенні рослини, експресуючі нуклеїнові кислоти способом індукції ушкодженням або патогенною інфекцією. Для процесу розробки гібридної нуклеїнової кислоти з використанням генів сГІБ по цьому винаходу крім промоторів застосовується ще ряд термінаторів транскрипції, що є в наявності. Термінатори транскрипції відповідають за припинення транскрипції за межами трансгена й за правильне поліаденілування. Прийнятними термінаторами транскрипції є термінатори, відомі своїм функціонуванням у рослинах, включаючи термінатора CaMV 35S, термінатор нопалін сінтази (NOS), гороховий термінатор rbc E9 й інші, відомі в галузі. Вони можуть застосовуватися як в однодольних, так й у двочасткові. У контексті цього винаходу може застосовуватися будь-який наявний термінатор, відомий своїм функціонуванням у рослинах. В експресійну касету, описану в цьому винаходу, можуть бути включені численні інші послідовності. До них ставляться послідовності, що показали здатність підвищувати експресію, такі як інтронні послідовності (напр. з Adhl й bronzel) і провідні вірусні послідовності (напр. з TMV, MCMV й AMV). Бажано було б направляти експресію нуклеїнових кислот по цьому винаходу до різним клітинних локалізаціям у рослині. У деяких випадках бажаної може бути локалізація в цитозолі, а в інших випадках може бути кращої локалізація в деякої 96187 42 субклітинній органеллі. Субклітинна локалізація трансгенно-кодованих ензимів здійснюється за допомогою добре відомих у галузі технологій. У типовому випадку ДНК, що кодує пептид-мішень із відомого генного продукту, спрямованого на органеллу, направляється й гібридизується перед нуклеїнової кислотою. Відомо багато таких послідовностей-мішеней для хлоропласта, і їхнє функціонування в гетерологічних конструкціях було показано. Експресія нуклеїнових кислот по винаходу також спрямований на ендоплазматичний ретикулум або на вакуолі клітин-хазяїв. Технології досягнення цього також добре відомі в галузі. Вектори, придатні для трансформації рослин, описані в різних місцях дійсного опису. Для переносу за допомогою агробактерій придатні бінарні вектори, або вектори, що несуть, щонайменше, одну граничну послідовність Т-ДНК, у той час як для прямого генного переносу підходить будь-який вектор, і кращої може бути лінійна ДНК, що включає тільки значиму конструкцію. У випадку прямого переносу генів може застосовуватися трансформація з єдиним видом ДНК або до-трансформація (Schocher й ін. Biotechnology 4:1093- 1096 (1986)). Як для прямого переносу генів, так і для агробактеріального переносу трансформація звичайно (але не обов'язково) здійснюється з обираним маркером, що може забезпечити стійкість до антибіотиків (канаміцину, гігроміцину або метотрексату) або до гербіцидів (basta). Вектори трансформації рослин, що містять гени сГІБ по цьому винаходу, можуть також містити гени (напр. ізомеразу фосфоманози; РМІ), що забезпечують позитивну селекцію трансгенних рослин, як описано в патентах США 5,767,378 й 5,994,629, включених сюди шляхом посилання. Однак вибір такого маркера не є критичним для цього винаходу. В іншому виконанні нуклеїнова кислота по цьому винаходу прямо трансформується в геном пластид. Більшою перевагою пластидної трансформації є те, що пластиди в загальному випадку здатні до експресію бактеріальних генів без істотної оптимізації кодонів, і пластиди здатні до експресії множинних відкритих рамок читання під керуванням єдиного промотору. Технологія пластидної трансформації широко описана в патентах США №№ 5,451,513, 5,545,817, і 5,545,818, у заявці РСТ № WO 95/16783 й у роботі McBride и ін. (1994) Рrос. Nati. Acad. Sci. USA 91, 7301-7305. Базова технологія хлоропластної трансформації містить у собі введення ділянок клонованої пластидної ДНК, що обмежують обираний маркер, спільно зі значимим геном у відповідну тканинумішень, напр., за допомогою біолистики або протопластної трансформації (напр., трансформації за допомогою хлориду кальцію або PEG). Обмежуючі ділянки розміром від 1 до 1,5 кб, іменовані послідовностями-мішенями, здійснюють гомологічну рекомбінацію з геномом пластид й у такий спосіб дають можливість заміни або модифікації специфічних ділянок пластома. Початково крапкові мутації в генах хлоропластів 16S rRNA й rps12, що надають опірність спектиноміцину та/або стрептоміцину, використаються в якості обираних маркерів для трансформації (Svab, Ζ., Hajdukiewicz, 43 P., та Maliga, P. (1990) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 8526-8530; Staub, J. M., та Maliga, P. (1992) Plant Cell 4, 39-45). Результатом цього є стійкі гомоплазменні трансформанти із частотою приблизно один на 100 бомбардувань листів-мішеней. Наявність сайтів клонування між цими маркерами дало можливість створення пластид-пластидспрямованого вектора для введення чужорідних генів (Staub, J.M., та Maliga, P. (1993) EMBO J. 12, 601-606). Істотні підвищення частоти трансформації отримані шляхом заміни рецесивних генів опірності антибіотикам рРНК або р-белка на домінантний обираний маркер, бактеріальний ген aad, що кодує ензим аміноглікозид - 3'-аденілтрансферазу, що знешкоджує спектиноміцин (Svab, Z., та Maliga, P. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 913-917). Раніше цей маркер успішно застосовувався для високочастотної трансформації генома пластид зеленої водорості Chlamydomonas reinhardtii (Goldschmidt-Clermont, M. (1991) Nucl. Acids Res. 19:4083-4089). Інші обирані маркери, корисні для пластидної трансформації також відомі в галузі й охоплюються рамками цього винаходу. У типовому випадку для досягнення гомопластидного стану потрібно приблизно 15-20 циклів клітинного розподілу після трансформації. Пластидна експресія, у якій гени вводяться шляхом гомологичної рекомбінації в усі кілька тисяч копій кільцевого генома пластид, що є присутнім у кожній клітині, використає перевагу від величезного числа копій над ядерною експресією генів, дозволяючи одержувати рівні експресії, що легко перевищують 10% від усього розчинного рослинного білка. У кращому виконанні нуклеїнова кислота по цьому винаходу вводиться в пластид-пластид-спрямований вектор і трансформується в геном пластид бажаного рослини-хазяїна. Виходять