Поліпептидний комплекс, що містить непептидильний полімер, який має три функціональні кінці

Є ще 10 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Білковий комплекс, який містить фізіологічно активний поліпептид, димерний білок і непептидильний полімер, що має три функціональні кінці, де два функціональні кінці вказаного непептидильного полімеру ковалентно зв'язані з двома N-кінцевими аміногрупами вказаного димерного білка, а третій кінець ковалентно зв'язаний з вказаним фізіологічно активним поліпептидом.

2. Білковий комплекс за п. 1, де димерний білок являє собою Fc-домен імуноглобуліну.

3. Білковий комплекс, як визначено за п. 2, де Fc-домен імуноглобуліну є аглікозилованим.

4. Білковий комплекс за п. 2, де Fc-домен імуноглобуліну складається з 1-4 різних доменів, вибраних з CH1, CH2, CH3 і CH4.

5. Білковий комплекс за п. 4, де Fc-домен імуноглобуліну додатково містить шарнірну область.

6. Білковий комплекс за п. 2, де Fc-домен імуноглобуліну вибраний з групи, що складається з Fc-доменів IgG, IgA, IgD, IgE, IgM і їх комбінацій і гібридів.

7. Білковий комплекс за п. 6, де Fc-домен імуноглобуліну вибраний з групи, що складається з Fc-доменів IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 і їх комбінацій і гібридів.

8. Білковий комплекс за п. 6, де Fc-домен імуноглобуліну присутній у формі димерів або мультимерів (комбінацій Fc імуноглобуліну), кожний з яких містить глікозиловані імуноглобуліни, що складаються з доменів однакового походження.

9. Білковий комплекс за п. 6, де Fc-домен імуноглобуліну являє собою Fc-домен IgG4.

10. Білковий комплекс за п. 9, де Fc-домен імуноглобуліну являє собою людський аглікозилований Fc-домен IgG4.

11. Білковий комплекс за п. 1, де непептидильний полімер вибраний з групи, що складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, співполімеру етиленгліколю і пропіленгліколю, поліоксіетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілетилового ефіру, таких біорозкладаних полімерів, як PLA (полімолочна кислота) і PLGA (співполімер молочної і гліколевої кислот), біорозкладаних полімерів, ліпополімерів, хітинів, гіалуронової кислоти і їх комбінацій.

12. Білковий комплекс за п. 11, де непептидильний полімер являє собою поліетиленгліколь.

13. Білковий комплекс за п. 1, де непептидильний полімер має кінцеву функціональну групу, вибрану з альдегідних груп, пропіональдегідних груп, бутилальдегідних груп, малеїнімідних груп і сукцинімідних похідних.

14. Білковий комплекс за п. 13, де непептидильний полімер має три функціональні альдегідні групи на своїх відповідних кінцях.

15. Білковий комплекс за п. 1, де три функціональні кінці непептидильного полімеру зв'язані з N-кінцевими функціональними групами Fc-домену імуноглобуліну і фізіологічно активного поліпептиду, де вказані N-кінцеві функціональні групи вибрані з групи, що складається із залишків лізину, гістидину, цистеїну і їх комбінацій.

16. Білковий комплекс за п. 1, де фізіологічно активний поліпептид вибраний з групи, що складається з гормонів, цитокінів, інтерлейкінів, зв'язуючих інтерлейкін білків, ферментів, антитіл, факторів росту, факторів транскрипції, факторів крові, вакцин, структурних білків, білків-лігандів, рецепторів, антигенів поверхні клітин, антагоністів рецепторів і їх похідних або аналогів.

17. Білковий комплекс за п. 16, де фізіологічно активний поліпептид вибраний з групи, що складається з людських гормонів росту, гормонів, що вивільняють гормон росту, пептидів, що вивільняють гормон росту, інтерферонів і рецепторів інтерферону, колонієстимулюючих факторів, глюкагоноподібних пептидів, пептидів ексендину-4, ANP, BNP, CNP, DNP, зв'язаних з G білком рецепторів, інтерлейкінів і рецепторів інтерлейкіну, ферментів, зв'язуючих інтерлейкіни білків, зв'язуючих цитокіни білків, факторів активації макрофагів, пептидів макрофагів, факторів В-клітин, факторів Т-клітин, білка А, інгібіторів алергії, глікопротеїнів некрозу клітин, імунотоксинів, лімфотоксинів, фактора некрозу пухлини, супресорів пухлин, трансформуючого фактора росту, антитрипсину альфа-1, альбуміну, α-лактальбуміну, аполіпопротеїну-Е, еритропоетину, високоглікозилованого еритропоетину, ангіопоетинів, гемоглобіну, тромбіну, активуючих рецептори тромбіну пептидів, тромбомодуліну, фактора крові VII, VIIa, VIII, IX і XIII, активаторів плазміногена, зв'язуючих фібрин пептидів, урокінази, стрептокінази, гірудину, білка С, С-реактивного білка, інгібітору реніну, інгібітору колагенази, супероксиддисмутази, лептину, тромбоцитарного фактора росту, епітеліального фактора росту, епідермального фактора росту, ангіостатину, ангіотензину, фактора росту кістки, стимулюючого ріст кісток білка, кальцитоніну, інсуліну, соматостатину, октреотиду (агоніста соматостатину), атріопептину, індукуючого утворення хряща фактора, елкатоніну, фактора активації сполучної тканини, інгібітору шляху тканинного фактора, фолікулостимулюючого гормону, лютеїнізуючого гормону, гормону, що вивільняє лютеїнізуючий гормон, факторів росту нервової тканини, паратиреоїдного гормону, релаксину, секретину, соматомедину, інсуліноподібного фактора росту, адренокортикального гормону, глюкагону, холецистокініну, панкреатичного поліпептиду, вивільняючого гастрин пептиду, вивільняючого кортикотропін фактора, тиреоїдстимулюючого гормону, аутотаксину, лактоферину, міостатину, рецепторів, антагоністів рецепторів, антигенів поверхні клітин, антигенів одержаних з вірусів вакцин, моноклональних антитіл, поліклональних антитіл, фрагментів антитіл.

18. Білковий комплекс за п. 17, де фізіологічно активний поліпептид вибраний з групи, що складається з людських гормонів росту, інтерферону-альфа, інтерферону-бета, гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора, еритропоетину, ексендину-4, імідазолацетилу пептиду ексендину-4 (агоніста ексендину-4), кальцитоніну, октреотиду (агоніста соматостатину), BNP і Fab'-фрагмента.

19. Спосіб одержання білкового комплексу, що складається з фізіологічно активного поліпептиду, димерного білка і непептидильного полімеру, що має три функціональні кінці, де два функціональні кінці вказаного непептидного полімеру ковалентно зв’язані з двома N-кінцевими аміногрупами вказаного димерного білка, а третій кінець ковалентно зв'язаний з вказаним фізіологічно активним поліпептидом,  який включає в себе:

(1) ковалентне приєднання двох функціональних кінців непептидильного полімеру до протилежних N-кінцевих аміногруп димерного білка з утворенням кон'югата,

(2) виділення з реакційної суміші зі стадії (1) кон'югата, в якому димерний білок ковалентно приєднаний по своїх N-кінцях до непептидильного полімеру, і

(3) ковалентного приєднання фізіологічно активного поліпептиду до одного вільного функціонального кінця непептидильного полімеру виділеного кон'югата.

20. Спосіб за п. 19, де димерний білок являє собою Fc-домен імуноглобуліну.

21. Спосіб за п. 19, де непептидильний полімер має три функціональні альдегідні групи на своїх відповідних кінцях.

22. Спосіб за п. 19, де на стадії (1) проводять реакцію димерного білка з непептидильним полімером в молярному співвідношенні від 1:2 до 1:5.

23. Спосіб за п. 19, де на стадії (3) проводять реакцію кон'югата з фізіологічно активним поліпептидом в молярному співвідношенні від 1:0,5 до 1:0,05.

24. Спосіб за п. 19, де реакції на обох стадіях (1) і (3) проводять в присутності відновлювального засобу.

25. Спосіб за п. 24, де відновлювальний засіб вибраний з групи, що складається з ціаноборогідриду натрію (NaCNBH3), борогідриду натрію, борату диметиламіну і борату піридину.

26. Фармацевтична композиція, яка містить білковий комплекс за будь-яким з пп. 1-18 і, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій.

27. Білковий комплекс, одержаний з використанням способу за будь-яким з пп. 19-25.

