Застосування лактобацил, що інгібують отримані від уражених кольками немовлят коліформні бактерії, які виробляють газ

Номер патенту: 107711

Опубліковано: 10.02.2015

Автор: Скатіцці Джанна

Є ще 6 сторінок.

Дивитися все сторінки або завантажити PDF файл.

Формула / Реферат

1. Пробіотичний штам бактерій Lactobacillus delbruekii DSM 22106 як інгібітор коліформних бактерій.

2. Пробіотичний штам бактерій відповідно до п. 1, де вказані коліформні бактерії є вибраними з групи, що включає коліформні бактерії, які виробляють газ шляхом ферментації цукру, переважно лактози.

3. Пробіотичний штам бактерій відповідно до п. 1 або п. 2, де вказані коліформні бактерії є вибраними з групи, що охоплює бактерії, які належать до видів Escherichia соli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis.

4. Пробіотичний штам бактерій відповідно до будь-якого одного з пп, 1-3, де штам L. delbruekii DSM 22106 має антибактеріальну активність проти бактерій, що належать до видів Escherichia соli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis.

5. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція, що містить штам бактерій відповідно до будь-якого одного з пп. 1-4.

6. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 5, де також є присутнім принаймні один інший штам бактерій, де вказаний штам являє собою Lactobacillus plantarum DSM 22107.

7. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 5 або 6 для застосування у запобіганні та/або лікуванні осіб, що страждають на кольки.

8. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до будь-якого одного з пп. 5-7, де вказаний штам Lactobacillus delbruekii DSM 22106, та вказаний Lactobacillus plantarum DSM 22107, мають покриття з композиції, що містить принаймні один ліпід, переважно рослинного походження, де вказаний ліпід є вибраним із групи, що включає насичені жири з температурою плавлення нижче 75 °С, переважно у межах 45-65 ° С.

9. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 8, де вказані насичені жири є вибраними з моно- та дигліцеридів насичених жирних кислот, полігліцеринів, естерифікованих при використанні насичених жирних кислот, та вільних насичених жирних кислот.

10. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 9, де вказані насичені жири є вибраними з полігліцерилдистеарату, гліцерилпальмітостеарату, насичених жирних кислот або гідрогенізованих рослинних жирів, які не мають походження від лауринових сполук.

11. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до будь-якого одного з пп. 5-10, де пробіотичні штами бактерій Lactobacillus delbruekii DSM 22106, та Lactobacillus plantarum DSM 22107 є покритими першим та другим покриттями, де вказане перше покриття являє собою гідрогенізовану пальмову олію з температурою плавлення близько 60 °С, а вказане друге покриття є жиром гліцерилдипальмітостеарату з температурою плавлення у межах 57-60 °С.

12. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до будь-якого одного з пп. 5-11 у формі маслянистої суспензії, що містить:

- принаймні одну харчову олію, вибрану з групи, що включає: оливкову олію, кукурудзяну олію, соєву олію, лляну олію, арахісову олію, кунжутну олію, риб'ячий жир та рисову олію, де вказана принаймні одна олія є присутньою у кількості, що є більшою або дорівнює 70 % за вагою відносно до загальної ваги суспензії, та

- пробіотичний штам бактерій Lactobacillus delbruekii DSM 22106, де вказаний штам є присутнім у кількості, що є меншою або дорівнює 30 % за вагою відносно до загальної ваги суспензії.

13. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 12, що додатково включає пробіотичний штам Lactobacillus plantarum DSM 22107.

14. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 12 або 13, де олією суспензії є оливкова олія, переважно оливкова олія у суміші з кукурудзяною олією та/або соєвою олією та/або лляною олією.

