Спосіб отримання молочного продукту з використанням n-зв’язаної глікозидази

Номер патенту: 112303

Опубліковано: 25.08.2016

Автори: Квіст Карстен Бруун, Якобсен Йонас, Вінд Сандра Люкке

Є ще 14 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Спосіб отримання молочного продукту, що включає:

a) отримання молочного субстрату,

b) обробку молочного субстрату ферментом з N-зв'язаною глікозидазною активністю, і

c) ферментацію молочного субстрату мікроорганізмом, таким як молочнокислі бактерії.

2. Спосіб за п. 1, в якому стадію b) проводять перед або під час стадії с).

3. Спосіб за п. 1 або 2, в якому мікроорганізм належить до видів, вибираних з групи, що складається з: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii підвид Bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis підвид cremoris, Leuconostoc mesnteroides підвид cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides підвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis підвид lactis біоваріант diacetylactis, Lactobacillus casei підвид Casei, Lactobacillus paracasei підвид Paracasei, Bifidobacterium bifidum, і Bifidobacterium longum.

4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, в якому N-зв'язана глікозидаза являє собою глікозидазу, вибирану з групи, що складається з: пептид-N(4)-(N-ацетил-бета-глюкозаміл)аспарагінамідази (ЕС номер 3.5.1.52); альтернативні назви: N-глюкозидази-F або PNGaзи-F і ендо-b-N-ацетилглюкозамідази Н (EC номер 3.2.1.96; альтернативна назва ENDO-H).

5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, в якому молочний субстрат вибирають з групи, що складається з молока тварини і молока рослинного походження.

6. Спосіб за п. 5, в якому молоко тварин являє собою молоко від корови, вівці, кози, буйволиці або верблюдиці.

7. Спосіб за п. 5, в якому молоко рослинного походження являє собою соєве молоко, вівсяне молоко, рисове молоко, мигдалеве молоко.

8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, в якому молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт.

9. Спосіб за п. 8, в якому ферментований молочний продукт являє собою щонайменше один продукт, вибираний з групи, що складається з: йогурту, йогурту на альтернативній культурі, пахти, ацидофільного молока, кефіру, кумису і домашнього сиру.

10. Молочний продукт, що містить молочний субстрат, оброблений ферментом з N-зв'язаною глікозидазною активністю і ферментований молочнокислими бактеріями.

11. Молочний продукт за п. 10, який являє собою йогурт.

12. Застосування N-зв'язаної глікозидази в способі отримання молочного продукту за будь-яким з пп. 1-9.