гомопластичні рослини з геномами пластид, що містять нуклеїнову кислоту по цьому винаходу, переважно здатні до високого рівня експресії цієї нуклеїнової кислоти. СГІБи по винаходу можуть застосовуватися в комбінації з іншими пестицидними елементами (напр., з Bt Cry-білками) з метою розширення діапазону шкідників, на яких вони спрямовані. Більше того, застосування сГІБів по винаходу в комбінації з модифікованими Сrу3А-токсинами, Bt Cryбілками або іншими елементами, активними проти ККЖ (кукурудзяного кореневого жука), такими як РНКи, що володіють іншим видом активності або спрямованими на інші рецептори в травному каналі комахи, особливо корисно для запобігання виникненню та/або регулювання опірності в кукурудзяного кореневого жука. Перелік інших інсектицидних елементів включає, не обмежуючись ними, лектини, δ-амілазу, пероксидазу й оксидазу холестерину. Також корисними в комбінації із сГІБами по цьому винаходу є Vip-гени, описані в патенті США № 5,889,174, включеному сюди шляхом посилання. Ця коекспресія більш ніж одного інсектицидного елемента в одному трансгенном рослині може бути досягнута шляхом готування одного рекомбінантного вектора, що містить послідовності, що кодують, більш ніж одного інсектицидного елемента в так називаному молекулярному стеці й гене 96187 44 тичному конструюванні рослини, яке б містило й експрессовало всі ці інсектицидні елементи. Такі молекулярні стеки можуть бути також отримані застосуванням міні-хромосом, як описано, наприклад, у патенті США 7,235,716. В альтернативному варіанті трансгеннa рослина, що містить одну нуклеїнову кислоту, що кодує перший інсектицидний елемент, може бути ретрансфоровано іншою нуклеїнової кислотою, що кодує інший інсектицидний елемент, і т.д. В альтернативному варіанті рослина, Батько 1, може бути генетично розроблене для експресії генів по цьому винаходу. Друга рослина, Батько 2, може бути генетично розроблене для експресії додаткового елемента боротьби з комахами. Схрещування Батька 1 з Батьком 2 дає потомство рослин, експресуючих всі гени, уведені в Батьків 1 й 2. Трансгенні насіння по цьому винаходу також можна обробляти інсектицидним покриттям, як описано в патентах США №№ 5,849,320 й 5,876,739, включених сюди шляхом посилання. Якщо й інсектицидне покриття насінь, і трансгенні насіння по винаходу є активними проти того самого комахи, то така комбінація корисна (і) у способі підвищення активності сГІБа по винаходу проти такої комахи й (іі) у способі запобігання розвитку опірності сГІБу по винаходу за рахунок наявності другого механізму дії проти комахи-мішені. Таким чином, винахід надає спосіб підвищення активності проти комахи-мішені або запобігання розвитку опірності в такої комахи, наприклад, у кукурудзяного кореневого жука, що складає в нанесенні інсектицидного покриття на трансгенні насіння, що містять один або трохи сГІБів по винаходу. Навіть якщо інсектицидне покриття активно проти іншої комахи, це інсектицидне покриття корисно для розширення діапазону комах, проти яких ведеться боротьба, наприклад, шляхом нанесення інсектицидного покриття, активного проти лускокрилих комах, на трансгенні насіння по винаходу, активні проти жорсткокрилих комах, у результаті чого отримані трансгенні насіння з покриттям будуть активні як проти лускокрилих, так і проти жорсткокрилих комах-шкідників. ПРИКЛАДИ Далі опис винаходу поданий на наступних детально представлених прикладах. Ці приклади є тільки ілюстративними й не призначені для якогонебудь обмеження, якщо воно не вказується. Використовувані тут стандартні технології рекомбінантної ДНК або клонування молекул добре відомі в галузі й описані в роботах J. Sambrook, і ін., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, третє видання., Cold Spring Harbor, Н'ю Йорк: Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001); T.J. Silhavy, M.L. Berman, та L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Н'ю Йорк (1984) і Ausubel, F.M. і ін., Current Protocols in Molecular Biology, New York, John Wiley та Sons Inc., (1988), Reiter, і ін., Methods in Arabidopsis Research, World Scientific Press (1992), а також Schultz й ін., Plant Molecular Biology Manual, Kluwer Academic Publishers (1998). Приклад 1. Батьківські послідовності, що кодують, 1 45 96187 Оптимізовані для кукурудзи послідовності, що кодують, Сrу3Аа, Сrу1Ab, Сrу1Ba, і Сrу1Fa, позначені тут відповідно як mосrу3Аа, mocry1Ab, mocry1Ba. й mocry1Fa, були отримані відповідно до процедури, описаної в патенті США 5,625,136, включеному сюди повністю шляхом посилання. Послідовність cry3A055 (SEQ ID NO: 67), що кодує білок Cry3A055 (SEQ ID NO: 68) була отримана шляхом модифікації послідовності, що кодує, mосrу3А введенням нуклеотидної послідовності, що кодує сайт пізнавання катепсин G у домен І відповідно до патенту США 7,030,295, включеному сюди повністю шляхом посилання. Послідовності mосrу3Аа (SEQ ID NO: 67), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 68, cry3A055 (SEQ ID NO: 69), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 70, mocry1Ab (SEQ ID NO: 71), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 72, mocry1Ba (SEQ ID NO: 73), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 74, mocry1Fa (SEQ ID NO: 75), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 76, cry8Aa (SEQ ID NO: 77), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 78, crу1Ac (SEQ ID NO: 79), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 80, і cry11а (SEQ ID NO: 81), що кодує білок, представлений в SEQ ID NO: 82, були використані в конструюванні кодуємих ними гібридних нуклеїнових кислот і білків як описано в наступних прикладах. Приклад 2. Застосування Пцр-праймерів для конструювання гібридних нуклеїнових кислот. Полімеразная ланцюгова реакція (ПЦР) являє собою повторюваний, ферментний, ініціюємий праймером синтез послідовності нуклеїнових кислот. Ця процедура добре відома й широко застосовується фахівцями в даній галузі (Cм. Mullis, патенти США №№ 4,683,195, 4,683,202 й 4,800,159; Saiki, Randall K., Stephen Scharf, Fred Faloona, Kary B. Mullis, Glenn T. Horn, Henry A. Erlich, Norman Arnheim [1985] "Enzymatic Amplification of .beta.