Композиція, що містить пробіотичні бактерії для застосування у лікуванні імунних розладів

Номер патенту: 111715

Опубліковано: 10.06.2016

Автори: Драґо Лоренцо, Моня Лука, Моня Джованні, Строцці Джан Паоло

Є ще 8 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Композиція, що включає наступні культури бактерій, які є задепонованими у Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ):

- Lactobacillus salivarius DSM 22775, що задепонований 23.07.2009;

- Bifidobacterium breve DSM 16604, що задепонований 20.07.2004;

для застосування у запобіганні та/або лікуванні патологій, вибраних з групи, яка складається з алергії, атопії, алергічного риніту, харчової гіперчутливості, атопічного дерматиту, екземи, астми або імунодефіцитів.

2. Композиція за п. 1 для превентивного та/або радикального лікування атопічного дерматиту та/або екземи.

3. Композиція за одним з пп. 1 або 2 для превентивного та/або радикального лікування атопічного дерматиту.

4. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, де вказана композиція складається з наступних культур бактерій, які є задепонованими у Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,(DSMZ):

- Lactobacillus salivarius DSM 22775, що задепонований 23.07.2009;

- Bifidobacterium breve DSM 16604, що задепонований 20.07.2004;

5. Композиція за будь-яким з пп. 1-3, де вказана композиція додатково включає культуру пробіотичної бактерії Lactobacillus pentosus DSM 21980, що задепонований 14.11.2008.

6. Композиція за п. 5, де вказана композиція складається з наступних бактеріальних культур, задепонованих у Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH,(DSMZ): Lactobacillus salivarius DSM 22775, Bifidobacterium breve  DSM 16604 та Lactobacillus pentosus DSM 21980.

7. Композиція за будь-яким з пп. 1-6, де вказані бактеріальні культури у присутні у вказаній композиції у формі живих бактерій, вбитих бактерій або клітинних компонентів, екстрактів клітин або їх лізатів.

8. Композиція за будь-яким з пп. 1-7, де вказана композиція знаходиться у твердій формі для перорального застосування.

9. Композиція за будь-яким з пп. 1-8, де вказані культури пробіотичних бактерій є присутніми у концентрації 1x107-1x1011 КУО/г композиції, переважно 1x108-1x1010 КУО/г композиції.

10 Композиція за будь-яким з пп. 1-9, де вказана композиція додатково включає харчові волокна з пребіотичною активністю, вибрані з фруктоолігосахаридів, інуліну та частково гідролізованої гуарової камеді.

11. Композиція за будь-яким з пп. 1-10, де вказана композиція є фармацевтичною, дієтичною, харчовою або нутрацевтичною композицією.

12. Штам Lactobacillus salivarius DSM 22775, що задепонований 23.07.2009, для одержання композиції за п. 1 для застосування у запобіганні та/або лікуванні патологій, вибраних з групи, яка складається з алергії, атопії, алергічного риніту, харчової гіперчутливості, атопічного дерматиту, екземи, астми або імунодефіцитів.