Текст

Дивитися

Реферат: Винахід стосується способу отримання молочного продукту, що включає a) отримання молочного субстрату, b) обробку молочного субстрату ферментом з N-зв'язаною глікозидазною активністю, і c) ферментацію молочного субстрату мікроорганізмом, таким як молочнокислі бактерії. Винахід стосується також застосування N-зв'язаної глікозидази при виготовленні молочного продукту і молочного продукту, одержаному за вказаним способом. UA 112303 C2 (12) UA 112303 C2 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 ГАЛУЗЬ ТЕХНІКИ Даний винахід стосується способу отримання молочного продукту (наприклад, йогурту), що включає додавання ефективної кількості N-зв'язаної глікозидази і/або О-зв'язаної глікозидази в молоко. РІВЕНЬ ТЕХНІКИ З рівня техніки добре відомі молочні продукти, такі як, наприклад, ферментовані молочні продукти (наприклад, йогурт). Як відомо з рівня техніки, важливими властивостями для відповідних молочних продуктів є в'язкість і густина гелю. Загалом кажучи, якщо можна отримати більшу в'язкість і/або густину гелю при використанні тієї ж самої молочної композиції, можна отримати ту ж в'язкість і/або густину гелю при використанні меншої кількості сухих речовин молока (або інших), це дозволить зекономити сировинний матеріал (або отримати більший вихід). Для ферментованих молочних продуктів з низьким вмістом жиру, таких як, наприклад, йогурт з низьким вмістом жиру, може бути важко отримати оптимальну переважну текстуру продуктів, точніше проблема може полягати, наприклад, в отриманні в таких продуктах з низьким вмістом жиру текстури з досить високою в'язкістю. Стандартною процедурою для поліпшення текстури йогуртів з низьким вмістом жиру вважається додавання білка, як правило, сухого знежиреного молока або сироваткових білків. Однак таке рішення може бути дорогим і не повністю відповідає концепції низькокалорійних продуктів, оскільки доданий білок вносить свій внесок в загальну енергетичну цінність. Для поліпшення текстури в US2005/0095316A1, абзац [0005] пропонується додавання так званих текстуруючих агентів (загусники, желюючі агенти), таких як крохмаль, пектин або желатин. Однак відомо, наприклад, що додатковий пектин або желатин в йогуртовому продукті може бути не переважним. У останні роки так звані текстуруючі культури, що основуються на виробництві позаклітинних полісахаридів (EPS), дозволяють значно поліпшити в'язкість таких молочних продуктів з низьким вмістом жиру, наприклад, в документі WO2007/095958A1 (Chr. Hansen А/S) описується, що штами Streptococcus thermophilus синтезують EPS, який дозволяє надавати заданої "тягучої" або в'язкої текстури ферментованим молочним продуктам. Відповідно, можна сказати, що, наприклад, для йогурту з низьким вмістом жиру проблема в'язкості текстури на сьогоднішній день дуже добре вирішується використанням, наприклад, культур, продукуючих EPC. Однак, як указано в статті A.N. Hassan et al. (J. Dairy Sci: 86: 16321638; 2003), так звана густина гелю може значно знижуватися при використанні таких культур, продукуючих EPS, в порівнянні з культурами, не продукуючими EPS. Відповідно, можна сказати, що на сьогоднішній день ситуація така, що, наприклад, для йогуртових продуктів з низьким вмістом жиру проблема в'язкості, що існувала раніше, по суті вирішена за рахунок використання культур, продукуючих EPS, однак використання культур, продукуючих EPS, може "створювати" нові проблеми, пов'язані зі зниженням густини гелю. У статті A.N. Hassan et al. в короткому викладі змісту вказується на зниження модулів в'язоеластичності, фахівцеві відомо, що модулі в'язкоеластичності є ознакою, що стосується густини гелю, в тому значенні, що якщо продукт має нижчий модуль в'язоеластичності, він буде мати нижчу густину гелю. На Фігурі 1, прикладеній до статті, показано, що зсувне напруження EPS йогуртів значно вище, фахівцеві зрозуміло, що це напряму вказує на вищу в'язкість. Як указано вище, для молочних продуктів загалом таких, як, наприклад, ферментовані молочні продукти (наприклад, йогурт) так звана густина гелю є дуже суттєвою властивістю. Наприклад, гель з низькою густиною може викликати небажані відчуття у роті при споживанні молочного продукту. Додатково, якщо, наприклад, йогурт має гель з низькою густиною, він буде дуже рідким і легко текучим, наприклад, на ложці або, наприклад, в чашці. Додатково, якщо, наприклад, йогурт має гель з низькою густиною, то він може бути схильним до синерезису (дивіться, нижче) через відділення сироватки. Як добре відомо з рівня техніки, для отримання сиру використовують ферменти, що згущують молоко, такі як протеаза - хімозин (що маєальтернативну назву ренін), який викликає коагуляцію і утворення згустку. Як добре відомо, отримання сиру включає три стадії або три етапи, які всі відбуваються в результаті додавання молокозсідного ферменту: 1) утворення згустку (або м'якого гелю), отвердження або ущільнення згустку, і подальше видалення сироватки, останній процес також називається синерезис. 1 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Як видно, наприклад, при отриманні йогурту відсутня зацікавленість в отриманні такого ефекту, як синерезис, тобто, розділення молока на згусток з сухих речовин і рідку сироватку. Відповідно, використання молокозсідних ферментів, таких як хімозин, як правило, не є переважним при отриманні, наприклад, йогурту. У US2005/0095317A1 (Danone) описується застосування протеази з каппа-казеїнолетичною активністю в процесі отримання ферментованих молочних продуктів, таких як йогурт. Протеаза може, наприклад, представляти хімозин, дивіться, наприклад, [0028] в заявці US. Протеази (наприклад, хімозин) гідролізують казеїн в молоці, отже, можна передбачити, що протеази ймовірно (наприклад, хімозин) можуть викликати при виробництві йогурту небажаний ефект синерезису. Однак в абзаці [0008] вказується, що дивно і несподівано було встановлено, що використання протеаз, таких як "поліпшення текстури і, зокрема, підвищення в'язкості йогуртів і ферментованого молока без індукування в результаті синерезису, який неприйнятний для ферментованих молочних продуктів". US2005/0095316A1 (Danone) по суті стосується тієї ж самої технології, що і приведена вище в US2005/0095317A1 (Danone), однак в цій заявці US відповідні протеази визначають, як бактеріальні протеази (хімозин отримують від корів, тобто, він не є бактеріальною протеазою). У US7560127B2 (DSM) описується застосування спеціальних деглікозилуючих ферментів в процесі отримання сиру. Деглікозилуючі ферменти визначають, як ферменти, які можуть деглікозилувати каппа-казеїн (K-казеїн), присутній в молоці. Як зазначено нижче, казеїн являє собою білок з так званим О-зв'язаним глікозилуванням. Отже, вказані в цьому патенті US деглікозилуючі ферменти представляють ферменти, які можуть деглікозилувати О-зв'язані глікозиловані білки, такі як каппа-казеїн (каппа-казеїн являє собою так званий О-зв'язаний глікопротеїн). Дивіться, в колонці 1, рядки в патенті US 51-58: "Несподівано було виявлено, що деглікозилування K-казеїну приводить до зсідання за рахунок цукру, пов'язаного з ним, що несе негативний заряд, який стабілізує міцели казеїну. Зсідання молока, таким чином, в результаті приводить до процесу, в якому більша частина Kказеїну зберігається в сирі, і може бути отриманий вищий вихід, ніж при використанні протеолітичної активності хімозину". Загалом можна сказати, що в патенті US7560127B2 по суті описується, що можна отримати при виробництві сиру необхідне зсідання з використанням вказаних споріднених О-зв'язаних деглікозилуючих ферментів замість хімозину. Оскільки цей патент US7560127B2 стосується отримання сиру і в пункті 1 формули винаходу указано, що він дозволяє отримати сир без використання протеази (такої як хімозин), фахівцеві в галузі техніки, до якої належить винахід, опосередковано зрозуміло, що застосування споріднених О-зв'язаних деглікозилуючих ферментів повинно приводити до значного синерезису. Потрібно зазначити, що US7560127B2 стосується виробництва сиру, де потрібен значний синерезис. Отже, фахівець в даній галузі не буде чекати, що його застосування буде стосуватися ферментованого молочного продукту, такого як йогурт, де синерезис, як правило, дуже небажаний. Додатково, в US7560127B2 відсутнє чітке вказування на відповідну властивість густини гелю, тобто, можна сказати, що вона явно вказує тільки на ефект зсідання/синерезису, пов'язаний з використанням замість хімозину вказаних О-зв'язаних деглікозилуючих ферментів. У статті E. Cases et al. (Journal of Food Science; Vol. 68, Nr. 8, 2003, Pages 2406-2410) описується деглікозилування хімічно підкисленого молока О-зв'язаним деглікозилуючим ферментом (нейрамінідаза; EC 3.2.1.18). Молоко хімічно підкислене хімічним GDL (дивіться, стор. 2407, частина "Acid milk coagulation"), відповідно, в статті E. Cases et al. не описується "ферментований молочний" продукт, інокульований відповідними мікроорганізмами (наприклад, йогурт). У статті E. Cases et al. описується, що застосування О-зв'язаного деглікозилуючого ферменту - нейрамінідази (EC 3.2.1.18) дає вищу кінцеву густину гелю ферментативно обробленому або хімічно підкисленому молоку. Потрібно зазначити, що в статті E. Cases et al. нічого не говориться про можливий ефект синерезису при використанні О-зв'язаного деглікозилуючого ферменту - нейрамінідази (EC 3.2.1.18). У статті E. Cases et al. не приводяться відповідні докази чистоти використовуваної нейрамінідази (EC 3.2.1.18) - препарату О-зв'язаного деглікозилуючого ферменту. У зв'язку з цим стверджується, що використовуваний ферментативний препарат може містити деякі відповідні ферменти з протеазною активністю, і що ці ферменти з протеазною активністю можуть бути відповідальні за описаний ефект густини гелю, як указано вище, в 2 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 US2005/0095317A1 (Danone) описується, що застосування протеази може поліпшувати густину гелю. Вагомість цієї підозри додатково посилюється тим фактом, що Clostridium perfringens мікроорганізм, продукуючий нейрамінідазу, зі статті E. Cases et al. (дивіться, частина Materials and Method) містить більше ніж 140 протеолітичних ферментів, дивіться, наприклад, авторитетну базу даних по пептидазі Merops (http://merops.sanger.ac.uk/cgibin/speccards?sp=sp000283;type=peptidase). При відсутності інформації про чистоту забезпеченого ферментного препарату, отже, представляється досить вірогідним, що він не був очищений для виключення всіх відповідних протеолітичних ферментів, які можуть впливати на густину гелю, описаного в статті E. Cases et al. article. Як відомо з рівня техніки, О-зв'язаний деглікозилуючий фермент - нейрамінідаза (EC 3.2.1.18) також може мати деяку N-зв'язану глікозидазну активність. Однак у вказаній вище статті E. Cases et al. вказується тільки О-зв'язана глікозидазна активність нейрамінідази (EC 3.2.1.18), коли відповідна ферментативна активність нейрамінідази описана в статті E. Cases et al. EP1489135A1 можна розглядати, як пов'язаний із застосуванням деглікозилованого олеуропеїну (отриманий з екстракту листя оливи) для підвищення густини гелю підкисленої молочної сироватки і йогурту. Бета-глікозидаза (бета-1,6-глюкозидаза) і лактаза в цьому документи вказуються, як такі, що "просто" використовуються для деглікозилування олеуропеїну, тобто, вказані ферменти не є активними компонентами для підвищення густини гелю молока/йогурту. Олеуропеїн не являє собою білок/пептид з ферментативною активністю. Спосіб за винаходом переважно не включає додавання активованого екстракту листя оливи (або інших екстрактів), як описано в EP1489135A1, в субстрат молока тварин. КОРОТКИЙ ОПИС Розв'язання проблеми даним винаходом полягає в забезпеченні нового способу поліпшення/підвищення густини гелю відповідного молочного продукту, наприклад, ферментованого молочного продукту, такого як йогурт, зокрема, ферментованого молочного продукту з низьким вмістом жиру, такого як йогурт з низьким вмістом жиру. Додатково, переважно новий спосіб не впливає негативним чином на в'язкість продукту. Рішення основується на тому, що автори даного винаходу встановили, що використання деглікозилуючого ферменту (тобто, глікозидази) дозволяє отримати молочний продукт (наприклад, йогурт) зі значно підвищеною/поліпшеною густиною гелю. Додатково, автори даного винаходу встановили, що застосування відповідних глікозидаз може бути здійснене способом, при якому не виникає вказаного вище значного ефекту синерезису, відсутність значного ефекту синерезису є великою