Текст

Реферат: Винахід належить до білкового комплексу, який містить фізіологічно активний поліпептид, димерний білок і непептидильний полімер, що має три функціональні кінці, де два функціональні кінці вказаного непептидильного полімеру ковалентно зв'язані з двома Nкінцевими аміногрупами вказаного димерного білка, а третій кінець ковалентно зв'язаний з UA 101670 C2 (12) UA 101670 C2 вказаним фізіологічно-активним поліпептидом. Білковий комплекс забезпечує тривало діючу активність і біостабільність фізіологічно активного поліпептиду, значно поліпшує час напівжиття в сироватці поліпептидів або пептидів, може застосовуватися для розробки складів з уповільненим вивільненням різних фізіологічно-активних поліпептидних лікарських засобів. Винахід також належить до способу отримання зазначеного білкового комплексу та фармацевтичної композиції, що містить зазначений білковий комплекс. UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Галузь техніки Даний винахід належить до білкового комплексу фізіологічно активного поліпептиду з димерним білком, що забезпечує тривало діючу активність. Більш конкретно, даний винахід стосується білкового комплексу, в якому фізіологічно активний поліпептид і димерний білок зв'язані з непептидильним полімером, що має три функціональні кінці (3 плеча), за допомогою відповідного ковалентного зв'язку, і способу його одержання. Рівень техніки Через низьку стабільність, поліпептиди, як правило, схильні до денатурації і деградації протеазами і втрачають свою активність. З іншого боку, пептиди є відносно невеликими за розміром, так що вони легко виділяються через нирки. Щоб підтримувати їх бажаний рівень концентрацій в крові і титри, таким чином, білкові лікарські засоби, що містять поліпептиди або пептиди як активні інгредієнти, необхідно вводити часто. Однак, оскільки білкові лікарські засоби існують, здебільшого, у формі, придатній для ін'єкцій, для підтримання відповідних рівнів в крові фізіологічно активних поліпептидів або пептидів необхідні часті ін'єкції, що викликають значний біль у пацієнта. Щоб подолати ці проблеми, зроблені спроби забезпечення максимальних лікувальних ефектів за допомогою збільшення стабільності білкових лікарських засобів в крові і за допомогою підтримання високих рівнів лікарського засобу в крові протягом тривалого періоду часу. Необхідно, щоб ці засоби для довговічності білкових лікарських засобів не тільки збільшували стабільність білкових лікарських засобів і підтримували достатні титри самих лікарських засобів, але також не викликали імунних відповідей у пацієнтів. Загальноприйнятим чином, високорозчинні полімери, такі як поліетиленгліколь (PEG), хімічно прищеплюють на поверхню білків з метою стабілізації білків, запобігаючи контактуванню протеаз з білками і супресуючи втрату пептидів малого розміру в нирках. Прищеплений до специфічної ділянки або до множини різних ділянок білків PEG є застосовним для стабілізації і запобігання гідролізу білків без створення побічних ефектів, що заслуговують уваги. Крім того, прищеплений PEG збільшує молекулярну масу білків, таким чином, обмежуючи втрату білків в нирках і підтримуючи фізіологічну активність білків. Наприклад, в WO 2006/076471 описане застосування натрійуретичного пептиду В-типу (BNP) в лікуванні застійної серцевої недостатності. BNP зв'язується з рецептором А натрійуретичного пептиду (NPR-A) для запуску синтезу cGMP, таким чином, зменшуючи артеріальний кров'яний тиск. Описано, що при пегилюванні BNP продовжується його фізіологічна активність на тривалий період часу. У патенті США № 6924264 описане також збільшення періоду активності ексендину-4 за допомогою щеплення PEG на залишок лізину. Щоб збільшити його фізіологічну активність, лікарський поліпептид приєднують до обох кінців PEG для формування біс-кон'югата (Патент США № 5738846). З іншого боку, два різних лікарських білки приєднують до відповідних кінців PEG для формування білкового комплексу, що має два різні види фізіологічної активності (WO 92/16221). Однак не виявлено значущості цих білкових лікарських засобів відносно підтримання активності. Опубліковано також, що збільшена стабільність злитого білка, в якому G-CSF і альбумін людини приєднані до одного PEG (Kinstler et al., Pharmaceutical Research 12(12): 1883-1888, 1995). Однак, виявлено, що у модифікованого лікарського засобу зі структурою G-CSF-PEGальбумін час утримання збільшений тільки приблизно в чотири рази в порівнянні з природними лікарськими засобами окремо, і час напівжиття в сироватці тільки слабо збільшений. Таким чином, модифікований лікарський засіб не застосовують на практиці як довговічний засіб. При з'єднанні з PEG, пептиди стають настільки стабільними, щоб продовжити свою персистенцію in vivo. Однак, при наданні високої молекулярної маси, PEG робить титр фізіологічно активного пептиду значно низьким і зменшує реакційну здатність відносно пептидів, приводячи до низького виходу. Альтернативно, для збільшення стабільності фізіологічно активних білків in vivo вдаються до генної рекомбінації. Ген, що кодує білок, високостабільний в крові, зв'язують з геном, що кодує цікавлячий фізіологічно активний білок, з подальшою трансформацією клітин тварин, які потім культивують для продукції злитого білка. Наприклад, злитий білок, в якому альбумін або його фрагмент, відомий як найбільш ефективний для стабілізації білків до теперішнього часу, злитий з фізіологічно активним цікавлячим білком (WO 93/15199 і 93/15200, Публікація EP № 413622). А також, у злитого білка з інтерферону-альфа і альбуміну, продукованого в Human Genome Sciences (торгове найменування Альбуферон), збільшений час напівжиття в сироватці від 5 годин до 93 годин, але він має критичний недолік зменшення біологічної активності до менше ніж 5 % активності наївного інтерферону (Osborn et al., J. Phar. Exp. Ther. 303(2): 540-548, 2002). 1 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Що стосується пептидів, їх модифікації згадані в WO 02/46227, де описано, що GLP-1, ексендин-4 і їх аналоги зливають з людським сироватковим альбуміном або фрагментами імуноглобуліну (Fc) з використанням способів генетичної рекомбінації, і в Патенті США № 6756480, де описані злиті білки з паратиреоїдного гормону (PTH) або його аналогів і фрагментів імуноглобуліну (Fc). Цими способами можна долати низький вихід пегилювання і неспецифічність, але вони мають ті недоліки, що час напівжиття в сироватці не є значно збільшеним, і в деяких випадках приводять до низьких титрів. Різні пептидні лінкери використовують для максимального збільшення часу напівжиття в сироватці, але вони мають високу здатність викликати імунні відповіді. При введенні, пептид, що має дисульфідний зв'язок, такий як BNP, з високою імовірністю індукує неправильне згортання і таким чином, його важко застосовувати. Відомо також, що інші різні злиті білки одержують приєднанням Fc-домену імуноглобуліну до інтерферону (Публікація патенту Кореї № 2003-9464), рецептора інтерлейкіну-4, рецептора інтерлейкіну-7 або рецептора еритропоетину (Патент Кореї № 249572) за допомогою генетичної рекомбінації. У Патентній публікації PCT № WO 01/03737 описаний злитий білок, в якому цитокін або фактор росту приєднаний за допомогою олігопептидного лінкера до Fc-фрагмента імуноглобуліну. У патенті США № 5116964 описаний LHR (глікопротеїн поверхні клітин лімфоцитів) або білок CD4, який зливають з N- або С-кінцем Fc-домену імуноглобуліну з використанням способу генетичної рекомбінації. А також, в Патенті США № 5349053 описаний злитий білок, в якому IL-2 приєднаний до Fc-домену імуноглобуліну. Описана множина інших злитих з Fc білків, сконструйованих з використанням способів генетичної рекомбінації, приклади яких включають в себе злитий білок з Fc-домену імуноглобуліну з інтерфероном-бета або його похідне (Патентна публікація PCT № WO 00/23472), Fc-домену імуноглобуліну з рецептором IL5 (Патент США № 5712121), Fc-домену імуноглобуліну G4 з інтерфероном-альфа (Патент США № 5723125) і Fc-домену імуноглобуліну G2 з білком CD4 (Патент США № 6451313). З іншого боку, в Патенті США № 5605690 пояснене застосування модифікованого Fc-домену імуноглобуліну для продукції злитих білків. Наприклад, Fc імуноглобуліну з амінокислотними залишками, модифікованими, зокрема, до ділянок зв'язування комплементу або до ділянок зв'язування рецептора, використовують для одержання злитого білка TNFR-Fc IgG1 з використанням способу генетичної рекомбінації. Інші злиті білки з модифікованим Fc-доменом імуноглобуліну, одержані з використанням способів генетичної рекомбінації, описані в Патентах США №№ 6277375, 6410008 і 6444792. Імуноглобуліни функціонують як антитіла, викликаючи антитілозалежну клітинну цитотоксичність (ADCC) або комплементзалежну цитотоксичність (CDC), і опубліковано, що ланцюги цукру, присутні в Fc-домені імуноглобуліну, грають важливу роль в ADCC і CDC (Burton D., Molec. Immun. 22, 161-206,1985). Відомо, що імуноглобуліни самі по собі, вільні від ланцюгів цукрів, мають схожість за часом напівжиття в сироватці з імуноглобулінами, що мають ланцюги цукрів, але мають 10-1000-кратне зменшення сили зв'язування комплементу і сили зв'язування рецептора (Waldmann Н., Eur. J. Immunol. 23, 403-411, 1993; Morrison S., J. Immunol. 