Текст

Дивитися

Реферат: Винахід належить до композиції, що включає наступні культури штамів бактерій, які є задепонованими у Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), а саме Lactobacillus salivarius DSM 22775, що задепонований 23.07.2009 та - Bifidobacterium breve DSM 16604, що задепонований 20.07.2004, для застосування у запобіганні та/або лікуванні патологій, вибраних з групи, яка складається з алергії, атопії, алергічного риніту, харчової гіперчутливості, атопічного дерматиту, екземи, астми або імунодефіцитів. Композиція може додатково містити культуру штаму пробіотичної бактерії Lactobacillus pentosus DSM 21980, що задепонований 14.11.2008. UA 111715 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений винахід стосується композиції, що містить пробіотичні бактерії для лікування патологій, пов'язаних зі зміненнями імунної системи. Зокрема, заявлений винахід стосується застосування вибраних пробіотичних бактерій для отримання композиції для лікування алергій, як-то атопічний дерматит. Добре відомо, що атопічний дерматит (далі, для стислості, просто AD) є хронічним рецидивуючим шкірним розладом, що починається у неонатальному періоді або у дитинстві та може зберігатися у дорослому віці. Отже, фази AD діляться на неонатальну, дитячу та дорослу. AD є запальною хворобою шкіри, що, подібно до астми та алергічного риніту, пов'язана з локальною інфільтрацією T-лімфоцитів, які продукують інтерлейкін-4 (IL-4) та інтерлейкін-5 (IL5). IL-4, як добре відомо, регулює розвиток T-хелперного фенотипу 2 (Th2) з наступним надлишковим продукуванням імуноглобуліну (Ig) та еозинофілією. Підвищені сироваткові рівні IgE та позитивні на їжу та на інгаляційні алергени алергічні шкірні проби можна виявити у 8090% суб'єктів з атопічним дерматитом. Хоча в основі AD лежать генетичні та імунологічні фактори, на його проявлення може впливати також велика кількість зовнішніх факторів. У 60% випадків AD може спостерігатися родинний анамнез цієї хвороби, інакше кажучи, якщо один з батьків мав атопічний діатез, то існує 60% ймовірність атопічності його дітей. Атопія є генетичною схильністю до розвинення місцевих анафілактичних реакцій після контакту, прийому всередину, щеплення або вдихання алергенів. У етіології AD слід брати до уваги наступні імунологічні фактори: алергію на продукти харчування, алергію, викликану контактними алергенами та подразниками, алергію, викликану аероалергенами та імунорегуляторні порушення . Серед великої кількості видів лікування, спрямованих на лікування та/або запобігання алергій або шкірних запалень, зокрема, при лікуванні атопічного дерматиту, слід окремо виділити багато способів на основі застосування різних ліків. Способи лікування з застосуванням ліків мають декілька протипоказань, що обмежують їх застосування. Крім того, ці ліки, здається, не завжди добре переносяться деякими категоріями пацієнтів. Проте, в даний час не існує лікування, що має абсолютної та повної ефективності. Можливо тільки прийняти певні запобіжні заходи проти наступу алергій або, якщо це потрібно, засоби для пом'якшення набридливих симптомів, як-то свербіж та почервоніння шкіри . Отже, залишається потреба у лікуванні, де будуть відсутні обмеження у застосуванні ліків та яке можна застосувати до всіх категорій пацієнтів. Зокрема, залишається потреба у лікуванні, що може бути корисним у боротьбі з початком алергій та розвитком шкірних запалень для зменшення надокучливих симптомів, як-то почервоніння шкірних тканин, свербіж та екзема. Після того, як це вдалося в результаті інтенсивної дослідницької діяльності, Заявник надає відповідь на вищезазначені потреби шляхом відбору специфічних штамів пробіотичних бактерій. Предметом заявленого винаходу є композиція, що містить принаймні одну культуру пробіотичних бактерій, як заявлено в доданому незалежному пункті Формули Винаходу. Крім того, предметом заявленого винаходу є застосування принаймні однієї культури пробіотичних бактерій, як заявлено в доданому незалежному пункті Формули Винаходу. Інші доцільні втілення заявленого винаходу викладені у детальному описі, наведеному тут у вигляді прикладів, без