перевагою, наприклад, відносно отримання ферментованого молочного продукту, такого як йогурт. Зокрема, відносно застосування О-зв'язаної глікозидази авторами даного винаходу несподівано було виявлено, що вона може бути застосована без значного ефекту синерезису. Також автори даного винаходу встановили, що застосування деглікозилуючого ферменту не впливає негативним чином на в'язкість продукту. У робочому Прикладі 4 за винаходом показано, що застосування глікозидази PNGаза-F дозволяє отримати йогурт з низьким вмістом жиру зі значно підвищеною/поліпшеною густиною гелю без здійснення якого-небудь негативного впливу на в'язкість йогурту з низьким вмістом жиру. Як указано в робочому Прикладі 1 за винаходом, ферментні препарати глікозидази, що використовуються в робочих Прикладах за винаходом, були піддані аналізу, і в них не було виявлено контамінанти, тобто, вони не містили контамінанти, такі як ферменти з протеазною активністю. Потрібно зазначити, що PNGаза-F являє собою глікозидазу, яка працює на "Nзв'язаних гліканах", тобто деглікозилує N-зв'язані глікопротеїни. Як указано вище, казеїн являє собою глікопротеїн, що містить О-зв'язані глікани, і, отже, PNGаза-F не може як така деглікозилувати казеїн, відповідно, причина, по якій PNGаза-F дозволяє отримати за винаходом хорошу густину гелю не є результатом, що по суті стосується механізму деглікозилування казеїну, як, наприклад, описано в US7560127B2 (дивіться, вище). Коротше, і не бажаючи бути обмеженими якою-небудь теорією, той факт, що автори даного винаходу продемонстрували, що N-зв'язана глікозидаза, така як PNGаза-F, працює в контексті даного винаходу (тобто, дозволяє отримати гель з поліпшеною густиною), ілюструє, що основний механізм, що стоїть за отриманням в даній заявці відповідного гелю з поліпшеною густиною, повністю відрізняється від "глікозилування казеїну" - базового механізму, запропонованого в US7560127B2 відносно застосування О-зв'язаних глікозидаз як замінник хімозину при отриманні сиру (дивіться, вище). 3 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Іншими словами, можна сказати, що той факт, що N-зв'язана глікозидаза, така як PNGаза-F, працює в контексті даного винаходу (тобто, дозволяє отримати гель з поліпшеною густиною), є дуже великою несподіванкою для фахівця в даній галузі в зв'язку з попереднім рівнем техніки, як описано, наприклад, в US7560127B2. Не бажаючи бути обмеженими якою-небудь теорією, автори даного винаходу вважають за можливе поясненням того, що застосування глікозидази як такої дозволяє отримати в даній заявці відповідний гель з поліпшеною густиною, видалення глікозидазою гліканів з відповідних не казеїнових білків сироватки. Наприклад, N-зв'язана глікозидаза, така як PNGаза-F, може видаляти N-глікани з деяких з сироваткових глікопротеїнів, таких як -лактальбумін, який, як відомо, N-глікозилований. Сироваткові білки також в деякій мірі беруть участь в утворенні білкової сітки, що дозволяє підвищити властивість міцності гелю. Видалення гідрофільних гліканів і зміна заряду, викликана реакцією деамінування, може сприяти утворенню більш ригідної білкової сітки і, отже, дозволяє отримати гель з поліпшеною густиною. Не бажаючи бути обмеженими якою-небудь теорією, автори даного винаходу вважають, що деякі відповідні сироваткові глікопротеїни також включають О-зв'язані глікани. Відповідно, автори даного винаходу провели тестування на предмет того, чи дозволяє О-зв'язана глікозидаза також в даному винаході отримати відповідний гель з поліпшеною густиною. У робочому Приклад 5 за винаходом показано, що застосування О-зв'язаної глікозидази, такої як GalNAC, також дозволяє отримати в даному винаході відповідний гель з поліпшеною густиною. З теоретичної точки зору можна передбачити, що відповідна перевага застосування N-зв'язаної глікозидази, такої як PNGаза-F, дозволяє обмежити (або ні) небажаний ефект синерезису, наприклад, відносно отримання йогуртового продукту. Однією з причин для такої теоретичної точки зору є те, що N-зв'язана глікозидаза, така як PNGаза-F, не працює на казеїні і, як описано, наприклад, в US7560127B2, дозволяє отримати необхідне зсідання (синерезис) при отриманні сиру при використанні вказаних вище споріднених О-зв'язаних деглікозилуючих ферментів (для деглікозилування казеїну) замість хімозину. У робочому Прикладі 4 за винаходом показано, що N-зв'язана глікозидаза - PNGаза-F дозволяє уникнути в даному винаході небажаного ефекту синерезису відносно отримання йогурту. Автори даного винаходу провели тестування небажаного ефекту синерезису відносно, наприклад, отримання йогурту для О-зв'язаної глікозидази, такої як GalNAC. Як показано в робочому Прикладі 6 за винаходом, можна говорити про те, що автори даного винаходу несподівано встановили відсутність небажаного ефекту синерезису відносно отримання йогурту при використанні О-зв'язаної глікозидази - GalNAC для отримання йогурту. У робочому Прикладі 4 за винаходом показано, що застосування глікозидази (тут PNGаза-F) дозволяє отримати в даному винаході відповідний гель з поліпшеною густиною в обох випадках, і у випадку молочнокислих бактерій (LAB), і у випадку хімічно підкисленого молока. Не бажаючи бути обмеженими якою-небудь теорією, автори даного винаходу передбачають, що вплив глікозидази на густину гелю є фізичним впливом (тобто, деглікозилування сироваткових білків, як указано вище) - а не біологічний вплив (тобто, вплив, при якому глікозидаза по суті тільки впливає негативним чином іноді відносно функціональності LAB, як такої). У робочих Прикладах, приведених вище, використовували молоко, що вже пройшло теплову обробку, тобто глікозидазний фермент додають в молоко після відповідної теплової обробки. Не бажаючи бути обмеженими якою-небудь теорією, автори даного винаходу вважають, що глікозидаза, наприклад, PNGаза-F, повинна також працювати (тобто, отримати відповідне поліпшення густини гелю) при додаванні в сире молоко (тобто, в молоко, що не пройшло теплову обробку) з подальшим проведенням відповідної теплової обробки. Відповідно, в першому аспекті даний винахід стосується способу отримання молочного продукту, що включає наступні стадії: (i): додавання N-зв'язаної глікозидази і/або О-зв'язаної глікозидази в молочний субстрат; і (ii) якщо потрібно, підкислення (наприклад, ферментування) молочного субстрату, і/або якщо потрібно, проведення адекватної стадії (стадій) для отримання молочного продукту, причому адекватну стадію (стадії) проводять в умовах, при яких ефективна кількість глікозидази надає молочному продукту - в результаті її присутності - підвищеної густини гелю. Молочний субстрат може бути вибраний з групи, що складається з молока тварин (таких як корови, вівці, вівцематки (ewes), кози, буйволиці або верблюдиці) і молока рослинного походження (таке як соєве молоко, вівсяне молоко, рисове молоко, мигдалеве молоко). 4 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Варіант виконання по першому аспекту даного винаходу стосується способу отримання молочного продукту, що включає наступні стадії: (i): додавання ефективної кількості N-зв'язаної глікозидази і/або О-зв'язаної глікозидази в молочний субстрат; і (ii): проведення адекватної стадії (стадій) для отримання молочного продукту, де адекватну стадію (стадії) проводять в умовах, при яких ефективна кількість глікозидази надає молочному продукту - в результаті її присутності - підвищеної густини гелю; при умові, що глікозидаза являє собою тільки О-зв'язану глікозидазу (таку як галактозидаза, N-ацетил-галактозамідаза [GalNAC] і нейрамінідаза), здатну проводити деглікозилування K-казину, присутнього в молоці, тоді молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт, інокульований відповідними мікроорганізмами (ферментований молочний продукт не є сирним продуктом зі значним видаленням молочної сироватки). Використовуваний в описі даної заявки термін "ефективна кількість глікозидази, що дозволяє отримати в результаті її присутності гель з підвищеною густиною в молочному продукті" стадії (ii) першого аспекту може бути як альтернатива визначений терміном "ефективна кількість глікозидази, що дозволяє отримати в результаті її присутності гель з поліпшеною густиною в молочному продукті". Використовуваний в описі даної заявки термін "проведення адекватної стадії (стадій) для отримання молочного продукту" стадії (ii) потрібно розуміти, як відповідні адекватні стадії для отримання молочного продукту, який цікавить (наприклад, йогурту). Очевидно, що фахівець в даній галузі чудово обізнаний, що така адекватна стадія(ї), яка, наприклад, при отриманні йогурту включає інокуляцію відповідними культурами кисломолочних бактерій (LAB). Для фахівця в даній галузі рутинною є робота по вимірюванню густини гелю молочного продукту, який цікавить (наприклад, йогурту). У робочому Прикладі 2 за винаходом забезпечений відповідний стандартний метод вимірювання густини гелю молочного продукту, який цікавить, переважно в даному винаході відповідна густина гелю вимірюється згідно з методом, описаним в цьому Прикладі 2. У статті A.N. Hassan et al. (J. Dairy Sci: 86: 1632-1638; 2003), вказаній вище, також описується відповідний стандартний метод вимірювання густини гелю. Дивіться, наприклад, розділ статті матеріали і методи, де визначають модуль еластичності і модуль в'язоеластичності, як можна бачити в Прикладі 2 за винаходом, параметри модуля еластичності і модуля в'язоеластичності використовують для визначення густини гелю, з якої можна, якщо потрібно, отримати так званий комплексний модуль, як описано в Прикладі 2 за винаходом. Оскільки фахівець в даній галузі може легко виміряти густину гелю молочного продукту, який цікавить, то для фахівця в даній галузі також легко визначити вимоги до стадії (ii) способу по першому аспекту за винаходом, що стосується умови: "ефективна кількість глікозидази, що дозволяє отримати в результаті її присутності гель з поліпшеною густиною в молочному продукті". Для визначення цієї вимоги фахівець в даній галузі повинен просто провести "адекватну стадію (стадії) для отримання молочного продукту" стадії (ii) з або без присутності ефективної кількості глікозидази, і потім визначити в даному винаході відповідний вплив на густину відповідного гелю доданої кількості глікозидази. Якщо встановлюють поліпшену/підвищену густину гелю, тоді в молочний субстрат відповідно до стадії (i) першого аспекту додана ефективна кількість глікозидази, і адекватна стадія(і) стадії (ii) також була проведена в умовах, при яких ефективна кількість глікозидази дозволяє отримати в результаті її присутності гель з поліпшеною густиною в молочному продукті. Фахівцеві в даній галузі відомо, що різні методи вимірювання густини гелю можуть давати різні результати в абсолютних показниках. Однак відносно вимірювання поліпшеної густини гелю, як указано в даній заявці, по суті визначають відносне поліпшення густини гелю, тобто поліпшення з або без присутності ефективної кількості глікозидази. Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі метод вимірювання густини гелю, як, наприклад, описаний в робочому Прикладі 2 за винаходом і показаний статті A.N. Hassan et al. (з відносно малими погрішностями вимірювання), буде давати ті ж самі відносні результати, тобто незалежно від використовуваного специфічного методу вимірювання будуть виходити ті ж самі результати відносно відносного поліпшення густини гелю. Умова способу по першому аспекту 5 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 можуть виглядати, як заперечення відносно вказаного вище в US7560127B2 і вказаного в статті E. Cases et al (Journal of Food Science; Vol. 68, Nr. 8, 2003, сторінки 2406-2410). Як указано вище, в статті E. Cases et al. не описується "ферментований молочний" продукт, інокульований відповідними мікроорганізмами (наприклад, йогурт). Як указано вище, в US7560127B2 відсутня чітка вказівка на відповідну властивість густини гелю, тобто можна сказати, що вона явно вказує тільки на ефект зсідання/синерезису, пов'язаний з використанням замість хімозину вказаних О-зв'язаних деглікозилуючих ферментів. Однак можна стверджувати, що при додаванні в US7560127B2 вказаних О-зв'язаних деглікозилуючих ферментів в молочний субстрат в процесі отримання сирного молочного продукту, теоретично явно не була додана ефективна кількість глікозидази, що могло б дозволити отримати відповідний гель з поліпшеною густиною. Умова стосується ситуації, коли глікозидаза являє собою тільки О-зв'язану глікозидазу, в US7560127B2 не вказується яканебудь релеватність відносно застосування N-зв'язаної глікозидази за винаходом, відповідно, якщо ефективна кількість глікозидази (тобто, покриває одну або більше глікозидаз) додана на стадії (i) першого аспекту, може бути, наприклад, суміш N-зв'язаної глікозидази і О-зв'язана глікозидази, то це може не бути ситуацією, коли глікозидаза являє собою тільки О-зв'язану глікозидазу. У контексті даного винаходу фахівець в даній галузі може рутинно визначити, чи є молочний продукт сирним продуктом, як указано в US7560127B2, або іншим відповідним молочним продуктом, таким як, наприклад, ферментований молочний продукт, такий як йогурт. ВИЗНАЧЕННЯ Використовуваний в описі даної заявки термін "глікан" стосується полісахариду або олігосахариду. Глікани можуть представляти гомо- або гетерополімери моносахаридних залишків і можуть бути лінійними або розгалуженими. Глікан також може бути використаний для вказування вуглеводневої частини глікокон'югату, такої як глікопротеїн, гліколіпід або протеоглікан. Використовуваний в описі даної заявки термін "глікопротени" стосується білків, що містять ланцюжки олігосахаридів (гліканів), ковалентно з'єднаних з бічними ланцюгами поліпептиду. Вуглевод з'єднаний з білком в котрансляційній або посттрансляційній модифікації. Використовуваний в описі даної заявки термін "глікозидаза" (що також називається глікозидна гідролаза) стосується ферменту, каталізуючого гідроліз глікозидного зв'язку, глікозидний зв'язок являє собою тип ковалентного зв'язку, який з'єднує молекулу вуглеводу (цукор) з іншою групою, яка може бути або може не бути іншим вуглеводом. Глікозидаза, яка частково або повністю деглікозилує N-зв'язані глікани, може бути визначена в описі даної заявки, як N-зв'язана глікозидаза. Аналогічно, глікозидаза, яка частково або повністю деглікозилує О-зв'язані глікани, може бути визначена в описі даної заявки, як О-зв'язана глікозидаза. Використовуваний в описі даної заявки термін N-зв'язана глікозидаза є чітко визначеним терміном в попередньому рівні техніки, і фахівець в даній галузі знає, чи є специфічна глікозидаза N-зв'язаною глікозидазою, яка цікавить, чи ні. Аналогічно, використовуваний в описі даної заявки термін О-зв'язана глікозидаза є чітко визначеним терміном в попередньому рівні техніки, і фахівець в даній галузі знає, чи є специфічна глікозидаза О-зв'язаною глікозидазою, яка цікавить, чи ні. Також в описі даної заявки глікозидаза може бути визначена, як деглікозилуючий фермент. Використовуваний в описі даної заявки термін "глікозилування" стосується ферментативного процесу, в якому глікани приєднуються до білків, ліпідів або інших органічних молекул. Використовуваний в описі даної заявки термін "N-зв'язані глікани" стосується гліканів, приєднаних в нормі до азоту бічного ланцюга аспарагіну або аргініну. Використовуваний в описі даної заявки термін "О-зв'язані глікани" стосується гліканів, приєднаних в нормі до гідрокси, кисню бічного ланцюга серину, треоніну, тирозину, гідроксилізину або гідроксипроліну або кисню на ліпідах, таких як цераміди. Використовуваний в описі даної заявки термін "молочнокислі бактерії" стосується грампозитивних мікроаерофільних або анаеробних бактерій, які ферментують цукри з продукуванням кислот, включаючи молочну кислоту як основну продуковану кислоту, оцтову кислоту і пропіонову кислоту. Найбільш використовувані в промисловому виробництві бактерії належать до сімейства "Lactobacillales", що включає Lactococcus spp., Streptococcus spp., Lactobacillus spp., Leuconostoc spp., Pseudoleuconostoc spp., Pediococcus spp., Brevibacterium spp., Enterococcus spp. і Propionibacterium spp. Додатково, бактерії, які продукують молочну кислоту, належать до групи облігатних анаеробних бактерій, біфідобактерії, тобто, Bifidobacterium spp., як правило, включаються в групу молочнокислих бактерій. Їх часто 6 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 використовують як харчові культури самі по собі або в комбінації з іншими молочнокислими бактеріями. Використовуваний в описі даної заявки термін "молочний субстрат" може представляти будь-яку сиру і/або молочну сировину, яка пройшла технологічну обробку, яка може бути піддана обробці (і може бути ферментована) способом за винаходом. Отже, використовуваний молочний субстрат включає без обмеження розчини/суспензії будь-якого молока або молокоподібних продуктів, що включають білок, таких як суцільне молоко або молоко з низьким вмістом жиру, знежирене молоко, пахту, відновлене сухе молоко, концентроване молоко, сухе молоко, сироватку, пермеат сироватки, лактозу, маточну рідину після кристалізації лактози, концентрат сироваткового білка або вершків. Очевидно, що молочний субстрат може бути отриманий від будь-якої тварини (ссавця) або не тваринного джерела, наприклад, він може представляти по суті чисте молоко або відновлене сухе молоко. Переважно щонайменше частина білка в молочному субстраті являє собою білки, спочатку присутні в молоці, такі як казеїн або сироватковий білок. Однак частина білка може представляти білки, які не спочатку присутні в молоці. Перед ферментацією молочний субстрат може бути гомогенізований і пастеризований згідно зі способами по попередньому рівню техніки. Використовуваний в описі даної заявки термін "молоко" включає в об'єм поняття секрет молочних залоз, отриманий доїнням ссавців, таких як корови, вівці, кози, буйволиці або верблюдиці. У переважному варіанті виконання даного винаходу молоко являє собою молоко корови. Термін молоко також включає в об'єм поняття молоко не тваринного або рослинного походження (наприклад, з рослинних або злакових джерел), таке як соєве молоко, вівсяне молоко, рисове молоко, мигдалеве молоко. Інші джерела представляють бавовну, пшеницю, солод, кукурудзу, картоплю, боби, люпин і сорго. Якщо потрібно, молоко може бути підкислене, наприклад, додаванням кислоти (такої як лимонна, оцтова або молочна кислота), або змішане, наприклад, з водою. Молоко може представляти сире або яке пройшло обробку, наприклад, фільтрацію, стерилізацію, пастеризацію, гомогенізацію і тому подібне або може представляти відновлене сухе молоко. Важливим прикладом "коров'ячого молока" за винаходом є пастеризоване коров'яче молоко. Потрібно розуміти, що молоко може бути підкислене, оброблене глікозидазою, змішане або піддане обробці перед, під час і/або після інокуляції бактеріями. У контексті даного винаходу термін молочний продукт являє собою продукт, отриманий обробкою молочного субстрату N- або О-зв'язаною глюкозидазою, якщо потрібно, продукт також ферментують або підкислюють. Термін включає в об'єм ферментовані молочні продукти (які можуть представляти питні, з порушеним згустком або з непорушеним згустком) і сири. Використовуваний в описі даної заявки термін "гомогенізація" стосується інтенсивного перемішування з отриманням суспензії або емульсії. У випадку, коли гомогенізацію проводять перед ферментацією, вона може бути проведена, таким чином, щоб зменшити розмір молочного жиру, таким чином, щоб він більше не відділявся від молока. Це може бути досягнуто проштовхуванням молока під тиском через маленькі отвори. Використовуваний в описі даної заявки термін "ферментація" стосується перетворення вуглеводів в спирти або кислоти при впливі мікроорганізмів. Переважно ферментація в способах за винаходом включає перетворення лактози в молочну кислоту. Молочнокислі бактерії включають бактерії видів Lactobacillus sp. і Streptococcus thermophilus, які, як правило, використовують при виробництві молочних продуктів у вигляді, як заморожених, так і ліофільних культур, для вирощування виробничої закваски, або так званих "культур прямого висівання" (DVS), призначеного для безпосередньої інокуляції в ферментер або бродильний чан для отримання молочного продукту, такого як продукт з ферментованого молока. Такі культури, як правило, вказуються як "заквашувальні культури" або "закваски". Якщо потрібно, ферментований молочний субстрат піддають тепловій обробці для інактивації мікроорганізмів. Процес ферментації, що використовується для отримання продуктів з ферментованого молока, добре відомий, і фахівець в даній галузі добре знає, як вибрати прийнятні технологічні умови, такі як температура, кисень, додавання вуглеводів, кількість і характеристики мікроорганізму(ів) і час обробки. Очевидно, що умови ферментації вибирають таким чином, щоб сприяти отриманню продукту за винаходом, тобто отриманню ферментованого молочного продукту. У контексті даного винаходу йогуртова заквашувальна культура являє собою переважно бактеріальну культуру, що включає щонайменше один штам Lactobacillus, наприклад, штам Lactobacillus bulgaricus, і щонайменше один штам Streptococcus thermophilus. Відповідно до даного винаходу йогурт являє собою ферментований молочний продукт, що отримується 7 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 інокулюванням і ферментуванням молока штамом Lactobacillus і штамом Streptococcus thermophilus. Використовуваний в описі даної заявки термін "густий (spoonable)" потрібно розуміти, як споживаний при використанні ложки. Використовуваний в описі даної заявки термін "густий молочний продукт" включає в свій об'єм продукти з порушеним згустком. Використовуваний в описі даної заявки термін "продукт з порушеним згустком", зокрема, стосується продукту з ферментованого молока, який піддають механічній обробці після ферментації, з отриманням в результаті зруйнованого і зрідженого згустку, отриманого на стадії ферментації. Як правило, механічну обробку без обмеження проводять перемішуванням, перекачуванням, фільтрацією або гомогенізацією гелю або змішуванням з іншими інгредієнтами. Використовуваний в описі даної заявки термін "продукт з непорушеним згустком" включає в об'єм поняття продукт на основі молока, інокульований заквашувальною культурою, наприклад, стартовою культурою, і упакований після стадії інокуляції з подальшою ферментацією в упаковці. Використовуваний в описі даної заявки термін "питний продукт" включає в об'єм поняття напої, такі як "питний йогурт" і аналогічне їм. Використовуваний в описі даної заявки термін "питний продукт" включає напої, такі як "питний йогурт" і аналогічне їм. Використовуваний в описі даної заявки термін "питний йогурт", як правило, включає в об'єм поняття молочний продукт, отриманий ферментацією комбінацією видів Lactobacillus і Streptococcus thermophilus. Як правило, питний йогурт має вміст знежирених сухих речовин молока 8 % або більше. Додатково, кількість культури живих бактерій в питних йогуртах, як правило, складає 6 щонайменше 10 колонієутворювальних одиниць (КУО) на мл. ДЕТАЛЬНИЙ ОПИС Молочний продукт Кажучи по суті, pH переважного молочного продукту за винаходом, що включає молочний продукт (тобто продукт на основі молока тварин), має від pH 3 до pH 6,5; більш переважно від pH 3,5 до pH 5,75. Як відомо фахівцеві в даній галузі можна отримати відповідний pH молочного продукту, наприклад, ферментацією відповідною культурою молочнокислих бактерій. Однак, як відомо фахівцеві в даній галузі можна просто додати відповідну кислоту (таку як молочна кислота) з отриманням необхідного pH. Як альтернатива, може бути доданий лактон (наприклад, GDL лактон) з отриманням необхідного pH або при використанні інших прийнятних способів (наприклад, ферментативні способи або обробкою діоксидом вуглецю з прикладанням високого тиску) з отриманням заданого pH. Як указано вище, застосування глікозидази для поліпшення густини гелю може бути по суті корисно відносно так званих молочних продуктів з низьким вмістом жиру. Відповідно, в переважному варіанті виконання за винаходом молочний субстрат, що використовується на стадії (i) способу по першому аспекту, являє собою молочний субстрат з низьким вмістом жиру, тобто із вмістом жиру меншим ніж 3,5 %; більш переважно із вмістом жиру меншим ніж 1,5 % і ще більш переважно із вмістом жиру меншим ніж 0,75 %. Як указано вище, перевагою застосування глікозидази для поліпшення густини гелю є відсутність необхідності в підвищенні вмісту білка, наприклад, в молочному продукті з низьким вмістом жиру, для отримання досить адекватної густини гелю, мінімізуючи, таким чином, додатково загальну калорійність/енергетичну цінність готового молочного продукту з низьким вмістом жиру (наприклад, йогурту з низьким вмістом жиру). Відповідно, в переважно варіанті виконання за винаходом готовий молочний продукт (наприклад, йогурт) має загальну калорійність/енергетичну цінність меншу ніж 150 кілокалорій на 100 г молочного продукту, більш переважно готовий молочний продукт (наприклад, йогурт) має загальну калорійність/енергетичну цінність меншу ніж 100 кілокалорій на 100 г молочного продукту. Для фахівця в даній галузі рутинній є робота по визначенню калорійності молочного продукту, який цікавить. Прийнятним прикладом молочного продукту є ферментований молочний продукт або сир. У переважному варіанті виконання за винаходом молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт. У переважному варіанті виконання за винаходом ферментований молочний продукт являє собою щонайменше ферментований молочний продукт, вибираний з групи, що складається з йогурту, йогурту на альтернативній культурі, пахти, ацидофільного молока, кефіру, кумису і домашнього сиру. Найбільш переважно ферментований молочний продукт являє собою йогурт. 