-Globin Genomic Sequences 46 and Restriction Site Analysis for Diagnosis of Sickle Cell Anemia," Science 230:1350-1354). ПЦР заснована на ферментному збільшенні значимого фрагмента ДНК, по краях якого перебувають два олігонуклеотидних праймера, що гібридизуються до протилежних ланцюжків послідовності-мішені. Ці праймери зорієнтовані так, що їх 3' кінці спрямовані один на одного. Повторювані цикли денатурації нагріванням, віджиг праймерів до їхніх комплементарних послідовностей і подовження відпалених праймерів за допомогою ДНК-полімерази дають у результаті збільшення сегмента, певного 5' кінцями цих ПЦР-праймерів. Оскільки продукт подовження кожного праймера може служити шаблоном для іншого праймера, кожен цикл практично подвоює кількість фрагментів ДНК, отримане в попередньому циклі. Результатом цього є експонентне нагромадження конкретного фрагмента-мішені в кілька мільйонів разів за кілька годин. Використовуючи термостабільну ДНК-полімеразу, наприклад, Taq-полімеразу, виділену з термофільної бактерії Thermus aquaticus, процес збільшення можна зробити повністю автоматичним. Химерні послідовності, що кодують, описані в наступних прикладах, були розроблені із застосуванням різних комбінацій прикладів праймерів, показаних у Таблиці 1. Суміші для реакцій ПЦР і протоколи температурних циклів ПЦР, що застосовувалися в експериментах, представлені в Таблицях 2 й 3 відповідно. У кожному з наступних прикладів праймери ПЦР позначаються найменуванням й "SEQ ID NO.", а суміші для реакцій ПЦР і протоколи температурних циклів ПЦР позначені їхніми відповідними номерами. Кваліфікований фахівець побачить, що для конструювання химерних послідовностей, що кодують, по цьому винаходу можуть застосовуватися інші праймери ПЦР, а також інші умови ПЦР, і, що перелік прикладів праймерів й умов ПЦР, використовуваних у цьому винаходу, у жодному разі не є обмежуючим. Таблиця 1 Праймери, застосовувані для конструювання послідовностей, що кодують, сГІБів Найменування праймера 5' 3А-1-bam С3-3А-6 С3-1Аb-3 1Аb-6-sac 8A-atg-delRI послідовність 5'-CCGGATCCATGACGGCCGACAACAACACCGAGGC-3' 5'-CAGGGGCAGCTGGGTGATCT-3' 5'-AGATCACCCAGATCCCCCTG-3' 5'-CCGAGCTCAGCTCCTACACCTGATCGATGTGGTAGTCGG-3' 5'-CCGGATCCACCATGACTAGTAACGGCCGCCAGTGTGCTGGTATTCGCC CTTATGAC-3' С2-3А-4 5'-GTCCAGCACGGTCAGGGTCA-3' протилежний 5'-GCGTGCAGTCAAGTCAGATC-3' FR8a-OL-1 5'-GGTGTTGTTGTCGGCCGTCATAGGGCGAATACCAGCAC-3' FR8a-OL-2 5' -GCCGACAACAACACCGAGGCCCTGGACAGCAGCACCACC-3' С1-3А-2 5'-CAGGTGGGTGTTGGCGGCCTGGGCGTA-3' 5' FR8a 5'-GGATCCACCATGACTAGTAAC-3' 5' FR8a-12aa 5'-CCGGATCCACCATGTATGACGGCCGACAACAACACC-3' C2-3A-3 5'-TGACCCTGACCGTGCTGGAC-3' 3' 1Ab-dm3 5'-GAGCTCCTAGGTCACCTCGGCGGGCAC-3' 5' FR-de16 5'-GGATCCACCATGTGTGCTGGTATTCGCCCTAT-3' 5' 1Ab-bam 5'-CCGGATCCATGGACAACAACCCCAACATCAAC-3' SEQ ID NO: SEQ ID NO:83 SEQ ID NO:84 SEQ ID NO:85 SEQ ID NO:86 SEQ ID NO:87 SEQ ID NO:88 SEQ ID NO:89 SEQ ID NO:90 SEQ ID NO:91 SEQ ID NO:92 SEQ ID NO:93 SEQ ID NO:94 SEQ ID NO:95 SEQ ID NO:96 SEQ ID NO:97 SEQ ID NO:98 47 96187 48 Продовження таблиці 1 C3-3A-8 C3-3A-7 1B-5 1B-10 3А-22 1B-7 C3-1Ab-2 C3-3A-5 3А-12-sac C4-3A-10 C4-3A-9 C1-1Ab-1 5' 8Aa-dm3 3' 8Aa-dm3 tant-OL-2 tant-OL-1 tant-3'sac 1Ac-OL-2 1Ac-OL-1 1Ac-3'sac 1la-OL-2 1la-OL-l 1la-3' sac FR-1Ab-2 FR-1Ab-1 FR-1Ab-4 FR-1Ab-3 CMS94 CMS95 CMS96 CMS97 CMS98 CMS99 CMS100 CMS101 5'-GATGTCGCCGCCGGTGAAGC-3' 5'-GCTTCACCGGCGGCGACATC-3' 5'-CCGCCGCGACCTGACCCTGGGCGTGCTGGAC-3' 5'-CCGAGCTCCTAGAACAGGGCGTTCAC-3' 5'-GGCCTTCACCAGGGGCAGCTGGGTGAT-3' 5'-ATCACCCAGATCCCCATGGTGAAGGCC-3' 5'-CAGGGGGATCTGGGTGATCT-3' 5'-AGATCACCCAGCTGCCCCTG-3' 5'-CCGAGCTCAGCTCAGATCTAGTTCACGGGGATGAACTCGATCTT-3' 5'-TGGTGCTGGCGTAGTGGATGCGG-3' 5'-CCGCATCCACTACGCCAGCACCA-3' 5'-TACGTGCAGGCCGCCAACCTGCACCTG-3' 5'-AGATCACCCAGCTGCCCCTGGTAAAGGGAGACATGTTATATC-3' 5'-GAGCTCCTATGTCTCATCTACTGGGATGAA-3' 5'-GAGGGTGTGGGCCTTCACCAGGGGCAGCTGGGT-3' 5'-ACCCAGCTGCCCCTGGTGAAGGCCCACACCCTC-3' 5'-GAGCTCTAGCTTAAGCAGTCCACGAGGTT-3' 5'-TAAAAAGAAAGTTTCCCTTCACCAGGGGCAGCTGGGT-3' 5'-ACCCAGCTGCCCCTGGTGAAGGGAAACTTTCTTTTTA-3' 5'-GAGCTCCTATGTTGCAGTAACTGGAATAAA-3' 5'-AAGACAGATTGAAAGCTTTTACTCAGGGGCAGCTGGGT-3' 5'-ACCCAGCTGCCCCTGAGTAAAAGCTTTCAATCTGTCTT-3' 5'-GAGCTCCTACATGTTACGCTCAATATGGAGT-3' 5'-GATGTTGTTGAACTCGGCGCTCTTGTGGGTCCA-3' 5'-TGGACCCACAAGAGCGCCGAGTTCAACAACATC-3' 5'-GGCTCGTGGGGATGATGTTGTTGAAGTCGACGCTCTTGTGG-3' 5'-CCACAAGAGCGTCGACTTCAACACATCATCCCCAGCAGCC-3' 5'-GGCGCGCCACCATGGCTAGCATGACTGGTGG-3' 5'-GCAGGAACAGGTGGGTGTTG-3' 5'-CCTGAACACCATCTGGCCCA-3' 5'-CTGGCTGCTGGGGATGATGTTGTTGAAGTCGACGCTCTT-3' 5'-GAGCTCTTAGGTCACCTCGGC-3' 5'-AAGAGCGTCGACTTCAACAACATCATCCCCAGCAGCCAG-3' 5'-GAAGTACCGCGCCCGCATCCGCTACGCCAGCACCACCAAC-3' 5'-GTTGGTGGTGCTGGCGTAGCGGATGCGGGCGCGGTACTTC-3' SEQ ID NO:99 SEQ ID NO:100 SEQ ID NO:101 SEQ ID NO:102 SEQ ID NO:103 SEQ ID NO:104 SEQ ID NO:105 SEQ ID NO:106 SEQ ID NO:107 SEQ ID NO:108 SEQ ID NO:109 SEQ ID NO:110 SEQ ID NO:111 SEQ ID NO:112 SEQ ID NO:113 SEQ ID NO:114 SEQ ID NO:115 SEQ ID NO:116 SEQ ID NO:117 SEQ ID NO:118 SEQ ID NO:119 SEQ ID NO:120 SEQ ID NO:121 SEQ ID NO:122 SEQ ID NO:123 SEQ ID NO:124 SEQ ID NO:125 SEQ ID NO:136 SEQ ID NO:137 SEQ ID NO:138 SEQ ID NO:139 SEQ ID NO:140 SEQ ID NO:141 SEQ ID NO:142 SEQ ID NO: 143 Таблиця 2 Реакційні суміші для ПЦР Суміші 50-100нг Днк-шаблон 0,8 мк праймера 1 0,8 мк праймера 2 1Х Pfu буфер 0,4м дНТФ 2 % формамід 1,25 одиниць Pfu полімерази (Stratagene) 2,5 одиниць Taq полімерази (Qiagen) Вода до повного обсягу 50 мкл Суміш 4 50-100нг Днк-шаблон 0,4 мк праймера 1 0,4 мк праймера 2 1Х Пцр-буфер (Invitrogen) 0,4 м дНТФ 2,5 одиниць HotStart Taq полімерази Вода до повного обсягу 50 мкл Суміш 2 50-100нг Днк-шаблон 0,8 мк праймера 1 0,8 мк праймера 2 1Х Taq буфер 0,4 м dNTPs 2 % формамід 2,5 одиниць Taq полімерази (Qiagen) Вода до повного обсягу 50 мкл Суміш 5 50-100нг Днк-шаблон 0,4 мк праймера 1 0,4 мк праймера 2 1Х Pfu буфер (Stratagene) 0,2 м дНТФ 1,25 единиц Pfu Turbo полімерази Вода до повного обсягу 50 мкл Суміш 3 50-100нг Днк-шаблон 0,8 мк праймера 1 0,8 мк праймера 2 1Х переважний буфер сДНК 0,4 м дНТФ х одиниць полімерази сДНК переважна полімераза (Clontech) Вода до повного обсягу 50 мкл 49 96187 50 Таблиця 3 Профілі температурних циклів ПЦР Профіль термоциклу 