обмеження, таким чином, обсягу заявленого винаходу. Заявник поставив перед собою мету, що спрямована до відбору специфічних штамів бактерій для оцінки їх впливу на клінічний перебіг та якість життя пацієнтів з помірним або суворим AD та з метою визначення їх впливу на клінічні та імунологічні параметри. Крім того, Заявник поставив перед собою мету, що спрямована до відбору штамів бактерій з пробіотичною активністю, що можуть переноситься хворими та здатні до колонізації шлунково-кишкового тракту. Діагноз помірного/суворого AD оцінювали за допомогою стандартизованого індексу тяжкості для атопічного дерматиту, позначеного далі, як AD (індекс SCORAD = підрахування атопічного дерматиту), що є відомим досвідченим фахівцям. Було знайдено, що штами бактерій заявленого винаходу мають високу імуномодуляторну дію, отже, корисні у лікуванні патологій, пов'язаних зі зміненнями імунної системи Після інтенсивної науково-дослідницької діяльності, Заявник обрав з числа багатьох наступні пробіотичні штами бактерій: 1) Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, що зберігається з 23.07.2009, від компанії Probiotical SpA of Novara - Італія; 2) Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604, що зберігається з 20.07.2004, від компанії Probiotical SpA of Novara - Італія; 1 UA 111715 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 3) Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, що зберігається з 14.11.2008, від компанії Probiotical SpA of Novara - Італія; 4) Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, що зберігається з 13.09 2006, від компанії Mofin Sri of Novara - Italy; 5) Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605, що зберігається з 20.07.2004, від компанії Probiotical SpA of Novara - Італія; 6) Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717, що зберігається з 06.08.2008, від компанії Probiotical SpA of Novara - Італія. Всі перелічені вище культури зберігалися у Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen-GmbH, (DSMZ) у Німеччині, у відповідності з Будапештським договором. У контексті заявленого винаходу, перелічені вище культури пробіотичних бактерій можуть знаходитися у вигляді живих бактерій, мертвих бактерій або їх клітинних компонентів, екстрактів клітин або їх лізатів. У бажаному втіленні, композиція містить принаймні одну бактеріальну культуру для застосування у вигляді імуномодуляторної композиції, здатної до модуляції імунної системи. Під експресією "імуномодуляторної композиції" мається на увазі, що композиція здатна до модуляції імунної системи у тому сенсі, що вона є здатною до стимулювання/індукування різних відповідей імунної системи, що робить її більш реактивною, наприклад, шляхом втручання завдяки продукуванню специфічних цитокінів. Переважно, вказані імуномодуляторні композиції спонукають імунну систему продукувати цитокіни типу 1. Переважно, штами бактерій та відповідні культури бактерій показали здатність до поліпшення клінічних та імунологічних параметрів. Зокрема, спостерігалося, що вони є здатними до: 1) значного підвищення індексу SCORAD та DLQI; 2) скорочення мікробної транслокації (рівні LPS плазми) та активування CD8+ T-лімфоцитів; 3) підвищення відсотку загальних регуляторних T-лімфоцитів (Treg) та подібного екпресування маркерів TLR2- та TLR4; 4) покращення співвідношень Th1/Тh2 та Th17/Treg. Отже, композиція заявленого винаходу (імуномодуляторна композиція) є здатною до запобігання, скорочення та/або лікування патологій, пов'язаних з зміненнями імунної системи, як-то алергій, атопії, алергічного риніту, гіперчутливості до продуктів харчування, атопічного дерматиту, екземи, астми та імунодефіцитів. Відповідно до одного втілення, заявлений винахід стосується композиції, що містить або, альтернативно, складається з принаймні однієї культури пробіотичних бактерій, вибраних від групи, що містить або, альтернативно, складається з культур Lactobacillus salivarius (LS01)SM22775, Bifidobacterium breve (BR03) DSM. 16604 та Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 2198-0. У бажаному втіленні, композиція містить або, альтернативно, складається з Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та Bifidobacterium breve (BR03). У бажаному втіленні, композиція містить або, альтернативно, складається з вказаної культури Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та вказаної культури Bifidobacterium breve (BR03) DSM. 16604 у поєднанні з принаймні однією іншою культурою, вибраною від групи, що охоплює або, альтернативно , складається з: Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605 та Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717. У бажаному втіленні, композиція містить або, альтернативно, складається з культур Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) та Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980. Відповідно з іншим бажаним втіленням, заявлений винахід охоплює застосування принаймні однієї культури пробіотичних бактерій, вибраних від групи, що охоплює або, альтернативно, складається з культур Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve(BR03) DSM 16604 та Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, для отримання композиції, здатної до запобігання, зменшення та/або лікування патологій, пов'язаних зі зміненнями імунної системи як-то алергій, атопії, алергічного риніту, гіперчутливості до продуктів харчування, атопічного дерматиту, екземи, астми та імунодефіцитів. Відповідно з іншим бажаним втіленням, заявлений винахід охоплює застосування композиції, що містить або, альтернативно, складається з вказаних культур Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та Bifidobacterium breve (BR03). Бажаним чином, винахід охоплює застосування вказаної культури Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та вказаної культури Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 у поєднанні з принаймні однією іншою культурою, вибраною від групи, що охоплює: Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, Lactobacillus casei ssp 2 UA 111715 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 rhamnosus (LR04) DSM 16605 та Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21111., для отримання композиції для запобігального та/або радикального лікування атопічного дерматиту. Відповідно з іншим бажаним втіленням, заявлений винахід охоплює застосування композиції, що містить або, альтернативно, складається з вказаних культур Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) та Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980. Переважно, композиція містить або, альтернативно, складається з Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 у ваговому співвідношенні у межах 1:3-3:1, бажано 1:1. Альтернативно, композиція містить або, альтернативно, складається з Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 та Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, переважно, у ваговому співвідношенні 1:1:1. Культури бактерій заявленого винаходу можна вважати "активними інгредієнтами", що можна перемішати, у відповідних співвідношеннях, з фізіологічними та/або фармацевтично прийнятними наповнювачами. Для підсилення своєї активності, активні інгредієнти можуть бути введені системним чином, переважно перорально, у вигляді композицій у твердому стані, отриманих у відповідності з відомими фахівцям способами. У бажаному втіленні, композиції наведені у вигляді ліофілізатів, порошків, гранул, таблеток, м'яких желатинових капсул або суспензій. Композиції заявленого винаходу можуть бути фармацевтичними, дієтичними, живильними або нутрицевтиками. Композиції заявленого винаходу, крім того, можуть містити баластні речовини з пребіотичною активністю, як-то фруктоолігосахариди (FOS), інулін та частково гідролізовану гуарову гуму (PHGG). Фармацевтичні, дієтичні, живильні або нутрицевтичні композиції заявленого винаходу містять принаймні одну культуру пробіотичних бактерій, як 7 11 вказано вище. Кінцева концентрація композиції містить 110 -110 CFU (одиниць, що 8 10 утворюють колонії) /г композиції, переважно, 110 -110 CFU/г композиції. Композиції заявленого винаходу , що містять вибрані пробіотичні бактерії, корисні у якості імуномодуляторних композицій, здатних до модуляції імунної системи. Вказані композиції здатні до лікування