Текст

Дивитися

Реферат: Винахід належить до композиції, що містить пробіотичний штам бактерій Lactobacillus delbruekii DSM 22106 та додатково бактеріальний штам з антиоксидантними властивостями, зокрема Lactobacillus plantarum DSM 22107, здатних здійснювати антиоксидантну та/або антибактеріальну та конкурентну дію проти видів коліформних бактерій, що виробляють газ шляхом ферментації цукру, зокрема лактози, отриманих від уражених кольками немовлят. UA 107711 C2 (12) UA 107711 C2 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявлений винахід стосується штаму пробіотичних бактерій, здатних до інгібування отриманих від уражених кольками немовлят коліформних бактерій, що виробляють газ. Крім того, заявлений винахід стосується харчової композиції або добавки або фармацевтичної композиції, що містить вказаний штам бактерій для застосування у профілактиці та/або у лікуванні кишкових розладів та кольок у немовлят та дітей. Добре відомо, що дитячі кольки є одним з найбільш частих порушень перших трьох місяців життя немовляти. Відомо також, що їх етіологія поки ще не цілком зрозумілою та, ймовірно, є багатофакторною. Протягом останніх років, спостерігається зростання даних, що вказують на участь кишкової бактеріальної флори в патогенезі кольок. Нещодавні експериментальні дослідження наводять на думку, що змінення мікробного середовища дітей, уражених кольками можуть викликати порушення регуляції моторної функції кишечника та привести до збільшення продукування газу, що, в результаті надмірного метеоризму, являє собою один з класичних симптомів розладу. Нарешті, відомо що немовлята, які страждають на кольки у порівнянні зі здоровими немовлятами є більш сприятливими до колонізування мікроорганізмом Clostridium difficile, що виробляє газ. В даний час, здається, найбільш прийнятним препаратом для лікування кольок є Симетикон (Simethicone). Цей препарат рекомендують для лікування кольок, хоча існують дослідження, що спростовують його реальну ефективність в природних умовах в порівнянні з плацебо у дітей з кольками (Metcalf TJ, et al. Simethicone in the Treatment of Infant Colic: A Randomized, PlaceboControlled, Multicenter Trial. 1994, Pediatrics. 94(1): 29-34; Sferra TJ, et al. Gastrointestinal gas formation and infantile colic. 1996, Pediatr Clin North Am. 43(2): 489-510). Отже, залишається потреба у ефективному, вільному від побічних дій та легкому у застосуванні лікуванні та/або у профілактиці шлунково-кишкових розладів та кольок у немовлят. Заявник зобов'язався вирішити проблеми, пов'язані з запобіганням та/або лікуванням шлунково-кишкових розладів у немовлят/дітей. Зокрема, Заявник звернувся до проблем, пов'язаних з запобіганням та/або лікуванням кольок у немовлят/дітей. Під час інтенсивної дослідницької активності, Заявник відібрав специфічні пробіотичні штами бактерій, що належать до виду Lactobacillus delbrueckii. Об'єктом заявленого винаходу є пробіотичний штам бактерій, вибраний з групи, що охоплює штами бактерій, що належать до виду Lactobacillus delbrueckii. Бажані втілення заявленого винаходу наведені нижче у наступному детальному описі, без будь-якого обмеження обсягу заявленого винаходу. Таблиця 1 стосується антагоністичній активності, яку можна спостерігати у чашках з Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 порівняно з коліформними бактеріями, отриманими від уражених кольками немовлят. Інгібування зростання патогенів показано у вигляді зростання радіуса зони пригнічення, що виникає навколо дисків, просочених цілими клітинами вибраних лактобацил. Таблиця 2 має відношення до кількісної оцінки загального вмісту коліформ у фекальних зразках 20 немовлят, що страждали на кольки, отриманих під час проявлення розладу. (*) Загальну кількість коліформ визначали шляхом підрахунку колоній, що зросли на чашках з агаром MacConkey, тоді як видові концентрації визначали за допомогою вид - специфічного способу ПЛР-фінгерпринтинга та риботипування. Вибрані пробіотичні штами бактерій діють у якості інгібіторів проліферації коліформних бактерій. Переважно, вказані коліформні бактерії є вибраними з групи, що охоплює коліформні бактерії, які виробляють газ шляхом ферментації цукру, переважно лактози. Доведено, що вибрані пробіотичні штами бактерій мають антибактеріальну та/або антимікробну активність (інгібіторну активність) проти видів Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та, нарешті, проти Enterococcus faecalis, що отримані від уражених кольками немовлят та належать до роду коліформних бактерій, що беруть участь у ферментації лактози та у виробництві кишкового газу, що вважається однією з головних супутніх причин кольок у немовлят. Зокрема, вказані коліформні бактерії є вибраними з групи, що охоплює бактерію Escherichia coli. У бажаному втіленні, пробіотичним штамом бактерій є Lactobacillus delbrueckii MB386, що зберігається у DSMZ (німецька колекція мікроорганізмів та клітинних культур, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) від компанії Steve Jones Sri, Florence, Italy, 10.12. 2008 та має інвентарний номер DSM 22106. 1 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 Штам Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 має ефективну антибактеріальну та/або антимікробну активність проти коліформних бактерій, отриманих від уражених кольками немовлят. Додатковим об'єктом заявленого винаходу є харчова композиція або добавка, що містить принаймні один пробіотичний штам бактерій, що належать до виду Lactobacillus delbrueckii, як зазначено вище. Додатковим об'єктом заявленого винаходу є композиція, що містить принаймні один пробіотичний штам бактерій, що належать до виду Lactobacillus delbrueckii, як зазначено вище, для застосування у якості лікувального засобу. Всі вищезазначені композиції заявленого винаходу мають застосовність у запобіганні та/або лікуванні розладів або патологій, пов'язаних з діареєю, кольками, розладом шлунку та підвищеною кислотністю шлункового соку, синдромом подразненого кишечника, метеоризмом, виразковою хворобою шлунка або дванадцятипалої кишки, диспепсією, хворобою Крона, ураженнями черевини та хворобами жовчовивідних шляхів. У бажаному втіленні, всі з вищезазначених композицій заявленого винаходу мають застосовність у запобіганні та/або лікуванні осіб, що страждають на шлунково-кишкові розлади, кольок и та метеоризм, зокрема, немовлят /дітей. У бажаному втіленні, всі з вищезазначених композицій заявленого винаходу додатково містять принаймні один інший штам бактерій, що мають антиоксидантні властивості, вибраний з групи, що охоплює штами бактерій, що належать до виду Lactobacillus plantarum; переважно вказаний штам є Lactobacillus plantarum LP1, що зберігається у DSMZ від компанії Steve Jones Sri, Florence, Italy, 10.12. 