1 94 °C - 5хвилин 20 циклів: 94 °C - 30 секунд 65 °C - 30 секунд 72 °C - 30 секунд 72 °C - 7 хвилин витримка при 4 °C Профіль термоциклу 4 94 °C - 15 хвилин 20 циклів: 94 °C - 30 секунд 50-70 °C- 30 секунд 72 °C - 30 секунд 72 °C - 7 хвилин витримка при 4° С Профіль термоциклу 2 94 °C - 5 хвилин 20 циклів: 94 °C - 30 секунд 55 °C - 30 секунд 72 °C - 30 секунд 72 °C - 7 хвилин витримка при 4 °C Профіль термоциклу 5 94 °C - 5 хвилин 20 циклів: 94 °C - 30 секунд 55-75 °C - 30 секунд 72 °C - 1 хвилина 72 °C - 15 хвилин витримка при 4 °C У Таблиці 4 показане взаємна відповідність між трьома доменами білків Сrу3А055, Сrу1Аb й Сrу3А з їх відповідними варіабельними ділянками Профіль термоциклу 3 94 °C - 5 хвилин 20 циклів: 94 °C - 30 секунд 55 °C - 30 секунд 68 °C - 30 секунд 68 °C - 7 хвилин витримка при 4° С Профіль термоциклу 6 94°C - 5 хвилин 20 циклів: 94 °C - 30 секунд 55-75 °C - 30 секунд 72 °C - 2 хвилини 72 °C - 15minutes витримка при 4° С й консервативними блоками. Для кожного білка показано, які амінокислоти містяться в доменах, консервативних блоках і варіабельних ділянках. Таблиця 4 ДОМЕН І II III ДІЛЯНКА V1 V1 СВ1 V2 СВ2 V3 СВ3 V4 СВ4 V5 CBS V6 Протоксин Сrу3 A05S (SEQ ID NO:70) 1-10 11-142 143-172 173-192 193-244 245-259 260-444 445-454 455-492 493-513 514-523 524-586 587-598 Приклад 3. Розробка 2OL-8a. Фрагмент першої нуклеїнової кислоти, що кодує N-кінцеву частину білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70) збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить cry3А055 (SEQ ID NO: 69), із застосуванням праймерів 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) і С3-3А-6 (SEQ ID NO: 84), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Ця реакція ПЦР увела крапкову мутацію шляхом видалення нуклеотида 28 послідовності SEQ ID NO: 69 (сrу3А055), що привело до зрушення рамки зчитування Сrу3А055, і видалила сайт BamHI і послідовність Козака (Kozak, M., 1986. Cell 44:283-92) на 5' кінці отриманого амплікона. Фрагмент другий нуклеїнової кислоти, що кодує С-кінцеву частину білка Cry1Ab (SEQ ID NO: 72) збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить mосrу 1Аb (SEQ ID NO: 71), із застосуванням Cry1Ab (SEQ ID NO:72) 1-32 33-152 153-182 183-202 203-254 255-269 270-452 453-462 463-500 501-520 521-531 532-596 597-606 607-610 611-648 Сrу3А (SEQ ID NO:68) 1-10 11-141 142-171 172-191 192-243 244-258 259-443 444-453 454-491 492-512 513-522 523-585 586-597 Сrу3А (SEQ ID NO:131) 1-57 58-188 189-218 219-238 239-290 291-305 306-490 491-500 501-538 539-559 560-569 570-632 633-644 праймерів С3-1Аb-3 (SEQ ID NO: 85) і 1Аb-6-Sac (SEQ ID NO: 86), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Описані вище перша й друга нуклеїнові кислоти були з'єднані шляхом використання їх як шаблони в розширеній (overlap) ПЦР реакції (Horton й ін., 1989. Gene 77: 61-68) із праймерами 5'3A-1bam (SEQ ID NO: 83) і 1Аb-6-Sac (SEQ ID NO: 86), а також Суміші 2 і температурний цикли Профілі 1, з тією відмінністю, що як температура віджигу використали градієнт 45-65°С. Отриманий у результаті амплікон лігірували як фрагмент із затупленим кінцем до вектора pCR2.1TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA), розрізаному Smal, для утворення плазміди p2OL8a/CR2.1. Потім фрагмент BamHI-SacI з p2OL8a/CR2.1 лігірували до рЕТ21а (EMD Biosciences, Inc., San Diego, CА), що був розрізаний за допомогою BamHI-SacI, і 51 трансформували в Е. соlі. Фрагмент BamHI-SacI з p2OL8a/CR2.1 містив 40 нуклеотидів, отриманих з вектора pCR2.1-TOPO, що примикають до позарамочному амплікону з першої ПЦР реакції. Лігірування цього фрагмента BamHI-SacI до рЕТ21а створило відкриту рамку зчитування, що починається стартовим кодоном (ATG) мітки Т7 й уведеної ДНК закінчується, що сайтом Sad. Ця відкрита рамка зчитування позначена 2OL-8a (SEQ ID NO: 1) і кодує химерний інсектицидний білок 2OL-8a (SEQ ID NO: 2). Таким чином, у химерному інсектицидному білку 2OL-8a від N-кінця до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MASMTGGQQMGRGSTSNGRQCAGIRPYDGRQQH RG (SEQ ID NO: 126), амінокислоти 10-468 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), що становлять варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6; а також 38 амінокислот протоксинової хвостової ділянки білка Сrу1Ab. Нуклеотиди, що кодують амінокислоти 1-14 пептидильного фрагмента, отримані з мітки Т7 і сайту розщеплення BamHI вектора рЕТ21. Нуклеотиди, що кодують амінокислоти 15-26 пептидильного фрагмента, отримані з вектора pCR2.1-ТОРО. А нуклеотиди, що кодують амінокислоти 27-35 пептидильного фрагмента, отримані із фрагмента Сrу3А055, Що перебуває за рамками іншої частини послідовності, що кодує, Сrу3А055. Приклад 4. Розробка FR8a. Послідовність, Що Кодує, FR8a була розроблена шляхом розміщення послідовності Козака (АСС) і стартового кодона (ATG) відразу ж після Nкінцевого сайту BamHI в 2OL-8 а (См. Приклад 3). Крім того, сайт EcoRI в 2OL-8a був зруйнований для допомоги майбутньої векторизації FR8a. Всі ці зміни були зроблені в ході однієї ПЦР із застосуванням 2OL-8a як шаблон, а в якості праймерів: 8a-atg-delRI (SEQ ID NO: 87) і С2-3А-4 (SEQ ID NO: 88), Суміші 2 і температурний цикли Профілі 2. Отриманий у результаті амплікон лігірували до вектора pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Фрагмент BamHI-PpuMI із клонованого продукту ПЦР потім лігірували до фрагмента PpuMI-Ncol з 2OL8a/pCR2.1 (См. Приклад 3) і до фрагмента NcoI-BamHI з 2OL8a/pCR2.1 для створення FR8a (SEQ ID NO: 3), що кодує химерний інсектицидний білок FR8a (SEQ ID NO: 4). Таким чином, у химерному інсектицидному білку FR8a від N-кінця до Скїнця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), амінокислоти 10-468 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), що становлять варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й Nкінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ 96187 52 ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6; а також 38 амінокислот протоксинового хвостової ділянки білка Сrу1Ab. Цей сГІБ FR8a має дуже високу активність проти західного кукурудзяного кореневого жука, як показано в Таблиці 5. Отже, видалення