та/або запобігання патологій, пов'язаних зі зміненнями у функціях наступних цитокінів: Th1 (IFN- та IL-12) та Th2 (IL-4, IL-5 та IL-10). Крім того, вказані композиції здатні до індукування імунної системи, спонукаючи її продукувати цитокіни типу 1. Отже, композиції заявленого винаходу мають вагому сферу застосування у запобігальному та/або кардинальному лікуванні патологій, пов'язаних зі зміненнями імунної системи, зокрема у запобігальному та/або кардинальному лікуванні алергій, атопії, алергічного риніту, гіперчутливості до продуктів харчування , атопічного дерматиту, екземи, астми або імунодефіцитів. Переважно, композиції заявленого винаходу мають вагому сферу застосування у запобігальному та/або кардинальному лікуванні атопічного дерматиту. Переважно, споживання пацієнтами, ураженими атопічним дерматитом AD, пробіотичної композиції, що містить культуру Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та культуру Bifidobacterium breve 7 11 9 (BR03) DSM 16604 з концентраціями у діапазоні між 110 та 110 CFU, переважно 110 CFU/г, впливає на пониження індексу Scorad (понижене значення індексу Scorad вказує на поліпшення якості життя). Крім того, застосування вказаної пробіотичної композиції на період строком 12-24 тижнів, переважно 16 тижнів, здатне зменшувати/блокувати секрецію цитокіну IL4. Заявник протестував всі шість вищезазначених штамів. Перші клінічні дослідження проводили з метою тестування композиції, що містить культуру Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та культуру Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604. Групу з 40 пацієнтів (чоловічої та жіночої статі, віком 18-55 років) з помірним/тяжким AD випадковим чином розподілили (1:1) по двом групам. Діагноз помірного/суворого AD оцінювали з застосуванням відомого фахівцям стандартизованого індексу суворості AD (індекс SCORAD = підрахування атопічного дерматиту). ТО відображає нульовий момент часу, як точку початку лікування, тоді як Т16 відображає 16-тижневий період лікування. Була проведена перевірка при Т16, зі Scorad та відбором зразків. Групу А піддали лікуванню з композицією, що містить культуру Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та культуру Bifidobacterium breve (BR03) DSM s 16604, що має концентрацію у 1x10 CFU (відповідно 0.01 г). Дві культури змішали з 1 г кукурудзяного крохмалю з отриманням 1.01 г кінцевої композиції у пакетах. 20 пацієнтів групи А отримували по 2 пакета на день протягом 16 тижнів. Група В отримувала плацебо, що являв собою 1 г одного кукурудзяного крохмалю. 20 пацієнтів групи В отримували по 2 пакета на день протягом 16 тижнів. Були протестовані наступні цитокіни: Th1 (IFN- та IL-12) та Th2 (IL-4, IL-5 та IL-10). Дані всіх 40 пацієнтів уважно зібрали та піддали аналізу. 3 UA 111715 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 У Фіг. 1 наведена гістограма відносно індексу Scorad при ТО та Т16. Отримані результати свідчать, що споживання 20 пацієнтами групи А пробіотичної композиції, що містить культуру Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та культуру Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 з s концентрацією у 1x10 CFU, впливає на пониження індексу Scorad у пацієнтів, уражених AD (понижене значення індексу Scorad вказує на поліпшення якості життя). Крім того, застосування вказаної пробіотичної композиції протягом 16 тижнів було у змозі блокувати секрецію цитокіну IL-4, якого розглядали, середнє значення якого була порівнянна з отриманим на момент зарахування, тоді як, на відміну від цього, застосування плацебо було не в змозі блокувати вивільнення цитокіну IL-4, що значно підвищується через 16 тижнів лікування (еволюція захворювання). Серію доклінічних досліджень провели з групою бактерій, що містить, серед іншого, культуру Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та культуру Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604. У доклінічних дослідженнях in vitro порівнювали імуномодуляторні властивості перевірених штамів бактерій, які продемонстрували, що культура Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та культура Bifidobacterium breve (BR03) DSM 