2008 та має інвентарний номер DSM 22107. Штам Lactobacillus plantarum LP1 DSMZ 22107 має антиоксидантні властивості. Штам Lactobacillus plantarum LP1 DSMZ 22107 є пробіотичним штамом, тому він демонструє антиоксидантну активність, пов'язану з відмінною життєздатністю, що було перевірено in vitro у шлунковому соку та у жовчі та свідчить про толерантність до кишкового транзиту. Всі з вищевказаних композицій є ефективними у запобіганні бактеріальних інфекцій та загамуванні шлунково-кишкових симптомів та розладів, кольок та метеоризму. У одному втіленні заявленого винаходу, харчова композиція або добавка або фармацевтична композиція може містити вищезазначені бактеріальні штами заявленого винаходу у вигляді мікрокапсул, тобто, покритих композицією, що містить принаймні одну рідину (рідку композицію), переважно рослинного походження. Альтернативно, харчова композиція або добавка або фармацевтична композиція може містити вищезазначені бактеріальні штами заявленого винаходу у вигляді мікрокапсульованих бактерій та не- мікрокапсульованих бактерій. Вказана рідка композиція містить принаймні одну рідину та вказана принаймні одна рідина є рослинного походження. Переважно, вказана рідина рослинного походження є вибраною з групи, що охоплює насичені жири. Переважно, застосовані насичені жири мають температуру плавлення, нижчу, ніж 75 °C, переважно, у межах 45 °C-65 °C. У бажаному втіленні, вказані насичені жири є вибраними з групи, що охоплює моно- та дигліцериди насичених жирних кислот, полігліцерини, естерифіковані з насиченими жирними кислотами та вільні насичені жирні кислоти. Переважно, вказані насичені жири є вибраними від полігліцерилдістеарату, гліцерилпальмітостеарату та гідрогенізованих рослинних жирів нелаурінового походження. У першому втіленні, вищезазначені бактеріальні штами заявленого винаходу мають одношарове покриття (монопокриття). Практично кажучи, у даному випадку застосовано одиничне покриття з одного ліпіду. Переважно, це одиничне покриття є на основі полігліцерил дистеарату (торгівельна назва Plurol Stearique WL 1009). Вищезазначені штами бактерій заявленого винаходу з монопокриттям знаходяться у харчовій композиції або у добавці або у фармацевтичній композиції заявленого винаходу. У другому втіленні, вищезазначені штами бактерії заявленого винаходу мають подвійне покриття. Практично кажучи, у даному випадку застосовано подвійне покриття, що складається з двох ліпідів, що відрізняються один від одного. Переважно, вибрані два ліпіди є гідрогенізованою пальмовою олією (Tm (температура плавлення) = 60 °C) та гліцерину дипальмітостеаратом (Tm=57-60 °C); їх по черзі розпилюють на ліофілат, тобто на ліофілат наносять подвійне покриття: спочатку з гідрогенізованою пальмовою олією (наприклад, з Revel C) та потім з гліцерину дипальмітостеаратом (наприклад, Precirol Ato 5) у ваговому 2 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 співвідношенні 3:1 один до одного, переважно 2:1, наприклад 2/3 ваги першого та 1/3 ваги другого. Вищевказані види бактерій присутні у кількостях, що знаходяться у межах 0.1 % - 75 % за вагою, переважно 0.5 % - 15 % за вагою; навіть більш переважно 1 % - 10 % за вагою, по відношенню до загальної ваги композиції або добавки. Однак, вказаний відсоток по відношенню до загальної ваги композиції залежить від типу продукту композиції або добавки. У бажаному втіленні, композиція або добавка містить покриті оболонкою та/або непокриті 6 11 бактерії у концентрації у межах 1 × 10 - 1 × 10 КУО (колонієутворюючих одиниць) / г, 8 10 переважно 1 × 10 - 1 × 10 КУО / г. У бажаному втіленні, композиція або добавка містить бактерії з концентрацією у межах 1 × 6 11 8 10 10 - 1 × 10 КУО / дозу, переважно 1 × 10 - 1 × 10 КУО / дозу. Доза може бути у межах 0.2-10 г; наприклад, вона може дорівнювати 0.25 г, 1 г, 3 г, 5 г або 7 г. Пробіотичні бактерії, застосовані у заявленому винаході можуть знаходитися у твердій формі, зокрема у вигляді порошку, зневодненого, розпиленого або ліофілізованого. Бактерії можуть бути покриті та/або непокриті оболонкою. Бактерії, переважно у вигляді мікрокапсул (покриті), можуть бути мікрокапсульовані за допомогою відомих фахівцям загальноприйнятних способів та з застосуванням відомих та прийнятних у фармацевтичній промисловості технічних засобів. Наприклад, це може бути технологія "киплячого шару" (наприклад, верхнього або нижнього розпилювання), де застосовують матеріали покриття ліпідної природи. Протягом мікроінкапсуляції, важливим фактором є температурний контроль виробничого процесу. Зокрема, важливо контролювати температуру застосованого ліпіду для уникнення загибелі застосованих штамів. У бажаному втіленні, композиція або добавка є у вигляді маслянистої суспензії, що містить: - принаймні одну харчову олію, вибрану з групи, що охоплює: оливкову олію, кукурудзяну олію, соєву олію, лляну олію, арахісову олію, кунжутну олію, риб'ячий жир та рисову олію, вказана принаймні одна олія є наявною у кількості, більшої ніж або що дорівнює 70 % за вагою по відношенню до загальної ваги суспензії та - принаймні один пробіотичний штам бактерій, вибраний з групи, що охоплює штами бактерій, що належать до виду L. delbrueckii та L. plantarum, вказаний штам є наявним у кількості, що є меншим або дорівнює 30 % за вагою по відношенню до загальної ваги суспензії. У бажаному втіленні, олією суспензії є тільки оливкова олія; переважно вона є оливковою олією у суміші з кукурудзяною олією та/або соєвою олією та/або лляною олією. У бажаному втіленні, маслянисті суспензії також можуть містити, у кількості у межах 0.1-15 % за вагою по відношенню до загальної ваги суспензії принаймні одну тонко подрібнену харчову речовину, вибрану з групи, що охоплює діоксид кремнію, силікагель, колоїдний діоксид кремнію, осаджений діоксид кремнію, тальк, силікат магнію, оксид магнію, карбонат магнію, силікат кальцію, лецитин, моно-або дигліцериди, як-то гліцерину моностеарат, гліцерину моноолеат, полігліцерид олеїнової кислоти, крохмаль, модифіковані крохмалі, конжакову, ксантанову та геланову камедь та карагенан. У бажаному втіленні, масляниста суспензія також може містити, у кількості 0.5-25 % за вагою по відношенню до загальної ваги суспензії, принаймні одну пребіотичну волокнисту речовину та/або біфідогенний вуглевод, вибраний від інуліну, фрукто-олігосахаридів (FОS), галакто- та трансгалакто- олігосахаридів (GOS та TOS), глюко-олігосахаридів (GOS), ксилоолігосахаридів (XOS), хітозанових олігосахаридів (COS), соєвих олігосахаридів (SOS), ізомальто-олігосахаридів (IMOS), мальтодекстрину, резистентного крохмалю, пектину, псиліуму, арабіногалактанів, глюко- та