143, 25952601, 1989). У Патенті США № 6660843 описане злиття Fc-домену з цікавлячим пептидом за допомогою лінкера і продукція злитого білка в Е. coli з використанням способу генної рекомбінації. У випадку використання для одержання комплексів, лінкер дозволяє відбір ділянок кон'югації між двома цікавлячими білками і їх орієнтацію і дозволяє одержання комплексів у формі гомогенних або гетерогенних мономерів, димерів або мультимерів. Крім того, при використанні цього способу, можна одержувати комплекси з більш низькою вартістю, ніж при використанні клітин ссавців. Крім того, можна одержувати комплекси у вільних від ланцюгів цукрів формах. Однак, через одночасну продукцію цікавлячого білка і Fc-домену імуноглобуліну в Е. coli, цей спосіб складно застосовувати до білка-мішені, коли природна форма білка-мішені має ланцюг цукрів. Приймаючи переваги тілець включення, цей спосіб дуже схильний до індукції неправильного згортання. У злитих з Fc білках, одержаних з використанням способів генетичної рекомбінації, злиття можливе тільки в конкретних ділянках, тобто на N- або С-кінці Fc-домену імуноглобуліну. Злиті з Fc білки експресуються тільки в формах гомогенних димерів, але не в мономерних формах. Крім того, злиття можливе тільки між глікозилованими білками або між аглікозилованими білками, але неможливе між глікозилованими білками і аглікозилованими білками. Якщо вона присутня, амінокислотна послідовність, знову сформована внаслідок злиття, може індукувати імунну відповідь. Більше того, лінкер може бути чутливим до ферментативної деградації. При розробці злитих білків з використанням Fc-доменів імуноглобулінів, ніде в попередніх публікаціях не робили спроб одержати комплекси білків-мішеней з природним Fc людини за 2 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 допомогою зшивального агента. Fc-домени імуноглобулінів можна одержувати в клітинах ссавців або Е. coli з використанням способів генетичної рекомбінації, але ніде в попередніх публікаціях не робили спроб одержати тільки природні Fc-домени імуноглобулінів, вільні від білків-мішеней, з високим виходом і переводити їх в довговічні форми. Крім того, не робили спроб одержати комплекси рекомбінантного Fc імуноглобуліну з білками-мішенями за допомогою зшивальних агентів. Як такі, множину різних способів здійснювали для кон'югації фізіологічно активних поліпептидів з полімерами. У загальноприйнятих способах можна поліпшувати стабільність поліпептидів, але зі значним зменшенням активності, або можна поліпшувати активність незалежно від стабільності. Таким чином, все ще існує необхідність способу для збільшення стабільності білкових лікарських засобів з мінімальним зменшенням індукованої модифікацією активності. У цьому контексті, автори даного винаходу розробили білковий комплекс з високою активністю, час напівжиття в сироватці якого поліпшений, за допомогою приєднання імуноглобуліну і фізіологічно активного поліпептиду, відповідно, до протилежних кінців непептидильного лінкера, як описано в Патентах Кореї №№ 10-0725315 і 10-0775343, повний зміст яких наведений як посилання. Білковий комплекс, в якому імуноглобулін і фізіологічно активний поліпептид, відповідно, приєднані до протилежних кінців непептидильного лінкера, загальноприйнятим чином одержують приєднанням непептидильного полімеру переважно до фізіологічно активного поліпептиду і потім до Fc-домену імуноглобуліну. Однак, цей загальноприйнятий спосіб приводить до множини небажаних забруднень, крім того, приводить до втрати великої кількості фізіологічно активного поліпептиду. Тобто, загальноприйнятий спосіб є економічно невигідним при його промисловому застосуванні, і одержаний комплекс необхідно очищати до деякої міри складним способом. У випадку, коли фізіологічно активний поліпептид присутній у формі димеру, він утворює форму містка з непептидильним полімером на обох кінцях, так що він не може утворювати комплекс з Fc імуноглобуліну або може утворювати комплекс, але з дуже низьким виходом. З іншого боку, коли Fc-домен імуноглобуліну спочатку приєднують до непептидильного полімеру, також виникають схожі проблеми. Оскільки Fc імуноглобуліну являє собою гомодимер з двома N-кінцями в близькому сусідстві один з одним, відповідні зв'язки формуються між двома N-кінцями Fc імуноглобуліну і протилежними кінцями непептидильного полімеру з утворенням форми містка, так що не залишається функціональних кінців для реакції з фізіологічно активним поліпептидом. Відповідно, вихід продукції значно зменшується. Опис винаходу Технічна проблема Інтенсивні і ретельні дослідження білкових комплексів, що привели до даного винаходу, які наводяться авторами даного винаходу, що мають на меті подолання проблем, які зустрічаються в попередній галузі техніки, привели до виявлення того, що застосування непептидильного полімеру з 3 плечима як лінкера для одержання білкового комплексу, що складається з димерного білка і фізіологічно активного поліпептиду, запобігає втратам фізіологічно активного поліпептиду зі значним збільшенням виходу продукції, дозволяє очищення комплексу простим способом і надає структурну стабільність білковому комплексу з подовженням часу напівжиття в сироватці при збереженні в той же самий час його біологічної активності. Розв'язання проблеми Таким чином, метою даного винаходу є надання білкового комплексу, в якому фізіологічно активний поліпептид, непептидильний полімер з 3 плечима і димерний білок зв'язані ковалентним зв'язком, і способу його одержання. Іншою метою даного винаходу є надання засобу для продовження довговічності білкового лікарського засобу, що містить білковий комплекс, який продовжує час напівжиття в сироватці фізіологічно активного поліпептиду при збереженні його біологічної активності. Корисні ефекти винаходу Маючи структуру, в якій фізіологічно активний поліпептид і димерний білок приєднані до непептидильного полімеру з 3 плечима за допомогою ковалентних зв'язків, білковий комплекс за даним винаходом може підтримувати високу концентрацію активного поліпептиду в крові протягом тривалого періоду часу, надаючи стабільні лікувальні ефекти. Крім того, спосіб одержання білкового комплексу відповідно до даного винаходу може значно зменшувати кількість фізіологічно активного поліпептиду, необхідного за загальноприйнятим способом з використанням непептидильного полімеру з 2 плечима, і в порівнянні із загальноприйнятим способом, користується перевагою включення більш простих способів очищення і значного збільшення виходу продукції. Зокрема, персистуючі білкові 3 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 комплекси з димерними, фізіологічно активними поліпептидами переважно одержували з використанням способу за даним винаходом. Короткий опис креслень На фіг. 1 показане репрезентативне зображення білкового комплексу з використанням непептидильного полімеру, що має три функціональні кінці (3 плеча). На фіг. 2 показана ефективність in vivo комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечимаОктреотиду(N) на графіках (HM11760B: комплекс Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечимаОктреотиду(N), Сандостатин-LAR: склад з уповільненим вивільненням октреотиду). На фіг. 3 показана ефективність in vivo комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечимаFSH(N) (HM12160A: комплекс Fc імуноглобуліну-PEG з 2 плечима-FSH(N), HM12160B: комплекс Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N)). Найкращий спосіб здійснення винаходу Відповідно до його аспектів, даний винахід стосується білкового комплексу, в якому фізіологічно активний поліпептид і димерний білок ковалентно приєднані до непептидильного полімеру з 3 плечима. Як застосовують в цьому документі, термін "білковий комплекс" або "комплекс" призначений для позначення структури, що складається з щонайменше одного фізіологічно активного поліпептиду, щонайменше одного непептидильного полімеру з 3 плечима і щонайменше одного димерного білка, із з'єднанням між ними за допомогою ковалентних зв'язків. Щоб відрізняти від "комплексу", термін "кон'югат" застосовують в цьому документі для позначення структури, в якій тільки пари фізіологічно активного поліпептиду, непептидильного полімеру і димерного білка з'єднані між собою за допомогою ковалентного зв'язку. Білковий комплекс за даним винаходом являє собою білковий лікарський засіб, модифікований для збільшення його персистенції in vivo і мінімального зменшення його біологічної активності. Даний винахід стосується застосування непептидильного полімеру з 3 плечима для з'єднання за допомогою нього фізіологічно активного поліпептиду і димерного білка для утворення білкового комплексу, таким чином дозволяючи застосування способу одержання, за допомогою якого можна запобігати втратам фізіологічно активного поліпептиду, і білковий комплекс може бути настільки структурно стабільним, щоб його можна було легко очищати. Як застосовують в цьому документі, термін "димерний білок" означає білок з двома Nкінцями. Переважним є Fc-домен імуноглобуліну, який можна використовувати як носій. Фізіологічно активні гомодимери або гетеродимери також включені в обсяг димерного білка. Fc-домен імуноглобуліну є досить стабільним для використання як носія для лікарського засобу, оскільки він є біологічно розкладаним поліпептидом, що піддається метаболізму in vivo. Крім того, завдяки відносно невеликій молекулярній масі, Fc-домен імуноглобуліну має переваги в порівнянні з повними молекулами імуноглобуліну відносно виділення, очищення і виходу комплексу. Крім того, оскільки він є вільним від Fab, який дуже відрізняється по амінокислотній послідовності між антитілами, Fc дуже сприяє гомогенності комплексу і, як очікують, знижує індукцію антигенності. Термін "Fc-домен імуноглобуліну", як застосовують в цьому документі, призначений для позначення константного домену 2 важкого ланцюга (CH2) і константного домену 3 важкого ланцюга (CH3), які вільні від варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга, константного домену 1 важкого ланцюга (CH1) і константного домену 1 легкого ланцюга (CL1) і можуть містити шарнірну область. Fc-домен імуноглобуліну за даним винаходом може являти собою подовжений Fc-домен, що додатково містить частковий або повний константний