16604 показують найкращу здатність у індукуванні продукування цитокінів типу 1. Також тестували культури бактерій Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605 та Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717. Культура штаму L. pentosus (LPS01) DSM 22775 показала індукування in vitro дуже сильного про-Th1 цитокінового профілю. Крім того, всі культури штамів Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980, Streptococcus thermophilus (FP4) DSM 18616, Lactobacillus casei ssp. rhamnosus (LR04) DSM 16605 та Lactobacillus acidophilus (LA02) DSM 21717 були перевірені на їх властивості індукувати синтез IL-12 за допомогою МКПК (мононуклеарних клітин периферичної крові) у дослідженнях in vivo. IL-12 є цитокіном типу Th1 та являє собою ключовий елемент у лікуванні алергій та інших атопічних патологій. В якості прикладу, повідомлені дані, що відносяться до L. pentosus (LPS01) DSM 21980, перевірених на МКПК: Th-1 (пг/мл) = 1.754; Th-2 (пг/мл) = 326; Th1/Th2 = 5.38. Заявник провів перше клінічне дослідження з застосуванням композиції, що містить культури Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775 та Bifidobacterium breve (BR03) та друге клінічне дослідження з застосуванням композиції, що містить культури Lactobacillus salivarius (LS01) DSM 22775, Bifidobacterium breve (BR03) та Lactobacillus pentosus (LPS01) DSM 21980. Для зручності, тут повідомляються тільки деталі вказаного першого клінічного дослідження, оскільки вказане друге клінічне дослідження проводили з застосуванням таких саме способів. Обидва клінічних дослідження (перше та друге) показали прийнятні до порівняння результати. Заявник проводив вказане перше клінічне дослідження (рандомізоване, подвійне сліпе, на пацієнтах, уражених тяжким або помірним атопічним дерматитом) для обчислення клінічної ефективності застосування двох пробіотичних штамів бактерій: Lactobacillus salivarius (LS01), що зберігається у DSMZ та має № зберігання DSM 22775; та Bifidobacterium breve (BR03), що зберігається у DSMZ та має № зберігання DSM 16604. У дослідженнях приймали участь 48 пацієнтів, уражених атопічним дерматитом (в подальшому, AD). їх характеристики наведені у Таблиці 1. Таблиця 1 Стать (Ч/Ж) Вік (років) Дихальна алергія Алергія на їжу Інші алергії Відсутність алергії AD (років) 45 Пацієнти з пробіотиками (n = 31) 14/17 32.44±1.47 23/31 (74.2%) 2/31 (6.4%) 7/31 (22.6%) 5/31 (16%) 19.36 ±2.38 Пацієнти з плацебо (n = 15) 5/10 30.91±2.79 9/15 (60%) 2/15 (13.3%) 2/15 (13.3%) 4/15 (26.6%) 15.08±3.04 Наведене нижче клінічне дослідження проводили у квітні-вересні 2010 р. 32 пацієнтів (група лікування) отримали препарат, що містив два пробіотичних штами бактерій під назвами L. 9 salivarius (LS01) DSM 22775 та В. breve (BR03) DSM 16604 з дозою у 110 CFU/г кожного штаму у мальтодекстрині, у той час, як 16 пацієнтів (група плацебо) отримали препарат, що містив тільки мальтодекстрин. Обидві групи отримували ліки двічі на день протягом 12 тижнів. Композиції у ліофілізованому вигляді розчинили у воді та перорально вводили пацієнтам. 4 UA 111715 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Жоден з пацієнтів не змінював свого раціону та всі з них повідомили, що під час клінічних досліджень вони не вживали кисломолочні продукти, що містять живі мікроорганізми. Пацієнти, що страждали на активне алергічне (дихальне або шкірне) або інфекційне захворювання протягом вагітності або грудного вигодовування, були виключені з даного дослідження. Пацієнти, що отримували лікування з пробіотиками, антибіотиками або імуномодуляторами протягом шести місяців перед зарахуванням або отримували лікування з пероральними стероїдами за місяць перед зарахуванням також були виключені з даного дослідження. Всі пацієнти дали свою усвідомлену згоду на момент реєстрації. Клінічну оцінку отримали на основі індексу SCORAD (індекс SCORAD = підрахування атопічного дерматиту), індексу DLQI (Dermatology Life Quality Index), мікробної транслокації та імунологічних параметрів. Для кожного окремого пацієнта, всі оцінки були зроблені під час реєстрації (початковий рівень), через 3 місяці лікування (3ms) та через 2 