галактомананів, ксиланів, лактосахарози, лактулози, лактиту, волокон акації, волокон рожкового дерева, вівсяних, бамбукових та цитрусових волокон. У бажаному втіленні, масляниста суспензія містить принаймні одну волокнисту речовину та принаймні один вуглевод, вибраний від глюко- олігосахаридів (GOS), фрукто- олігосахаридів (FOS), інуліну та/або мальтодекстрину. У бажаному втіленні, масляниста суспензія містить Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 та Lactobacillus plantarum LP1 DSMZ 22107, покритий (мікрокапсульований) одиничним покриттям (або двома покриттями) з принаймні однією рідиною з температурою плавлення нижче 75 °C, переважно, у межах 45-65 °C, як зазначено вище. Маслянисту суспензію заявленого винаходу отримали за допомогою відомих фахівцям способів та обладнання. Практично кажучи, вибрану кількість олії вводять у контейнер, обладнаний засобами перемішування та нагрівання. Потім пробіотичні бактерії у твердій формі поступово додають разом з перемішуванням, щоб уникнути утворення грудочок та агломератів. Після закінчення додавання бактерій, маслянисту субстанцію зберігають протягом 1-30 хв., з перемішуванням та легким нагріванням у разі потреби до температури у межах 24-40 °C, переважно 30-35 °C. 3 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 У бажаному втіленні заявленого винаходу, пробіотичні бактерії можна застосувати у вигляді мікрокапсул, тобто покритих композицією, що містить принаймні одну рідину, переважно рослинного походження. Потім, за допомогою тих же саме оперативних способів, що вказані вище, до олії додають мікрокапсульовані бактерії. У іншому втіленні заявленого винаходу, бактерії додають до олії у вигляді мікрокапсульованих бактерій та "оголених", немікрокапсульованих бактерій. Бактерії, переважно у вигляді мікрокапсул, можуть бути мікрокапсульовані за допомогою відомих способів, відомих фахівцям. Наприклад, це може бути технологія "киплячого шару" (наприклад, верхнього або нижнього розпилювання), де застосовують матеріали покриття ліпідної природи. У бажаному втіленні, застосовують насичені рослинні жири з температурою плавлення нижче 75 °C, переважно у межах 45-65 °C. У бажаному втіленні, можна застосувати насичені рослинні жири, що мають певний рівень гідрофільності; вибрані від моно- та ди- гліцеридів насичених жирних кислот, полігліцеринів, естерифікованих з насиченими жирними кислотами та вільних насичених жирних кислот. Наприклад, можна застосувати полігліцерил дистеарат (торгівельна назва Plurol Stearique WL 1009), гліцерил пальмітостеарат (торгівельна назва Precirol Ato 5), насичені жирні кислоти (торгівельна назва Revel C) або зневоднені рослинні жири не-лауринового походження. У бажаному втіленні, вагове співвідношення між ліофілізованим мікроорганізмом та його рідким матеріалом покриття дорівнює 50:50 або 40:60. У першому втіленні, на ліофілат розпилюють по черзі два ліпіди, гідрогенізовану пальмову олію (Tm=60 °C) та гліцерину дипальмітостеарат (Tm=57-60 °C), тобто тут застосовують подвійне покриття ліофілату: перше з гідрогенізованою пальмовою олією та друге з гліцерину дипальмітостеаратом у співвідношенні одного до другого, що дорівнює 3:1. Подвійне покриття клітин надає кращу ізоляцію бактерій від навколишнього середовища з отриманням суцільного шару плівки, що позбавлена пор, які виходять назовні. Однак, ця оболонка повинна відчинитися у шлунково-кишковому тракті для вивільнення бактерій, щоб дозволити там їх заселення. Фактично, вибрані ліпіди є стійкими до кислих значень pH, отже оболонка залишається інтактною у шлунку, але вони є чутливими до навіть слабких основних значень pH, що робить можливим утворення дірок у оболонці протягом її проходу крізь кишечник. Масляниста суспензія містить бактерії у кількості, меншій ніж або що дорівнює 30 % за вагою, у межах 0.520 % за вагою по відношенню до загальної ваги суспензії; переважно у кількості 0.5-10 %; більш переважно у кількості 1.5-5 % за вагою по відношенню до загальної ваги суспензії. Масляниста суспензія має великий потенціал для застосування у якості лікувального засобу для лікування шлункових розладів, як-то кольок у педіатричних пацієнтів. Метою досліджень була оцінка ролі коліформних бактерій, що виробляють газ у етіології кольок у немовлят. Практично кажучи, до рандомізованих перспективних досліджень залучили 49 немовлят, що страждали на кольок и та 35 здорових немовлят; вік немовлят був у межах 20-90 днів відповідно до гестаційному віку, всі вони мали виключно грудне годування та не мали захворювань шлунково-кишкової системи. У заздалегідь визначені моменти часу, з обох груп немовлят зібрали фекальні зразки, які перевірили протягом наступних 48 годин. Дослідження мали на меті встановлення існування значних якісних / кількісних відмінностей у двох групах дітей відносно наявності коліформних бактерій, що виробляють газ. Типовими видами, що входять до групи коліформних бактерій є Citrobacter, Enterobacter, Escherichia coli, Klebsiella та інші малі групи. Ідентифікацію найбільш характерних видів, виділених з фекальних зразків проводили на молекулярному рівні за допомогою ПЛР (полімеразна ланцюгова реакція) та способів автоматизованого риботипування. Наприкінці, була перевірена здатність мікробних колоній виробляти газ шляхом ферментації лактози та інших цукрів. Молекулярна та фенотипічна ідентифікації різних видів коліформних бактерій показали різну картину колонізації у двох групах, з кольками та без них. Зокрема, концентрація видів Escherichia coli була значно вищою у групі немовлят з кольками [(6.04 Log 10 порівняно з 4.47 -1 Log 10) CFUг фекалій]. Вважається, що саме аномальна концентрація цих видів Escherichia coli може приймати участь у розвитку розладу. Втім, не може бути виключено, що велика кількість видів коліформних бактерій, яку спостерігали в нашому дослідженні у дітей, постраждалих від патології може бути пов'язана зі зменшенням присутності деяких інших видів бактерій, поки ще не визначених, які є сприятливими для організму хазяїна, що, можливо, впливає на його стан здоров'я. 4 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 Заявник провів дослідження з метою відбору пробіотичних штамів бактерій, що належать до роду Lactobacillus, відбору та оцінки щодо ефективності їх антиоксидантної, антибактеріальної та антимікробної дії проти видів коліформних бактерій, отриманих від уражених кольками немовлят. З фекального матеріалу немовлят, що страждають на кольки, були виділені десятки штамів коліформних бактерій, що виробляють газ шляхом ферментації цукру, особливо лактози, з метою оцінки інгібування їх зростання in vitro пробіотичними штамами бактерій роду Lactobacillus, що були взяті на розгляд. Для кількісного підрахунку та