послідовності амінокислоти Т7 з N-кінцевого пептидильного фрагмента сГІБа 2OL-8a не позначилося негативно на інсектицидній активності. Додаванням додаткових 34 амінокислот до Nкінця FR8a створили сГІБ, що одержав позначення FR8a+34 (SEQ ID NO: 160), що має N-кінцевий пептидильний фрагмент із 56 амінокислот (SEQ ID NO: 131). Цей N-кінцевий пептидильний фрагмент із 56 амінокислот не зробив негативного впливу на активність FR8a проти західного кукурудзяного кореневого жука (См. Табл.5). Приклад 5. Розробка FRCG. Для того, щоб визначити, чи є сайт пізнавання Протеази катепсин G необхідним для інсектицидної активності гібридного білка, що містить Nкінцевий фрагмент від Сrу3А055, була виготовлена модель, що усуває сайт катепсина G з гібридного білка FR8a (Приклад 4). Перший фрагмент нуклеїнової кислоти MluI-PpuMI із плазміди, що містить FR8a (SEQ ID NO: 3), і другий фрагмент нуклеїнової кислоти PpuMI/MluI із плазміди, що містить mосrу3Аа (SEQ ID NO: 67) лігірували за допомогою стандартної в молекулярній біології технології для створення FRCG (також позначуваної FR8a-catg) (SEQ ID NO: 5), що кодує гібридний білок FRCG (SEQ ID NO: 6). Таким чином, у химерному інсектицидному білку FRCG від N-кінця до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), амінокислоти 10-467 білка Сrу3А (SEQ ID NO: 68), що становлять варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й Nкінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6; а також 38 амінокислот протоксинового хвостової ділянки білка Сrу1Ab. Білок FRCG показав таку ж активність проти західного кукурудзяного кореневого жука, як і білок FR8a (див. Таблицю 5), із чого можна припустити, що сайт Протеази катепсина G не є необхідним для інсектицидної активності сГІБа. Приклад 6. Розробка FR8a-9F. Перший фрагмент нуклеїнової кислоти розміром приблизно 323 бп збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить FR8a (SEQ ID NO: 3), із застосуванням праймерів reverse (SEQ ID NO: 89) і FR8a-OL-l (SEQ ID NO: 90), a також Суміші 2 і температурний цикли Профілі 2. Другий фрагмент нуклеїнової кислоти розміром приблизно 470 бп збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить 53 FR8a, за допомогою праймерів FR8a-OL-2 (SEQ ID NO: 91) і С1-3А-2 (SEQ ID NO: 92), а також Суміші 2 і температурний цикли Профілі 2. Отримані в результаті два амплікона з'єднали шляхом використання їх як шаблони в розширеної ПЦР реакції із застосуванням праймерів 5'FR8a (SEQ ID NO: 93) і С1-3А-2 (SEQ ID NO: 92), використовуючи для ПЦР Суміш 2 і температурний цикл Профілю 2, для збільшення 5' кінця послідовності FR8a-9F. Продукт розширеної ПЦР клону вали у вектор pCR2.1-ТОРО (Invitrogen), позначений 5TR9F/pCR2.1. Фрагмент BamHI/PpuMI послідовності 5TR-9F/pCR2.1 потім лігірували до фрагмента РрпМІ/BamHI послідовності FR8a для створення послідовності FR8a-9F (SEQ ID NO: 7), що кодує химерний білок FR8a-9F (SEQ ID NO: 8). Таким чином, у химерному інсектицидному білку FR8a-9F від N-кінця до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), амінокислоти 1-468 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), що містить варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6; а також 38 амінокислот протоксинового хвостової ділянки білка Сrу1Ab. Активність сГІБа FR8a-9F проти західного кукурудзяного кореневого жука виявилася трохи нижче, ніж у сГІБа FR8a (См. Таблицю 5), із чого можна припустити, що С-кінцеві 9 амінокислот пептидильного фрагмента SEQ ID NO: 127 відіграють роль у наділенні білка FR8a повною інсектицидною активністю. Приклад 7. Розробка FR-9F-catg. Кодуюча послідовність FR-9F-catg була створена для того, щоб повернути отримані з Сrу3А055 позарамочні нуклеотиди FR8a назад у рамку й усунути сайт пізнавання катепсин G. Фрагмент BamHI/PpuMI з 5'FR-9F/pCR2.1 (См. Приклад 6) лігірували із фрагментом PpuMI/BamHI послідовності FRCG (См. Приклад 5) для створення послідовності, що кодує, FR-9 F-catg (SEQ ID NO: 9), що кодує химерний білок FR-9F-catg (SEQ ID NO: 10). Таким чином, у химерному білці FR-9F-catg від Nкінця до С-кінця розташовуються: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), амінокислоти 1-467 білка Сrу3А (SEQ ID NO: 68), що містить варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6; а також 38 амінокислот протоксинового хвостової ділянки білка Сrу1Ab. Рівень активності сГІБа FR8a-9F-catg проти західного кукурудзяного кореневого жука виявився 96187 54 таким же, як в FR8a (См. Таблицю 5), це підтверджує те, що сГІБ може бути отриманий з послідовності або модифікованого Сrу3А, або нативного Сrу3. Приклад 8. Розробка FR8a-12aa. Нуклеотиди, що кодують амінокислоти 2-13 пептидильного фрагмента, що втримується в FR8a (SEQ ID NO: 4) витягли за допомогою ПЦР. Фрагмент збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить FR8a (SEQ ID NO: 3), за допомогою праймерів 5'FR8a-12aa (SEQ ID NO: 94) і С1-3А-2 (SEQ ID NO: 90), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Отриманий у результаті амплікон клонували в pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Фрагмент BamHI-PpuMI із клону pCR2.1-TOPO потім лігірували із фрагментом PpuMI-BamHI із плазміди, що містить FR8a для створення послідовності FR8a12aa (SEQ ID NO: 11), що кодує химерний інсектицидний білок FR8a-12aa (SEQ ID NO: 12). Таким чином, у химерному інсектицидному білку FR8a12аа від N-кінця до С-кінця розташовуються: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 128), амінокислоти 10-468 білка Cry3A055 (SEQ ID NO: 70), що містить варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6; а також 38 амінокислот протоксинового хвостової ділянки білка Cry1Ab. Рівень активності сГІБа FR8a-12aa проти західного кукурудзяного кореневого жука виявився таким же, як в FR8a (См. Таблицю 5), на основі чого можна припустити, що для повної інсектицидної активності FR8a не потрібні N-кінцеві 12 амінокислот пептидильного фрагмента послідовності SEQ ID NO: 127. Приклад 9. РозробкаWr-9mut. Фрагмент нуклеїнової кислоти збільшили способом ПЦР із FR8a/pCR2.1 (Приклад 2) за допомогою праймерів 5TR8a-12aa (SEQ ID NO: 94) і С13А-2 (SEQ ID NO: 92), а також Суміші 1 і температурного