місяці після закінчення терапії (3+2ms). Діагностичні критерії для AD були встановлені після нещодавно опублікованого клінічного довідника. Клінічну тяжкість оцінювали з застосуванням індексу SCORAD, що був розроблений європейською оперативною групою для атопічного дерматиту. Протягом досліджень, для вимірювання змінень у симптомах, що пов'язані з патологією, всі зареєстровані пацієнти заповнили специфічну анкету DLQI ( дерматологічний індекс якості життя (Dermatology Life Quality Index)). Оцінку SCORAD на початку, у кінці та через два місяці після закінчення курсу лікування (пробіотиками або плацебо) проводив оператор, що не мав інформації про те, до якої групи належав той чи інший пацієнт. Пацієнти заповняли анкету DLQI під час реєстрації та через 12 та 20 тижнів. Зразки периферичної венозної крові від всіх піддослідних суб'єктів для відокремлення плазми та мононуклеарних клітин периферичної крові (МКПК) відбирали під час реєстрації, після трьох місяців лікування та через два місяці після закінчення курсу лікування. Відібрану плазму зберігали до моменту аналізу, тоді як МКПК відокремлювали за допомогою центрифугування у градієнті щільності. Життєздатність клітин визначали з застосуванням клітинного лічильника Adam-MC МКПК інкубували 18 годин у присутності та у відсутності ліпополісахаридного (LPS) бактеріального стимулювання. Аналіз цитокінів, індукованих антигенним стимулюванням проводили за допомогою проточної цитометрії з додаванням Брефелдину А у якості інгібітору клітинного транспорту в останні години культури. Відсоток активованих CD8+ T-лімфоцитів обчислювали безпосередньо у зразках периферичної венозної крові шляхом цитофлуорометричного аналізу з застосуванням моноклональних антитіл (mAb), сполучених з флуорохромами (CD8, CD38, CD45RO). Після інкубування з mAb, еритроцити лізували та клітини фіксували та аналізували на проточному цитометрі FC500 (Beckman Coulter). Ідентифікацію різних субпопуляцій T-лімфоцитів проводили на нестимульованих культурах МКПК та на культурах МКПК, що стимулювали з LPS протягом 18 годин у всі моменти часу вимірювань (початок досліджень, 3 місяці та 3+2 місяці). Маркування клітин проводили одночасно з застосуванням комбінацій флуоресцентних антитіл, здатних розпізнавати молекули на клітинній поверхні та на внутрішньоклітинних компонентах. Зокрема, хелперні лімфоцити типу 1 T (Th1) ідентифікували, як CD4+/IFN~Y+/Tbet+; хелперні лімфоцити типу 2 T (Тh2), як CD4+/IL-4+/GATA3+; хелперні лімфоцити типу 17 T (Th17), як CD4+/IL-1 7+/RORyT+ та, нарешті, регуляторні T-хелперні лімфоцити (Treg) ідентифікували, як CD4+/CD25+/FoxP3+/IL-10+/TGF-p+. Аналіз проводили на нестимульованих МКПК, відповідно протоколу, наданого виробником mAb. Зокрема, були необхідні наступні mAb: CD4, CD25, FoxP3, TLR-4, TLR-2. Для визначення концентрації LPS у зразках плазми застосували набор "LAL Chromogenic Endopoint Assay" від компанії Hycult biotechnology, згідно з інструкціями виробника. Тест проводили на 96-лунковому планшеті. Після 45 хв. інкубування при кімнатній температурі, поглинання з довжиною хвилі у 405 нм вимірювали за допомогою спектрофотометру та концентрації LPS у пг/мл обчислювали шляхом інтерполяції з кривою відомої концентрації. Зразки фекалій збирали під час реєстрації, після трьох місяців лікування та через два місяці після закінчення курсу лікування. Зібрані зразки негайно поміщали в умови з температурою 4°C, відбирали аліквоти та зберігали їх до часу аналізу при - 80°C. Кількісний аналіз бактерій у зразках фекалій проводили для всіх аеробних бактерій на наступні бактеріальні групи: Enterobacteria, Staphylococci, Lactobacilli (зокрема, Lsalivarius LS01) та Bifidobacteria (зокрема, В. breve BR03). Зразки фекалій розчинили у фізіологічному розчині та відповідні розведення інкубували у відповідності з наступною схемою: Всі аеробні бактерії: триптичний соєвий агар з 5% сироваткою крові овець (AS); Ентеробактерії: агар MacConkey (MC); Стафілокок: манітоловий сольовий агар (MSA); Лактобацили: агар, відповідно до DeMan, Rogosa, Sharp (MRS); 5 UA 111715 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 Біфідобактерії: селективне