домен 1 важкого ланцюга (CH1) і/або константний домен 1 легкого ланцюга (CL1) і вільний від варіабельних доменів важкого і легкого ланцюга, якщо він забезпечує ефект, по суті такий же або більш сильний в порівнянні з ефектом природної форми. Альтернативно, Fc-домен може являти собою укорочену форму CH2 і/або CH3 з відсутністю значної частини відповідної амінокислотної послідовності. Для узагальнення, Fc-домен імуноглобуліну за даним винаходом може являти собою 1) CH1 домен, CH2 домен, CH3 домен і CH4 домен, 2) CH1 домен і CH2 домен, 3) CH1 домен і CH3 домен, 4) CH2 домен і CH3 домен, 5) комбінацію одного або декількох доменів і шарнірної області імуноглобуліну (або частини шарніра) або 6) димер, що складається з кожного з константного домену легкого ланцюга і константного домену легкого ланцюга. Крім того, термін "Fc-домен імуноглобуліну", як застосовують в цьому документі, призначений, щоб включати не тільки природні амінокислотні послідовності, але також їх мутанти. Мутант амінокислотної послідовності означає амінокислотну послідовність, відмінну від природної послідовності делецією, вставкою, неконсервативною або консервативною заміною одного або декількох амінокислотних залишків або їх поєднаннями. Наприклад, 4 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 амінокислотні залишки в положеннях 214-238, 297-299, 318-322 або 327-331 Fc IgG, відомі як такі, що грають важливу роль в зв'язуванні антитіла, можна модифікувати так, щоб використовувати як придатні ділянки зв'язування. Крім того, можливі різні мутанти, наприклад, з відсутністю залишку, що формує дисульфідний зв'язок, або декількох N-кінцевих амінокислот природного Fc, або з додатковим залишком метіоніну на N-кінці природного Fc. Крім того, ефекторні функції можна припиняти видаленням зв'язуючого комплемент мотиву, наприклад зв'язуючого C1q мотиву, або мотиву ADCC (антитілозалежної опосередковуваної клітинами цитотоксичності). Можна зробити посилання на WO 97/34631 і WO 96/32478 відносно одержання мутантів амінокислотної послідовності Fc-доменів імуноглобулінів. Заміни амінокислот, що не змінюють активність природних білків або пептидів, загалом відомі в даній галузі (Neurath H., Hill R. L., The Proteins, Academic Press, New York, 1979). Найбільш типові заміни відбуваються між Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu і Asp/Gly. При необхідності, амінокислоти можна піддавати модифікації, такій як фосфорилування, сульфатування, акрилування, глікозилування, метилування, фарнезилування, ацетилювання, амідування і т. д. Вищеописані мутанти Fc, переважно, являють собою функціональні еквіваленти їх природних форм, таким чином, є схожими по біологічній активності, з поліпшенням стабільності структури відносно нагрівання і pH. Fc-домен може являти собою природну форму, виділену з людини і інших тварин, включаючи корів, кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів і морських свинок, або може бути рекомбінантним або похідним з них, одержаним з трансформованих клітин тварин або мікроорганізмів. У першому випадку, тотальний імуноглобулін виділяють з людей або тварин, з подальшою обробкою протеазою. При обробці папаїном тотальний імуноглобулін розділяють на Fab і Fc. Пепсин розщеплює тотальний імуноглобулін на pF'c і F(ab) 2. Від цих фрагментів Fc або pF'c можна відділити з використанням ексклюзійної хроматографії. Переважним є рекомбінантний Fc-домен імуноглобуліну, одержаний з Fc-домену людини в мікроорганізмах. Fc-домен імуноглобуліну, застосовний за даним винаходом, може мати ланцюг цукрів, який по довжині менший, рівний або більш довгий, ніж в природному Fc-домені, або може не мати ланцюгів цукрів. Додавання, зменшення або видалення ланцюга цукрів Fc імуноглобуліну можна здійснювати з використанням загальноприйнятого способу, такого як хімічний спосіб, ферментативний спосіб або спосіб генетичної рекомбінації з використанням мікроорганізму. Деглікозилований Fc-домен імуноглобуліну має значно зменшену силу зв'язування комплементу (C1q) і має малу або не має антитілозалежної опосередковуваної клітинами цитотоксичності або комплементзалежної цитотоксичності, і таким чином, не індукує непотрібних імунних відповідей. У цьому контексті, деглікозиловані або аглікозиловані Fc-домени імуноглобулінів переважно відповідають функціонуванню як носії лікарського засобу. Як застосовують в цьому документі, термін "дегликозилування" стосується ферментативного видалення ланцюга цукрів з природного Fc. Термін "аглікозилування" стосується відсутності ланцюгів цукрів в Fc-домені через його продукцію в еукаріотах і переважно в Е. coli. Fc-домен імуноглобуліну може походити з тварин, включаючи людину, корів, кіз, свиней, мишей, кроликів, хом'яків, щурів і морських свинок, при перевазі людського походження. Крім того, Fc-домен імуноглобуліну, застосовний за даним винаходом, можна одержувати з IgG, IgA, IgD, IgE, IgM і їх комбінацій або їх гібридів. Переважно, його одержують з IgG або IgM, які є більш поширеними, ніж інші типи імуноглобулінів, і найбільш переважно з IgG, який, як відомо, продовжує час напівжиття в сироватці зв'язуючих ліганд білків. Крім того, Fc-домен імуноглобуліну може існувати у формі димерів або мультимерів (комбінацій Fc імуноглобуліну), кожний з яких містить глікозиловані імуноглобуліни, що складаються з доменів одного і того ж походження. Термін "комбінація", як застосовують в цьому документі, означає, що поліпептиди, які кодують одноланцюжкові Fc-фрагменти імуноглобуліну одного і того ж походження, приєднані до одноланцюжкового поліпептиду іншого походження для формування димеру або мультимеру. Тобто, димер або мультимер можна одержувати комбінацією двох або більше фрагментів, вибраних з Fc-фрагментів Fc IgG, Fc IgA, Fc IgM, Fc IgD і Fc IgE. Термін "гібрид", як застосовують в цьому документі, означає, що послідовності, які кодують два або більше Fc-фрагментів імуноглобулінів різного походження, присутні в одноланцюжковому Fc-фрагменті імуноглобуліну. За даним винаходом можливі різні гібридні форми. Наприклад, Fc-домен складається з від одного до чотирьох різних доменів, вибраних з CH1, CH2, CH3 і CH4 Fc IgG, Fc IgM, Fc IgA, Fc IgE і Fc IgD, і може містити шарнірну область. 5 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 IgG також далі розділяють на підкласи IgG1, IgG2, IgG3 і IgG4, і їх комбінації або гібриди передбачені за даним винаходом. Переважним є Fc-домен IgG2 або IgG4, з найбільшою перевагою Fc-домену IgG4, вільного від ефекторних функцій, таких як комплементзалежна цитотоксичність (CDC). Відповідно, аглікозилований Fc-домен IgG4 людини є найбільш переважним носієм лікарського засобу. Fc-домен людського походження є переважним в порівнянні з Fc-доменом походження, що не належить до людини, оскільки останній може діяти як антиген в організмі, індукуючи продукцію антитіл проти нього. Даний винахід стосується приєднання білкового лікарського засобу до димерного білка за допомогою непептидильного полімеру. За даним винаходом, непептидильний полімер означає біосумісний полімер, що складається з двох або більше повторюваних одиниць, приєднаних одна до одної за допомогою ковалентного зв'язку, відмінного від пептидного зв'язку. Загальноприйняті пептидильні лінкери, використовувані в злитих білках, одержаних за допомогою злиття в рамці зчитування, мають недолік простого розщеплення in vivo протеазами, що приводить до неможливості забезпечення часу напівжиття в сироватці активного лікарського засобу настільки довгого, якого чекають, коли носій залишається інтактним. На відміну від цього, полімер за даним винаходом є стійким до ферментативної деградації, підтримуючи час напівжиття в сироватці лікарського засобу настільки довгим, як це забезпечується, коли носій залишається інтактним. Доти, поки він діє, як згадано вище, тобто є стійким до протеаз in vivo, будь-який полімер можна використовувати за даним винаходом без застосування до нього обмежень. Молекулярна маса непептидильного полімеру, застосовного за даним винаходом, лежить в діапазоні від 1 до 100 кДа і переважно від 1 до 20 кДа. Непептидильний полімер за даним винаходом, який кон'югують з Fc-доменом імуноглобуліну, може являти собою полімер або комбінацію різних полімерів. Приклади непептидильного полімеру, застосовного за даним винаходом, включають в себе такі біорозкладані полімери, як поліетиленгліколь, поліпропіленгліколь, співполімер етиленгліколю і пропіленгліколю, поліоксіетилований поліол, полівініловий спирт, полісахарид, декстран, полівінілетиловий ефір, такі біорозкладані полімери, як PLA (полімолочна кислота) і PLGA (співполімер молочної і гліколевої кислот), ліпополімери, хітини, гіалуронова кислота і їх комбінації, з перевагою поліетиленгліколю. Крім того, їх похідні, які відомі в даній галузі або які можна легко одержати з використанням загальноприйнятого способу, включені в обсяг даного винаходу. Непептидильні полімери, застосовувані за даним винаходом, мають функціональні групи, з якими може зв'язуватися Fc-домен імуноглобуліну і білковий лікарський засіб. На відміну від попередніх способів одержання білкового комплексу з використанням непептидильного полімеру, що має два функціональні кінці (2 плеча) (Патент Кореї № 100725315), даний винахід стосується непептидильного полімеру з 3 плечима. На відміну від загальноприйнятого непептидильного полімеру, який має один функціональний кінець і відгалуження від корової молекули, непептидильний полімер, застосовний за даним винаходом, має три функціональні кінці, з яких два відповідають за формування ковалентних зв'язків з димерним білком, в той час як один, що залишився, ковалентно приєднаний до фізіологічно активного поліпептиду. Більш детально, оскільки Fc імуноглобуліну являє собою гомодимер з двома N-кінцями в близькому сусідстві один з одним, відповідні зв'язки формуються між двома N-кінцями Fc імуноглобуліну і протилежними кінцями непептидильного полімеру. Таким чином, коли непептидильний полімер з 2 плечима спочатку формує ковалентні зв'язки з Fc-доменом імуноглобуліну, не залишається функціональних кінців, які можуть вступати в реакцію з фізіологічно активним поліпептидом, що приводить до значного зменшення виходу продукції. Таким чином, проводять реакцію фізіологічно активного поліпептиду, до непептидильного полімеру з 2 плечима, з Fc-доменом імуноглобуліну. Однак, коли попередньо проводять реакцію з фізіологічно активним поліпептидом, утворюється множина небажаних домішок, таким чином, приводячи до втрати фізіологічно активного поліпептиду. На відміну від цього, є можливим проводити реакцію непептидильного полімеру з 3 плечима з Fc-доменом імуноглобуліну до реакції з фізіологічно активним поліпептидом, оскільки два з трьох його функціональних кінців відповідають за два N-кінці Fc імуноглобуліну, в той час як його функціональний кінець, що залишився, може націлюватися на фізіологічно активний поліпептид. Таким чином, можна одержувати білковий комплекс з високим виходом. На практиці, виявили, що вихід продукції збільшується в два-дев'ять разів в порівнянні із застосуванням непептидильних полімерів з 2 плечима. 