перевірки наявності коліформних бактерій, дослідники зібрали фекальні зразки від 49 немовлят виключно грудного годування, що страждали на кольок та ці кольки були у них виявлені за 6±1 днів перед реєстрацією. Виділення штамів здійснювали на селективних чашках з агаром MacConkey (DIFCO n. 0075.17.1), де середовище звичайно застосовували для виділення та кількісного аналізу ентеричних бактерій (відомих, як "коліформи") після їх розміщення у ідеальні умови для зростання: 37 °C у контрольованій атмосфері. Після 12 год. інкубування, дослідники перелічили колонії, що виникли на чашках та уважно занотували всі морфологічні відмінності між ними. Численні результати зображені у вигляді Log 10 КУО (колонієутворюючих одиниць) на грам фекального матеріалу. Потім кожну виділену колонію окремо відбирали на інокуляцію у пробірці з рідким середовищем LB (Luria-Bertani) для отримання чистих культур. Взагалі, для отримання найбільш характерних видів коліформних бактерій, було проаналізовано 20 фекальних культур, отриманих з фекального матеріалу немовлят, що страждали на кольки. Вид-специфічне розпізнавання колоній проводили за допомогою двох різних процедур молекулярної ідентифікації: праймер-специфічної ПЛР та автоматизованого риботипування. При об'єднанні результатів, отриманих за допомогою обох способів, стало можливим ідентифікувати з високим рівнем точності виділений штам та визначити, які види є найбільш характерними для популяції коліформних бактерій з кишечника немовлят, що страждають на кольки. Нарешті, кожен з бактеріальних видів був підданий кількісному аналізу шляхом обчислення його відсотка відносно цілої виділеної популяції коліформних бактерій. Автоматизоване штам - специфічне риботипування полягало в застосуванні надзвичайно складного приладу RiboPrinter Microbial Characterization System (Qualicon Inc., Wilmington, DE, USA). Бактеріальні колонії, виділені на чашці відбирали по окремості; після етапу термальної обробки та за допомогою застосування літичних ферментів було отримано вивільнення ДНК, яку розрізали рестрикційною ендонуклеазою EcoRl. Нарешті, розділені за допомогою гельелектрофорезу фрагменти ДНК аналізували за допомогою модифікованого Саузерн-блот аналізу. Результати гібридизаційного аналізу перетворили на зображення окремих хемілюмінесцентних смуг, що прилад перетворив на електронні дані або на шаблони ("генетичні знімки") приладу Riboprinter, який їх захоплює та зберігає в пам'яті. Остаточної ідентифікації досягають шляхом порівняння шаблонів приладу Riboprinter, що зберігаються у базі даних Dupont приладу. Профілі зі схожістю, що принаймні дорівнює 93 %, що були обчислені за допомогою відповідного алгоритму, об'єднали з утворенням динамічної групи (Ribogroup), яка відображає відносини або генетичні ідентичності серед виділених колоній. Для молекулярної ідентифікації колонієутворюючих бактерій, ампліфікували 16S-23S фрагменти внутрішньо транскрибованих спейсерних регіонів рибосомальної ДНК. Виділені на чашках чисті колонії зібрали, кожну по окремості, ресуспендували у стерильній дистильованій воді та потім лізували протягом 5 хв. при 95 °C для вивільнення ДНК. Реакції ампліфікації здійснювали за допомогою універсальних праймерів: 16S-for (5'GCTGGATCACCTCCTTTC-3') та 23S-rev (5'-AGTGCCAAGGCATCCACC-3'). Реакції ампліфікації проводили за допомогою приладу Biometra TGradient Thermal Cycler (Biometra, Gottingen, Germany), що був обладнаний специфічною термоциклічною програмою. Ампліфікати розділили шляхом гель-електрофорезу; фрагменти у приблизно 400 п.о. очистили за допомогою набору QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Germany). Остаточно, фрагменти ДНК, ампліфіковані з 16S та 23S праймерами піддали автоматичному сиквенсаналізу. Опосередковану всіма отриманими коліформними бактеріями здатність виробляти газ оцінювали шляхом інокуляції кожного окремого штаму у рідкому середовищі LB та/або у середовищі лаурил-сульфат триптози (LST) з 10 г/л лактози в якості єдиного джерела вуглецю. Через 24-48 год. після інокуляції та інкубації при 35 °C, бактеріальні культури перевірили на 5 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 присутність бульбашок газу у рідкому середовищі відповідно за способом від Jiang T et al. Про наявність газу свідчила позитивна реакція перевірки. Штами лактобактерій, чию антимікробну активність перевіряли у порівнянні з коліформними бактеріями немовлят являли собою 30 випадково вибраних штамів різних видів лактобактерій. Лактобацили, що застосовували у цих дослідженнях, надійшли від колекцій ATCC та DSMZ (American Type Culture Collection, Rockville, Md. та Deutsche Sammlung von Mikroorganismem und Zellkulturen, Braunschweig, Germany, відповідно). Таксономію штаму Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 підтвердили на видовому рівні шляхом автоматизованого риботипування. Вибраний шляхом скринінгу штам Lactobacillus! delbrueckii MB386 надійшов від німецької колекції DSMZ (DSM 20074 або ATCC 9649). Всі лактобацили, що застосовували у даних дослідженнях культивували протягом 24 год. при 37 °C у середовищі MRS для лактобацил від Difco Laboratories, Sparks, Maryland, USA(MRS), що містило 0.5 г/л цистеїну в якості відновлювача. Антимікробні властивості оцінювали за допомогою двох підходів: інгібування бактеріального зростання на чашках або диско-дифузійного тесту Кірбі-Бауера (1940). Отримання спільної культури вибраних лактобактерій з одним або декількома штамами коліформних бактерій здійснили від немовлят, що страждають на кольки. Метою способу дослідження антимікробної активності на чашках є перевірка інгбуючої дії штамів лактобацил, яку розглядали під час зростання in vitro коліформних бактерій, отриманих з немовлят. Штами лактобацил підрощували у анаеробній культурі у рідкому середовищі MRS протягом 48 год. при 37 °C. Клітини, зібрані з культури шляхом центрифугування 4 6 ресуспендували в сольовому розчині до отримання концентрації 10 та 10 клітин/мл, яку визначали вимірюванням оптичної щільності при 600 нм. Супернатант, відокремлений від біомаси, нейтралізували до pH 7.0. Клітинну суспензію, що містить коліформні бактерії, яку 3 6 перевіряли при концентрації 10 та 10 клітин/мл розподілили на твердому агарному (0.7 %) середовищі LB (Luria Bertani); потім на цьому середовищі розмістили два диска (діаметром 6 мм), де один був просочений клітинною суспензією досліджуваних лактобацил та інший був просочений пов'язаним з ними супернатантом. Контроль отримали таким саме чином, але з розміщенням двох непросочених стерильних дисків у середовищі. Після 18 - годинного інкубування при 37 °C, було проведено вимірювання ділянок площини інгібування псевдопатогену, що з'явилися навколо