середовище для біфідобактерій (BSM). Середовище MC та BSM інкубували при 37°С протягом 24 та 48 годин, відповідно. Середовище AS, MRS та BSM інкубували при 37°С у присутності 10% діоксиду вуглецю протягом 24, 48 та 72 годин, відповідно. Всі колонії ідентифікували шляхом зростання у селективному середовищі, забарвленням по Граму, аналізом клітинної морфології та за допомогою тестів на каталазу та оксидазу. Склад кишкової мікрофлори кількісно обчислили (середнє значення ± стандартне відхилення на основі логарифму log 10 на грам фекальних мас) для кожної групи бактерій. Межі виявлення сягали 2 log 10 CFU/г для всіх мікроорганізмів, за виключенням В.Breve, межа виявлення для яких сягала 5 log 10 CFU/г. Модифікації підрахунків для різних мікробних груп обчислювали, як: [(Log 10 CFU/г при Т12 або Т16) - (Log 10 CFU/г при TO)] Два штами бактерій спочатку ідентифікували на основі їх морфологічних особливостей: L salivarius LS01, що культивували у агаризованому середовищі BSM утворюють кремово-білі колонії, округлі, з подовженою формою та діаметром у 2-4 мм; В. breve BR03 у агаризованому середовищі BSM утворюють пурпурові колонії, округлі, з подовженою формою та діаметром у 12 мм. У культурах, де можна припустити наявність штамів L. salivarius та В. breve, десять випадково вибраних колоній аналізували з застосуванням ПЛР (полімеразної ланцюгової реакції) у відповідності з вказівками, опублікованими Національним інститутом охорони здоров'я. Всі колонії, що класифікували, як L. salivarius або В. breve потім були досліджені за допомогою гель-електрофорезу у пульсуючому полі (PFGE) та порівнянням профілів з прийнятними зразками. Результати аналізували з застосуванням відповідних статистичних тестів. Т-тести застосували для порівняння пацієнтів протягом лікування. Можливі співвідношення обчислили з застосуванням тесту кореляції Пірсона. Змінення кількості бактерій аналізували з застосуванням тесту Вілкоксона - Манна - Уітні. Статистичний аналіз проводили за допомогою програмного забезпечення SPSS. Клінічні дослідження повністю пройшли 46 пацієнтів, уражених AD; 2 пацієнта (по одному пацієнту на групу) були виключені з досліджень. Оцінки SCORAD (індекс SCORAD) та DLQI були зроблені в ході подальших обстежень. Пацієнти, яких лікували пробіотиками показали значне зменшення індексу SCORAD у кінці лікування (р=0.001), що також підтримувався після припинення лікування (р=0.006) (Таблиця 2). Аналогічним чином, DLQI показав поліпшення у пацієнтів, яких лікували з пробіотичною сумішшю (дані на початок досліджень (реєстрація) у порівнянні з даними, отриманими після 3 міс. лікування: р=0.024; дані на початок досліджень (реєстрація) у порівнянні з даними, отриманими через 2 міс. після завершення лікування: р=0.001). У групі пацієнтів, що вживали плацебо, ніякої значущої різниці у індексі SCORAD або DLQI не спостерігалося (Таблиця 2). Концентрація LPS є індексом мікробної транслокації; підвищення цієї концентрації пов'язане зі зміненнями кишкової проникності. Лікування з двома пробіотичними штамами викликає зменшення концентрації LPS у плазмі, що також зберігається після призупинення терапії (початкове значення у порівнянні з даними, отриманими після 3 міс. лікування: р=0.050; початкове значення у порівнянні з даними, отриманими через 2 міс. після завершення лікування: р

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Composition comprising probiotic bacteria for use in the treatment of immune disorders

Автори англійською

Mogna, Giovanni, Strozzi, Gian Paolo, Mogna, Luca, Drago, Lorenzo

Автори російською

Моня Джованни, Строцци Джан Паоло, Моня Лука, Драго Лоренцо

МПК / Мітки

МПК: A61P 17/00, A61P 37/00, C12R 1/08, A61K 35/74, C12R 1/225, C12N 1/12

Мітки: імунних, бактерії, розладів, містить, застосування, лікуванні, композиція, пробіотичні

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/16-111715-kompoziciya-shho-mistit-probiotichni-bakteri-dlya-zastosuvannya-u-likuvanni-imunnikh-rozladiv.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Композиція, що містить пробіотичні бактерії для застосування у лікуванні імунних розладів</a>

Подібні патенти