6 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Три кінцеві функціональні групи непептидильного полімеру можуть зв'язуватися з N-кінцем, вільними залишками лізину, гістидину або цистеїну Fc-домену імуноглобуліну і фізіологічно активного поліпептиду. Переважно, три кінцеві функціональні групи непептидильних полімерів вибирають з альдегідних груп, пропіональдегідних груп, бутилальдегідних груп, малеїнімідних груп і сукцинімідних похідних. Приклади сукцинімідних похідних, застосовних за даним винаходом, включають в себе сукцинімідилпропіонат, гідроксисукцинімідил, сукцинімідилкарбоксиметил і сукцинімідилкарбонат. Переважними є альдегідні групи. При присутності на трьох кінцях непептидильного полімеру, реакційноздатні альдегідні групи можуть мінімізувати неспецифічні реакції і є ефективними для формування зв'язків між фізіологічно активним поліпептидом і димерним білком. Крім того, кінцевий продукт, утворений за допомогою відновлювального алкілування за допомогою альдегіду, є набагато більш стабільним, ніж продукт, утворений за допомогою амідних зв'язків. Як правило, альдегідні функціональні групи вибірково реагують з Nкінцями при низькому pH, в той час як формують ковалентний зв'язок із залишком лізину при високому pH, наприклад pH 9,0. Три кінцеві функціональні групи непептидильного полімеру можуть бути однаковими або відмінними одна від одної. Відповідно до даного винаходу, кон'югат димерного білка з непептидильним полімером приєднують до фізіологічно активного поліпептиду з формуванням білкового комплексу. У цьому документі терміни "фізіологічно активний поліпептид", "фізіологічно активний білок", "активний білок", "активний поліпептид" або "білковий лікарський засіб" означають поліпептид, пептид або білок, що мають деяку антагоністичну активність проти фізіологічної події in vivo, і ці терміни можна використовувати взаємозамінно. Фізіологічно активні поліпептиди, застосовні в білковому комплексі за даним винаходом, можна проілюструвати прикладами гормонів, цитокінів, інтерлейкінів, зв'язуючих інтерлейкін білків, ферментів, антитіл, факторів росту, факторів транскрипції, факторів крові, вакцин, структурних білків, білків-лігандів, рецепторів, антигенів поверхні клітин, антагоністів рецепторів і їх похідних або аналогів. Конкретні приклади фізіологічно активних поліпептидів, застосовних за даним винаходом, включають в себе людські гормони росту, гормони, що вивільняють гормон росту, пептиди, що вивільняють гормон росту, інтерферони і рецептори інтерферону (наприклад, інтерферон-α, -β і -γ, розчинні рецептори інтерферону типу I), колонієстимулюючі фактори, глюкагоноподібні пептиди (GLP-1 і т. д.), пептиди ексендину-4, ANP, BNP, CNP, DNP, зв'язані з G білком рецептори, інтерлейкіни (наприклад, інтерлейкін-1,-2,-3,-4,-5,-6,-7,-8,-9,-10,-11,-12,-13,-14,-15,16,-17,-18,-19,-20,-21,-22,-23,-24,-25,-26,-27,-28,-29,-30) і рецептори інтерлейкіну (наприклад, рецептор IL-1, рецептор IL-4 і т. д.), ферменти (наприклад, глюкоцереброзидаза, ідуронат-2сульфатаза, α-галактозидаза-А, α-L-ідуронідаза, бутирилхолінестераза, хітиназа, глутаматдекарбоксилаза, іміглюцераза, ліпаза, уриказа, ацетилгідролаза фактора активації тромбоцитів, нейтральна ендопептидаза, мієлопероксидаза і т. д.), зв'язуючі інтерлейкіни і цитокіни білки (наприклад, IL-18bp, зв'язуючий TNF білок і т. д.), фактори активації макрофагів, пептиди макрофагів, фактори В-клітин, фактори Т-клітин, білок А, інгібітори алергії, глікопротеїни некрозу клітин, імунотоксини, лімофтоксини, фактор некрозу пухлини, супресори пухлин, трансформуючий фактор росту, антитрипсин альфа-1, альбумін, α-лактальбумін, аполіпопротеїн-Е, еритропоетин, глікозилований еритропоетин, ангіопоетини, гемоглобін, тромбін, активуючі рецептори тромбіну пептиди, тромбомодулін, фактор крові VII, VIIa, VIII, IX і XIII, активатори плазміногена, зв'язуючі фібрин пептиди, урокіназа, стрептокіназа, гірудин, білок С, С-реактивний білок, інгібітор реніну, інгібітор колагену, супероксиддисмутаза, лептин, тромбоцитарний фактор росту, епітеліальний фактор росту, епідермальний фактор росту, ангіостатин, ангіотензин, фактор росту кістки, стимулюючий ріст кісток білок, кальцитонін, інсулін, соматостатин, октреотид (агоніст соматостатину), атріопептин, індукуючий утворення хряща фактор, елкатонін, фактор активації сполучної тканини, інгібітор шляху тканинного фактора, фолікулостимулюючий гормон, лютеїнізуючий гормон, гормон, що вивільняє лютеїнізуючий гормон, фактори росту нервової тканини (наприклад, фактор росту нервової тканини, ціліарний нейротрофічний фактор, фактор аксогенезу-1, глюкагоноподібні пептиди (GLP-1), пептиди ексендину-4, натрійуретичний пептид головного мозку, гліальний нейротрофічний фактор, нетрин, інгібуючий фактор нейтрофілів, нейртурин і т. д.), паратиреоїдний гормон, релаксин, секретин, соматомедин, інсуліноподібний фактор росту, адренокортикальний гормон, глюкагон, холецистокінін, панкреатичний поліпептид, вивільняючий гастрин пептид, вивільняючий кортикотропін фактор, тиреоїдстимулюючий гормон, аутотаксин, лактоферин, міостатин, рецептори (наприклад, TNFR(P75), TNFR(P55), рецептор IL-1, рецептор VEGF, рецептор фактора активації В-клітин і т. д.), антагоністи 7 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 рецепторів (наприклад, IL1-Ra і т. д.), антигени поверхні клітин (наприклад, CD 2, 3, 4, 5, 7, 11a, 11b, 18, 19, 20, 23, 25, 33, 38, 40, 45, 69 і т. д.), моноклональні антитіла, поліклональні антитіла, фрагменти антитіл (наприклад, scFv, Fab, Fab' F(ab') 2 і Fd) і антигени одержаних з вірусів вакцин. Переважно, фізіологічно активний поліпептид вибирають з людських гормонів росту, інтерферону-альфа, інтерферону-бета, гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора, еритропоетину, ексендину-4, імідазолацетилу пептиду ексендину-4 (агоніста ексендину-4), кальцитоніну, октреотиду (агоніста соматостатину), BNP і Fab'. Є несприятливим, що ці білкові лікарські засоби не можуть зберігати свою біологічну активність in vivo протягом тривалого часу, оскільки вони дуже схильні до денатурації або легко деградують під дією протеаз. Однак, у комплексу за даним винаходом, в якому димерний білок і поліпептид кон'юговані за допомогою непептидильного полімеру, збільшені як структурна стабільність, так і час напіввиведення лікарського засобу. Зменшення біологічної активності поліпептиду через кон'югацію з димерним білком є дуже незначним, в порівнянні з одержуваним в загальноприйнятих комплексах. Таким чином, комплекс поліпептиду і Fc-домену імуноглобуліну відповідно до даного винаходу характеризується наявністю значно поліпшеної біодоступності, в порівнянні з біодоступністю загальноприйнятих поліпептидних лікарських засобів. Відповідно до іншого його аспекту, даний винахід стосується способу одержання білкового комплексу, в якому димерний білок кон'югують з фізіологічно активним поліпептидом за допомогою непептидильного полімеру з 3 плечима, що включає в себе: (1) ковалентне приєднання двох плечей непептидильного полімеру з 3 плечима до протилежних N-кінцевих аміногруп димерного білка з формуванням кон'югата, (2) виділення з реакційної суміші зі стадії (1) кон'югата, в якому димерний білок ковалентно приєднаний по своїх N-кінцях до непептидильного полімеру, і (3) ковалентне приєднання фізіологічно активного поліпептиду до одного вільного плеча непептидильного полімеру виділеного кон'югата. У переважному варіанті здійснення димерний білок зі стадії (1) являє собою Fc-домен імуноглобуліну. У іншому переважному варіанті здійснення три плеча непептидильного полімеру зі стадії (1) мають відповідні альдегідні функціональні групи на своїх кінцях. Більш переважно, непептидильний полімер приєднують до N-кінцевої аміногрупи фізіологічно активного поліпептиду при pH 6,0. На стадії (1) проводять реакцію димерного білка з непептидильним полімером в молярному співвідношенні від 1:2 до 1:5. На стадії (3) молярне співвідношення кон'югата, виділеного на стадії (2), і фізіологічно активного поліпептиду переважно лежить в діапазоні від 1:0,5 до 1:0,05. Реакції на стадіях (1) і (3) залежать від трьох кінцевих груп непептидильного полімеру. При необхідності реакції можна проводити в присутності відновлювального засобу. Переважні приклади відновлювального засобу включають в себе ціаноборогідрид натрію (NaCNBH3), борогідрид натрію, борат диметиламіну і борат