дисків. Антагонізм, спрямований проти зростання коліформних бактерій, що був викликаний досліджуваними лактобацилами був підтверджений шляхом спільного інкубування у рідкому середовищі кожного потенціального пробіотичного інгібітору з найбільш характерними коліформними бактеріями, отриманими з немовлят. Інокулят спільного культивування отримали шляхом окремого культивування пробіотичних та коліформних бактерій у оптимальних умовах, після чого бактеріальні клітини від кожної з двох культур зібрали шляхом центрифугування та ре-суспендували у свіжому еквівалентному середовищі для уникнення будь-якого сприяння зростанню, що може трапитись через небажані змінення pH або через зменшення вмісту додаткових поживних речовин. Рідке середовище на основі модифікованого середовища LB (Luria Bertani) з додаванням 3 % дріжджового екстракту, pH 7) піддали інокуляції лактобацилами з загальною кількістю 105 КУО/мл лактобацил та відомою бактеріальною суспензією коліформних бактерій з такою ж саме концентрацією. Контроль отримали таким саме чином, замінивши пробіотичний інокулят на чисте свіже середовище без будь-яких клітин. Отримані таким чином спільні культури та контролі інкубували при 37 °C у контрольованому середовищі з низькім вмістом кисню та через 8-10 год. антагоністичну активність пробіотичних бактерій оцінювали шляхом визначення інгібування зростання коліформних бактерій. Це значення обчислювали шляхом віднімання кількості коліформних бактерій у пробірці при спільному інкубуванні від кількості коліформних бактерій з контрольної пробірки (інокуляція тільки з коліформними бактеріями). КУО/мл зростаючої життєздатної бактеріальної популяції вимірювали шляхом розподілення відомих аліквот спільної культури та контролів у середовищі, селективному до лактобацил (лактобацильний агар MRS) та коліформ (агар MacConkey) (Annuk 2003); Нарешті, після 24 год. спільного інкубування були визначені змінення pH. Результати щодо концентрацій лактобацил та коліформних бактерій наведені, як Log 10 КУО/мл. Нижче, з ілюстративною метою, наведені приклади, що не призначені для обмеження обсягу винаходу в будь-якому випадку. Приклад 1 Вибраний штам Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 анаеробно культивували у рідкому середовищі протягом 48 год. при 37 °C. Нічну культуру штаму коліформних бактерій Escherichia coli sp., отриманого від немовляти № 15 (див. Таблицю 2), що мав клінічно підтверджені 6 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 симптоми дитячих кольок піддали обробці, подібній до попередньо описаного аналізу 3 6 дослідження антимікробної активності на чашках. Суспензію, що мала концентрацію у 10 -10 клітин/мл коліформних бактерій розподілили на поверхні твердого середовища LB; після чого на ньому розмістили два диски, де один (диск B, Фіг. № 1) був просочений суспензією зібраних клітин Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 та другий був просочений відповідним нейтралізованим супернатантом (диск A, Фіг. № 1), після чого чашку з цим матеріалом залишали на принаймні одну годину при 4 °C. Після 18-годинного інкубування при 37 °C, була виміряна зона інгібування зростання штаму Escherichia coli sp., що з'явилася навколо двох дисків. Результат: ореол від інгібування зростання перевіреного штаму Escherichia coli, отриманого від немовляти № 15, що страждав на дитячі кольки можна було візуально спостерігати тільки навколо диску, що був просочений суспензією клітин Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106, тоді як навколо диска, просоченого відповідним супернатантом лактобацил виникла зона відсутності інгібування. Виміряний ореол інгібування зростання коліформних бактерій мав радіус у 13 мм (Фіг. № 1). Приклад 2 Була проведена оцінка антимікробної активності, яку проявляли пробіотичні лактобацили Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 відносно штаму b Klebsiella pneumonia, отриманого від немовляти № 12, що страждав на дитячі кольки (Таблиця № 2). Для досягнення мети тестування, два бактеріальних штами були піддані обробці, як описано у Прикладі 1. Результат: були проведені вимірювання зони інгібування зростання штаму b Klebsiella pneumoniae, отриманого від немовляти № 12 з дитячими кольками, яка виникла навколо диску, просоченого суспензією клітин Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106. У цьому випадку також не виникло жодної антагоністичної активності від диска, просоченого тільки супернатантом, позбавленим клітин, що походять від культури лактобацил. Виміряний ореол інгібування зростання коліформних бактерій мав радіус у 12.5 мм, що можна побачити у Фіг. № 2. Приклад 3 Була проведена оцінка антимікробної активності, яку проявляли пробіотичні лактобацили Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 відносно всіх штамів Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis, отриманих від немовлят, що страждали на кольки та від здорових контролів. Для досягнення мети тестування, пробіотичний штам лактобактерій та коліформні бактерії, отримані з немовлят були піддані обробці, як описано у Прикладі 1. Результат: загальним чином, перевірений штам Lactobacillus delbrueckii MB386 DSM 22106 завжди проявляв інгібуючу активність до всіх досліджуваних коліформних бактерій. Контрольну чашку отримали шляхом розміщення на середовищі LB з агаром двох аналогічних стерильних дисків, не просочених клітинною суспензію або окремо культуральною рідиною. Контроль в жодному разі не показав будь-якої інгібіторної дії на зростання підданих перевірці штамів коліформних бактерій. Всі розглянуті результати досліджень оцінки антагоністичної активності лактобацил, яку можна було спостерігати на чашках наведені у вигляді середнього радіуса зон інгібування у Таблиці 1. Приклад 4 Також була здійснена оцінка антимікробної активності вибраних пробіотичних лактобацил Lactobacillus plantarum LPl DSM 22107 проти всіх штамів Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis, отриманих від немовлят, що страждали на кольок та від здорових контролів. Для досягнення мети тестування, пробіотичний штам лактобактерій та коліформні бактерії, отримані з немовлят були піддані обробці, як описано у Прикладі 1. Результат: головним чином, досліджуваний штам Lactobacillus plantarum LPl DSM 22107 жодного разу не показав будь-якої інгібіторної дії проти перевірених коліформних бактерій. Приклад 5 Була проведена оцінка спільної антимікробної активності двох пробіотичних штамів лактобактерій даного винаходу, Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 та Lactobacillus plantarum LPl DSM 22107 проти всіх виділених штамів коліформних бактерій: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis, отриманих від немовлят, що страждали