8 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У контексті даного винаходу терміни "йогурт" і "ферментоване молоко" мають їх звичайні значення. У US2005/0095316A1 і US2005/0095317A1 (обидва від Danone) ці терміни визначають відповідно до відповідного офіційного указу/норми у Франції, нижче по суті приведене посилання на ті ж самі відомі визначення цього терміну. Як відомо фахівцеві в даній галузі для отримання "йогурту або ферментованого молочного" продукту по суті визнано, що не повинно бути суттєвого видалення молочної сироватки і повинна бути проведена теплова обробка щонайменше еквівалентна пастеризації. Прийнятною релевантною тепловою обробкою для отримання ферментованого молочного продукту, такого як, наприклад йогурт, є, наприклад, теплова обробка при температурі від 85 до 98 °C протягом від 15 секунд до 30 хвилин. При застосуванні теплової обробки, яка є щонайменше еквівалентною стандартній пастеризації, білки молочної сироватки молочного субстрату денатурують в більшій або меншій мірі (близько від 25 до 99 % білків). Як очевидно фахівцеві в даній галузі оскільки для йогурту або ферментованого молочного продукту "не повинно бути значного видалення молочної сироватки", то йогурт або ферментований молочний продукт не є сирним продуктом, як вказано в US7560127B2 (дивіться, вище). Використовуваний в описі даної заявки термін "ферментоване молоко" стосується молочного продукту, отриманого зі знежиреного або не знежиреного молока, концентрованого або порошкоподібного молока, збагаченого або не збагаченого складовими молока, яке було піддане тепловій обробці, щонайменше еквівалентній пастеризації, інокульовано мікроорганізмом, що належить до видів, які є або не є характерними для кожного продукту. Вміст вільної молочної кислоти переважно не повинен складати більше ніж 0,6 грам на 100 грам на момент продажу споживачеві. Ферментоване молоко повинно переважно зберігатися аж до моменту продажу споживачеві при температурі, що запобігає його псуванню. Використовуваний в описі даної заявки термін "йогурт" стосується ферментованого молочного продукту, отриманого згідно з прийнятими і традиційними нормами, переважно за рахунок розвитку специфічних термофільних молочнокислих бактерій, таких як Lactobacillus delbruekii підвид bulgaricus і Streptococcus thermophilus, які переважно повинні бути інокульовані одночасно і переважно залишаються живими в готовому продукті в кількості щонайменше 10 мільйонів бактерій на грам відносно молоковмісної частини. Ферментований молочний продукт в нормі отримують 5 13 6 11 (А): інокулюванням від 10 до 10 КУО/мл (переважно від 10 до 10 КУО/мл) культурою молочнокислих бактерій (LAB) субстрату; і (В): ферментуванням молочного субстрату протягом від 2 до 120 годин при температурі від 10 °C до 55 °C. Як відомо фахівцеві в даній галузі відповідні види молочнокислих бактерій включають Bifidobacterium, Lactobacillus (такі як Lactobacillus delbrueckii підвид bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei або Lactobacillus helveticus), Streptococcus (такий як Streptococcus thermophilus), Lactococcus (такий як Lactococcus lactis), Leuconostoc (такі як Leuconostoc lactis, Leuconostoc mesenteroides). Коли молочний субстрат інокулюють ферментом, продукованим штамами Lactobacillus delbrueckii підвид bulgaricus і Streptococcus thermophilus, як правило, продукт визначають як йогурт. Як відомо з рівня техніки, термін "йогурт на альтернативній культурі" стосується ферментованого молочного продукту, отриманого при використанні культур Streptococcus thermophilus і будь-якого Lactobacillus species. Як відомо з рівня техніки, термін "ацидофільне молоко" стосується ферментованого молочного продукту, отриманого при використанні культури Lactobacillus acidophilus. Як відомо з рівня техніки, термін "кефір" стосується ферментованого молочного продукту, отриманого при використанні заквашувальної культури, отриманої з кефірного грибка, Lactobacillus kefiri, видів роду Leuconostoc, Lactococcus і Acetobacter, що зростають в дуже специфічних взаємовідношеннях. Кефірні грибки складаються з обох, і дріжджів, ферментуючих лактозу (Kluyveromyces marxianus), і дріжджів, ферментуючих не лактозу (Saccharomyces unisporus, Saccharomyces cerevisiae і Saccharomyces exiguus). Як відомо з рівня техніки, термін "кумис" стосується ферментованого молочного продукту, отриманого при використанні культур Lactobacillus delbrueckii підвид bulgaricus і Kluyveromyces marxianus. 9 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У переважному варіанті виконання за винаходом молочний продукт являє собою йогурт, де йогурт отримують інокуляцією культурою йогуртових молочнокислих бактерій, що включають Lactobacillus delbrueckii підвид bulgaricus і Streptococcus thermophiles, здатних синтезувати позаклітинні полісахариди (EPS), цей переважний варіант виконання за винаходом може бути по суті відповідним, якщо йогурт являє собою йогурт з низьким вмістом жиру, тобто, коли молочний субстрат, що використовується на стадії (i) способу по першому аспекту, являє собою молочний субстрат з низьким вмістом жиру, тобто із вмістом жиру меншим ніж 3,5 % жиру, більш переважно із вмістом жиру меншим ніж 1,5 % і ще більш переважно із вмістом жиру меншим ніж 0,75 %. Як указано вище, в попередньому рівні техніки описується множина таких штамів Streptococcus thermophiles, які продукують EPS, дивіться, наприклад, WO2007/095958A1 (Chr. Hansen А/S). Відповідно, фахівець в даній галузі може рутинним чином визначити кількість таких EPS, продукованих штамами, і також він може рутинним чином визначити, чи здатний штам, який цікавить, синтезувати EPS чи ні. Приклад за винаходом дозволяє компанії розробити відповідний теоретичний бізнессценарій з отриманням концентрованого молока/сухого молока при використанні глікозидази, як описано в даній заявці, і потім продати це концентроване молоко/сухе молоко, наприклад, виробнику йогурту, який використовує його в процесі отримання йогурту з отриманням йогурту з поліпшеною/підвищеною густиною гелю без додаткового додавання, таким чином, глікозидази в процесі отримання йогурту як такого. Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі такий теоретичний бізнес-сценарій може бути прикладом способу по першому аспекту даного винаходу, як указано вище. Концентроване молоко/сухе молоко розглядається, як приклад молочного продукту, отриманого способу по першому аспекту. Додатково, як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в контексті даного винаходу готовий йогурт буде мати поліпшену/підвищену густину гелю через проведене раніше додавання глікозидази в молоко, тобто виробник йогурту також реалізовує мету способу по першому аспекту, як вказано вище. Глікозидаза Як указано вище, використовуваний в описі даної заявки термін "глікозидаза" (що також називається глікозидна гідролаза) стосується ферменту, каталізуючого гідроліз глікозидного зв'язку, глікозидний зв'язок являє собою тип ковалентного зв'язку, який з'єднує молекулу вуглеводу (цукор) з іншою групою, яка може бути або може не бути іншим вуглеводом. Як указано вище, глікозидаза також може бути визначена, як деглікозилуючий фермент. Глікозидаза може представляти натуральну глікозидазу, або вона може представляти варіант/мутантів натуральної глікозидази, як відомо фахівцеві в даній галузі можна отримати мутантні варіанти ферменту, який цікавить (тут глікозидаза), наприклад, для поліпшення стабільності ферменту при збереженні ключової ферментативної активності (тут глікозидазна активність) ферменту. Наприклад, для отримання мінімального небажаного синерезису (зокрема, якщо молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт, такий як йогурт) може бути переважно, щоб глікозидаза представляла N-зв'язану глікозидазу. Як указано вище, використовуваний в описі даної заявки термін N-зв'язана глікозидаза є чітко визначеним терміном в попередньому рівні техніки, і фахівець в даній галузі знає, чи є специфічна глікозидаза N-зв'язаною глікозидазою, яка цікавить, чи ні. Додатково, в попередньому рівні техніки описана множина відповідних N-зв'язаних глікозидаз. Приклади прийнятних для даного винаходу N-зв'язаних глікозидаз можуть представляти щонайменше одну глікозидазу, вибирану з групи, що складається з пептид-N(4)-(N-ацетил-бетаглюкозаміл)аспарагінамідази (EC номер: 3.5.1.52; альтернативні назви: N-глікозидаза-F або PNGаза-F) і ендо--N-ацетилглюкозамідази Н (EC номер: 3.2.1.96; альтернативна назва ENDOH). Вказані безпосередньо вище N-зв'язані глікозидази можуть бути в контексті даного винаходу описані, як глікозидази, які мають N-зв'язану глікозидазну активність і не має значної О-зв'язаної глікозидазної активності. Відповідно, в даному винаході може бути переважно, щоб N-зв'язана глікозидаза представляла N-зв'язану глікозидазу, яка не має відповідної О-зв'язаної глікозидазної активності (такої як не О-зв'язана глікозидазна активність). N-глікозидаза-F, також відома як PNGаза-F, що використовується в способі, являє собою аспарагінамідазу (EC 3.5.1.52), яка може бути отримана з Flavobacterium mesingosepticum. Вона каталізує повне і інтактне (intact) розщеплення N-зв'язаних олігосахаридів від глікопротеїнів (It catalyses the complete and intact cleavage of N-linked oligosaccaharides from glycoproteins). Доступна як комерційний продукт від 10 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 New England Biolabs Inc. під торговою маркою PNGase-F або отримана рекомбінантно в штамі, такому як Escherichia coli, як було здійснено авторами даного винаходу при використанні плазмід і способу, описаного в робочому Прикладі 1 за винаходом. Ендо--N-ацетилглюкозамідаза Н (EC 3.2.1.96), також відома як ENDO-H, може бути отримана з Streptomyces plicatus. ENDO-H каталізує гідроліз глікозидного зв'язку між двома Nацетилглікозамінами N-зв'язаних глікозилатів (glycosylations). Доступна як комерційний продукт від New England Biolabs Inc. під торговою маркою ENDO-H. Приклади прийнятних для даного винаходу О-зв'язаних глікозидаз можуть представляти щонайменше одну глікозидазу, вибирану з групи, що складається з -N-ацетил-галактозамідази (EC номер: 3.2.1.49; альтернативна назва: GalNAC); -галактозидази (EC номер: 3.2.1.22); і нейрамінідази (EC номер: 3.2.1.18). GalNAC являє собою високо специфічну екзоглікозидазу, каталізуючу гідроліз залишків зв'язаного D-N-ацетил-галактозаміну. Доступна як комерційний продукт від New England Biolabs Inc. Як указано вище, використовуваний в описі даної заявки термін О-зв'язана глікозидаза є чітко визначеним терміном в попередньому рівні техніки, і фахівець в даній галузі знає, чи є специфічна глікозидаза О-зв'язаною глікозидазою, яка цікавить, чи ні. Додатково, в попередньому рівні техніки описана множина прийнятних О-зв'язаних глікозидаз. Ефективну кількість/активність глікозидази в даному винаході визначають згідно з попереднім рівнем техніки. Згідно з попереднім рівнем техніки для N-зв'язаної глікозидази (такої, як наприклад, PNGase-F і Endo-H) одиницю активності визначають, як кількість ферменту, необхідну для видалення >95 % вуглеводів з 10 µг денатурованої RNази-B протягом 1 години при температурі 37 °C в загальному реакційному об'ємі 10 µл. Для GalNAC (О-зв'язана глікозидаза) одиницю активності визначають, як кількість ферменту, необхідну для розщеплення > 95 % термінального -D-N-ацетил-галактозаміну з 1 нмоль (GalNAca l-3)(Fuca l-2)Gala l-4Glc-7-аміно-4-метил-кумарину (AMC), протягом 1 години при температурі 37 °C в загальному реакційному об'ємі 10 µл. Множина відповідних глікозидазних ферментів комерційно доступна від компанії New England Biolabs, також зроблено посилання на каталог продуктів New England Biolabs (як, наприклад, доступно он-лайн на їх сайті) для додаткових деталей відносно специфічних стандартних визначень відповідних одиниць глікозидазної активності. Стадія (i) способу по першому аспекту Стадія (i) описаного способу по першому аспекту даного винаходу представляє: "(i): додавання ефективної кількості N-зв'язаної глікозидази і/або О-зв'язаної глікозидази в молочний субстрат". Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі в контексті даного винаходу N-зв'язану глікозидазу і/або О-зв'язану глікозидазу в нормі додають в субстрат як композицію по суті чистої глікозидази, наприклад, композицію глікозидази, де глікозидазна активність складає щонайменше 5 % від загальної ферментативної активності композиції глікозидази, як такої. Це може бути композиція глікозидази, де глікозидазна активність складає щонайменше 25 % від загальної ферментативної активності композиції глікозидази, або композиція глікозидази, де глікозидазна активність складає щонайменше 50 % від загальної ферментативної активності композиції глікозидази. Переважно така композиція по суті чистої глікозидази являє собою композицію глікозидази, де глікозидазна активність складає щонайменше 90 % від загальної ферментативної активності композиції глікозидази. Ефективна кількість глікозидази може бути представлена одним специфічним типом глікозидази (наприклад, PNGаза-F) або сумішшю відповідних глікозидазних ферментів (наприклад, двох різних N-зв'язаних глікозидаз або однієї N-зв'язаної і однієї О-зв'язаної глікозидаз). Коли в описі даної заявки вказується, що переважно, щоб глікозидаза, додана на стадії (i) способу першого аспекту, представляла N-зв'язану глікозидазу, це звичайно означає, що повинна бути додана ефективна кількість N-зв'язаної глікозидази на стадії (i), і ця N-зв'язана глікозидаза дозволяє отримати в результаті її присутності гель з поліпшеною густиною в молочному продукті. Однак коли вказується, що N-зв'язана глікозидаза є переважною, це не означає, що на стадії (i) не повинна додаватися яка-небудь О-зв'язана глікозидаза. Те ж саме застосовне в описі даної заявки, коли вказується, що О-зв'язана глікозидаза є переважною, тобто повинна бути додана О-зв'язана глікозидаза на стадії (i), але також може бути додана N-зв'язана глікозидаза. 11 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Навпаки і як очевидно фахівцеві в даній галузі коли в описі даної заявки вказується, що глікозидаза являє собою тільки О-зв'язану глікозидазу, тоді на стадії (i) першого аспекту не повинна бути додана N-зв'язана глікозидаза. Те ж саме застосовне в описі даної заявки, коли вказується, що глікозидаза являє собою тільки N-зв'язану глікозидазу, тоді на стадії (i) першого аспекту не повинна бути додана О-зв'язана глікозидаза. Як відомо з рівня техніки, молочний продукт, як правило, проходить теплову обробку. Як відомо з рівня техніки, при тепловій обробці, як правило, використовують температуру нижчу за кипіння, оскільки при дуже високих температурах, міцели казеїну незворотно агрегують (або "згортаються"). У контексті даного винаходу використовуваний в описі даної заявки термін "пастеризований" відносно пастеризованого молочного продукту стосується стадії стандартної пастеризації (тобто, при використанні прийнятної теплової обробки молока). У контексті даного винаходу очевидно, що фахівець в даній галузі знає, чи є специфічний молочний продукт, який цікавить, пастеризованим молочним продуктом чи ні. Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі стадія стандартної пастеризації може представляти теплову обробку при температурі близько 7172 °C протягом близько 15-20 секунд. Як указано вище, для отримання "йогурту або ферментованого молочного" продукту по суті визнано, що не повинно бути суттєвого видалення молочної сироватки і що повинна бути проведена теплова обробка, щонайменше еквівалентна пастеризації. Прийнятна відповідна теплова обробка для отримання ферментованого молочного продукту, такого, наприклад, як йогурт, представляє, наприклад, теплову обробку при температурі від 85 до 98 °C протягом від 15 секунд до 30 хвилин. Залежно від типу використовуваної теплової обробки, теплова обробка може представляти теплову обробку молока при температурі від 65 до 150 °C від частки секунди до 30 хвилин. Як указано вище, коли молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт такий, наприклад, як йогурт, повинна бути проведена теплова обробка, щонайменше еквівалентна пастеризації. Глікозидаза на стадії (i) може бути додана перед або після стадії теплової обробки, тобто теплової обробки при температурі від 65 до 150 °C від частки секунди до 30 хвилин. У деяких випадках може бути переважно, щоб глікозидазу додавали у молоко, що вже пройшло теплову обробку. Як указано вище, коли молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт, молочний субстрат інокулюють і ферментують відповідною культурою молочнокислих бактерій (LAB). Коли молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт, глікозидаза може бути додана перед, разом або після інокуляції молочного субстрату культурою молочнокислих бактерій (LAB). Відносно молочного продукту загалом може бути переважно, щоб глікозидазу додавали перед досягненням pH молочного субстрату нижче ніж 6. Відносно ферментованого молочного продукту переважне додавання глікозидази перед закінченням процесу ферментації відповідними молочнокислими бактеріями, тобто переважно до досягнення pH молочного субстрату нижче за 6. Автори даного винаходу вважають, що додавання від 10 одиниць активності глікозидази на мл молока до 1000 одиниць активності на мл молока достатньо для досягнення ефективної кількості глікозидази, тобто достатньо для досягнення відповідної поліпшеної густини гелю. Відповідно до конкретних цілей можна додавати більше глікозидази, наприклад, аж до 20000 одиниць активності глікозидази на мл молока. Як указано вище, ефективну кількість/активність глікозидази в даному винаході визначають згідно з попереднім рівнем техніки. Стадія (ii) способу по першому аспекту Стадія (ii) описаного способу по першому аспекту даного винаходу представляє: "(ii) проведення адекватної стадії (стадій) для отримання молочного продукту, де адекватну стадію (стадії) проводять при умовах, що ефективна кількість глікозидази дозволяє отримати в результаті її присутності гелю з поліпшеною густиною в молочному продукті". Як указано вище, проведення адекватної стадії (стадій) для отримання молочного продукту, який цікавить є рутинною роботою для фахівця в даній галузі наприклад, якщо молочний продукт представляє, наприклад, йогурт, фахівець в даній галузі звичайно, знає адекватну стадію (стадії) для отримання йогурту, який цікавить. Відносно умов, що ефективна кількість глікозидази дозволяє отримати гель з поліпшеною густиною в молочному продукті, очевидно, що ці умови, повинні представляти умови, при яких глікозидазний фермент залишається активним протягом достатнього періоду часу. Як показано в робочих Прикладах за винаходом, автори даного винаходу визначили, що множина різних глікозидазних ферментів мають прийнятну активність протягом нормальних 12 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 прийнятних умов (наприклад, температура, pH і тому подібне) для отримання відповідного молочного продукту, такого як йогурт. Коротше і як зрозуміло фахівцеві в даній галузі переважні умови для отримання переважної відповідної глікозидазної активності в даному винаході залежать від використовуваного специфічного глікозидазного ферменту(ів) (наприклад, PNGаза-F) і отримуваного специфічного молочного продукту (наприклад, йогурт). У контексті даного винаходу приклади прийнятних умов реакції для глікозидази, що дозволяють отримати відповідний гель з поліпшеною густиною, можуть представляти: - температуру від 10 до 50 °C (таку як від 20 до 40 °C); - pH від pH 3 до pH 9 (такий як від pH 4 до pH 7,5; від 3 до 7 або від 3 до 6,5); - період часу від 10 хвилин до 120 годин (такий як від 1 години до 120 годин, або від 0,5 до 5 годин). У переважному варіанті виконання даного винаходу присутність глікозидази на стадії (ii) дозволяє отримати в 1,25 рази поліпшену густину гелю в молочному продукті; більш переважно в 1,50 рази поліпшену густину гелю в молочному продукті і ще більш переважно присутність глікозидази на стадії (ii) дозволяє отримати в 1,7 разів поліпшену густину гелю в молочному продукті. Як указано вище, автори даного винаходу встановили, що застосування глікозидази не впливає негативного чином на в'язкість готового молочного продукту. Відповідно, в переважному варіанті виконання даного винаходу стадію (ii) проводять в умовах, при яких ефективна кількість глікозидази в результаті її присутності не впливає негативного чином на в'язкість молочного продукту. Для фахівця в даній галузі рутинною роботою є вимірювання в'язкості молочного продукту, який цікавить (наприклад, йогурту). У робочому Прикладі 2 за винаходом приведений відповідний стандартний спосіб вимірювання в'язкості молочного продукту, який цікавить, переважно в даному винахід відповідну в'язкість вимірюють згідно зі способом за Прикладом 2. У статті A.N. Hassan et al. (J. Dairy Sci: 86: 1632-1638; 2003) також описується відповідний стандартний спосіб вимірювання в'язкості. Дивіться, наприклад, розділ матеріали і методи (materials and method) на Фігурі 1, прикладеній до статті, де показане певне зсувне напруження, як можна бачити в Прикладі 2 опису даної заявки, параметр зсувного напруження використовують як показник для вимірювання в'язкості. Оскільки фахівцеві в даній галузі легко виміряти в'язкість молочного продукту, який цікавить, то фахівцеві в даній галузі звичайно ж, легко визначити переважний варіант виконання стадії (ii) способу по першому аспекту відносно того, якщо: "стадію (ii) проводять в умовах, при яких ефективна кількість глікозидази в результаті її присутності не впливає негативного чином на в'язкість молочного продукту". Для визначення цієї вимоги фахівець в даній галузі повинен просто провести "адекватну стадію (стадії) для отримання молочного продукту" стадії (ii) з або без присутності ефективної кількості глікозидази, і потім визначити в даному винаході відповідний вплив на в'язкість доданої кількості глікозидази. Як можна бачити в робочих Прикладах за винаходом, фактично можна отримати поліпшену в'язкість при використанні глікозидази, як указано в описі даної заявки. Відповідно, в переважному варіанті виконання даного винаходу присутність глікозидази на стадії (ii) дозволяє отримати в 1,10 разів підвищену в'язкість молочного продукту; більш переважно в 1,20 разів підвищену в'язкість молочному продукту. Як зрозуміло фахівцеві в даній галузі метод вимірювання в'язкості, як, наприклад, описаний в робочому Прикладі 2 за винаходом і показаний статті A.N. Hassan et al. (з відносно малими погрішностями вимірювання), буде давати ті ж самі відносні результати, тобто незалежно від використовуваного способу вимірювання будуть отримуватися ті ж самі результати відносно відносного поліпшення в'язкості. Як указано вище, в робочих Прикладах за винаходом показано, що обидві, і N-зв'язана, і Озв'язана глікозидаза не приводять до виникнення небажаного ефекту синерезису відносно отримання йогурту. Відповідно, в переважному варіанті виконання даного винаходу стадію (ii) проводять в умовах, при яких ефективна кількість глікозидази в результаті її присутності не підвищує ефект синерезису у молочного продукту. Це не підвищує ефект синерезису, зокрема відповідно, коли молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт, такий як, наприклад, йогурт. 