Профілю 2. Отриманий у результаті амплікон клонували в pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Потім фрагмент BamHI/PpuMI лігірували до фрагмента PpuMI/BamHI послідовності FR8a (SEQ ID NO: 3) для створення послідовності Wr-9mut (SEQ ID NO: 13), що кодує білок WR-9mut (SEQ ID NO: 14), у якому від N-кінця до С-кінця розташовуються пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 128) і амінокислоти 10-598 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70). Таким чином, білок WR-9mut являє собою Сrу3А055 з N-кінцевим пептидильным фрагментом по винаходу. Білок WR-9mut не має активність проти західного кукурудзяного кореневого жука. Отже, додавання N-кінцевого пептидильного фрагмента до негібридного модифікованого білка Сrу3а знищило інсектицидну активність. Із цього можна зробити 55 висновок, що, можливий деякий взаємозв'язок між С-кінцевою частиною Сrу1Ab гібридного білка FR8a й N-кінцевим пептидильным фрагментом, що надає інсектицидну активність білку FR8a. Приклад 10. Розробка FRD3. 3' кінець цієї послідовності, що кодує, створили шляхом збільшення способом ПЦР фрагмента із плазміди, що містить FR8 a (SEQ ID NO: 3), із застосуванням праймерів С2-3 А-3 (SEQ ID NO: 95) і 3'1Ab-dm3 (SEQ ID NO: 96), a також Суміші 2 і температурний цикли Профілі 2. Отриманий у результаті амплікон клонували в pCR2.1-TOPO (Invitrogen). Фрагмент Apal/SacI клонованого амплікона розміром 364 п. о., позначений 3'FRD3/pCR2.1, лігірували із фрагментом Sacl/Apal послідовності FR8a для створення FRD3 (SEQ ID NO: 15), що кодує химерний білок FRD3 (SEQ ID NO: 16). У цьому химерному білці FRD3 від N-кінця до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), амінокислоти 10-468 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), що містить варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-610 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6. Таким чином, химерний інсектицидний білок FRD3 являє собою варіант химерного інсектицидного білка FR8a, у якого вилучена ділянка з 38 амінокислот, що представляє собою протоксинну хвіст Сrу1Ab. СГІБ FRD3 показав такий же рівень активності проти західного кукурудзяного кореневого жука, як й в FR8a (См. Таблицю 5), це дає основи припускати, що хвостовий протоксинну ділянка з 38 амінокислот білка FR8a не є необхідним для повної інсектицидної активності. Приклад 11. Розробка FR-12-cg-dm3 Фрагмент SacI/PpuMI розміром 3082 п. о. із плазміди, що містить FR8a-12 (См. Приклад 8), фрагмент PpuMI/MluI розміром 721 п. о. від послідовності FRCG (См. Приклад 5) і фрагмент MluI/SacI розміром 923 п. о. від послідовності FRD3 (См. Приклад 10) скомбінували для створення послідовності, що кодує, FR-12-cg-dm3 (SEQ ID NO: 17), що кодує химерний білок FR-12-cg-dm3 (SEQ ID NO: 18). У цьому химерному білці FR-12cg-dm3 від N-кінця до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 129), амінокислоти 10-467 білка Сrу3Аа (SEQ ID NO: 70), що містить повну варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-610 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6. Таким чином, химерний білок FR-12-cg-dm3 являє собою варіант 96187 56 FR8a, у якого вилучені 12 N-кінцевих амінокислот пептидильного фрагмента, сайт пізнавання Протеази катепсин G, а також 38 амінокислот протоксинової хвостової ділянки Cry1Ab. Цей сГІБ FR-12-cg-dm3 не настільки активний проти західного кукурудзяного кореневого жука, як FR8a (См. Таблицю 5), із чого можна зробити висновок, що для повної інсектицидної активності потрібно деяка взаємодія між С-кінцевою частиною FR8a й N-кінцевим пептидильным фрагментом. Приклад 12. Розробка 9F-cg-del6 5'кінець цієї послідовності, що кодує, одержали шляхом збільшення способом ПЦР фрагмента із плазміди, що містить FR-9 F-catg (См. Приклад 7), із застосуванням праймерів 5'FR-del6 (SEQ ID NO: 97) і С1-3А-2 (SEQ ID NO: 92), a також Суміші 3 і температурний цикли Профілі 3. Отриманий у результаті амплікон клонували в pCR2.1-TOPO. Потім фрагмент BamHI/PpuMI розміром 215 п. о. лігірували із фрагментом PpuMI/BamHI розміром 4668 п. о. від послідовності FR-9F-catg для створення FR-9F-cg-del6 (SEQ ID NO: 19), що кодує химерний білок FR-9F-cg-del6 (SEQ ID NO: 20). У цьому химерному білці FR-9F-cg-del6 від N-кінця до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MCAGIRP (SEQ ID NO: 130), амінокислоти 1-467 білка Cry3А (SEQ ID NO: 68), що містить варіабельні ділянки 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й Nкінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-648 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6, а також 38 амінокислот протоксинової хвостової ділянки Сrу1Ab. Таким чином, химерний білок FR9F-cg-del6 являє собою варіант FR8a-9F-catg, у якого вилучені амінокислоти 2-7 пептидильного фрагмента. Цей FR-9F-cg-del6 не має активність проти західного кукурудзяного кореневого жука, із чого можна зробити висновок, що для активності проти західного кукурудзяного кореневого жука Nкінцевому пептидильному фрагменту потрібні, щонайменше, 7 амінокислот з 9 С-кінцевих амінокислот послідовності SEQ ID NO: 127. Приклад 13. Розробка FR-cg-dm3 Фрагмент MluI/SacI розміром 3839 п. о. від FRCG (Приклад 5) і фрагмент MluI/SacI розміром 923 п. о. від FRD3 (Приклад 10) лігірували для створення FR-cg-dm3 (SEQ ID NO: 21), що кодує білок FR-cg-dm3 (SEQ ID NO: 22). У цьому химерному інсектицидному білку FR-cg-dm3 від N-кінця до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), амінокислоти 10-467 білка Сrу3А (SEQ ID NO: 68), що містить варіабельні ділянки 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-610 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 57 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6. Однаковий рівень активності в сГІБа FRD3 й в FR8a проти західного кукурудзяного кореневого жука (См. Таблицю 5) підтверджує, що сайт катепсина G і протоксинна хвостова ділянка білка FR8a не потрібні для повної інсектицидної активності проти західного кукурудзяного кореневого жука. Приклад 14. Розробка 9F-cg-dm3. Фрагмент MluI/SacI плазміди, що містить FR9F-cg (См. Приклад 7) лігірували із фрагментом MluI/SacI розміром 923 п. о. із плазміди, що містить FRD3 (См. Приклад 10) для створення 9F-cg-dm3 (SEQ ID NO: 23), що кодує химерний білок 9F-cgdm3 (SEQ ID NO: 24). У цьому химерному білці 9Fcg-dm3 від N-конца до С-кінця розташовані: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRP (SEQ ID NO: 129), амінокислоти 1-467 білка Сrу3А (SEQ ID NO: 68), що містить варіабельні ділянки 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2, консервативний блок 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, а також амінокислоти 477-610 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 24 амінокислоти консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5, консервативний блок 5 і варіабельну ділянку 6. Рівень активності сГІБа 9F-cg-dm3 проти західного кукурудзяного кореневого жука виявився таким же (См.