піридину. З'єднання Fc-домену імуноглобуліну і фізіологічно активного поліпептиду досягають не за допомогою злиття на основі генетичної рекомбінації, а за допомогою ковалентного зв'язку. Відповідно до його додаткового аспекту, даний винахід стосується фармацевтичної композиції, що містить білковий комплекс за даним винаходом і фармацевтично прийнятний носій, що має поліпшену стійкість in vivo фізіологічно активного поліпептиду. За допомогою придатного способу, фармацевтичну композицію за даним винаходом необхідно вводити в цікавлячу тканину або орган. Доти, поки він забезпечує доставку до тканини-мішені, будь-який спосіб можна використовувати для введення фармацевтичної композиції за даним винаходом. Наприклад, введення можна здійснювати за допомогою внутрішньоочеревинного, внутрішньовенного, внутрішньом'язового, підшкірного, черезшкірного, перорального, місцевого, інтраназального, внутрішньолегеневого і ректального способів, але не обмежуючись ними. Переважно, фармацевтичну композицію за даним винаходом вводять в придатній для ін'єкції формі. Крім того, фармацевтичну композицію можна вводити за допомогою пристрою, за допомогою якого активну речовину доставляють в клітини-мішені. Фармацевтична композиція на основі комплексу за даним винаходом може додатково містити фармацевтично прийнятний носій. Для застосування як фармацевтично прийнятного носія в пероральних лікарських формах вибирають зв'язуючу речовину, мастильну речовину, дезінтергратор, наповнювач, солюбілізатор, диспергуючий засіб, стабілізатор, суспендуючу речовину, барвник і/або фрагмент. Якщо фармацевтична композиція за даним винаходом складена для ін'єкцій, можна використовувати буфер, консервант, знеболюючий засіб, солюбілізатор, ізотонічний засіб і стабілізатор, окремо або в комбінації. Для місцевого застосування можна використовувати наповнювач, мастильну речовину і консервант. Для застосування на практиці, фармацевтичну композицію за даним винаходом можна складати в 8 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 поєднанні з фармацевтично прийнятним носієм в різних лікарських формах. Для лікарських форм, наприклад, її можна складати в формі таблеток, коржиків, капсул, еліксиру, суспензій, сиропів, облаток і т. д. Що стосується препаратів для ін'єкцій, вони можуть існувати в формі ампул з однократною дозою або множинними дозами. Інші доступні форми включають в себе розчини, суспензії, пілюлі, порошки, капсули і засоби з уповільненим вивільненням. Приклади носіїв, наповнювачів і розріджувачів, застосовних в складі, включають в себе лактозу, d-лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбіт, маніт, ксиліт, еритрит, мальтит, крохмаль, гуміарабік, альгінат, желатин, фосфат кальцію, силікат кальцію, целюлозу, метилцелюлозу, аморфну целюлозу, полівінілпіролідон, воду, метилгідроксибензоат, пропілгідроксибензоат, тальк, стеарат магнію і мінеральне масло. Крім того, застосовними є наповнювач, засіб проти агломерації, мастильна речовина, ароматизуючий засіб, емульгатор і консервант. Фармацевтично ефективна кількість білкового комплексу за даним винаходом змінюється залежно від виду захворювань, що підлягають лікуванню, способу і частоти введення, віку, статі і маси пацієнта, і тяжкості захворювання, так само як від виду фізіологічно активних поліпептидів. Перевага білкового комплексу в персистенції і титрі in vivo робить можливим зменшення дози і частоти введення фармацевтичної композиції за даним винаходом. Як описано в Патентах Кореї №№ 10-0725315 і 10-0775343, представлений білковий комплекс, в якому константний домен імуноглобуліну і фізіологічно активний поліпептид, відповідно, приєднані до протилежних кінців непептидильного полімеру. Цей білковий комплекс одержаний з'єднанням непептидильного полімеру з фізіологічно активним поліпептидом для формування кон'югата і потім з Fc імуноглобуліну. Спосіб одержання є несприятливим в тому, що фізіологічно активний поліпептид втрачається у великій кількості під час одержання. На відміну від цього, застосування непептидильного полімеру з 3 плечима для одержання білкового комплексу може, як очікують, зменшувати втрати фізіологічно активного поліпептиду. Крім того, білковий комплекс можна виділяти з використанням простого способу очищення. Краще розуміння даного винаходу можна одержати за допомогою наступних прикладів, які наведені з метою ілюстрації, але які не треба розглядати як такі, що обмежують даний винахід. Здійснення винаходу Приклад 1: Одержання комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотид(N) Для пегилювання Fc імуноглобуліну по його N-кінцю, проводили реакцію 10 мг/мл Fc імуноглобуліну в молярному співвідношенні 1:2 з 5K PropionALD(3) PEG (PEG з трьома пропіональдегідними групами, NOF, Japan) при 4 °C протягом 4,5 годин. Реакцію проводили в буфері 100 мМ фосфаті калію, pH 6,0, в присутності 20 мМ SCB (NaCNBH 3) як відновлювального засобу. З використанням SOURCE Q (XK 16 мл, GE Healthcare), монопегильований Fc імуноглобуліну очищали від реакційної суміші. Потім проводили реакцію октреотиду в молярному співвідношенні 1:2 з кон'югатом Fc імуноглобуліну-5K PEG при 4 °C протягом 20 годин, з тотальною концентрацією білка, доведеною до 25 мг/мл. Цю реакцію зв'язування проводили в 100 мМ фосфаті калію, pH 6,0, в присутності відновлювального засобу 20 мМ SCB. Реакційну суміш для зв'язування очищали на колонці для очищення SP HP. При використанні буфера 10 мМ фосфату натрію (pH 5,4) як буфера для зв'язування, кон'югат Fc імуноглобуліну-5K PEG, що не піддався реакції зв'язування, не зв'язувався з колонкою SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare), але відділявся пропусканням через колонку, в той час як імуноглобулін-PEG-Октреотид (HM11760B) слабо зв'язувався з колонкою, і потім його елюювали градієнтом солі 1M NaCl. Колонка: SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare), швидкість потоку: 2,0 мл/хв., градієнт: А 0 → 20 % 60 хв. В (А: 10 мМ Na-P pH 5,4, В: А + 1M NaCl). Приклад 2: Одержання комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Кальцитоніну(N) Реакцію імуноглобуліну-Fc по його N-кінцях з 5K PropionALD(3) PEG проводили таким же способом, як в прикладі 1, після чого тільки монопегильований Fc імуноглобуліну очищали і зв'язували з кальцитоніном. При цьому проводили реакцію кальцитоніну в молярному співвідношенні 1:2 з кон'югатом Fc імуноглобуліну-5K PEG при 4 °C протягом 20 годин, з тотальною концентрацією білка, доведеною до 25 мг/мл. Для використання як середовища в цій реакції зв'язування, буфер 100 мМ фосфат калію, pH 6,0 доповнювали відновлювальним засобом 20 мМ SCB (NaCNBH3). Реакційну суміш для зв'язування очищали на колонці для очищення SP HP. Спочатку колонку SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare) використовували для видалення кон'югата Fc імуноглобуліну-5K PEG, який залишався незв'язаним з кальцитоніном. При використанні буфера 10 мМ фосфату натрію (pH 5,4) як буфера для зв'язування, кон'югат Fc імуноглобуліну-5K PEG, що не піддався реакції зв'язування, не зв'язувався з колонкою SP HP (XK 16 мл, GE Healthcare), але відділявся пропусканням через колонку, в той час як 9 UA 101670 C2 5 10 15 імуноглобулін-PEG-кальцитонін слабо зв'язувався з колонкою, і потім його елюювали градієнтом солі 1M NaCl. Колонка: SP HP (XK16 мл, GE Healthcare), швидкість потоку: 2,0 мл/хв., градієнт: А 0 → 20 % 60 хв. В (А: 10 мМ Na-P pH 5,4, В: А + 1M NaCl). Приклад 3: Порівняння виходу продукції і простоти способу очищення для комплексу PEG з 3 плечима (Приклад 1 і 2) і комплексу PEG з 2 плечима Вихід продукції для комплексу PEG з 3 плечима і комплексу PEG з 2 плечима порівнювали з використанням комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотиду(N) і комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Кальцитоніну(N), одержаних в Прикладах 1 і 2, відповідно (таблиця 1). Комплекс PEG з 2 плечима як контрольну групу одержували приєднанням октреотиду або кальцитоніну як фізіологічно активного поліпептиду до області Fc імуноглобуліну за допомогою PEG з 2 плечима (PEG з двома пропіональдегідними групами, IDB, South Korea) як лінкера. Зокрема, PEG з 2 плечима з'єднували з октреотидом або кальцитоніном і потім з Fc-доменом імуноглобуліну за допомогою ковалентного зв'язку (KR10-0725315). Таблиця 1 Активний фармацевтичний інгредієнт (API) з 2 плечима з 3 плечима з 2 плечима з 3 плечима Октреотид Кальцитонін 20 Форма PEG Вихід продукції (на основі API) 9% 33 % 18 % 30 % Способи очищення комплексу з реакційної суміші аналізували по простоті і розміру первинної колонки, і результати узагальнені в таблиці 2 нижче. Таблиця 2 API Октреотид Кальцитонін 25 30 35 40 Форма PEG Спосіб очищення з 2 плечима з 3 плечима з 2 плечима з 3 плечима Source Q → Source ISO SP HP Source Q → Source ISO SP HP Розмір первинної колонки 5 1 4 1 При використанні комплексу PEG з 2 плечима, всі Fc імуноглобуліну, що залишилися неприєднаними, зв'язувалися з колонкою, так що відділялися від Fc імуноглобуліну-PEG з 2 плечима-октреотиду або Fc імуноглобуліну-PEG з 2 плечима-кальцитоніну. На відміну від цього, при використанні комплексу PEG з 3 плечима, розділення між кон'югатом Fc імуноглобуліну-5K PEG, що залишився неприєднаним до фізіологічно активного поліпептиду, і Fc імуноглобулінуPEG з 3 плечима-Октреотидом або Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Кальцитоніном досягали таким способом, що кон'югат Fc імуноглобуліну-5K PEG видаляли пропусканням через колонку, в той час як Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотид або Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Кальцитонін зв'язувався з колонкою. Таким чином, не тільки спосіб очищення зменшували від двох стадій до однієї, але також розмір колонки зменшували до 1/5. Приклад 4: Одержання комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N) Реакцію імуноглобуліну-Fc по його N-кінцях з 5K PropionALD(3) PEG проводили таким же способом, як в прикладі 1, після чого тільки монопегильований Fc імуноглобуліну очищали і зв'язували з FSH. При цьому проводили реакцію FSH в молярному співвідношенні 1:15 з кон'югатом Fc імуноглобуліну-5K PEG при 4 °C протягом 20 годин, з тотальною концентрацією білка, доведеною до 40 мг/мл. Для використання як середовища в цій реакції зв'язування буфер 100 мМ фосфат калію, pH 6,0, доповнювали відновлювальним засобом 20 мМ SCB. Реакційну суміш для зв'язування очищали за допомогою двох колонок для очищення. Спочатку колонку Blue HP (Hitrap 5 мл, GE Healthcare) використовували для видалення кон'югата Fc імуноглобуліну-5K PEG, який залишався незв'язаним з FSH. Потім мультиполімери, в яких кон'югат двох або більше Fc імуноглобуліну-5K PEG приєднаний до FSH, видаляли за допомогою Resource Iso (1 мл, GE Healthcare) на основі гідрофобності. 