13 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Для фахівця в даній галузі рутинною роботою є вимірювання ефекту синерезису молочного продукту, який цікавить (наприклад, йогурту). У робочому Прикладі 3 за винаходом приведений відповідний стандартний спосіб вимірювання синерезису молочного продукту, який цікавить, переважно в даному винаході відповідний синерезис вимірюють згідно зі способом за Прикладом 3. По суті стандартний спосіб вимірювання ефекту синерезису за Прикладом 3 основується по суті на відповідному зберіганні молочного продукту, який цікавить і вимірюванні кількості сироватки у верхній частині молочного продукту, який цікавить. Оскільки фахівцеві в даній галузі легко виміряти синерезис молочного продукту, який цікавить, то фахівцеві в даній галузі звичайно ж, легко визначити переважний варіант виконання стадії (ii) способу по першому аспекту відносно того, якщо: "стадію (ii) проводять в умовах, при яких ефективна кількість глікозидази в результаті її присутності не приводить до синерезису молочного продукту". Для визначення цієї вимоги фахівець в даній галузі повинен просто провести "адекватну стадію (стадії) для отримання молочного продукту" стадії (ii) з або без присутності ефективної кількості глікозидази, і потім визначити в даному винаході відповідний вплив на синерезис доданої кількості глікозидази. Також даний винахід стосується способу отримання молочного продукту, вказаний спосіб включає: a) отримання молочного субстрату; b) обробку молочного субстрату ферментом з N-зв'язаною глікозидазною активністю; і c) якщо потрібно, ферментацію молочного субстрату мікроорганізмом, таким як молочнокислі бактерії. У цікавлячому варіанті виконання даного винаходу стадію b) проводять перед або під час стадії с). Як указано вище, молочний субстрат може бути з будь-якої тваринного або не тваринного джерела. Молочний продукт переважно отримують по суті без або повністю без додавання загусника і/або стабілізатора, такого як пектин, желатин, крохмаль, модифікований крохмаль, карагенан, альгінат і гуарова камедь. У варіанті виконання даного винаходу, який цікавить, мікроорганізм являє собою молочнокислі бактерії і/або мікроорганізми, продукуючі полісахариди, такі як екзополісахариди (EPS). Мікроорганізм може представляти молочнокислі бактерії, що переважно належать до видів, вибираних з групи, що складається з: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii підвид Bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis підвид cremoris, Leuconostoc mes-enteroides підвид cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides підвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis підвид lactis біоваріант diacetylactis, Lactobacillus casei підвид Casei, Lactobacillus paracasei підвид Paracasei, Bifidobacterium bifidum, і Bifidobacterium longum. Цікавлячи варіанти виконання будь-якого способу за винаходом представляють: - Спосіб, де молочний субстрат піддають пастеризації перед підкисленням, і ферментативну обробку проводять перед пастеризацією; - Спосіб, де молочний субстрат піддають тепловій обробці перед обробкою ферментом, що має N-зв'язану глікозидазну активність; - Спосіб, де молочний продукт вибирають з групи, що складається з ферментованого молочного продукту з непорушеним згустком, питного ферментованого молочного продукту і густого (spoonable) ферментованого молочного продукту; - Спосіб, де молочний продукт має вміст сухих знежирених речовин молока менший ніж 8 %; - Спосіб, де молочний продукт має вміст жируменший ніж 2 %; - Спосіб, де молочний продукт має вміст жиру менший ніж 0,5 %; - Спосіб, де молочний продукт розфасовують (тобто, спосіб включає розфасування); і/або - Спосіб, де глікозидазу вибирають з групи, що складається з -N-ацетил-галактозамідази; GalNAC; -галактозидази; нейрамідази; пептид-N(4)-(N-ацетил-бета-глюкозаміл) аспарагінамідази; N-глюкозидази-F; PNGази-F; ендо--N-ацетилглюкозамідази Н; ENDO-H і будь-якого ферменту, класифікованого в EC 3.2.1.49, EC 3.2.1.18, EC 3.2.1.22, EC 3.5.1.52, або EC 3.2.1.96. У контексті даного винаходу використовуваний в описі даної заявки термін "розфасування" (прийнятна кількість продукту у прийнятній упаковці) стосується готового розфасованого продукту з отриманням продукту в формі, що продається, таким чином, що продукт може бути спожитий, наприклад, індивідуумом або групою індивідуумів. Прийнятною упаковкою може бути пляшка, контейнер, пакет або аналогічне їм, і прийнятна кількість може складати, наприклад, від 10 або до 5000 мл, але по суті переважно кількість в упаковці складає від 50 мл до 1000 мл. Такий розфасований продукт є частиною даного винаходу. 14 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 У іншому аспекті даний винахід також стосується молочного продукту, що отримується способом за винаходом. У додатковому аспекті даний винахід стосується молочного продукту, що отримується способом, що включає додавання N-зв'язаної глікозидази і/або О-зв'язаної глікозидази в молочний субстрат. Для досягнення заданої густини гелю глікозидаза повинна бути додана в "ефективній кількості". Молочні продукти за винаходом можуть бути ферментовані інокуляцією культурою молочнокислих бактерій перед і/або під час і/або після обробки глікозидазою. Молочний продукт може бути розфасований, наприклад, в закупорений контейнер об'ємом в межах від 10 мл до 5000 мл, такий як контейнер об'ємом від 25 мл до 1500 мл або об'ємом від 50 мл до 1000 мл. У іншому аспекті даний винахід стосується застосування N-зв'язаної глюкозидази в способі отримання молочного продукту, такого як ферментований молочний продукт (такого як йогурт) або сир (такого як молодий незрілий сир, м'який сир з низькою жирністю, домашній сир і тому подібне). Також даний винахід стосується застосування N-зв'язаної глюкозидази в способі поліпшення текстури (такої як густина гелю) молочного продукту, такого як ферментований молочний продукт (такого як йогурт) або сир (такого як, молодий незрілий сир, м'який сир з низькою жирністю, домашній сир і тому подібне). По суті в переважному варіанті виконання даний винахід стосується застосування ферменту, що має N-зв'язувальну і/або О-зв'язувальну глікозидазну активність, для поліпшення відчуття у роті при споживанні молочного продукту, такого як йогурт. Застосування може включати таке, де молочний продукт був отриманий при використанні молочнокислих бактерій, продукуючих полісахариди, такі як екзополісахариди (EPS). Використовувані в описі даної заявки (зокрема, в прикладеній формулі винаходу) форми однини включають і множину, якщо в контексті чітко не переглядається інше. Використовувані в описі даної заявки дієслово "містити", "мати", "складатися з", "включати" і його форми потрібно інтерпретувати у відкритому, а не закритому значенні, якщо чітко не вказано інше (тобто, в значення "включаючи без обмеження"), якщо чітко не вказано інше. Приведені межі значень приведені, як спосіб стисло показати весь діапазон, тобто кожний окремий показник з цього діапазону, якщо чітко не вказано інше. Всі описані в даному винаході способи можуть бути проведені будь-яким відповідним чином, якщо чітко не вказано інше, або якщо з контексту чітко не переглядається інше. Використання в описі даної заявки будь-якого прикладу або всіх прикладів або термінів, що вказують на приведення прикладу (наприклад, такий як) приведено для кращого розуміння і ілюстрації і не обмежує об'єм домагань даного винаходу, викладений в прикладеній формулі винаходу. Жодне формулювання в описі не повинно розглядатися, як таке, що вказує на будь-який не викладений в формулі винаходу елемент як суттєвий для здійснення даного винаходу. ПРИКЛАДИ ПРИКЛАД 1: Глікозидази Приклади глікозидаз, використаних в способі за винаходом, представляли аспарагінамідазу, ацетилглюкозамідазу або галактозамідазу. N-глікозидаза-F, також відома, як PNGаза-F, використана в способі, являє собою аспарагінамідазу (EC 3.5.1.52), яка може бути отримана з Flavobacterium mesingosepticum. Вона каталізує повне і інтактне (intact) розщеплення N-зв'язаних олігосахаридів від глікопротеїнів (It catalyses the complete and intact cleavage of N-linked oligosaccaharides from glycoproteins). Доступна як комерційний продукт від New England Biolabs Inc. під торговою маркою PNGase-F або отримана рекомбінантно в штамі, такому як Escherichia coli, як було зроблено при використанні плазмід і способу, описаного в Loo et al. (Protein Expression and Purification 24, 9098, 2002). Ендо-p-N-ацетилглюкозамідаза Н (EC 3.2.1.96), також відома як ENDO-H, може бути отримана з Streptomyces plicatus. ENDO-H каталізує гідроліз глікозидного зв'язку між двома Nацетилглюкозамінами N-зв'язаних глікозилатів (glycosylations). Доступна як комерційний продукт від New England Biolabs Inc. під торговою маркою ENDO-H. -N-ацетил-галактозамідаза (EC 3.2.1.49) являє собою високо специфічну екзоглікозидазу, каталізуючу гідроліз залишків -зв'язаного D-N-ацетил-галактозаміну. Доступна як комерційний продукт від New England Biolabs Inc під торговою маркою -N-ацетил-галактозамідаза. Для самостійно отриманої на місці PNGази-F авторами даного винаходу була підтверджена висока міра (>95 %) чистоти при використанні електрофорезу в поліакриламідному гелі в присутності додецилсульфату натрію (SDS-PAGE) з подальшим фарбуванням кумасією діамантовим блакитним (CBB). Для додаткового підтвердження чистоти зібраний фермент 15 UA 112303 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 розділяли при використанні SDS-PAGE і забарвлювали при використанні срібла. При подальшому проведенні аналізу з використанням мас-спектрометрії поява смуг підтверджує присутність PNGази-F і тільки PNGази-F. Потенційну -специфічну протеолітичну активність самостійно отриманої на місці очищеної PNGази-F оцінювали при проведенні протеолітичного аналізу при використанні коров'ячого каппа-казеїну (Sigma-Aldrich) як субстрату. У цьому аналізі автори даного винаходу провели тестування протеолітичної активності при різних показниках pH, що імітує природне зниження pH, що відбувається при ферментації. Для перевірки системи автори даного винаходу використали 20 кратне підвищення концентрації ферменту в порівнянні зі способом за винаходом і інкубували протягом 4 годин при кожному показнику pH. При цих умовах автори даного винаходу не виявили якої-небудь -специфічної протеолітичної активності. Висновок: Виходячи з приведених вище результатів, зрозуміло, що так звана самостійно отримана на місці PNGаза-F вільна від контамінантів. Інші комерційно доступні глікозидази, приведені вище, також вільні від контамінатів, як вказується виробником. ПРИКЛАД 2: Спосіб вимірювання густини і в'язкості гелю Густину гелю вимірювали при використанні реометра Anton Paar MCR, забезпеченого автоматичним пристроєм для заміни зразків (Physica DSR Rheometer+ASC). Вимірюваний тягарець помістили у вимірювальну чашу, що містить 20 мл зразка, які перемішали вручну і нагріли до температури 13 °C. Потім тягарець помістили в зразок і витримали його там. Далі провели вимірювання густини гелю при використанні осциляції. Напругу підтримували на постійному рівні при значенні 0,3 %, а частоту підвищували від 0,5 Гц до 30 Гц. За даними модуля еластичності (G') і модуля в'язкості (G") може бути розрахований їх комплексний модуль (G*): , G* при 1 Гц використовували як ступінь густини гелю, що використовується для порівняння різних зразків. При використанні одного і того ж реометра (Anton Paar rheometer) проводили вимірювання в'язкості при підвищенні градієнта зсуву із 0,2707 1/с до 300 1/с по контрольно-вимірювальних точках (напруження зсуву) кожні 10 с. Потім градієнт зсуву знизили із 275 1/с до 0,2707 1/с по контрольно-вимірювальних точках (напруження зсуву) кожні 10 с. Напруження зсуву при 300 1/с використовували, як міру в'язкості продукту. Висновок: Основуючись на приведених вище стандартних способах вимірювання густини гелю і в'язкості, для фахівця в даній галузі рутинною роботою є визначення того, чи досягнуте поліпшення густини гелю і/або в'язкості молочного продукту, який цікавить при додаванні глікозидази згідно зі способом отримання молочного продукту за винаходом. ПРИКЛАД 3: Способи вимірювання синерезису У даному винаході використали два різних способи вимірювання синерезису: Спосіб 1: 50 мл йогурту (отримано по прикладу 4) помістили в пробірку Еппендорфа і помістили на холодильне зберігання (5 °C) протягом 14 днів, після чого провели вимірювання кількості сироватки у верхній частині йогурту при використанні мірної лінійки (в мм). Фахівцеві в даній галузі очевидно, що також можна виміряти ефект синерезису іншого молочного продукту, іншого ніж йогурт, поміщенням молочного продукту на зберігання і вимірюванням кількості сироватки у верхній частині молочного продукту, який цікавить. Спосіб 2: Знежирене молоко збагатили 2 % сухого знежиреного молока (SMP, виробник?) і помістили в холодильник на ніч. Партію піддали тепловій обробці протягом 20 хвилин при температурі 90 °C. 75 мл молочного розчину вмістили в 100 мл мірну колбу разом з йогуртовою культурою 0,02 % YoFlex® Advance 2.0 (доступна від Chr. Hansen А/S, Denmark) і ферментом (або PNGазою або GalNAC). Реєстрували загальну масу молока, культури і ферменту. Розчин нагрівали до температури 43 °C і ферментувати до досягнення pH 4,55, після чого пробірки поміщували на холодильне зберігання протягом 7 днів. Через 7 днів зливали верхню частину йогурту і зважили. Синерезис розраховували в процентах. Фахівцеві в даній галузі очевидно, що також можна виміряти ефект синерезису іншого молочного