Таблицю 5), це підтверджує, що Скінцеві 9 амінокислот пептидильного фрагмента можуть надавати активність у тому випадку, якщо домен сГІБа складається або з варіабельних ділянок і консервативних блоків модифікованого Сrу3А (Cry3А055), або з варіабельних ділянок і консервативних блоків Сrу3А. Приклад 15. Розробка В8а. Фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує Nкінцеву частину білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить cry3A055 (SEQ ID NO: 69), із застосуванням праймерів 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) і С3-3А-8 (SEQ ID NO: 99), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує С-кінцеву частину білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить варіабельні ділянки 4-6 збільшили із плазміди, що містить mocry1Ab (SEQ ID NO: 71), із застосуванням праймерів С3-3А-7 (SEQ ID NO: 100) і 1Аb-6-sac (SEQ ID NO: 86), a також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Отриманий у результаті амплікон позначили 2OL-8b. Фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує Nкінцеву частину білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить cry3A055 (SEQ ID NO: 69), із застосуванням праймерів 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) і С2-3А-4 (SEQ ID NO: 88), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує Скінцеву частину білка Сrу1Ba (SEQ ID NO: 74) збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить mocry1Ba (SEQ ID NO: 73), із застосуванням прай 96187 58 мерів 1В-5 (SEQ ID NO: 101) і 1В-10 (SEQ ID NO: 102), a також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1, з тією відмінністю, що застосовувалася температура віджигу 60°С. Потім два описаних вище продукти ПЦР використали як шаблони в розширеної ПЦР реакції із праймерами 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) і 1B-10 (SEQ ID NO: 102) і із застосуванням Суміші 1 і температурного циклу Профілю 2. Отриманий у результаті амплікон позначили В10. Далі фрагмент нуклеїнової кислоти cry3A055 (SEQ ID NO: 69) збільшили способом ПЦР, використовуючи 2OL-8b (див вище) як шаблон, із праймерами 5'3А-1-bam (SEQ ID NO: 83) і 3А-22 (SEQ ID NO: 103) при наступних умовах ПЦР: Суміш 1, профіль температурного циклу: 94°С - 45 секунд, градієнт 50°С-70°С - 45 секунд, 72°С-90 секунд, 30 циклів. Фрагмент інший нуклеїнової кислоти збільшили способом ПЦР, використовуючи як шаблон В10 (див. вище), праймери 1В-7 (SEQ ID NO: 104) і 1B-10 (SEQ ID NO: 102), із застосуванням Суміші 1 реакції ПЦР і температурного циклу Профілю 2, з тією відмінністю, що застосовували температуру віджигу 60°С. Отримані в результаті ПЦР два продукти потім використали як шаблони в розширеній реакції ПЦР із праймерами 5'3А-1-bаm (SEQ ID NO: 83) і 1В-10 (SEQ ID NO: 102), з використанням наступних умов ПЦР: Суміш 2, профіль температурного циклу: 94°С -30 секунд, градієнт 40°С-60°С- 30 секунд, 72°С - 60 секунд, 30 циклів. Отриманий у результаті ПЦР продукт лігірували до вектора pCR2.1-TOPO (Invitrogen) і позначили B10/pCR2.1. Фрагмент BamHi-SacI з B8a/pCR2.1 потім лігірували до рЕТ21а (Novagen), що був розрізаний за допомогою BamHi/SacI, для створення послідовності, що кодує, В8a (SEQ ID NO: 25), що кодує гібридний білок В8а (SEQ ID NO: 26). Цей гібридний білок В8а містить від N-кінця до С-кінця амінокислоти 1-468 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), а також амінокислоти 505-656 білка Сrу1Ba (SEQ ID NO: 74). Приклад 16. Розробка 5*В8а. Фрагмент BamHI-Xbal із плазміди, що містить 2OL-8a (См. Приклад 3) і фрагмент Xbal-SacI із плазміди утримуючої В8а (См. Приклад 15) лігірували для створення 5*В8а (SEQ ID NO: 27), що кодує химерний білок 5*В8а (SEQ ID NO: 28). У цьому білку 5*В8а від N-кінця до С-кінця розташовуються: пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), амінокислоти 10-467 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70) і амінокислоти 505-656 білка Сrу1Ba (SEQ ID NO: 74). Таким чином, химерний білок 5*В8а являє собою гібридний білок В8а, до якого додали N-кінцевий пептидильний фрагмент. Приклад 17. Розробка V3А. Цей ген збільшили способом ПЦР, використовуючи 3 фрагменти разом як шаблони: перший шаблон збільшили із плазміди, що містить cry3A055 (SEQ ID NO: 69) із застосуванням праймерів 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) і С2-3А-4 (SEQ ID NO: 88), a також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1; другий фрагмент збільшили із пла 59 зміди, що містить mocry1Ab (SEQ ID NO: 71), із застосуванням праймерів С2-3А-3 (SEQ ID NO: 95) і C3-1Ab-2 (SEQ ID NO: 105), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1; а третій фрагмент збільшили із плазміди, що містить cry3A055 (SEQ ID NO: 69), із застосуванням праймерів С33А-5 (SEQ ID NO: 106) і 3А-12-sac (SEQ ID NO: 107), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Ці три продукти ПЦР потім використали як шаблони в розширеної ПЦР реакції із праймерами 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) і 3А-12-sac (SEQ ID NO: 107), а також із застосуванням Суміші 1 і Профілю 1 для одержання послідовності, що кодує, v3A (SEQ ID NO: 29), що кодує гібридний білок V3A (SEQ ID NO: 30). У гібридному білку V3A від N-кінця до С-кінця розташовані: амінокислоти 1-226 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), що містить варіабельну ділянку 1, консервативний блок 1, варіабельну