на кольки. Для досягнення мети тестування, два пробіотичних штами лактобактерій культивували окремо, як написано у Прикладі 1 та, подібним чином, кожен штам коліформних бактерій обробили, як написано у 3 6 Прикладі 1. Суспензію, що мала концентрацію у 10 -10 клітин/мл коліформних бактерій розподілили на поверхні твердого середовища LB; після чого, на ньому розмістили два диски, 7 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 де один був просочений суспензією зібраних клітин Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 з відомою концентрацією разом з суспензією, що мала аналогічну концентрацію клітин та була зібрана від культури L. plantarum DSM 22107 та інший диск був просочений сумішшю, отриманою є двох нейтралізованих супернатантів, що мали походження від культури двох лактобактерій та були позбавлені клітин. Потім чашку з цим матеріалом залишали принаймні на одну годину при 4 °C. Після 18-годинного інкубування при 37 °C, була виміряна зона інгібування зростання коліформних бактерій, що з'явилася навколо двох дисків. Результати: У ході перевірок синергічної антибактеріальної активності було виявлено, що зона інгібування зростання кожного коліформного штаму, отриманого від уражених кольками немовлят завжди виникала тільки навколо диску, що був просочений двома суспензіями клітин L. delbruekii DSM 22106 та L. plantarum DSM 22107, тоді як жодних ознак ореолу зони інгібування навколо диску, просоченого відповідними супернатантами, що походять від культури двох лактобактерій виявлено не було. Нарешті, було виміряне ореол, який свідчить про інгібування, мав походження від цілих клітин та мав середній радіус, який можна порівняти з середнім радіусом, отриманим від окремої антагоністичної активності L. delbruekii DSM 22106 (Таблиця 1). Приклад 6 Антагоністичну активність Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 in vitro оцінювали шляхом інокуляції модифікованого середовища LB, вже описаного у розділі, присвяченому способу оцінки антимікробної активності у рідкій культурі для спільного культивування, з 5 загальною концентрацією лактобацил 10 КУО/мл та з такою ж концентрацією клітин штаму Escherichia coli, отриманого від немовляти № 15, що страждає від кольок. Другу пробірку, що містила модифіковане середовище LB інокулювали тільки клітинами коліформних бактерій. Спільну культуру та контроль інкубували при 37 °C у мікроаерофільних умовах. Антагоністичну активність лактобактерій проти штаму Escherichia coli оцінювали після 8-10 - годинного інкубування. Для вимірювання зростання Lactobacillus delbruekii MB386 DSM 22106 та штаму Escherichia coli в результаті досліджень спільного інкубування та у контрольному зразку, КУО/мл двох бактеріальних штамів оцінювали у нульову точку інокуляції та через 24 год., шляхом нанесення аліквот живильного середовища зі спільної культури та контролю на агар MRS з 0.2 % ванкоміцином (селективний для лактобактерій) та на агар MacConkey (селективний для Escherichia coli); останні змінення pH у пробірці зі спільним інкубуванням та у контрольному зразку були визначені через 24 год. 5 Результати: у нульову точку (t0) (момент часу інокуляції) 2.7 × 10 клітин Lactobacillus 5 delbruekii DSM 22106 інокулювали разом з 5.0 × 10 клітин Escherichia coli. Початкове значення 9 pH дорівнювало 6.8. Через 24 години, (t24), на селективних чашках було виявлено 7.0 × 10 5 КУО/мл Lactobacillus delbruekii DSM 22106 та 5.0 × 10 КУО/мл Escherichia coli, тоді як pH 5 знизився до 4.3. У контрольній пробірці у нульову точку інокулювали тільки 4.5 ×10 КУО/мл Escherichia coli; інокулят лактобактерій перенесли шляхом додавання рівного обсягу свіжого 9 середовища, без будь-яких клітин. Після 24 - годинного інкубування, було виявлено 1.0 × 0 КУО/мл інокульованих Escherichia coli. pH середовища, що дорівнював 6.8, залишався незмінним після 24 год. Приклад 7 Подібний до Прикладу 5, але тут досліджували антимікробну активність комбінації двох штамів Lactobacillus delbruekii MB386 DS 22106 та Lactobacillus plantarum LP1 DSM 22107 при спільному інкубуванні з найбільш характерними штамами коліформних бактерій кожного з ідентифікованих видів, отриманих з немовлят. Антагоністичну активність, що виникла в "синергії" двох лактобактерій оцінювали шляхом інокуляції модифікованого середовища LB бактеріями L. delbruekii DSMZ 22106 з загальною 2 2 концентрацією 10 КУО/мл та L. plantarum DSMZ 22107 (10 клітин) та подібною концентрацією 4 (10 ) клітин досліджуваних коліформних бактерій. Другу пробірку з модифікованим середовищем LB піддали інокуляції тільки одними клітинами обох лактобактерій. Отриману таким чином спільну культуру та контроль інкубували при 37 °C у мікроаерофільних умовах протягом 8-10 год., після чого оцінювали антагоністичну активність (якщо вона була). Для вимірювання зростання лактобактерій та коліформних бактерій в результаті досліджень спільного інкубування та у контрольному зразку, КУО/мл кожної бактерії оцінювали у нульову точку інокуляції та через 24 год., як написано у Прикладі 5. Загальну концентрацію КУО/мл лактобактерій підраховували разом з КУО/мл досліджуваних коліформних бактерій та після цього визначали змінення значення pH у пробірці (спільна інкубація) та pH контролю через 24 год. 8 UA 107711 C2 5 10 15 Результати: незалежно від видів та від дитини, з якої їх отримали, концентрація коліформних бактерій при спільному культивуванні з двома пробіотичними штамами 9 5 лактобацил знизилися принаймні на 4 десяткові логарифмічні одиниці (з E10 до E10 ) у порівнянні з контрольною пробіркою. pH, що завжди вимірювали перед та після 24 - годинного інкубування, змінювався на величину принаймні 3.3±0.4 при спільному інкубуванні пробірок з лактобактеріями та штамами коліформних бактерій, тоді як pH у контрольних пробірках завжди залишався незмінним. З вищевказаного можна зробити висновок, що штам L. delbruekii MB386 DSM 22106 має чітку антибактеріальну активність до видів Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis, отриманих від уражених кольками немовлят, що належать до роду коліформних бактерій та беруть участь у ферментації лактози та у виробництві кишкового газу, що вважається однією з основних супутніх причин кольок у немовлят. Зменшення концентрації кишкових коліформних бактерій вважається необхідним з метою підтримки стабільної рівноваги кишкової мікрофлори людини, що є корисним для стану здоров'я людини. Таблиця 1 Антагоністична активність, яку демонструє Lactobacillus delbruekii DSMZ 22106 на чашках у вигляді середнього радіусу зони інгібування. Ореол, спричинений інгібуванням (середній радіус зони ± SD) 10.23±1.29 9.83±1.04 9.75+1.06 10.25±0.35 10.25±0.35 10.16±0.76 Виділена коліформна