10 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Колонка: Blue HP (Hitrap 5 мл, GE Healthcare), швидкість потоку: 3,0 мл/хв., градієнт: А 0 → 100 % 20 хв. В, А: 50 мМ Gly-NaOH+0,2M KCl, В: 50 мМ Gly-NaOH+2,5M KCl, колонка: Resource ISO (1 мл, GE Healthcare), А 0 → 100 % 90 хв. В (А: 20 мМ Тріс pH 7,5, В: А + 1,3 М A.S). Приклад 5: Одержання комплексу Fc імуноглобуліну -PEG з 3 плечима-Інсуліну(N) Для пегилювання Fc імуноглобуліну по його N-кінцю, проводили реакцію 10 мг/мл Fc імуноглобуліну в молярному співвідношенні 1:2 з 5K PEG PropionALD(3) PEG (PEG з трьома пропіональдегідними групами, NOF, Japan) при 4 °C протягом 4,5 годин. Реакцію проводили в буфері 100 мМ фосфаті калію, pH 6,0, в присутності 20 мМ SCB (NaCNBH 3) як відновлювального засобу. З використанням SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare), монопегильований Fc імуноглобуліну очищали від реакційної суміші. Потім проводили реакцію інсуліну в молярному співвідношенні 1:4 з кон'югатом Fc імуноглобуліну-5K PEG при 4 °C протягом 19,5 годин. Для використання як середовища в цій реакції зв'язування буфер 100 мМ фосфат калію, pH 6,0, доповнювали відновлювальним засобом 20 мМ SCB. Реакційну суміш для зв'язування очищали за допомогою двох колонок для очищення. Спочатку колонку SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare) використовували для видалення кон'югата Fc імуноглобуліну5K PEG, який залишався незв'язаним з інсуліном. Градієнт солі 1 M NaCl в 20 мМ Тріс (pH 7,5) дозволяв елюювати кон'югат Fc імуноглобуліну-5K PEG першим через відносно слабу силу зв'язування, з наступною безпосередньо за цим елюцією Fc імуноглобуліну-PEG-Інсуліну. Під час цього первинного очищення кон'югат Fc імуноглобуліну-5K PEG видаляли, але мультиполімери Fc-5K PEG і інсуліну повністю не відділялися. Вторинне очищення, таким чином, проводили на основі різниці молекулярної маси між комплексом і мультиполімером з використанням колонки Сефакрил S-300 (GE Healthcare). У той же час складали комплекс Fc імуноглобуліну-PEG-Інсуліну. Спочатку елюювали високомолекулярні мультиполімери Fc імуноглобуліну-5K PEG і інсуліну, потім комплекс Fc імуноглобуліну-PEG-Інсуліну. Колонка: Source Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare), швидкість потоку: 8,0 мл/хв., градієнт: А 0 → 25 % 100 хв. В (А: 20 мМ Тріс pH 7,5, В: А + 1M NaCl), колонка: Сефакрил S-300 (HiPrep 120 мл, GE Healthcare), швидкість потоку: 0,6 мл/хв. Приклад 6: Порівняння виходу продукції для комплексу PEG з 3 плечима (Приклади 4 і 5) і комплексу PEG з 2 плечима Вихід продукції для комплексу PEG з 3 плечима і комплексу PEG з 2 плечима порівнювали з використанням комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N) і комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Інсуліну(N), одержаних в Прикладах 4 і 5, відповідно (таблиця 3). При застосуванні загальноприйнятого способу одержання з використанням PEG з 2 плечима, димерні фізіологічно активні поліпептиди, такі як FSH (Mw. приблизно 40000 Да) і інсулін (Mw. 5807), займали обидва кінці непептидильного полімеру, так що полімер не міг формувати ковалентний зв'язок з Fc-доменом імуноглобуліну, що забезпечує персистенцію in vivo. Цей феномен був більш вираженим для димерного фізіологічно активного поліпептиду малої молекулярної маси, такого як інсулін. Відповідно, персистуючі білкові комплекси з димерними фізіологічно активними поліпептидами переважно одержували з використанням PEG з 3 плечима. Відмінності у виході продукції для FSH і інсуліну за способом одержання з використанням PEG з 2 плечима і PEG з 3 плечима узагальнені в таблиці 3 нижче. 50 Таблиця 3 Активний фармацевтичний інгредієнт (API) FSH Інсулін Форма PEG PEG з 2 плечима PEG з 3 плечима PEG з 2 плечима PEG з 3 плечима 11 Вихід продукції (на основі API) 10 % 32 % 3% 27 % UA 101670 C2 5 10 15 20 25 Приклад 7: Одержання комплексу Fc імуноглобуліну-PEG-FacVIIa(N) Для пегилювання Fc імуноглобуліну по його N-кінцю, проводили реакцію 6 мг/мл Fc імуноглобуліну в молярному співвідношенні 1:2 з 5K PropionALD(3) PEG (PEG з трьома пропіональдегідними групами, NOF, Japan) при 4 °C протягом 4,5 годин. Реакцію проводили в буфері 100 мМ фосфаті калію, pH 6,0, в присутності 20 мМ SCB (NaCNBH 3) як відновлювального засобу. З використанням SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare), монопегильований Fc імуноглобуліну очищали від реакційної суміші. Потім проводили реакцію FVIIa в молярному співвідношенні 1:9 з кон'югатом Fc імуноглобуліну-5K PEG при 4 °C протягом 18 годин, з тотальною концентрацією білка, доведеною до 20 мг/мл. Для використання як середовища в цій реакції зв'язування буфер 100 мМ фосфат калію, pH 6,0, доповнювали відновлювальним засобом 20 мМ SCB. Реакційну суміш для зв'язування очищали за допомогою двох колонок для очищення. Спочатку колонку SOURCE Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare) використовували для видалення кон'югата Fc імуноглобуліну-5K PEG, який залишався незв'язаним з FVIIa. Градієнт солі 1 M NaCl в 20 мМ Тріс (pH7,5) дозволяв елюювати кон'югат Fc імуноглобуліну-5K PEG першим через відносно слабу силу зв'язування, з наступною безпосередньо за цим елюцією Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FVIIa. Після цього проводили повторне очищення для відділення Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FVIIa від домішок мультимерів FVIIa з використанням колонки RESOURCE ISO (GE Healthcare). Спочатку елюювали Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FVIIa, потім домішки мультимерів FVIIa. Колонка: Source Q (LRC25 85 мл, GE Healthcare), швидкість потоку: 4 мл/хв., градієнт: А 0 → 7 % 1 хв. В, 7 % 37 % 80 хв. В (А: 20 мМ Тріс pH7,5, В: А + 1M NaCl), колонка: RESOURCE ISO (попередньо набита, 1 мл, GE Healthcare), швидкість потоку: 2 мл/хв., градієнт: В 100 0 % 60 хв. А (А: 20 мМ Тріс pH7,5, В: А + 1,6 M (NH 4)2SO4). Таблиця 4 Активний фармацевтичний інгредієнт (API) FacVIIa 30 35 40 45 50 Форма PEG PEG з 2 плечима PEG з 3 плечима Вихід продукції (на основі API) Не одержаний Приблизно вище 3 % Приклад 8: Аналіз in vivo комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотиду(N) Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотид(N) аналізували, щоб встановити ефекти на масу тіла і рівень IGF-1 у щурів SD при його підшкірному введенні. Октреотид є сильним інгібітором гормону росту і його в основному застосовують для лікування акромегалії. Він комерційно доступний в Novatis в двох формах: Сандостатин, варіант короткої дії; і Сандостатин-LAR, варіант тривалої дії. На даний час, акромегалія являє собою синдром, що призводить до надпродукції гормону росту людини (hGH). У тестах октреотиду in vivo, у щурів, яким його підшкірно вводили, моніторували масу тіла і рівень IGF-1 для оцінки його ефектів наінгібування секреції GH. Подібним чином, Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотид(N) аналізували in vivo по змінах маси тіла і рівня IGF-1 у щурів. Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотид(N) вводили в однократних дозах 0,5, 1,0 і 2,0 мг/кг, в той час як Сандостатин-LAR як контроль вводили в однократних дозах 1,0 і 2,0 мг/кг, після чого у щурів моніторували масу тіла і рівень IGF-1 протягом двох тижнів. Обидві тестовані речовини вводили підшкірно. У порівнянні з групою з введенням носія, в групах з Сандостатином-LAR спостерігали зменшення маси тіла приблизно на 3,7 % при введенні в дозі 1,0 мг/кг і приблизно на 8,9 % при введенні в дозі 2,0 мг/кг. З іншого боку, в групах з Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечимаОктреотиду(N) маса тіла зменшувалася приблизно на 44,3 % при введенні 0,5 мг/кг, приблизно на 40,1 % при введенні 1,0 мг/кг введення і приблизно на 55,1 % при введенні 2,0 мг/кг. Для кількісного аналізу змін IGF-1 у щурів використовували набір для ELISA IGF-1 щура. У порівнянні з носієм, спостерігали зменшення рівня IGF-1 в крові приблизно на 15 % з 1,0 мг/кг Сандостатину і приблизно на 11 % з 2,0 мг/кг Сандостатину на основі AUC рівня IGF-1 в крові. З іншого боку, в групах з Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотиду(N) рівень IGF-1 в крові зменшувався приблизно на 23 % при дозі 0,5 мг/кг, приблизно на 18 % при дозі 1,0 мг/кг і приблизно на 25 % при дозі 2,0 мг/кг [фіг. 2]. Дані тесту in vivo показують, що Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-Октреотид(N) є більш сильним по активності, ніж Сандостатин-LAR, склад з уповільненим вивільненням октреотиду. 12 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Приклад 9: Аналіз in vivo комплексу Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N) Аналіз in vivo Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N) проводили згідно зі способом Steelman-Pohley (Endocrinology 53, 504-616). Нестатевозрілих самиць щурів SD (у віці 21 доби) застосовували для аналізу in vivo Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N). Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N) вводили в однократних дозах 0,018, 0,075 і 0,3 мкг/щура, в той час як Фолітроп, комерційно доступну природну форму FSH, використовували як контроль в дозах 4, 2 і 1 МО/щура один раз на добу протягом трьох діб. Носій і тестовані речовини вводили в поєднанні з hCG (хоріонічний гонадотропін людини) при 13,3 МО/щура. Кожну тестовану речовину вводили підшкірно в кількості 0,25 мл/кг. Через 72 години після першого введення тестованих речовин тварин піддавали евтаназії і оваріектомії. Видаленим таким чином яєчники зважували. Як зображено на фіг. 3, для Fc імуноглобуліну-PEG з 3 плечима-FSH(N) показали активність in vivo залежним від дози чином, таку ж, як для Fc імуноглобуліну-PEG з 2 плечима-FSH(N). ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 1. Білковий комплекс, який містить фізіологічно активний поліпептид, димерний білок і непептидильний полімер, що має три функціональні кінці, де два функціональні кінці вказаного непептидильного полімеру ковалентно зв'язані з двома N-кінцевими аміногрупами вказаного димерного білка, а третій кінець ковалентно зв'язаний з вказаним фізіологічно активним поліпептидом. 2. Білковий комплекс за п. 1, де димерний білок являє собою Fc-домен імуноглобуліну. 3. Білковий комплекс, як визначено за п. 2, де Fc-домен імуноглобуліну є аглікозилованим. 4. Білковий комплекс за п. 2, де Fc-домен імуноглобуліну складається з 1-4 різних доменів, вибраних з CH1, CH2, CH3 і CH4. 5. Білковий комплекс за п. 4, де Fc-домен імуноглобуліну додатково містить шарнірну область. 6. Білковий комплекс за п. 2, де Fc-домен імуноглобуліну вибраний з групи, що складається з Fc-доменів IgG, IgA, IgD, IgE, IgM і їх комбінацій і гібридів. 7. Білковий комплекс за п. 6, де Fc-домен імуноглобуліну вибраний з групи, що складається з Fc-доменів IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 і їх комбінацій і гібридів. 8. Білковий комплекс за п. 6, де Fc-домен імуноглобуліну присутній у формі димерів або мультимерів (комбінацій Fc імуноглобуліну), кожний з яких містить глікозиловані імуноглобуліни, що складаються з доменів однакового походження. 9. Білковий комплекс за п. 6, де Fc-домен імуноглобуліну являє собою Fc-домен IgG4. 10. Білковий комплекс за п. 9, де Fc-домен імуноглобуліну являє собою людський аглікозилований Fc-домен IgG4. 11. Білковий комплекс за п. 1, де непептидильний полімер вибраний з групи, що складається з поліетиленгліколю, поліпропіленгліколю, співполімеру етиленгліколю і пропіленгліколю, поліоксіетилованого поліолу, полівінілового спирту, полісахариду, декстрану, полівінілетилового ефіру, таких біорозкладаних полімерів, як PLA (полімолочна кислота) і PLGA (співполімер молочної і гліколевої кислот), біорозкладаних полімерів, ліпополімерів, хітинів, гіалуронової кислоти і їх комбінацій. 12. Білковий комплекс за п. 11, де непептидильний полімер являє собою поліетиленгліколь. 13. Білковий комплекс за п. 1, де непептидильний полімер має кінцеву функціональну групу, вибрану з альдегідних груп, пропіональдегідних груп, бутилальдегідних груп, малеїнімідних груп і сукцинімідних похідних. 14. Білковий комплекс за п. 13, де непептидильний полімер має три функціональні альдегідні групи на своїх відповідних кінцях. 15. Білковий комплекс за п. 1, де три функціональні кінці непептидильного полімеру зв'язані з Nкінцевими функціональними групами Fc-домену імуноглобуліну і фізіологічно активного поліпептиду, де вказані N-кінцеві функціональні групи вибрані з групи, що складається із залишків лізину, гістидину, цистеїну і їх комбінацій. 16. Білковий комплекс за п. 1, де фізіологічно активний поліпептид вибраний з групи, що складається з гормонів, цитокінів, інтерлейкінів, зв'язуючих інтерлейкін білків, ферментів, антитіл, факторів росту, факторів транскрипції, факторів крові, вакцин, структурних білків, білків-лігандів, рецепторів, антигенів поверхні клітин, антагоністів рецепторів і їх похідних або аналогів. 17. Білковий комплекс за п. 16, де фізіологічно активний поліпептид вибраний з групи, що складається з людських гормонів росту, гормонів, що вивільняють гормон росту, пептидів, що вивільняють гормон росту, інтерферонів і рецепторів інтерферону, колонієстимулюючих 13 UA 101670 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 факторів, глюкагоноподібних пептидів, пептидів ексендину-4, ANP, BNP, CNP, DNP, зв'язаних з G білком рецепторів, інтерлейкінів і рецепторів інтерлейкіну, ферментів, зв'язуючих інтерлейкіни білків, зв'язуючих цитокіни білків, факторів активації макрофагів, пептидів макрофагів, факторів В-клітин, факторів Т-клітин, білка А, інгібіторів алергії, глікопротеїнів некрозу клітин, імунотоксинів, лімфотоксинів, фактора некрозу пухлини, супресорів пухлин, трансформуючого фактора росту, антитрипсину альфа-1, альбуміну, α-лактальбуміну, аполіпопротеїну-Е, еритропоетину, високоглікозилованого еритропоетину, ангіопоетинів, гемоглобіну, тромбіну, активуючих рецептори тромбіну пептидів, тромбомодуліну, фактора крові VII, VIIa, VIII, IX і XIII, активаторів плазміногена, зв'язуючих фібрин пептидів, урокінази, стрептокінази, гірудину, білка С, С-реактивного білка, інгібітору реніну, інгібітору колагенази, супероксиддисмутази, лептину, тромбоцитарного фактора росту, епітеліального фактора росту, епідермального фактора росту, ангіостатину, ангіотензину, фактора росту кістки, стимулюючого ріст кісток білка, кальцитоніну, інсуліну, соматостатину, октреотиду (агоніста соматостатину), атріопептину, індукуючого утворення хряща фактора, елкатоніну, фактора активації сполучної тканини, інгібітору шляху тканинного фактора, фолікулостимулюючого гормону, лютеїнізуючого гормону, гормону, що вивільняє лютеїнізуючий гормон, факторів росту нервової тканини, паратиреоїдного гормону, релаксину, секретину, соматомедину, інсуліноподібного фактора росту, адренокортикального гормону, глюкагону, холецистокініну, панкреатичного поліпептиду, вивільняючого гастрин пептиду, вивільняючого кортикотропін фактора, тиреоїдстимулюючого гормону, аутотаксину, лактоферину, міостатину, рецепторів, антагоністів рецепторів, антигенів поверхні клітин, антигенів одержаних з вірусів вакцин, моноклональних антитіл, поліклональних антитіл, фрагментів антитіл. 18. Білковий комплекс за п. 17, де фізіологічно активний поліпептид вибраний з групи, що складається з людських гормонів росту, інтерферону-альфа, інтерферону-бета, гранулоцитарного колонієстимулюючого фактора, еритропоетину, ексендину-4, імідазолацетилу пептиду ексендину-4 (агоніста ексендину-4), кальцитоніну, октреотиду (агоніста соматостатину), BNP і Fab'-фрагмента. 19. Спосіб одержання білкового комплексу, що складається з фізіологічно активного поліпептиду, димерного білка і непептидильного полімеру, що має три функціональні кінці, де два функціональні кінці вказаного непептидного полімеру ковалентно зв’язані з двома Nкінцевими аміногрупами вказаного димерного білка, а третій кінець ковалентно зв'язаний з вказаним фізіологічно активним поліпептидом, який включає в себе: (1) ковалентне приєднання двох функціональних кінців непептидильного полімеру до протилежних N-кінцевих аміногруп димерного білка з утворенням кон'югата, (2) виділення з реакційної суміші зі стадії (1) кон'югата, в якому димерний білок ковалентно приєднаний по своїх N-кінцях до непептидильного полімеру, і (3) ковалентного приєднання фізіологічно активного поліпептиду до одного вільного функціонального кінця непептидильного полімеру виділеного кон'югата. 20. Спосіб за п. 19, де димерний білок являє собою Fc-домен імуноглобуліну. 21. Спосіб за п. 19, де непептидильний полімер має три функціональні альдегідні групи на своїх відповідних кінцях. 22. Спосіб за п. 19, де на стадії (1) проводять реакцію димерного білка з непептидильним полімером в молярному співвідношенні від 1:2 до 1:5. 23. Спосіб за п. 19, де на стадії (3) проводять реакцію кон'югата з фізіологічно активним поліпептидом в молярному співвідношенні від 1:0,5 до 1:0,05. 24. Спосіб за п. 19, де реакції на обох стадіях (1) і (3) проводять в присутності відновлювального засобу. 25. Спосіб за п. 24, де відновлювальний засіб вибраний з групи, що складається з ціаноборогідриду натрію (NaCNBH3), борогідриду натрію, борату диметиламіну і борату піридину. 26. Фармацевтична композиція, яка містить білковий комплекс за будь-яким з пп. 1-18 і, необов'язково, фармацевтично прийнятний носій. 27. Білковий комплекс, одержаний з використанням способу за будь-яким з пп. 19-25. 14 UA 101670 C2 15 UA 101670 C2 Комп’ютерна верстка М. Ломалова Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 16

Дивитися

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Polypeptide complex comprising non-peptidyl polymer having three functional ends

Автори англійською

Song, Dae Hae, Shin, Jae Hee, Lee, Mi Ji, Hong, Sung Hee, Kwon, Se Chang, Lee, Gwan Sun

Назва патенту російською

Полипептидный комплекс, содержащий непептидильный полимер, который имеет три функциональных конца

Автори російською

Сонг Дае Хае, Шин Дзае Хи, Ли Ми Дзи, Хонг Сунг Хи, Квон Се Чанг, Ли Гван Сун

МПК / Мітки

МПК: C07K 19/00

Мітки: непептидильний, кінці, три, функціональні, комплекс, містить, полімер, має, поліпептидний

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/18-101670-polipeptidnijj-kompleks-shho-mistit-nepeptidilnijj-polimer-yakijj-maeh-tri-funkcionalni-kinci.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Поліпептидний комплекс, що містить непептидильний полімер, який має три функціональні кінці</a>

Подібні патенти