ділянку 2 й N-кінцеві 34 амінокислоти консервативного блоку 2, амінокислоти 237-474 білка Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), що містить С-кінцеві 33 амінокислоти консервативного блоку 2, варіабельну ділянку 3 й N-кінцеві 20 амінокислот консервативного блоку 3, а також амінокислоти 467-598 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), що містить Скінцеві 28 амінокислот консервативного блоку 3, варіабельну ділянку 4, консервативний блок 4, варіабельну ділянку 5 і консервативний блок 5. У сГІБі V3A містяться дві позиції схрещування. Перше схрещування між Сrу3А055 й Cry1Ab, розташовано в консервативному блоці 2, а друге схрещування між Сrу1Ab й Сrу3А055 розташовано в консервативному блоці 3. Таким чином, V3A є варіантом Сrу3А055, у якому весь варіабельну ділянку 3 замінили варіабельною ділянкою 3 білки Сrу1Ab. Цей сГІБ V3A виявився не настільки активним проти західного кукурудзяного кореневого жука, як FR8a, на основі чого можна припустити, що наявність послідовності Сrу1Ab у консервативному блоці 3, варіабельній ділянці 4, консервативному блоці 4, варіабельній ділянці 5, консервативному блоці 5 та/або варіабельній ділянці 6 є важливим для повної інсектицидної активності білка FR8a. Кодуюча послідовність, v5A лігірували до вектора pCR2.1-TOPO, а потім субклонували в рЕТ21а за допомогою фрагмента BamHI/SacI. Білок V3A, експресований вектором рЕТ21а, має мітку Т7 на N-кінці. Цей білок позначили Т7-V3A. Приклад 18. Розробка V4F. Перший фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує ділянки 1-3 білка Сrу3А055 збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить cry3A055 (SEQ ID NO: 69), із застосуванням праймерів 5'3А-1-bam (SEQ ID NO: 83) і С3-3А-6 (SEQ ID NO: 84), a також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Другий фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельну ділянку 4 білки Сrу1Ab, ПЦР збільшили із плазміди, що містить mocry1Ab (SEQ ID NO: 71), із застосуванням праймерів С3-1Аb-3 (SEQ ID NO: 85) і С4-3А-10 (SEQ ID NO: 108) a також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Третій фрагмент нуклеїнової кислоти, що кодує варіабельні ділянки 5-6 білка Сrу3А055 збільшили способом ПЦР із плазміди, що містить 96187 60 Сrу3А055 (SEQ ID NO: 69), із застосуванням праймерів С4-3А-9 (SEQ ID NO: 109) і 3А-12-sac (SEQ ID NO: 107), а також Суміші 1 і температурного циклу Профілю 1. Всі три амплікона ПЦР скомбінували й використали як шаблон у розширеної ПЦР із праймерами 5'3A-1-bam (SEQ ID NO: 83) і 3А-12-sac (SEQ ID NO: 107) із застосуванням наступних умов ПЦР: Суміш 1 і профіль термоциклу: 94°С - 30 секунд, градієнт 50°С-70°С- 30 seconds, 72°С - 30 секунд, 20 циклів. Отриманий у результаті амплікон v4F послідовність (SEQ ID NO: 31), що кодує гібридний токсин V4F (SEQ ID NO: 32), клонували у вектор pCR2.1-TOPO і позначили v4F/pCR2.1. Гібридний белок v4F містить від N-кінця до С-кінця амінокислоти 1-468 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), амінокислоти 477-520, що становлять варіабельну ділянку 4 білки Сrу1Ab (SEQ ID NO: 72), а також амінокислоти 512-598 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70). Білок V4F має дві позиції схрещування. Перша позиція кросинговеру між Сrу3А055 й Сrу1Ab перебуває в консервативному блоці 3, а друге схрещування між Сrу1Ab й Сrу3А055 - у консервативному блоці 4. Отже, білок V4F є варіантом Сrу3А055, у якому весь варіабельну ділянку 4 замінений варіабельною ділянкою 4 білки Сrу1Ab. Гібридний білок V4F не активний проти західного кукурудзяного кореневого жука, це дає основу припускати, що послідовність із Сrу1Ab в Скінцевій частині FR8a вносить вклад в інсектицидну активність FR8a. Фрагмент BamHI-SacI з v4F/pCR2.1 субклонировали в рЕТ21. Білок, експресований результуючої плазмидой, позначили T7-V4F. Приклад 19. Розробка 5*V4F. Фрагмент BamHI-Xbal із плазміди, що містить FR8a (См. Приклад 4) і фрагмент Xbal-SacI H34F/pCR2.1 (См. Приклад 18) лігірували до рЕТ21, розрізаному за допомогою BamHI-SacI, у результаті одержали 5*V4F/pET21. Кодуюча послідовність, 5*V4 F (SEQ ID NO: 33) кодує химерний білок 5*V4F (SEQ ID NO: 34). Цей химерний інсектицидний білок 5*V4F містить від N-кінця до Скінця пептидильний фрагмент, що містить послідовність амінокислот MTSNGRQCAGIRPYDGRQQHRG (SEQ ID NO: 127), амінокислоти 10-491 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70), амінокислоти 501-520, що становлять варіабельну ділянку 4 білки Cry1Ab (SEQ ID NO: 72), а також амінокислоти 512-598 білка Сrу3А055 (SEQ ID NO: 70). СГІБ 5*V4F являє собою гібридний білок V4F з доданим N-кінцевим пептидильным фрагментом (SEQ ID NO: 127). Активністю проти західного кукурудзяного жука сГІБ 5*V4F володіє, хоча й не на тім же рівні, що FR8a. Отже, N-кінцева частина додала інсектицидну активність білку V4F, підтверджуючи, що можливо наявність внесок, що вносить, взаємодії між С-кінцевою частиною й Nкінцевим пептидильным фрагментом FR8a. Білок, експресований плазмідою 5*V4F/pET21, позначається T7-5*V4F і має мітку Т7 N-кінцеву для пептидильного фрагмента 5*V4F.

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Hybrid insecticidal proteins having activity against western corn rootworm or european corn borer

Автори англійською

Hart, Hope, Chen, Jeng S., Stacy, Cheryl, Walters, Frederick

Назва патенту російською

Гибридные инсектицидные белки, которые имеют активность против западного кукурузного корневого жука или европейского кукурузного мотылька

Автори російською

Харт Хоуп, Чэнь Жэн С., Стэйси Чэрил, Вальтэрс Фрэдэрик

МПК / Мітки

МПК: C12N 15/82, A01H 5/00, C07K 14/325

Мітки: інсектицидні, активність, жука, кореневого, західного, білки, метелика, гібридні, європейського, мають, кукурудзяного

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/247-96187-gibridni-insekticidni-bilki-shho-mayut-aktivnist-proti-zakhidnogo-kukurudzyanogo-korenevogo-zhuka-abo-ehvropejjskogo-kukurudzyanogo-metelika.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Гібридні інсектицидні білки, що мають активність проти західного кукурудзяного кореневого жука або європейського кукурудзяного метелика</a>

Подібні патенти