продукту, іншого ніж йогурт, поміщенням молочного продукту на зберігання і вимірюванням кількості сироватки у верхній частині молочного продукту, який цікавить. Висновок: 16 UA 112303 C2 5 10 Основуючись на приведених вище стандартних способах вимірювання синерезису, для фахівця в даній галузі рутинною роботою є визначення того, чи має місце значний ефект синерезису молочного продукту, який цікавить при додаванні глікозидази згідно зі способом отримання молочного продукту за винаходом ПРИКЛАД 4: Вплив PNGазиF на густину гелю (2 лабораторний експеримент) 2 літра знежиреного молока (0,1 % жиру, Aria Express, Slagelse) збагатили 1,6 % сухого знежиреного молока (SMP, виробник?) і помістили в холодильник на ніч. Партію піддали тепловій обробці протягом 20 хвилин при температурі 90 °C і охолодили до температури 43 °C, інокулювали йогуртовою культурою 0,02 % YoFlex® Advance 2.0 (доступна від Chr. Hansen А/S, Denmark) і внесли або 10 мл PNGази-F або в контрольному зразку 10 мл 20 мM Na-фосфатного буфера з pH 7,5, що містить 50 мM NaCI, і ферментували до досягнення pH 4,55. При досягненні pH 4,55 йогурт перемішали і пропустили через пристрій для пост-обробки (PTU), в якому йогурт піддали впливу підвищеного тиску 2 бара (20 кПа) при температурі 25 °C. Готовий продукт піддали реометричному аналізу на 5 день. 15 Таблиця 1 Результати 2 експерименту лабораторного отримання йогурту з низьким вмістом жиру за відсутності і в присутності самостійно отриманої на місці PNGази-F Advance 2.0 Advance 2,0+PNGаза-F (250 U/мл молока) 20 25 30 35 40 Комплексний модуль (Па) 29,2±0,86 51,0±0,57 Напруження зсуву (300 1/с) 63,7±0,61 70,7±0,2 Синерезис (мм) 8 4 Для N-глікозидази одиницю активності визначали, як кількість ферменту, необхідну для видалення >95 % вуглеводів з 10 µг денатурованої RNази-B протягом 1 години при температурі 37 °C в загальному реакційному об'ємі 10 µл. Числові значення в Таблиці 1 показали, що PNGаза-F підвищила густину гелю йогурту з низьким вмістом жиру. При цих умовах різниця становила 75 % в порівнянні з контролем. В'язкість, отримана в присутності PNGази-F, порівнянна або трохи краще такої у контрольного зразка. У даних, не приведених тут, автори даного винаходу виявили, що підвищення густини гелю у відповідь на обробку PNGазою-F дозозалежно. Також автори даного винаходу провели оцінку синерезису при використанні Способу 1 Прикладу 3 і виявили, що синерезис знизився у відповідь на обробку PNGазою-F. Висновок: Приведені вище результати продемонстрували, що PNGаза-F підвищує густину гелю йогурту з низьким вмістом жиру. При цих умовах різниця становила 75 % (тобто, в 1,75 рази) в порівнянні з контролем. Додатково, було виявлено, що синерезис знизився у відповідь на обробку PNGазою-F. Отримана в'язкість в присутності PNGази-F порівнянна або трохи краща такої у контрольного зразка. ПРИКЛАД 5: Тестування різних глікозидаз в йогурті з низьким вмістом жиру Йогурти отримували безпосередньо в 20 мл чашах для проведення реометричного аналізу. Знежирене молоко (0,1 % жиру, Aria Express, Slagelse) збагатили 2 % сухого знежиреного молока (SMP) і вмістили в холодильник на ніч. Розчин піддали тепловій обробці протягом 20 хвилин при температурі 90 °C і охолодили до температури 43 °C, інокулювали йогуртовою культурою 0,02 % YoFlex® Advance 2.0 і різними деглікозидазами, і ферментували (Таблиця 1). Потім зразки вмістили в холодильник і провели вимірювання реології на 3 день за Прикладом 2. 17 UA 112303 C2 Таблиця 2 Результати експерименту лабораторного отриманню в 20 мл чашах йогурту з низьким вмістом жиру за відсутності і в присутності комерційно доступних деглікозидаз. Всі протестовані ферменти в цій Таблиці доступні від New England Biolabs Inc Advance 2,0+PNGаза-F Advance 2,0+Endo-H Advance 2,0+ N-ацетилгалактозамінідаза Advance 2,0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Концентрація (U/мл молока) 250 250 50 Густина гелю (Па) 608±32,5 564± 482±19,8 0 391±7,5 Для N-глікозидаз PNGази-F і Endo-H одиниці визначають по Таблиці 1. Для -N-ацетилгалактозамінідази, О-зв'язаної глікозидази одиницю активності визначають, як кількість ферменту, необхідну для розщеплення >95 % термінального -D-N-ацетил-галактозамінуз 1 нмоль (Gal-NAca l-3)(Fuca l-2)Gala l-4Glc-7-аміно-4-метил-кумарин (AMC), протягом 1 години при температурі 37 °C в загальному реакційному об'ємі 10 µл. Для всіх протестованих глікозидаз, N-глюкозидаз поряд з О-глюкозидазою GalNAC, було відмічене значне поліпшення густини гелю. Було встановлено, що при тестованих концентраціях комерційно доступна PNGаза-F вчинила найсильніший вплив на густину гелю йогурту з низьким вмістом жиру. Висновок: Результати показали, що у всіх протестованих глікозидаз, N-глюкозидаз поряд з Оглюкозидазою GalNAC, було відмічене значне поліпшення густини гелю. ПРИКЛАД 6: Експеримент на синерезис при використанні глікозидази, працюючої на Озв'язане глікозилування. У US 7560127 показано, що -глюкозидаза GalNAC приводить до утворення сирного згустку/зсідання. Автори даного винаходу провели аналіз впливу GalNAC на синерезис йогурту з низьким вмістом жиру. Експеримент проводили за Прикладом 3 Спосіб 2. Йогурти отримували безпосередньо в 100 мл чашах для проведення реометричного аналізу. Знежирене молоко (0,1 % жиру, Aria Express, Slagelse) збагатили 2 % сухого знежиреного молока (SMP, Aria Express, Slagelse) і помістили в холодильник на ніч. Розчин піддали тепловій обробці протягом 20 хвилин при температурі 90 °C і охолодили до температури 43 °C, інокулювали йогуртовою культурою 0,02 % YoFlexо Advance 2.0 і GalNAC в концентрації 100 U/мл молока. Для контрольних зразків без ферменту процент сироватки через 21 день становив 0,3±0,04 %, в той час як фракція сироватки для зразка, обробленого ферментом, становила 0,2±0,08 %. Несподівано було виявлено, що обробка GalNAC не підвищила синерезис в порівнянні з контрольним зразком, ферментованим тією ж самою культурою. Цей результат був несподіваним, оскільки в US 7560127 указано, що видалення О-зв'язаних гліканів приводить до утворення згустку і, отже, відділенню сироватки. Висновок: Приведені вище результати продемонстрували, що протестована О-зв'язана глікозидаза не підвищує синерезис в процесі отримання йогурту. ПРИКЛАД 7: LAB і хімічно підкислене молоко У цьому Прикладі автори даного винаходу хотіли з'ясувати, чи надає вплив PNGаза-F залежно від механізму підкислення. Експеримент був проведений порівнянням впливу PNGазиF на ферментований йогурт і на йогурт, підкислений хімічно, при використанні глюконо-δлактону (GDL). Молоко, що містило 9,5 % сухих речовин, інокулювали або YoFlex® Advance 2.0 або глюконо-δ-лактоном (GDL) і PNGазою-F, як указано в Таблиці 3, нагріли до температури 43 °C і ферментували до pH 4,55. Потім зразки зберігали протягом 3 днів при температурі 5 °C, зразки перемішали при використанні мішалки і перелили в чаші для реологічного аналізу, реологічний аналіз і вимірювання проводили по Прикладах 2 і 3. Результати, приведені в Таблиці 3, підтвердили, що вплив PNGази-F може бути описаний, як фізичний феномен. У хімічно підкисленого йогурту спостерігався більш щільний гель в порівнянні з таким у культури Advance 2.0. Однак для обох способів очевидно, що додавання PNGази-F поліпшує густину гелю. 18 UA 112303 C2 Таблиця 3 Результати експерименту лабораторного отриманню 200 мл йогурту з низьким вмістом жиру в присутності PNGази-F при використанні для підкислення або Advance 2.0 або GDL. Advance 2,0+PNGаза-F Advance 2.0 GDL+PNGаза-F GDL 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Концентрація (U/мл молока) 250 0 250 0 Густина гелю (Па) 35,5±7,8 24,7±0,9 148,0±7,0 121,5±6,4 Висновок: Приведені вище результати продемонстрували для обох способів підкислення очевидність того факту, що додавання PNGази-F поліпшило густину гелю. Переважні варіанти виконання даного винаходу включають найкращий спосіб здійснення даного винаходу, відомий його авторам. Варіанти переважних варіантів виконання даного винаходу очевидні для фахівця в даній галузі при прочитанні опису даної заявки. Автори даного винаходу чекають від фахівця в даній галузі використання таких варіантів у встановленому порядку, і автори даного винаходу мають на увазі, що даний винахід може бути здійснений іншим способом, ніж приведений в описі даної заявки. Отже, даний винахід включає всі модифікації і еквіваленти предмета домагань, викладеного в прикладеній формулі винаходу. Додатково, будь-яка комбінація вказаних вище елементів у всіх можливих варіантах входить в об'єм домагань даного винаходу, якщо чітко не вказано інше, або якщо в контексті чітко не переглядається інше. ПОСИЛАННЯ 1. US2005/0095316A1 (Danone) 2. US2005/0095317A1 (Danone) 3. WO2007/095958A1 (Chr. Hansen А/S) 4. A.N. Hassan et al. (J. Dairy Sci: 86: 1632-1638; 2003) 5. US7560127B2 (DSM) 6. Е. Cases et al. (Journal of Food Science; Vol. 68, Nr. 8, 2003, стор. 2406-2410) 7. EP1489135A1 8. R. Scott, (1986), Cheesemaking process, second ed., Elsevier Applied Science Publishers, London and New York. 9. G. Bylund, (1995), Dairy processing handbook, Tetra Pak Processing Systems, Lund, Sweden 10. F. Kosikowski, (1982), Cheese and fermented milk foods, second ed., Kosikowski & Associates, New York. Всі посилання в даній заявці приведені в повному об'ємі. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Спосіб отримання молочного продукту, що включає: a) отримання молочного субстрату, b) обробку молочного субстрату ферментом з N-зв'язаною глікозидазною активністю, і c) ферментацію молочного субстрату мікроорганізмом, таким як молочнокислі бактерії. 2. Спосіб за п. 1, в якому стадію b) проводять перед або під час стадії с). 3. Спосіб за п. 1 або 2, в якому мікроорганізм належить до видів, вибираних з групи, що складається з: Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii підвид Bulgaricus, Lactococcus lactis, Lactococcus lactis підвид cremoris, Leuconostoc mesnteroides підвид cremoris, Pseudoleuconostoc mesenteroides підвид cremoris, Pediococcus pentosaceus, Lactococcus lactis підвид lactis біоваріант diacetylactis, Lactobacillus casei підвид Casei, Lactobacillus paracasei підвид Paracasei, Bifidobacterium bifidum, і Bifidobacterium longum. 4. Спосіб за будь-яким з пп. 1-3, в якому N-зв'язана глікозидаза являє собою глікозидазу, вибирану з групи, що складається з: пептид-N(4)-(N-ацетил-бета-глюкозаміл)аспарагінамідази (ЕС номер 3.5.1.52); альтернативні назви: N-глюкозидази-F або PNGaзи-F і ендо--Nацетилглюкозамідази Н (EC номер 3.2.1.96; альтернативна назва ENDO-H). 5. Спосіб за будь-яким з пп. 1-4, в якому молочний субстрат вибирають з групи, що складається з молока тварини і молока рослинного походження. 19 UA 112303 C2 5 10 6. Спосіб за п. 5, в якому молоко тварин являє собою молоко від корови, вівці, кози, буйволиці або верблюдиці. 7. Спосіб за п. 5, в якому молоко рослинного походження являє собою соєве молоко, вівсяне молоко, рисове молоко, мигдалеве молоко. 8. Спосіб за будь-яким з пп. 1-7, в якому молочний продукт являє собою ферментований молочний продукт. 9. Спосіб за п. 8, в якому ферментований молочний продукт являє собою щонайменше один продукт, вибираний з групи, що складається з: йогурту, йогурту на альтернативній культурі, пахти, ацидофільного молока, кефіру, кумису і домашнього сиру. 10. Молочний продукт, що містить молочний субстрат, оброблений ферментом з N-зв'язаною глікозидазною активністю і ферментований молочнокислими бактеріями. 11. Молочний продукт за п. 10, який являє собою йогурт. 12. Застосування N-зв'язаної глікозидази в способі отримання молочного продукту за будь-яким з пп. 1-9. 15 Комп’ютерна верстка О. Гергіль Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Василя Липківського, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут інтелектуальної власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 20

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Use of glycosidase in preparation of a milk product

Автори англійською

Jacobsen, Jonas, Wind, Sandra Lykke, Qvist, Karsten Bruun

Автори російською

Якобсен Йонас, Винд Сандра Люкке, Квист Карстен Бруун

МПК / Мітки

МПК: A23C 9/127, A23C 9/12

Мітки: молочного, спосіб, глікозидази, n-зв'язаної, продукту, використанням, отримання

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/22-112303-sposib-otrimannya-molochnogo-produktu-z-vikoristannyam-n-zvyazano-glikozidazi.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Спосіб отримання молочного продукту з використанням n-зв’язаної глікозидази</a>

Подібні патенти