бактерія Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Klebsiella oxytoca Enterobacter aerogenes Enterobacter cloacae Enterococcus faecalis SD - стандартне відхилення. Таблиця 2 Загальна Кількість концентрація Фактор розведення № морфологічно коліформних бактерій (фактор суб'єктів різних колоній на КУО (г-1 фекального послаблення дії) чашці матеріалу)* -6 a. 10 6 2 5,0 × 10 2 -6 b. 10 -6 a. 10 6 3 1,0 × 10 2 -4 b. 10 -6 a. 10 7 4 1,0 × 10 2 -6 b. 10 -8 a. 10 8 6 3,0 × 10 2 -7 b. 10 7 -6 7 2,0 × 10 1 a. 10 3 -3 9 7,0 × 10 1 a. 10 -7 a. 10 7 12 4,0 × 10 2 -7 b. 10 -7 a. 10 7 13 3,7 × 10 2 -5 b. 10 -8 a. 10 8 15 3,4 × 10 2 -5 b. 10 -8 a. 10 8 16 4,3 × 10 2 -5 b. 10 20 9 Визначені види a.E. coli b. E. coli a. K. pneumoniae b. E. coli a.E. coli b. K. oxytoca a.E. coli b. E. coli a.E. faecalis a.E. coli a.E. coli b. K. pneumoniae a.E. coli b. E. coli a.E. coli b. E. coli a.E. coli b. K. oxytoca UA 107711 C2 Продовження таблиці 2 Загальна Кількість концентрація Фактор розведення № морфологічно коліформних бактерій (фактор суб'єктів різних колоній на КУО (г-1 фекального послаблення дії) чашці матеріалу)* -6 a. 10 6 17 1,1 × 10 2 -5 b. 10 -6 a. 10 6 18 8,1 × 10 2 -5 b. 10 3 -3 22 1,1 × 10 1 a. 10 -6 a. 10 -6 b. 10 6 23 9,5 × 10 4 -6 c. 10 -5 d. 10 3 -3 24 1,0 × 10 1 a. 10 -8 a. 10 8 29 5,8 × 10 2 -7 b. 10 -6 a. 10 -5 b. 10 6 32 2,7 × 10 4 -5 c. 10 -5 d. 10 4 -4 36 1,0 × 10 1 a. 10 4 -4 39 1,0 × 10 1 a. 10 6 -6 48 2,6 × 10 1 a. 10 Визначені види a.E. coli b.Enterobacter cloacae a. K. oxytoca b. E. faecalis a.E. coli a. K. oxytoca b.E.aerogenes c.E. coli d. E. coli a.E. coli a.E. coli b. E. coli a. E. coli b. K. oxytoca c.K. pneumoniae d. K. oxytoca a. K. oxytoca a.K. pneumoniae a. K. oxytoca (*) загальну кількість коліформних бактерій визначали шляхом підрахування колоній, що зростали на чашках з агаром МаcConkey, тоді як видові концентрації визначали за допомогою вид - специфічного способу ПЛР- фінгерпринтингу та риботипування. ФОРМУЛА ВИНАХОДУ 5 10 15 20 25 30 1. Пробіотичний штам бактерій Lactobacillus delbruekii DSM 22106 як інгібітор коліформних бактерій. 2. Пробіотичний штам бактерій відповідно до п. 1, де вказані коліформні бактерії є вибраними з групи, що включає коліформні бактерії, які виробляють газ шляхом ферментації цукру, переважно лактози. 3. Пробіотичний штам бактерій відповідно до п. 1 або п. 2, де вказані коліформні бактерії є вибраними з групи, що охоплює бактерії, які належать до видів Escherichia соli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis. 4. Пробіотичний штам бактерій відповідно до будь-якого одного з пп. 1-3, де штам L. delbruekii DSM 22106 має антибактеріальну активність проти бактерій, що належать до видів Escherichia соli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae та Enterococcus faecalis. 5. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція, що містить штам бактерій відповідно до будь-якого одного з пп. 1-4. 6. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 5, де також є присутнім принаймні один інший штам бактерій, де вказаний штам являє собою Lactobacillus plantarum DSM 22107. 7. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 5 або 6 для застосування у запобіганні та/або лікуванні осіб, що страждають на кольки. 8. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до будь-якого одного з пп. 5-7, де вказаний штам Lactobacillus delbruekii DSM 22106, та вказаний Lactobacillus plantarum DSM 22107, мають покриття з композиції, що містить принаймні один ліпід, переважно рослинного походження, де вказаний ліпід є вибраним із групи, що включає насичені жири з температурою плавлення нижче 75 °С, переважно у межах 45-65 ° С. 10 UA 107711 C2 5 10 15 20 25 9. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 8, де вказані насичені жири є вибраними з моно- та дигліцеридів насичених жирних кислот, полігліцеринів, естерифікованих при використанні насичених жирних кислот, та вільних насичених жирних кислот. 10. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 9, де вказані насичені жири є вибраними з полігліцерилдистеарату, гліцерилпальмітостеарату, насичених жирних кислот або гідрогенізованих рослинних жирів, які не мають походження від лауринових сполук. 11. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до будь-якого одного з пп. 5-10, де пробіотичні штами бактерій Lactobacillus delbruekii DSM 22106, та Lactobacillus plantarum DSM 22107 є покритими першим та другим покриттями, де вказане перше покриття являє собою гідрогенізовану пальмову олію з температурою плавлення близько 60 °С, а вказане друге покриття є жиром гліцерилдипальмітостеарату з температурою плавлення у межах 57-60 °С. 12. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до будь-якого одного з пп. 5-11 у формі маслянистої суспензії, що містить: - принаймні одну харчову олію, вибрану з групи, що включає: оливкову олію, кукурудзяну олію, соєву олію, лляну олію, арахісову олію, кунжутну олію, риб'ячий жир та рисову олію, де вказана принаймні одна олія є присутньою у кількості, що є більшою або дорівнює 70 % за вагою відносно до загальної ваги суспензії, та - пробіотичний штам бактерій Lactobacillus delbruekii DSM 22106, де вказаний штам є присутнім у кількості, що є меншою або дорівнює 30 % за вагою відносно до загальної ваги суспензії. 13. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 12, що додатково включає пробіотичний штам Lactobacillus plantarum DSM 22107. 14. Харчова композиція або добавка, або фармацевтична композиція відповідно до п. 12 або 13, де олією суспензії є оливкова олія, переважно оливкова олія у суміші з кукурудзяною олією та/або соєвою олією та/або лляною олією. 11 UA 107711 C2 Комп’ютерна верстка Л. Ціхановська Державна служба інтелектуальної власності України, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна ДП “Український інститут промислової власності”, вул. Глазунова, 1, м. Київ – 42, 01601 12

Додаткова інформація

Назва патенту англійською

Use of lactobacilli inhibiting gas producing coliform bacteria isolated from infants affected by colic

Автори англійською

Scatizzi, Gianna

Автори російською

Скатицци Джанна

МПК / Мітки

МПК: C12N 1/20, A61K 35/74, C12R 1/25, C12R 1/225

Мітки: інгібують, кольками, коліформні, газ, лактобацил, уражених, бактерії, немовлят, застосування, отримані, виробляють

Код посилання

<a href="http://uapatents.com/14-107711-zastosuvannya-laktobacil-shho-ingibuyut-otrimani-vid-urazhenikh-kolkami-nemovlyat-koliformni-bakteri-yaki-viroblyayut-gaz.html" target="_blank" rel="follow" title="База патентів України">Застосування лактобацил, що інгібують отримані від уражених кольками немовлят коліформні бактерії, які виробляють газ</a>

Подібні патенти